Podcasts about mutationsanalyse

Friederike, 30, erzählt uns die wichtige Perspektive einer Angehörigen: Ihr jetziger Ehemann ist an metastasierten Lungenkrebs erkrankt (EGFR), mal wieder als sportlicher Mensch und Nie Raucher. Alles fing im Sommer 2022 mit einer Coronaerkrankung und Verdacht auf Long Covid an. Dann nahm alles seinen Lauf... Hört einfach selbst zu.. Vielen lieben Dank, liebe Friederike für deinen Mut und deine Offenheit. Hier erreichst Du Friederike https://instagram.com/fre.d?utm_source=qr Der erwähnte Artikel mit mir: https://jimdo-storage.global.ssl.fastly.net/file/ee3a46d7-2ff6-47c9-ac5e-192f36f1a2e0/20221016_F.A.S._Seite%2015.pdf Biologische Krebsabwehr e.V. https://www.biokrebs.de/ Patientenorganisation zielgenau e.V., "dort bekommst Du auch mehr Informationen zum Thema "Mutationsanalyse" und "zertifizierte Lungenkrebszentren": https://www.zielgenau.org/ --- Send in a voice message: https://podcasters.spotify.com/pod/show/kab4/message

Die Geschichte von Alex, 55 und Mutter von 2 erwachsenen Söhnen zeigt mal wieder, dass die krassesten Geschichten das wahre Leben erzählt. Alex ist die 2. Betroffene in diesem Monat, die die Diagnose Brustkrebs nach dem Lungenkrebs (ROS1) bekommen hat. Und es ist immer wieder beeindruckend, wie auch Alex die Situation meistert, auch dank ihrer Ausbildungen. Aber nehmt euch einfach die Zeit & hört euch das Gespräch in Ruhe an und nehmt euch das mit, was euch weiterhilft. Ich habe dieses Mal das Gespräch laufen lassen, so dass ihr mehr erfahrt, wie ich auch immer wieder nach den Podcastaufnahmen. Hier erreichst Du Alex: https://instagram.com/alexandramenke?igshid=MzRlODBiNWFlZA== www.menke-coaching.com  Hier die empfohlenen Links von Alex:  Eine tolle Seite, hier besonders die Broschüre „Leben mit Krebs, Wegbegleiter zu mehr Wohlbefinden“https://www.frauenselbsthilfe.de/medien/broschueren-orientierungshilfen.html   Resilienz, wie man Krisen übersteht und daran wächst : https://www.amazon.de/Resilienz-Krisen-%C3%BCbersteht-daran-w%C3%A4chst/dp/3956140664/ref=sr_1_1?crid=3FZ7NKYAYLU8C&keywords=matthew+johnstone+resilienz&qid=1698311077&sprefix=matthew+Johnston%2Caps%2C94&sr=8-1   Hier eine Seite mit einem Super Magazin „meine Zeit“. Eigentlich ein Magazin für Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs, allerdings gibt es viele tolle Ideen, Vorlagen und auch Tipps für den Alltag mit Krebs im Allgemeinen. https://www.leben-mit-brustkrebs.de/mehr-infos/infomaterial Informationen zur Task Force „Genetic Tumor Risk“ https://nngm.de/news/genetic-tumor-risk-lungenkrebs/ Das Gespräch mit Prof. Dr. Griesinger vom Pius Krankenhaus, Oldenburg: https://spotifyanchor-web.app.link/e/TL5WMiLJeEb Hier kannst Du andere Lungenkrebsbetroffene treffen: https://www.instagram.com/lungenkrebs.betroffene/ Patientenorganisation zielgenau e.V., "dort bekommst Du auch mehr Informationen zum Thema "Mutationsanalyse" und "zertifizierte Lungenkrebszentren": https://www.zielgenau.org/ Bundesverband Selbsthilfe Lungenkrebs e.V. https://www.bundesverband-selbsthilfe-lungenkrebs.de   --- Send in a voice message: https://podcasters.spotify.com/pod/show/kab4/message

Janine, 39 und Mutter von 2 Teenagern, erhielt 2021 durch einen Zufallsbefund die Diagnose "metastasierter Lungenkrebspatient" (ALK Mutation). Schon von Anfang an hat sie sich über die Krankheit informiert. Sie wechselte zwischen zwei Lungenfachkliniken und hat die unterschiedlichsten Erfahrungen mit Ärzten gemacht. Es geht in diesem Gespräch viel um Eigenverantwortung und "Patient Empowerment". Ich hatte öfter einen Überraschungseffekt , aber hört einfach selbst zu und zieht euch die Informationen heraus, die euch weiterhelfen. Vielen lieben Dank, liebe Janine für deine Zeit und deine Offenheit. Hier erreichst Du Janine : https://instagram.com/janine541984?igshid=MzRlODBiNWFlZA==    Das erwähnte Lungenkrebs- Barcamp, das nach Ausstrahlung dieser Folge schon gewesen ist, aber hoffentlich im nächsten Jahr wieder stattfindet: https://www.bundesverband-selbsthilfe-lungenkrebs.de/ Hier kannst Du andere Lungenkrebsbetroffene treffen: https://www.instagram.com/lungenkrebs.betroffene/ Patientenorganisation zielgenau e.V., "dort bekommst Du auch mehr Informationen zum Thema "Mutationsanalyse" und "zertifizierte Lungenkrebszentren": https://www.zielgenau.org/ Bundesverband Selbsthilfe Lungenkrebs e.V. https://www.bundesverband-selbsthilfe-lungenkrebs.de --- Send in a voice message: https://podcasters.spotify.com/pod/show/kab4/message

