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Thu, 15 Nov 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15122/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15122/1/Grasse_Katinka.pdf Grasse, Katinka ddc:610, ddc:600, Medizinis

In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden Histon-Methyltransferasen Su(var)3-9 und E(Z) aus Drosophila melanogaster charakterisiert. Die Histonmethylierung als Modifikation war schon länger bekannt gewesen, bis zum Jahr 2000 war jedoch vor allem die Acetylierung etwas genauer untersucht worden. Su(var)3-9 war die einzige bekannte Histon-Lysin-Methyltransferase, als diese Arbeit begonnen wurde. Zur Charakterisierung wurde das myc-getagte Enzym aus Drosophila-Kernextrakt durch Affinitätschromatographie aufgereinigt und zunächst die Substratspezifität festgestellt. Wie das humane Enzym Suv39H1 methyliert es ebenfalls spezifisch H3-K9 (Lysin 9 im Histon H3). Das aus den Kernextrakten aufgereinigte Enzym besitzt aber auch die Fähigkeit, ein an H3-K9 präacetyliertes Substrat zu methylieren. Die Vermutung, dass Su(var)3-9 mit einer Histondeacetylase assoziiert ist, konnte durch Verwendung von TSA als HDAC-Inhibitor bestätigt werden. Es stellte sich heraus, dass HDAC1 (Rpd3) mit Su(var)3-9 assoziiert ist. Um das Enzym besser untersuchen zu können, wurde es als Volllängenprotein und als Deletionsmutante in E. coli exprimiert. Die Aufreinigung des rekombinanten Enzyms sowie seine Lagerbedingungen wurden optimiert. Das Volllängenprotein Su(var)3-9 liegt – wie durch Gelfiltration festgestellt - als Dimer vor, die Interaktion mit sich selbst ist über den N-Terminus vermittelt. Su(var)3-9 bindet an sein eigenes, bereits methyliertes Substrat. Dies wurde an Peptiden untersucht, die den ersten 20 Aminosäuren des Histons H3 entsprechen, und entweder an Lysin 9 dimethyliert oder unmodifiziert waren. Die Interaktion mit dem methylierten Substrat ist auf die Chromodomäne von Su(var)3-9 zurückzuführen, ist jedoch schwächer als die Wechselwirkung von HP1 mit methyliertem H3-K9. Des weiteren wurde eine Drosophila-Zelllinie stabil mit Su(var)3-9 transfiziert. Das überexprimierte Protein ist jedoch nur schwach aktiv. Die Tatsachen, dass Su(var)3-9 mit HDAC1 interagiert sowie mit seinem eigenen Substrat assoziiert, ermöglichen die Aufstellung von Hypothesen über die bis jetzt kaum erhellte Ausbreitung von Heterochromatin in euchromatische Bereiche. Durch die Wechselwirkung mit der Deacetylase könnte Su(var)3-9 auch in aktiv transkribierte Bereiche vordringen und diese methylieren. Die Acetylierung, Zeichen für aktive Transkription, würde durch die Methylierung ersetzt werden. Die Interaktion mit seinem umgesetzten Substrat könnte verhindern, dass das Enzym sich nach der Reaktion entfernt, vielmehr könnte Su(var)3-9 entlang eines DNA-Stranges sukzessive alle Nukleosomen methylieren. Die darauffolgende Bindung von HP1 an methyliertes H3-K9 könnte den heterochromatischen Charakter des Chromatins verstärken und für längere Zeit