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Mitochondriales Hsp70 spielt eine wichtige Rolle bei der Biogenese und Funktion von Mitochondrien. Es ist essenziell für den Import, die Faltung und den Abbau mitochondrialer Proteine. Wie alle Hsp70-Proteine arbeitet mtHsp70 dabei mit Cochaperonen zusammen. In dieser Arbeit wurden neue Interaktionspartner von mtHsp70 identifiziert und funktionell charakterisiert. MtHsp70 ist die zentrale Komponente des Importmotors der TIM23-Translokase, der den ATP-abhängigen Transport von Proteinen über die Innenmembran der Mitochondrien vermittelt. Mit Tim14 und Mdj2 wurden in dieser Arbeit zwei Proteine des Importmotors als J-Cochaperone identifiziert. Sowohl Tim14 als auch Mdj2 wurden als MBP-Fusionsproteine aus E. coli gereinigt und stimulierten die ATPase-Aktivität von mtHsp70. Eine Variante von Tim14 mit einer Mutation im HPD-Motiv, die die Stimulation der ATPase-Aktivität von mtHsp70 durch Tim14 verhindert, konnte die Funktion von Tim14 in Hefezellen nicht übernehmen. Die Entdeckung von membranassoziierten J-Proteinen im Importmotor macht deutlich, dass mtHsp70 durch die Stimulation seiner ATPase-Aktivität effizient an ein importiertes Protein binden kann, sobald dieses die Translokationspore des TIM23- Komplexes verlässt. Ebenso wird die evolutionäre Konservierung zwischen dem Importmotor und bakteriellen Hsp70-Systemen ersichtlich. Der Importmotor der TIM23-Translokase ist aber eine Ausnahme unter den Hsp70-Systemen, da in diesem System mit Tim16 eine weitere, regulatorische Komponente identifiziert werden konnte. Tim16 ist ein J-ähnliches Protein, das selber keine stimulierende Wirkung auf die ATPase-Aktivität von mtHsp70 hat, aber die Stimulation von mtHsp70 durch Tim14 reguliert. Dies könnte einen unnötigen Verbrauch von ATP durch mtHsp70 in Abwesenheit eines Präproteins verhindern. Mit der Charakterisierung der J- und J-ähnlichen Proteine des Importmotors wurden wesentliche Erkenntnisse über die Funktionsweise des Importmotors geliefert. Ein bisher nicht bekanntes Protein wurde zusammen mit mtHsp70 aus S. cerevisiae gereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert. Dieses Protein, Hep1, ist ein lösliches Protein der mitochondrialen Matrix. Es interagiert mit mtHsp70 in seiner nukleotidfreien und ADPgebundenen Form. Für diese Interaktion ist die ATPase-Domäne von mtHsp70 notwendig. Jedoch trägt vermutlich auch die PBD zur Bindung von mtHsp70 an Hep1 bei, da eine solche Bindung nur beobachtet werden konnte, wenn mtHsp70 sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Hep1 hat im Gegensatz zu den bekannten Cochaperonen keinen Einfluss auf den ATPase- Zyklus von mtHsp70. Allerdings aggregieren in Abwesenheit von Hep1 mitochondriale Hsp70-Proteine. Diese Aggregation ist irreversibel und führt zum Verlust der Funktion der mitochondrialen Hsp70-Proteine. Diese Beeinträchtigung führt wiederum zu Defekten in Prozessen, die funktionelle mitochondriale Hsp70-Proteine benötigen. So wurden in ∆hep1- Zellen Defekte im mitochondrialen Proteinimport und der Biogenese von Eisen-Schwefel- Clustern beobachtet. Aufgrund dieser Defekte zeigen ∆hep1-Zellen einen Temperatursensitiven Wachstumsphänotyp. Die Tendenz zur Aggregation ist spezifisch für mitochondriale Hsp70-Proteine, wobei besonders die nukleotidfreie Form von mtHsp70 betroffen ist. Im aggregierten Material ließ sich eine erhöhte Sensitivität der ATPase-Domäne gegenüber zugesetzter Protease feststellen, was auf eine Fehlfaltung dieser Domäne deutet. Es wurde eine Region in der ATPase- Domäne von mtHsp70 identifiziert, die zur Aggregation von mtHsp70 beiträgt. Durch Austausch dieser Region gegen die entsprechende Region aus DnaK, dem nächsten nicht mitochondrialen Verwandten von mtHsp70, konnte ein teilweise funktionsfähiges Hsp70- Protein hergestellt werden, dessen Löslichkeit nicht mehr von Hep1 abhängig ist. MtHsp70 aggregiert nur, wenn es sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Die Interdomänenkommunikation zwischen der ATPase-Domäne und der PBD von mtHsp70 scheint zur Ausbildung einer instabilen Konformation notwendig zu sein. Hep1 bindet an mtHsp70 in dieser Konformation und verhindert somit die Aggregation. Mit Hep1 wurde in dieser Arbeit ein neuer Typ von Interaktionspartnern mitochondrialer Hsp70-Proteine entdeckt. Es wirkt als Chaperon für dieses Hsp70-Proteine, indem es an sie bindet und deren Aggregation verhindert.