Linda, 53 und Mutter von 2 Kindern hat schon einiges mit dem Krebs durchgemacht. Sie erzählt uns von ihrer ersten Diagnose vor 16 Jahren, einer Desmoid - Tumorerkrankung, bis über die jetzige Lungenkrebsdiagnose (EGFR) hin zum Brustkrebs. Es ist sehr beeindruckend, wie Linda trotz ihres mehrfachen Leidensweges - den sie bis jetzt schon durchgemacht hat- mit viel Lebensfreude und Eigenverantwortung lebt und sich auch noch für andere Betroffene in der Selbsthilfegruppe einsetzt. Vielen lieben Dank, liebe Linda, für deinen Mut und deine Offenheit. Du erreichst Linda auf Instagram: https://instagram.com/linda_s1202?igshid=MzRlODBiNWFlZA== Hier kannst Du andere Lungenkrebsbetroffene treffen: https://www.instagram.com/lungenkrebs.betroffene/ Patientenorganisation zielgenau e.V., "dort bekommst Du auch mehr Informationen zum Thema "Mutationsanalyse" und "zertifizierte Lungenkrebszentren": https://www.zielgenau.org/ Bundesverband Selbsthilfe Lungenkrebs e.V. https://www.bundesverband-selbsthilfe-lungenkrebs.de/ Das Video, welches Linda so viel Mut gemacht hat;-) https://youtu.be/JFY-BgIuPcs?si=VYcE7J7WeuANVZoW --- Send in a voice message: https://podcasters.spotify.com/pod/show/kab4/message

Martina, verheiratet, 40 und Mutter einer fast 3jährigen Tochter, bekam 6 Monate nach der Geburt ihres Kindes - im Mai 2019 - heftige Beckenschmerzen. Da keine Behandlung half wurde im April 2020 endlich ein MRT gemacht. Diagnose: viele Knochenmetastasen. Dann der Primärtumor: Lungenkrebs ( EGFR - Mutation). Mal wieder als Nieraucherin. Leider war auch hier in der Arzt Patienten Kommunikation vieles im Argen. Auch Martinas Erzählung macht wieder einmal fassungslos und berührt. Einen Tag nach dieser Veröffentlichung wird sie eine Herz - OP haben. Let's talk about Lungcancer. Du erreichst Sie auf Instagram unter https://instagram.com/martina.s2602?utm_medium=copy_link und bei LungPowerWomen https://instagram.com/lungpowerwomen?utm_medium=copy_link. Professionelle Unterstützung bei ganzheitlicher Beratung bekommst du bei der Biologischen Krebsabwehr https://www.biokrebs.de/. Wenn du die Diagnose Lungenkrebs hast bestehe bitte auf eine Mutationsanalyse . Ich kann nicht genug über diese aufklären, genauere Infos erhältst Du auf der Homepage der Patientenorganisation zielgenau: https://www.zielgenau.org/

Julia, 43 Jahre, erhielt im Juli 2016 die Diagnose ALK Translokation im Stadium IV. Mitten in den Hochzeitsvorbereitungen. Sie erzählt nicht nur von ihrem Weg, sondern wir reden intensiv über das Leben als Palliativpatientin, den Umgang mit der Situation, der psychischen Belastung, aber auch den unterstützenden Wegen die wir gefunden haben. Du erreichst Julia auf Instagram unter https://instagram.com/5phasen?utm_medium=copy_link. Hier erfährst du mehr über „ Cyber Knife “ https://www.erc-munich.com/?gclid=EAIaIQobChMIpYeEyIm59QIViQIGAB2uqAHuEAAYASAAEgLd8_D_BwE Ich kann nicht genug über die Mutationsanalyse aufklären, genauere Infos erhältst Du auf der Homepage der Patientenorganisation zielgenau: https://www.zielgenau.org/

LUNGENKREBSMONAT NOVEMBER LungCancerAwarenessMonth LCAM Anett, 49 und Mutter einer 16 jährigen Tochter, bekam im Februar 2020 die Diagnose Lungenkrebs (Adenokarzinom, EGFR - Mutation), nachdem sie beim liegen Atembeschwerden hatte. Am Anfang wurde noch von Heilung gesprochen und sie hatte eine heftige Behandlung mit Chemotherapie & Bestrahlungen. Dann wendete sich aber das Blatt und Anett wurde erst nach einer gesundheitlichen Verschlechterung über die Mutationsanalyse aufgeklärt: Hochemotional und informativ. Ich erzähle auch von meinem aktuellen persönlichem Erlebnis, welches mir mal wieder gezeigt hat, wie wichtig es ist eigenverantwortlich zu handeln und sich selbst zu informieren. Danke, liebe Anett, für das Teilen deiner Geschichte. Jeder muss über die Molekulardiagnostik Bescheid wissen, die Patientenorganisation zielgenau https://www.zielgenau.org/ , die Lung Cancer Group Cologne https://lungcancergroup.de/ und das Nationale Netzwerk Genomische Medizin Lungenkrebs https://www.nngm.de/ informieren genauer darüber. Eine ganzheitliche schulmedizinische Beratung bekommst du bei der Biologischen Krebsabwehr: https://www.biokrebs.de/ Das informative Gespräche von der Yescon02 kannst Du hier abrufen: https://youtu.be/JFY-BgIuPcs