festlegen. Aus Drosophila-Kernextrakten gelang es weiterhin, den E(Z)/ESC-Komplex über Säulenchromatographie aufzureinigen. Dieser enthält neben E(Z), ESC, p55 und Rpd3 auch Su(z)12. E(Z), ESC und Su(z)12 gehören der Polycomb-Gruppe an. Deren Funktion ist die dauerhafte Repression der homöotischen Gene. Sie spielen daher eine wichtige Rolle im „Zellgedächtnis“ während der frühen Entwicklung von Drosophila. Es konnte gezeigt werden, dass der E(Z)/ESC-Komplex Lysin 9 sowie Lysin 27 im Histon H3 methyliert. Außerdem wurde in vitro ein Teilkomplex aus rekombinantem E(Z), p55 und ESC rekonstituiert, der das Histon H3 methylieren kann. Ein Teilkomplex, der E(Z) mit mutierter SET-Domäne enthält, ist nicht in der Lage, H3 zu methylieren. Die Vorhersage, dass E(Z) aufgrund seiner SET-Domäne eine Methyltransferase sein müsse, konnte durch vorliegende Untersuchungen bestätigt werden. Polycomb ist ein weiteres Protein aus der Polycomb-Gruppe. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses Protein spezifisch an das Histon H3 bindet, das an K27 trimethyliert ist. Polycomb besitzt wie HP1 eine Chromodomäne. Aus den vorliegenden Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Nach der Methylierung von H3-K9 sowie H3-K27 durch den E(Z)/ESC-Komplex in homöotischen Genen, die schon abgeschaltet sind und weiterhin reprimiert werden müssen, bindet Polycomb an dieses Methylierungsmuster. Polycomb befindet sich in einem großen Komplex mit weiteren Polycomb-Gruppen-Proteinen. Die Bindung dieses Komplexes an Chromatin könnte ein denkbarer Mechanismus sein, wie die dauerhafte Repression der homöotischen Gene vermittelt wird. Um den E(Z)/ESC-Komplex genauer untersuchen zu können, wurden Viren für das Baculosystem hergestellt, so dass eine Einzel- oder auch Coexpression der Proteine möglich ist. Die Aktivität von E(Z), das im Baculosystem exprimiert wurde, ist nicht besonders hoch. Es bindet unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen weder an DNA, noch an Histone noch an H3-Peptide, die methyliert sind. Innerhalb des E(Z)/ESC-Komplexes bindet E(Z) an p55, Rpd3, ESC sowie Su(z)12. Su(z)12 interagiert mit p55, Rpd3 und E(Z). Die weiteren Interaktionen werden am besten durch eine bildliche Darstellung (siehe Abb. 86) vermittelt. In einem Luciferase-Assay wurde eine repressive Wirkung von E(Z) festgestellt. Dieses Experiment bedarf allerdings eines aktivierten Systems. Ferner muss durch Mutationsanalysen sichergestellt werden, dass die repressive Wirkung auf die Methyltransferase-Aktivität von E(Z) zurückzuführen ist. Kürzlich wurde entdeckt, dass E(Z) sowie Su(z)12 in verschiedenen Tumoren überexprimiert sind. Noch ist weder deren Funktion in den Tumorzellen klar, noch weiss man, ob die Überexpression der Grund oder eine Folge der Tumorbildung ist, noch kennt man alle Zielgene, die durch eine Überexpression von E(Z) und Su(z)12 beeinflusst werden. In nächster Zeit sind hier Einsichten in die Wirkungsweise von E(Z), Su(z)12 und anderen Polycomb-Gruppen-Proteinen zu erwarten.