Die Innenmembran von Mitochondrien besitzt zwei Translokasen für den Import von Proteinen. Der TIM23-Komplex vermittelt die Translokation über und in die Innenmembran, der TIM22-Komplex inseriert Proteine mit mehreren hydrophoben Segmenten in die Innenmembran. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Komponenten dieser Translokationsmaschinerien in N. crassa und S. cerevisiae identifiziert und charakterisiert werden. In N. crassa waren zu Beginn der Arbeit im Vergleich zu S. cerevisiae nur wenige Komponenten der TIM-Translokasen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Tim22, Tim54 und Tim44 in N. crassa identifiziert. Dies wurde entweder durch die Verwendung degenerierter Primer in PCR-Reaktionen mit cDNA aus N. crassa oder durch Durchmustern von Datenbanken erreicht. Die identifizierten Proteine des TIM22-Komplexes wurden bezüglich ihrer Lokalisation und Topologie untersucht. Es handelt sich bei Tim22 um ein Membranprotein der inneren mitochondrialen Membran mit vier Transmembranhelices, das sowohl den N- als auch den C-Terminus in den Intermembranraum exponiert. Tim54 ist ebenso in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt nur eine Transmembranhelix. Der größte Teil des Proteins liegt im Intermembranraum, nur wenige Aminosäurereste befinden sich in der mitochondrialen Matrix. Ferner wurde der TIM22-Komplex von N. crassa charakterisiert. Dazu zählten die Untersuchungen der beteiligten Komponenten, der Komplexgröße und der Stabilität des Komplexes. In N. crassa besteht der TIM22-Komplex aus den Komponenten Tim22, Tim54, Tim9 und Tim10, die einen etwa 350 kDa großen Komplex bilden. Für spätere funktionelle Untersuchungen wurde der TIM22-Komplex bzw. Tim22 alleine gereinigt. Beides wurde in Lipidvesikel rekonstituiert. Dieses Verfahren bietet die Grundlage für Untersuchungen in einem definierten experimentellen System, wie Proteine der Carrier-Familie in Lipidmembranen inseriert werden. In S. cerevisiae wurde mit Tim16 eine neue Komponente des mitochondrialen Importmotors des TIM23-Komplexes identifiziert. Dies konnte durch Koreinigung mit einer weiteren Komponente des Importmotors, Tim14, erreicht werden. Die strukturelle Vorhersage für Tim16 ähnelt stark der des J-Proteins Tim14. Tim16 fehlt allerdings das für die Funktion von J-Proteinen essentielle HPD-Motiv. Tim16 ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und peripher mit der inneren mitochondrialen Membran assoziiert. Durch Depletion von Tim16 wird der Import von Substraten in Mitochondrien beeinträchtigt, die vom mitochondrialen Importmotor abhängig sind. Durch Koimmunopräzipitationen und Quervernetzungsexperimente wurde Tim16 als neue Komponente des mitochondrialen Importmotors der TIM23-Translokase definiert. Funktionell spielt Tim16 eine große Rolle für die Integrität des Importmotors. Die genaue Struktur des Importmotors, seine Regulation und dessen Dynamik im Zuge der Translokation von Präproteinen muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden.