Sabine, 42 und Mutter einer 16 jährigen Tochter, hat nie geraucht und dieselbe Lungenkrebsmutation EGFR wie ich. Sie erzählt ihren langen Weg über die vielen sog. Fachärzte bis zur Diagnose 2018. Wieder eine besonders tragische Geschichte, aber auch Sabine hat viel daraus gelernt & gibt nicht auf. Wir sprechen über viele Themen & darüber was uns mental stark macht. Danke, liebe Sabine, dass du deine Geschichte teilst, mit der du so viel Mut machst & aufklärst. Wir sind nicht müde zu betonen, auf eine Mutationsanalyse zu bestehen, der Verein „ zielgenau“ klärt darüber auf: https://www.zielgenau.org/. Du erreichst Sabine unter https://instagram.com/sumsi_mit_po_tagrisso?igshid=1oi977qg7wdoj

Mit 32 Jahren und als Mutter eines 3jährigen Sohnes erhielt Vesna 2016 die Diagnose „ unheilbarer Lungenkrebs“ (Adenokarzinom). Eine Geschichte, die mich wieder tief bewegt. Vesna erzählt, wie sie eigenverantwortlich auf eine Mutationsanalyse bestanden hat, von den engmaschigen regelmäßigen Untersuchungen - wegen der Veränderung des Tumors - und wie sie mit diesem und diversen Nebenwirkungen lebt. Es kommen viele Themen zur Sprache. Danke Vesna für deine Offenheit. Leider musste ich wegen technischen Problemen am Ende einiges rausschneiden. Diese Folge widme ich dem LCAM ( Lungcancer Awareness Month), der im November ist. Du erreichst Vesna über Instagram https://instagram.com/v2vesna?igshid=6jdqxsdezmbh

Thu, 18 Apr 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15644/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15644/1/Blankenstein_Thomas.pdf Blankenstein, Thomas

Morbus Fabry wird X-chromosomal vererbt und führt durch einen Defekt des lysosomalen Enzyms α-Galaktosidase A zu einer Störung im Glykosphingolipid-Katabolismus. Neutrale Glykosphingolipide, v.a. Gb3 (Globotriaosylceramid), akkumulieren in Lysosomen verschiedenster Gewebe. Mit zunehmender Ablagerung dieser Stoffe im Gefäßendothel und in den Organen kommt es zur Ausprägung der Krankheitssymptome. In der Kindheit beginnt die Erkrankung häufig mit Akroparästhesien und Angiokeratomen. Im weiteren Verlauf treten dann die lebenslimitierenden Manifestationen dieser Erkrankung auf, wie terminale Niereninsuffizienz und, durch Ischämie- und Infarktereignisse, Myokardinfarkt und zerebrale Ischämie. Im Gegensatz zur überwiegenden Mehrzahl anderer X-gebundener Erkrankungen zeigen bei Morbus Fabry nahezu alle heterozygoten Mutationsträgerinnen im Laufe der Zeit klinische Manifestationen dieser Erkrankung, teils in gleich schwerer Form wie männliche Patienten. Da bisherige Hypothesen davon ausgingen, dass eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des mutierten GLA-Allels am Auftreten von Symptomen bei heterozygoten Fabry-Mutationsträgerinnen beteiligt sei, wurden die X-Inaktivierungsmuster von durch Mutationsanalyse gesicherten Morbus Fabry-Patientinnen mit Hilfe des Androgenrezeptor-Tests untersucht. Bei diesem Assay wird genomische DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen inkubiert. Diese verdauen nur die unmethylierte DNA des aktiven X-Chromosoms, so dass in der anschließenden PCR-Amplifikation eines hochpolymorphen CAG-Repeats im Exon 1 des Androgenrezeptor-Gens lediglich Allele des inaktiven X-Chromosoms amplifiziert werden. Nach der automatisierten Auswertung mittels Fragmentanalyse, ermöglicht durch einen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten PCR-Primer, zeigt das Verhältnis der zwei Androgenrezeptor-Allele zueinander die relative Häufigkeit eines jeden Allels auf dem aktiven oder inaktiven X-Chromosom in den Zellen des untersuchten Materials. Erstmals wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die X-Inaktivierungsmuster heterozygoter Mutationsträgerinnen von Morbus Fabry im Vergleich zu einem nichtverwandten Kontrollkollektiv untersucht. 13 (46%) der 28 Fabry-Mutationsträgerinnen zeigten eine random X-Inaktivierung, 10 (36%) eine moderate Verschiebung der X-Inaktivierung und 5 (18%) eine ausgeprägte Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten eines Allels. Es zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied zu den Inaktivierungsmustern gleichaltriger Kontrollen (p = 0,669). Segregationsanalysen konnten anhand der Familien von sechs Frauen mit ausgeprägter oder moderater Verschiebung der X-Inaktivierung durchgeführt werden. Hier zeigte sich bei vier dieser Frauen eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des Wildtyp GLA-Allels, während bei zwei weiteren eine Verschiebung zugunsten des mutierten Allels in Leukozyten erkennbar war. Bei jeder der Fabry-Patientinnen war sowohl der klinische Schweregrad der Erkrankung mittels MSSI (Mainz Severity Score Index), einem detaillierten Scoring-System für Morbus Fabry, als auch die Enzymaktivität der α-Galaktosidase A bestimmt worden. Eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der X-Inaktivierung in Leukozyten heterozygoter Fabry-Mutationsträgerinnen und deren klinischen oder biochemischen Krankheitsparametern konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass heterozygote Fabry-Patientinnen random X-Inaktivierungsmuster ähnlich denen gesunder Frauen aufweisen. Anhand unserer Daten konnte nicht belegt werden, dass das Auftreten und der Schweregrad der Erkrankung bei der Mehrzahl der heterozygoten Fabry-Patientinnen auf eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des mutierten Allels als Pathomechanismus zurückzuführen ist. X-Inaktivierungsstudien können jedoch dazu beitragen, jene Frauen frühzeitig herauszufiltern, welche aufgrund einer bei ihnen möglicherweise rascher progredient verlaufenden Erkrankung von einer sehr teuren Enzymersatztherapie am meisten profitieren könnten.