Das Dhh1 Protein aus Saccharomyces cerevisiae ist aufgrund von acht hoch konservierten Aminosäure-Motiven als putative RNA Helikase klassifiziert. In S. pombe (Ste13p), Drosophi-la melanogaster (ME31B), Xenopus laevis (Xp54), Mus musculus (mmRCK) und Homo sa-piens (hRCK/p54) findet man Proteine, die zu Dhh1p eine sehr hohe Konservierung von bis zu 83 % aufweisen. Lediglich der N- und C-Terminus dieser Proteingruppe ist nicht konserviert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung der Deletion von DHH1 in Saccharomyces cerevisiae auf verschiedene Aspekte der DNA Schädigung und Reparatur, sowie die Funktio-nalität verschiedener Domänen von Dhh1p durch Mutationsanalysen untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde das DHH1 Gen in verschiedenen Hefestämmen deletiert und die Auswirkungen von DNA schädigenden Substanzen auf diese Mutanten untersucht. Die De-letion von DHH1 führte zu einer starken Erhöhung der Sensitivität von Hefezellen sowohl ge-genüber Bleomycin als auch gegenüber MMS. Allerdings zeigten dhh1D-Zellen nur eine schwache Sensitivität gegenüber UV-Strahlung und keine Sensitivität gegenüber g-Strahlung. Dies weist sehr stark darauf hin, dass die beobachteten Sensitivitäten auf einem eventuell durch Membrandefekte verursachten, sogenannten „uptake“-Phänotyp beruhen. In „uptake“ unabhängigen Experimenten wurde die Funktionalität des Non-homologous End-joining Repa-raturweges der Hefe untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass dhh1D-Stämme eine um den Faktor fünf reduzierte Effizienz in der Rezirkularisierung linearisierter Plasmide zeigen. Allerdings ist nur die Effizienz, nicht die Genauigkeit des End-joining in dhh1D-Stämmen be-troffen – die rezirkularisierten Plasmide wurden zu 100 % genau repariert. Dies weist darauf hin, dass die Deletion sich auf mehr als nur einen einzelnen Aspekt zellulä-rer Vorgänge auswirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die extreme Sensitivität der dhh1D-Stämme gegenüber Ble-omycin und MMS als Testsystem für die funktionelle Charakterisierung verschiedener Dhh1p Domänen verwendet. Dabei zeigte sich, dass eine Deletion des N-Terminus von Dhh1p kaum Einfluss auf die Funktionalität des Proteins hat. Die Deletion des C-Terminus führt zu einer deutlichen Sensitivität der Zellen gegenüber Bleomycin. Bei Deletion beider Termini wachsen die Zellen auf Bleomycin nur noch geringfügig besser als der dhh1D-Stamm. Diese Effekte werden durch Überexpression der verkürzten Proteine aufgehoben. Keine der drei Verkürzun-gen hat Einfluss auf das Wachstum auf MMS-haltigen Platten. Die Mutation der ATPase Domäne (Walker A Motiv) hebt die Funktion des Proteins fast voll-ständig auf. Diese Mutanten sind nahezu so sensitiv gegenüber Bleomycin, wie dhh1D Zellen. Die Überexpression der ATPase Mutante führt im Gegensatz zu den Verkürzungen zu keiner Verringerung der Sensitivität gegenüber Bleomycin. Die zusätzliche Entfernung der Termini in der ATPase Mutante führt nicht zu einer Erhöhung der Bleomycin-Sensitivität. Allerdings zeigt die Dreifachmutante deutlich schlechteres Wachstum auf MMS-haltigen Platten. Die Mutation des SAT-Motives in AAA führt ebenfalls zu einer deutlichen Bleomycin-Sensitivität. Der Phänotyp ist vergleichbar mit den Auswirkungen der Deletion des C-Terminus. Das ur-sprünglich als RNA Entwindemotiv charakterisierte SAT-Motiv wind mittlerweile eher als eine Art „Scharnier“ angesehen, das eine Bewegung der Domänen 1 und 2 im Dhh1 Protein relativ zueinander ermöglicht. Die Auswirkung der Mutation des SAT-Motivs in AAA im Vergleich zu den Verkürzungen und den ATPase Mutanten weist auf eine eher strukturelle Rolle des SAT-Motives in Dhh1p hin. Aus diesen Daten ließ sich ein vorläufiges Modell über die Funktionsweise des Dhh1 Proteins ableiten. In in vitro Experimenten wurde mit dem IMPACT-System aufgereinigtes Dhh1 Protein auf seine Fähigkeit hin untersucht, DNA und RNA zu entwinden. Für die verwendeten Substrate konnte keine in vitro Helikase Aktivität festgestellt werden. Zur Analyse der ATPase Aktivität wurde IMPACT-gereinigtes Dhh1p und durch Immunopräzipitation aus Heferohextrakten ge-wonnenes Protein eingesetzt. In beiden Fällen konnte keine ATP Hydrolyse beobachtet wer-den, obwohl die Mutationsanalyse eindeutig darauf hinweist, dass die ATPase Aktivität essen-tiell für die Funktion des Dhh1 Proteins ist.