In S. cerevisiae bilden Mitochondrien ein tubuläres Netzwerk, für dessen Erhaltung ein Gleichgewicht aus Fusions- und Teilungsprozessen notwendig ist. Mgm1 ist ein Dynamin-ähnliches Protein in Mitochondrien, das an der mitochondrialen Fusion beteiligt ist. Es kommt in einer großen Isoform (l-Mgm1) von 97 kD und einer kleinen Isoform (s-Mgm1) von 84 kD vor. In der vorliegenden Arbeit sollte die Biogenese dieser beiden Isoformen und ihre Rolle in der Erhaltung der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA geklärt werden. Beide Isoformen konnten im Intermembranraum von Mitochondrien lokalisiert werden. Durch Immunpräzipitation und N-terminale Sequenzierung wurden die N-Termini beider Isoformen identifiziert. l-Mgm1 besitzt an seinem N-Terminus ein hydrophobes Segment. Mit diesem Segment ist es in der inneren mitochondrialen Membran verankert. s-Mgm1, dem dieses Segment fehlt, ist peripher membranassoziiert. Die Rhomboid-ähnliche Protease Pcp1 in der mitochondrialen Innenmembran ist für die Prozessierung von Mgm1 zu s-Mgm1 verantwortlich. Die Deletion von PCP1 führt zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien und zum Verlust der Respirationskompetenz und der mitochondrialen DNA. Dieser Phänotyp ist von dem der Deletion von MGM1 nicht zu unterscheiden. Der Phänotyp der Deletion von PCP1 ist eine direkte Konsequenz der fehlenden Mgm1–Prozessierung und des Fehlens von s-Mgm1. Darüber hinaus ist die Bildung beider Isoformen in ungefähr gleicher Menge für die volle Funktionalität von Mgm1 erforderlich. Für die koordinierte Bildung beider Isoformen ist eine konservierte Abfolge von zwei hydrophoben Segmenten am N-Terminus von Mgm1 erforderlich. Das weiter C-terminal gelegene hydrophobe Segment enthält die Spaltstelle für Pcp1. Die Hydrophobizität des N-terminalen Segments determiniert hingegen das Mengenverhältnis beider Isoformen. Dabei führt verringerte Hydrophobizität zur vermehrten Bildung von s-Mgm1, während erhöhte Hydrophobizität die Bildung von s-Mgm1 fast vollständig verhindert. Die intermediäre Hydrophobizität der Wildtyp-Sequenz ist kritisch für die koordinierte Bildung beider Isoformen im Verhältnis von ungefähr 1:1. Die Bildung von s-Mgm1 hängt weiterhin von einem funktionalen Importmotor und einer hinreichend hohen ATP–Konzentration in der mitochondrialen Matrix ab. l-Mgm1 kann dagegen ATP-unabhängig und unabhängig vom Importmotor gebildet werden. Diese Daten führten zum Modell der alternativen Topogenese von Mgm1. Demnach dient das erste hydrophobe Segment als Stopp-Transfer-Signal im TIM17/TIM23-Translokationskomplex. Laterale Insertion dieses Segments in die mitochondriale Innenmembran führt zur Bildung von l-Mgm1. Die Überwindung dieses Translokationsarrests führt zum weiteren Import bis das zweite hydrophobe Segment mit der Spaltstelle die Innenmembran erreicht. Dort entsteht durch Pcp1-Spaltung s-Mgm1. Der weitere Import und damit die Pcp1-Prozessierung sind abhängig von ATP und einem funktionalen Importmotor. Die Bildung von l-Mgm1 und s-Mgm1 sind kompetierende Prozesse. Störungen in diesem kompetitiven Gleichgewicht (veränderte Hydrophobizität des ersten hydrophoben Segments, nicht funktionaler Importmotor, niedrige ATP–Konzentration in der Matrix) führen zu Verschiebungen im Verhältnis beider Mgm1-Isoformen und zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien. Daher stellt der Mechanismus der alternativen Topogenese eine Möglichkeit dar, wie der bioenergetische Zustand der Mitochondrien auf molekularer Ebene an die mitochondriale Struktur gekoppelt sein könnte. Auf diese Weise könnte in Mitochondrien, deren bioenergetischer Status z.B. aufgrund von Mutationen in der mitochondrialen DNA, wie sie durch oxidativen Stress entstehen, gestört ist, die Bildung von s-Mgm1 verringert sein. Möglicherweise führt das dazu, dass die betroffenen Mitochondrien nicht mehr effizient fusionieren und so aus dem mitochondrialen Netzwerk ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Topogenese würde in diesem Fall gegen geschädigte mitochondriale DNA selektionieren und so deren Vererbung unterbinden.