Das kongenitale zentrale Hypoventilationssyndrom (Undine-Syndrom) ist eine multisymptomale Erkrankung des autonomen Nervensystems, durch Störung der Migration der Neuralleistenzellen, im Rahmen der embryologischen Entwicklung. Klinisches Hauptmerkmal stellt die alveoläre Hypoventilation der Patienten im Schlaf dar. Den Patienten fehlt der Automatismus des Atemantriebs, die Atmung im Wachen ist im klassischen Fall unbeeinträchtigt, nachts ist eine Beatmung erforderlich. Die Diagnosestellung dieses Syndroms, war bislang nur als Ausschlussdiagnose, mit entsprechendem Zeitaufwand und klinischen Belastungen des Patienten, durch invasive Diagnostik möglich. Im Jahr 2003 wurden Mutationen im PHOX2B Gen als ursächlich für das Auftreten eines kongenitalen zentralen Hypoventilationssyndroms nachgewiesen. Es gelang im Rahmen dieser Arbeit, in Anlehnung an ein in der Literatur veröffentlichtes Protokoll, eine genetische Diagnostik des CCHS in unserem Labor zu etablieren. Die initial auch in der Literatur beschriebenen Probleme der Allelverluste im Rahmen der PCR, konnten durch Modifikationen der Methode behoben werden. Zusätzlich wurden die im Gelbild erhobenen Befunde durch Fragmentlängenanalysen und Sequenzierungen des Genabschnittes verifiziert. Es konnten von 2004 bis 2008 bei 12 Patienten Mutationen im PHOX2B Gen nachgewiesen werden. Eine der nachgewiesenen Expansionsmutationen stellt die längste bislang in der Literatur beschriebene Expansion dar. In unserem Patientengut besteht bei 92 % der Patienten eine Mutation im 20 Alanine umfassenden Polyalaninrepeat des PHOX2B Gens. Mit einem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Fragebogen, wurden bei den einsendenden Ärzten Informationen zum Krankheitsbild erhoben. Eine Genotyp--Phänotyp Korrelation konnte nachgewiesen werden. Die genetische Untersuchung ermöglicht somit, neben der reinen Krankheitsdiagnose, auch noch eine prognostische Einschätzung des Krankheitsverlaufes, sowie eine Anpassung weiterer diagnostischer Schritte. Zusammenfassend sind die für das CCHS ursächlichen PHOX2B Mutationen durch eine Mutationsanalyse gut und sicher nachweisbar. Amplifikation und Geldarstellung des Polyalaninrepeats stellen ein methodisch gut durchführbares, und für mögliche Verdachtspatienten kaum belastendes, Verfahren dar. Eine frühe und sichere Diagnosestellung des CCHS und - aufgrund der bestehenden Genotyp-Phänotyp Korrelation - auch eine Prognosebeurteilung, werden hierdurch ermöglicht. Der Status als „Ausschlussdiagnose” mit der Notwendigkeit multipler, belastender und invasiver Diagnostik, ist für das kongenitale zentrale Hypoventilationssyndrom, nach heutigem Stand, nicht mehr gerechtfertigt.