Die vorliegende Promotionsarbeit beschäftigt sich vorwiegend mit der Untersuchung von Patienten mit partieller Monosomie 10p. Der Phänotyp dieser Patienten ähnelt häufig dem des DiGeorge-Syndroms. Neben fazialen Dysmorphien und weiteren Nebensymptomen ist die Symptomentrias Herzfehler, T-Zelldefekt und Hypoparathyreoidismus das typische Merkmal dieses Entwicklungsdefektes. Viele Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p zeigen diese Symptome, was für einen DiGeorge-Syndrom-Locus auf Chromosom 10p spricht. Der Hauptlocus für das DiGeorge-Syndrom liegt jedoch auf Chromosom 22q11. Mehr als 90 % der DiGeorge-Syndrom-Patienten haben eine Mikrodeletion 22q11. Diese Mikrodeletion zählt mit einer Frequenz von etwa 1/4000 zu den häufigsten Deletionen beim Menschen überhaupt und ist deshalb schon seit langem das Ziel intensiver Forschungstätigkeit. Dennoch ist es erst in der jüngsten Zeit gelungen, zumindest ein Gen aus der Mikrodeletionsregion 22q11 (TBX-1) zu isolieren, welches für den beobachteten Herzfehler verantwortlich sein könnte. Ansonsten sind die molekularen Ursachen dieses Entwicklunsdefektes noch immer weitgehend unbekannt. Die Deletionen auf Chromosom 10p sind sehr selten. Sie sind aber von wissenschaftlichem Interesse, da die molekulare Aufklärung dieser Region zu einem tieferen Verständnis der Pathogenese des DiGeorge-Syndroms und isolierter Fehlbildungen insgesamt beitragen kann. Im ersten Teil der Arbeit wurden 16 Patienten mit partieller Monosomie 10p zytogenetisch und molekulargenetisch untersucht. Elf dieser Patienten zeigten einen DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp, fünf Patienten wurden nicht in das DiGeorge-Syndrom-Krankheitsbild eingeordnet. Die Patienten besaßen terminale und interstitielle Deletionen im Größenbereich von 13-48 cM. Mit Hilfe von FISH mit genomischen YAC-, PAC- und BAC-Sonden wurden die Bruchpunktregionen in den Patienten bestimmt. Bei einigen Patienten, bei denen DNA der Eltern vorlag, konnte auch eine Genotypisierung mit polymorphen Markern aus der Region vorgenommen werden. Mittels zweier Patienten konnte eine Haploinsuffizienzregion (DGCR2) kartiert werden, die für den Herzfehler und den T-Zelldefekt verantwortlich sein sollte. Die Region DGCR2 ist um den Marker D10S585 lokalisiert und besitzt eine minimale Ausdehnung von etwa 300 kb. Eine genaue Genotyp-Phänotyp-Analyse unter Einbeziehung von Patienten aus der Literatur zeigte jedoch, daß der gesamte Phänotyp der partiellen Monosomie 10p nicht mit der Haploinsuffizienz nur einer Region erklärt werden konnte, sondern daß zumindest noch ein zweiter Locus (HDR1) deletiert sein mußte. Dieser Locus war mit dem typischen DiGeorge-Syndrom-Symptom des Hypoparathyreoidismus assoziiert. Zusätzlich kartierten in diesen Locus noch eine sensorineurale Taubheit und Nierendefekte. Patienten mit diesen drei Symptomen leiden an einem HDR-Syndrom. Dieser zweite Haploinsuffizienzlocus HDR1 kartiert etwa 3 Mb distal zur Region DGCR2. Im zweiten Teil der Arbeit wurde sowohl über die Region DGCR2 als auch über die HDR1-Region ein PAC/BAC-Contig etabliert. Ausgewählte Klone aus den Contigs wurden im Rahmen des Humangenomprojekts vom Sanger Centre sequenziert. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der molekulargenetischen Untersuchung der beiden Haploinsuffizienzregionen DGCR2 und HDR1. Es konnten 12 EST-Klone in die Region DGCR2 kartiert werden. Bei allen Klonen handelte es sich um Transkripte, die nicht zu funktionellen Proteinen translatiert wurden. Nachdem die genomische Sequenz zugänglich war, konnte eine In-silico-Analyse dieser Region durchgeführt werden. Es handelt sich um eine sehr genarme Region. In die minimale Region DGCR2 kartiert nur das Gen NAPOR, das für ein RNA bindendes Protein kodiert. Es wurde als Kandidatengen für den mit dieser Region assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt näher charakterisiert. Eine Northern-Blot-Hybridisierung zeigte eine Expression in allen aufgetragenen Herzgeweben. Es wurden mindestens sechs verschiedene Transkripte identifiziert, was für die Existenz mehrerer Isoformen des Gens spricht. RNA-in-situ-Hybridisierungen auf Schnitte humaner Embryos und Foeten ergaben eine Genexpression in verschiedenen Geweben beginnend von Embryos des Carnegie-Stadiums C12 bis zu 18 Wochen alten Foeten. Es wurde eine Expression im Thymus vom Carnegie-Stadium C16 an und eine Expression im Herzen bei einem Foetus der 9. Woche beobachtet. Das Expressionsmuster machte NAPOR zu einem guten Kandidatengen für den mit der Haploinsuffizienzregion DGCR2 assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt. Mutationsanalysen in mehr als 100 Patienten ergaben keine Mutationen im NAPOR-Gen. Die meisten untersuchten Patienten besaßen einen DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp waren aber zytogenetisch normal. Besonderer Wert wurde auf die Anwesenheit eines Herzfehlers gelegt. Nur bei etwa 10 % der untersuchten Patienten lag auch eine Thymus-Hypoplasie vor. Ein direkter Beweis für die Beteiligung des NAPOR-Gens am Herzfehler und/oder T-Zelldefekt bei Patienten mit partieller Monosomie 10p steht noch aus. Die HDR1-Region konnte mit Hilfe zweier Mikrodeletionspatienten auf etwa 200 kb eingegrenzt werden. In diese Region kartiert das Gen GATA-3. Mutationsanalysen in zytogenetisch normalen HDR-Patienten zeigten in drei Patienten Mutationen, die zu einem funktionslosen GATA-3-Protein führen. Damit wurde der Beweis erbracht, daß das HDR-Syndrom eine Einzelgenerkrankung ist und daß die Symptome Hypoparathyreoidismus,sensorineurale Taubheit und Nierendefekte bei Patienten mit partieller Monosomie 10p auf eine Haploinsuffizienz des GATA-3-Gens zurückzuführen sind. Zusätzlich zu Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p wurden auch zwei Patienten näher charakterisiert, die eine interstitielle Deletion auf dem Chromosom 14q11-q13 aufwiesen. Diese Region war von Interesse, da das Gen PAX-9 dorthin kartiert und homozygote Pax9 -/- Knockout-Mäuse unter anderem eine Thymus-Hypoplasie und einen Hypoparathyreoidismus zeigen. Die Mäuse haben zwei der drei Leitsymptome des DiGeorge-Syndroms und stellen eine Beziehung zum Phänotyp der partiellen Monosomie 10p her. Die Deletionsbruchpunktregionen der beiden Patienten wurden über eine Genotypisierung mit polymorphen Markern identifiziert. Mit Hilfe eines Dosis-Blots und einer FISH-Analyse konnte gezeigt werden, daß beide Patienten für PAX-9 hemizygot waren. Beide Patienten zeigen keine Symptome des DiGeorge-Syndroms, was daraufhin weist, daß beim Menschen eine PAX-9-Haploinsuffizienz nicht zu