Die Bakteriophagen Integrase PhiC31 stellt ein viel versprechendes Werkzeug zur Integration genetischen Materials im nicht viral-basierten Gentransfer dar. Die PhiC31 Integrase vermittelt die Rekombination von spezifische Erkennungssequenz attB enthaltenden Plasmiden mit natürlich vorkommenden attP Erkennungssequenzen innerhalb des Zielgenoms mit unterschiedlicher Integrationsfrequenz und -spezifität. Nebeneffekte der Integration in Form von insertioneller Mutagenese, wie z.B. große Deletionen und chromosomale Veränderungen im Genom der Zielzelle konnten beobachtet werden. Ziel dieser Dissertation war, die PhiC31 vermittelte Effizienz zu verbessern und die Spezifität zu adressieren. Als Ansatz wurde die Mutagenese der DNA-Bindungsdomäne der Integrase basierend auf Punktmutanten zur verbesserten Integrationseffizienz gewählt. Integrationsassays wurden in verschiedenen humanen Zelllinien durchgeführt. Etablierung von Doppelmutanten, sowie Dosisoptimierung des Integrase kodierenden Plasmids verbesserten die Integrationseffizienz mehr als dreifach, verglichen mit der Wildtypintegrase in den Zelllinien HeLa und HCT. Weitere Assays verglichen die Exzisionsaktivität der Integrasemutanten mit dem Wildtyp. Bei fünf Mutanten wurde eine etwa zweifach erhöhte Exzision gefunden. Die Beurteilung der Spezifität der Integrasemutanten erfolgte durch Substitution der Wildtyp-attP Sequenz mit drei Pseudo attP Erkennungssequenzen des Reporterplasmids, deren erhöhte Spezifität bereits dokumentiert war. Einzelne Mutanten zeigten eine zweifach erhöhte Exzisionsaktivität. Die Rekombinationsaktivität von Integrasemutanten wurde im Kontext chromosomaler DNA mittels einer stabil GFP-exprimierenden Reporterzelllinie, in der die eGFP Expression mittels Integrase-vermittelter „Raus-Rekombination“ eines polyA Stoppsignals angeschaltet wird, untersucht. Auf chromosomaler Ebene wurde keine verbesserte Ausschneidungsaktivität erreicht. Zur Evaluierung der in vivo Effizienz zweier ausgewählter PhiC31 Integrasemutanten, die in vitro erhöhte Integrationsaktivität aufwiesen, wurden zwei Plasmide am C57BL/6 Mausmodell getestet. Reportergen war ein für den humanen Koagulationsfaktor IX kodierendes Gen. In Abhängigkeit von der Integrationseffizienz der Mutanten und des Wildtyps, wurden im Zeitraum von einhundert Tagen ähnliche Expressionslevel gefunden. Die Mutanten zeigten keine Verbesserung der Langzeitexpression von humanem Faktor IX. Die hier durchgeführten Studien zur Mutationsanalyse der Phagenintegrase PhiC31 zeigten einen wirksamen Ansatz zur Verbesserung der PhiC31 Integrase-vermittelten Integrationseffizienz in vitro.

Sat, 13 Feb 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11335/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11335/1/Puerzel_Jana.pdf.pdf Pürzel, Jana ddc:590, ddc:500, Tierärztliche Fakultät

Zusammenfassung Die Protease Separase trägt zur Regulation mitotischer und meiotischer Vorgänge entscheidend bei. Ihre klassische Funktion ist die Induktion der Schwesterchromosomen-trennung durch Spaltung des Cohesin-Proteinkomplexes, der die Schwesterchromatiden von der S-Phase bis zur Mitose gepaart hält. Separase wird am Ende der Metaphase durch Ubiquitin-abhängigen Abbau ihres Inhibitors Securin aktiviert. Ein zweiter Separase-Inhibitionsmechanismus ist die Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 („Cyclin Dependent Kinase 1“). Dafür ist Separase-Phosphorylierung durch Cdk1 notwendig (Stemmann et al., 2001). In vielen Modellorganismen hat Separase Funktionen, die über die Anaphase-Induktion hinausgehen. So trägt sie in S. cerevisiae beispielsweise zur Cdk1-Inaktivierung beim Meiose I-Meiose II-Übergang bei. Diese Separase-Funktion benötigt die proteolytische Separase-Aktivität nicht, ist jedoch abhängig vom Securin-Abbau. Für andere Funktionen der Separase hingegen könnte die Separase-abhängige Spaltung noch nicht identifizierter Substrate notwendig sein. In der vorliegenden Arbeit wird deshalb die Etablierung der IVEC-Methode („In Vitro Expression Cloning“) zur Identifizierung neuer Separase-Substrate vorgestellt. Mittels IVEC wurde - basierend auf der proteolytischen Separase-Aktivität - aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek das In-vitro-Separase-Substrat GASP isoliert. Des Weiteren wurde die Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 näher untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von Separase durch Cyclin B1/Cdk1 für ihre Inhibition zwar notwendig, aber nicht hinreichend ist. Nach Phosphorylierung der Separase assoziiert die Kinase stabil mit der Protease, und erst diese Komplexbildung führt letztendlich zur Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität. Cyclin B1/Cdk1 ist also ein nicht-katalytisch wirkender Separase-Inhibitor. Die zeitlich korrekte Separase-Aktivierung ist für die fehlerlose Chromosomentrennung essentiell. Da Zellen ohne Securin ihre Chromosomen jedoch akkurat und zum richtigen Zeitpunkt trennen, muss es alternative Separase-Inhibitionsmechanismen geben. Die Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1-Bindung könnte dieser gesuchte Securin-unabhängige Mechanismus sein, da der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex in Zellen bereits vor der Anaphase nachgewiesen werden kann und Cyclin B1 - wie Securin - am Ende der Metaphase Ubiquitin-vermittelt abgebaut wird. Securin und Cyclin B1/Cdk1 können nicht gleichzeitig an Separase binden. Die beiden Inhibitoren sind also Komponenten parallel und nicht konvergent wirkender Regulationsmechanismen. Die Phosphorylierung von Separase an Serin 1126 ist für ihre Cyclin B1/Cdk1-abhängige Inhibition essentiell (Stemmann et al., 2001). Daneben konnte in der hier vorgestellten Arbeit eine zweite Domäne in Separase identifiziert werden, die ebenfalls sowohl für die Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität als auch für die Komplexbildung mit Cyclin B1/Cdk1 nötig ist. Da diese zweite Cyclin B1/Cdk1-Bindungsdeterminante Sequenzhomologie zu dem Cdc6-Protein aufweist, wurde sie CLD („Cdc6 Like Domain“) genannt. Cdc6 ist ein konserviertes Protein, das in S. cerevisiae Cdk1-Inhibitionsaktivität besitzt. Dazu bindet es abhängig von der Phosphorylierung seines Aminoterminus direkt an B-Typ-Cycline, die sich im Komplex mit ihren Cdks befinden (Mimura et al., 2004). Durch Phosphatase-behandlung und Mutationsanalyse konnte bewiesen werden, dass die Interaktion zwischen Separase und Cyclin B1/Cdk1 auch von Phosphorylierung der Protease innerhalb ihrer CLD abhängt. Dies legt nahe, dass die Separase-CLD wie der Cdc6-Aminoterminus direkte Kontakte mit der Cyclin-Untereinheit der Kinase ausbildet. Serin 1126-Phosphorylierung ist dagegen indirekt an der Kinase-Bindung beteiligt. Denn erstens wird sie nach der Etablierung des Komplexes für seinen Erhalt nicht mehr benötigt (Holland et al., 2006), und zweitens ist sie für die Wechselwirkung zwischen CLD-enthaltenden Separasefragmenten und der Kinase abkömmlich. Ein zunächst favorisiertes Bindungsmodell, bei dem die Polo-Kinase an phosphoryliertes Serin 1126 bindet, um danach die Bindung von Cyclin B1 durch Phosphorylierung der CLD zu vermitteln, konnte ausgeschlossen werden. Stattdessen bewirkt die Phosphorylierung von Serin 1126 wohl eine Konformationänderung der CLD, die dadurch in die Lage versetzt wird, starke Wechselwirkungen mit der Cyclin B1-Untereinheit der Kinase einzugehen. Überraschenderweise ist im Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex auch die Kinase inaktiv. Diese unerwartete Separase-Funktion als Cdk1-Inhibitor ist in Oozyten der Maus für den Übergang von der Meiose I in die Meiose II von entscheidender Bedeutung. Denn die Inhibition der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplexbildung durch Mikroinjektion entsprechender Antikörper in Maus-Oozyten verhindert den Ausstoß des ersten Polkörpers, d.h., die Eizellen können den Meiose I-Meiose II-Übergang nicht vollziehen. In diesen Oozyten sinkt die Cdk1-Aktivität am Ende der Meiose I nicht wie bei Kontroll-Oozyten ab. Diese persistente Cdk1-Aktivität ist der Grund für den verhinderten Übergang von Meiose I nach -II, da künstliche Cdk1-Inhibition in Anwesenheit des inhibitorischen Antikörpers den Polkörperausstoß wiederherstellt. In mitotischen Zellen steigt der unter endogenen Bedingungen mit Separase assoziierte Anteil von Cyclin B1/Cdk1 in der Anaphase - d.h. nach dem Abbau seines Bindungskompetitors Securin - an. Übertragen auf die Meiose bedeutet das, dass Securin-Abbau die Induktion der Anaphase mit der Separase-abhängigen Cdk1-Inaktivierung koppelt.

Die sporadische Einschlusskörpermyositis (s-IBM) ist eine chronisch progressive, entzündliche Muskelerkrankung. Die Pathogenese der s-IBM ist unklar, es werden verschiedenste Mechanismen diskutiert. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Sequenz des Prion-Gens bei Patienten mit s-IBM stellen in diesem Zusammenhang einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Pathogenese der Erkrankung dar. Es wurden bei 35 s-IBM Patienten die Zygotie am Kodon 129 des Prion-Gens und die Sequenz des Prion- und des aB-Crystallin-Gens untersucht. Dabei fand sich eine signifikante Häufung der Methionin/ Methionin-Homozygotie bei s-IBM-Patienten im Gegensatz zum deutlichen Überwiegen der Methionin/Valin-Heterozygotie bei der gesunden Kontrollpopulation. Außerdem wurde in dieser Arbeit bei einem s-IBM-Patienten eine bis dahin noch nicht beschriebene Mutation H140R im Prion-Gen gefunden. Der Bereich dieses Aminosäureaustausches liegt in einer bei Säugetieren hochkonservierten Region und ist möglicherweise nicht neutral in Bezug auf die Funktion des Prion-Proteins. Die Funktion des aB-Crystallins als Chaperon, welches neben der korrekten Proteinfaltung möglicherweise auch die Umfaltung von Proteinen in pathologische Formen wie z.B. in PrPsc katalysiert, macht dieses Protein interessant im Hinblick auf die Funktion des Prion-Proteins.In der Mutationsanalyse im Rahmen dieser Arbeit wurden sieben Patienten auf Mutationen im gesamten aB-Crystallin-Gen und insgesamt 24 Patienten auf Sequenzabweichungen im dritten Exon untersucht. Es stellte sich heraus, dass es bis auf einen schon bekannten Polymorphismus (A117A) keine weiteren Abweichungen von der Wildtypsequenz gab. Lediglich bei einem Patienten fand sich der A117A-Polymorphismus ohne konsekutiven Aminosäureaustausch.