einem DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp führt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen an Patienten mit partieller Monosomie 10p und an Patienten mit einer interstitiellen Deletion 14q11-q13 lieferten einen Beitrag zur molekulargenetischen Charakterisierung des DiGeorge-Syndroms. Der DiGeorge-Syndrom ähnliche Phänotyp bei vielen Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p ist das Resultat eines Contiguous Gene Syndroms, bei dem mindestens zwei unabhängige Regionen (DGCR2 und HDR1) auf Chromosom 10p hemizygot vorliegen müssen. Es wurde gezeigt, daß eine GATA-3-Haploinsuffizienz u.a. zu einem Hypoparathyreoidismus führt, einem der drei Leitsymptome des DiGeorge-Syndroms. Für den mit dem Syndrom assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt wurde mit NAPOR ein gutes Kandidatengen aus der Haploinsuffizienzregion DGCR2 identifiziert und charakterisiert. Eine Haploinsuffizienz des PAX-9-Gens auf Chromosom 14q12 führt zu keinem DiGeorge-Syndrom beim Menschen.

Die Aktivierung naiver Lymphozyten bezeichnet einen komplexen, immunmodulatorischen Prozeß, in dessen Verlauf mitotisch inaktive B- und T-Zellen als Folge des Kontakts mit Antigen in den Zellzyklus eintreten, proliferieren und anschließend zu spezifischen Effektorzellen oder zu langlebigen Gedächtniszellen differenzieren. Die klonale Expansion von Lymphozyten ist somit einerseits bedeutsam für die Förderung der akuten Immunantwort, andererseits ist sie auch Voraussetzung für die Etablierung von dauerhafter, adaptiver Immunität, deren zelluläre Grundlage die lymphozytären Gedächtniszellen darstellen. Auf wiederholte Antigen-Exposition reagieren Lymphozyten mit unmittelbarer und effizienter Aktivierung der Effektorfunktionen, beispielsweise der Produktion von Antikörpern durch BZellen oder der zytotoxischen bzw. immunmodulatorischen Aktivität von T-Zellen. Die Spezifität der Antigen-Erkennung wird in Lymphozyten durch hypervariable Antigenrezeptoren gewährleistet, deren Stimulation ein komplexes Netzwerk von Signaltransduktionsprozessen im Zellinneren initiiert. In T-Lymphozyten des Helfertyps resultieren diese Signalkaskaden unter anderem in der transkriptionellen Induktion des IL-2 Promotors. Das Signal des Antigenrezeptors wird jedoch moduliert durch die Aktivität von Corezeptoren, im Falle von T-Helferzellen beispielsweise unter Beteiligung des CD4-Moleküls. CD4 bindet an konstante Bereiche der antigenpräsentierenden MHC-II-Moleküle und stabilisiert so deren Interaktion mit dem T-Zell-Antigenrezeptor (TCR). Detaillierte Untersuchungen zu den Mechanismen der Koordination und Integration von Signalen des T-Zell-Antigenrezeptors mit denen des CD4-Moleküls bildeten das übergeordnete Thema der vorliegenden Arbeit. Sowohl der T-Zell-Antigenrezeptor als auch CD4 gehören zu einer Klasse von Rezeptoren, deren zytoplasmatische Anteile an Proteintyrosinkinasen (PTKs) koppeln. CD4 interagiert konstitutiv und nahezu stöchiometrisch mit der src-ähnlichen Kinase p56lck, welche während der Induktion von T-Zell Aktivierung eng mit der TCR-assoziierten Syk-ähnlichen Kinase ZAP-70 zu kooperieren vermag. Die Verknüpfung beider Kinasen mit den nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden erfolgt durch die Phosphorylierung spezifischer Substrate, welche