Bei 28 Patienten mit Prämaturer Pubarche wurde untersucht, ob eine Heterozygotie für 21-Hydroxylase-Mangel als Ursache des symptomatischen Hyperandrogenismus vorläge. Eine Heterozygotie wurde einerseits nach Knorr et al. angenommen, wenn der 17-OHP-Spiegel 60 min. nach ACTH-Stimulation 260 ng/dl überstieg, was bei neun Patienten (32%) der Fall war. Andererseits wurde mittels Sequenzierung des CYP21-Gens überprüft, ob bei diesen Patienten tatsächlich Mutationen nachweisbar wären. Bei keinem der neun Patienten mit pathologischem ACTH-Test konnte eine Mutation gefunden werden. Der ACTH-Test ist demnach bei Patienten mit Prämaturer Pubarche ungeeignet, eine Heterozygotie für CYP21-Mutationen nachzuweisen. Bei einem unserer Patientinnen mit normalem ACTH-Test wurde eine CYP21-Mutation nachgewiesen, was im Rahmen der Heterozygotenhäufigkeit in der Normalbevölkerung liegt. Daher ist eine Heterozygotie für 21-Hydroxylase-Mangel entgegen der bisherigen Meinung keine häufige Ursache der Prämaturen Pubarche. Somit ist eine Dysregulation des P450c17-Enzyms wahrscheinlicher, was einer zukünftigen genaueren Untersuchung bedarf. Ein ACTH-Test ist bei Patienten mit atypischer Prämaturer Pubarche allerdings unbedingt notwendig, um ein homozygotes nicht-klassisches oder Late-onset-AGS auszuschliessen. Unsere Patienten mit erhöhtem 17-OHP-Anstieg unterschieden sich von den anderen durch häufigere begleitend zur Pubesbehaarung aufgetretene Axillarbehaarung, niedrigere Körperhöhe, einen höheren diastolischen Blutdruck, einen erhöhten Leptin-Spiegel und einen durchschnittlich niedrigeren Cortisol-Spiegel. Der basale 17-OHP-Spiegel war bei diesen Patienten allerdings normal, erst nach ACTH-Stimulation fiel das erhöhte 17-OHP auf. Dies rechtfertigt aber nicht die Durchführung eines ACTH-Tests bei Patienten mit typischer Prämaturer Pubarche. Vielmehr ist bei der Untersuchung der Patienten mit Prämaturer Pubarche auf die genannten klinischen Auffälligkeiten zu achten. Insgesamt konnte bei unseren Patienten im Gegensatz zu anderen Studien kein erhöhter BMI und auch keine Erniedrigung des Geburtsgewichts festgestellt werden. Häufig wurde ein fortgeschrittenes Knochenalter festgestellt, was aber aufgrund des gleichzeitig bestehenden Wachstumsvorsprungs nicht zu einer Beeinträchtigung der Endlänge führt. Ausserdem konnte eine erhöhte trabekuläre Knochendichte nachgewiesen werden. Der schon von anderen Autoren beschriebene Hyperandrogenismus mit seinen Folgeerscheinungen war auch bei unseren Patienten nachweisbar: bei 50% bestanden basal erhöhte Androstendion-Spiegel, 14% wiesen eine Hypertrichose, 39% Akne in verschiedenen Schweregraden auf. Auch metabolische Auffälligkeiten von Patienten mit Prämaturer Pubarche bestätigten sich in unserem Kollektiv: 21% zeigten einen erhöhten Gesamtcholesterin-Spiegel, 30% eine pathologische Glucose/Insulin-Ratio als Hinweis auf eine Insulinresistenz. Wir konnten ausserdem erstmals einen insgesamt erhöhten systolischen Blutdruck bei Patienten mit Prämaturer Pubarche messen. Ich empfehle daher eine konsequente und regelmässige Nachuntersuchung von Patienten mit Prämaturer Pubarche über die Pubertät hinaus mit besonderer Beachtung klinischer Zeichen des Hyperandrogenismus wie Akne und Hirsutismus, unter Einschluss von Blutdruckmessung und Bestimmung von Cholesterin und Glucose/Insulin-Ratio zur Stoffwechselüberwachung und frühzeitigen Einschätzung des kardiovaskulären Risikoprofils. Eine Sonographie der Ovarien sollte bei allen Patientinnen aufgrund des durch Hyperandrogenismus und Insulinresistenz erhöhten Risikos eines PCOS zusätzlich in regelmässigen Abständen erfolgen.