zu Beginn dieser Untersuchungen noch größtenteils unbekannt waren. Zwei unabhängige experimentelle Ansätze sollten eine Identifikation potentieller in vivo Substrate der Tyrosinkinase ZAP-70 ermöglichen. Aufgrund von Befunden mit transmembran exprimierten Kinase-Fusionsproteine konnten mehrere Phosphoproteine als wahrscheinliche Substrate von ZAP-70 bestätigt werden, die zur selben Zeit von anderen Autoren als solche diskutiert wurden. Die zweite, parallel verfolgte experimentelle Strategie zielte auf die Charakterisierung einer konstitutiv-aktiven Variante von ZAP-70, deren Expression in TZellen zu einer Entkopplung von stimulierenden Signalen und somit zur Phosphorylierung spezifisch nachgeschalteter Substrate führen sollte. Tatsächlich konnte - durch Substitution carboxyterminaler Tyrosinreste von ZAP-70 - eine funktionell konstitutiv-aktive Mutante generiert und deren Substrate in vivo analysiert werden. Dieser Ansatz resultierte in der Charakterisierung einer bislang unvermuteten, positiv-regulatorischen Rückkopplungsschleife zwischen ZAP-70 und der ζ-Untereinheit des T-Zell-Antigenrezeptors. Dieser Rückkopplungsmechanismus könnte bedeutsam sein für die Amplifikation von Signalen des T– Zell Rezeptors. Dem Carboxyterminus von ZAP-70 würde somit entscheidendes Potential zur Modulation von T-Zell Aktivierung zukommen. Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der funktionellen Charakterisierung des bislang unbekannten Proteins ACP33, welches im Vorfeld als ein potentieller Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne von CD4 identifiziert worden war. Verschiedene Befunde hatten zuvor darauf schließen lassen, daß - neben p56lck - alternative intrazelluläre Liganden von CD4 existieren könnten. Mittels der Two-Hybrid Methodik konnte daraufhin die cDNA des ACP33 Proteins kloniert und zudem dessen Bindungsspezifität analysiert werden. ACP33 besitzt offenbar eine peptidbindende Domäne, welche spezifisch eine Kombination zweier hydrophober, nicht-aromatischer Aminosäurereste am Carboxyterminus von Peptiden erkennt. In der zytoplasmatischen Domäne von humanem CD4 und der aller bekannter CD4-Orthologe ist ein derartiges Interaktionsmotiv konserviert. Copräzipitationsexperimente und Mutationsanalysen bestätigten, daß C-terminale Deletionen von CD4 einen Verlust der Interaktion mit ACP33 zur Folge haben. Derselbe Effekt resultierte überraschenderweise auch aus der Substitution des Serinrestes 109 in ACP33, wodurch eine zu Hydrolasen homologe Region des ACP33 Proteins als neuartige peptidbindende Domäne identifiziert werden konnte. Funktionelle Analysen der carboxyterminalen CD4-Deletionsmutanten identifizierte das Interaktionsmotiv mit ACP33 als eine inhibitorische Determinante der antigenabhängigen T-Zell Aktivierung. ACP33 könnte demnach als eine negativ-regulatorische Komponente des Signalnetzwerkes einen bedeutenden Beitrag zur Modulation von TZell Aktivierung leisten. Zusammengenommen verdeutlichen die Resultate beider Teilprojekte, daß Regulation von T-Zell Aktivierung als ein integrativer Prozeß aus stimulatorischen und inhibitorischen Signalen anzusehen ist. Detailliertere Analysen zur Koordination dieser gegensätzlichen Signale sollte in Zukunft wesentlich zu einem besseren Verständnis von T-Zell Aktivierungsprozessen beitragen.