Das Dhh1 Protein aus Saccharomyces cerevisiae ist aufgrund von acht hoch konservierten Aminosäure-Motiven als putative RNA Helikase klassifiziert. In S. pombe (Ste13p), Drosophi-la melanogaster (ME31B), Xenopus laevis (Xp54), Mus musculus (mmRCK) und Homo sa-piens (hRCK/p54) findet man Proteine, die zu Dhh1p eine sehr hohe Konservierung von bis zu 83 % aufweisen. Lediglich der N- und C-Terminus dieser Proteingruppe ist nicht konserviert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung der Deletion von DHH1 in Saccharomyces cerevisiae auf verschiedene Aspekte der DNA Schädigung und Reparatur, sowie die Funktio-nalität verschiedener Domänen von Dhh1p durch Mutationsanalysen untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde das DHH1 Gen in verschiedenen Hefestämmen deletiert und die Auswirkungen von DNA schädigenden Substanzen auf diese Mutanten untersucht. Die De-letion von DHH1 führte zu einer starken Erhöhung der Sensitivität von Hefezellen sowohl ge-genüber Bleomycin als auch gegenüber MMS. Allerdings zeigten dhh1D-Zellen nur eine schwache Sensitivität gegenüber UV-Strahlung und keine Sensitivität gegenüber g-Strahlung. Dies weist sehr stark darauf hin, dass die beobachteten Sensitivitäten auf einem eventuell durch Membrandefekte verursachten, sogenannten „uptake“-Phänotyp beruhen. In „uptake“ unabhängigen Experimenten wurde die Funktionalität des Non-homologous End-joining Repa-raturweges der Hefe untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass dhh1D-Stämme eine um den Faktor fünf reduzierte Effizienz in der Rezirkularisierung linearisierter Plasmide zeigen. Allerdings ist nur die Effizienz, nicht die Genauigkeit des End-joining in dhh1D-Stämmen be-troffen – die rezirkularisierten Plasmide wurden zu 100 % genau repariert. Dies weist darauf hin, dass die Deletion sich auf mehr als nur einen einzelnen Aspekt zellulä-rer Vorgänge auswirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die extreme Sensitivität der dhh1D-Stämme gegenüber Ble-omycin und MMS als Testsystem für die funktionelle Charakterisierung verschiedener Dhh1p Domänen verwendet. Dabei zeigte sich, dass eine Deletion des N-Terminus von Dhh1p kaum Einfluss auf die Funktionalität des Proteins hat. Die Deletion des C-Terminus führt zu einer deutlichen Sensitivität der Zellen gegenüber Bleomycin. Bei Deletion beider Termini wachsen die Zellen auf Bleomycin nur noch geringfügig besser als der dhh1D-Stamm. Diese Effekte werden durch Überexpression der verkürzten Proteine aufgehoben. Keine der drei Verkürzun-gen hat Einfluss auf das Wachstum auf MMS-haltigen Platten. Die Mutation der ATPase Domäne (Walker A Motiv) hebt die Funktion des Proteins fast voll-ständig auf. Diese Mutanten sind nahezu so sensitiv gegenüber Bleomycin, wie dhh1D Zellen. Die Überexpression der ATPase Mutante führt im Gegensatz zu den Verkürzungen zu keiner Verringerung der Sensitivität gegenüber Bleomycin. Die zusätzliche Entfernung der Termini in der ATPase Mutante führt nicht zu einer Erhöhung der Bleomycin-Sensitivität. Allerdings zeigt die Dreifachmutante deutlich schlechteres Wachstum auf MMS-haltigen Platten. Die Mutation des SAT-Motives in AAA führt ebenfalls zu einer deutlichen Bleomycin-Sensitivität. Der Phänotyp ist vergleichbar mit den Auswirkungen der Deletion des C-Terminus. Das ur-sprünglich als RNA Entwindemotiv charakterisierte SAT-Motiv wind mittlerweile eher als eine Art „Scharnier“ angesehen, das eine Bewegung der Domänen 1 und 2 im Dhh1 Protein relativ zueinander ermöglicht. Die Auswirkung der Mutation des SAT-Motivs in AAA im Vergleich zu den Verkürzungen und den ATPase Mutanten weist auf eine eher strukturelle Rolle des SAT-Motives in Dhh1p hin. Aus diesen Daten ließ sich ein vorläufiges Modell über die Funktionsweise des Dhh1 Proteins ableiten. In in vitro Experimenten wurde mit dem IMPACT-System aufgereinigtes Dhh1 Protein auf seine Fähigkeit hin untersucht, DNA und RNA zu entwinden. Für die verwendeten Substrate konnte keine in vitro Helikase Aktivität festgestellt werden. Zur Analyse der ATPase Aktivität wurde IMPACT-gereinigtes Dhh1p und durch Immunopräzipitation aus Heferohextrakten ge-wonnenes Protein eingesetzt. In beiden Fällen konnte keine ATP Hydrolyse beobachtet wer-den, obwohl die Mutationsanalyse eindeutig darauf hinweist, dass die ATPase Aktivität essen-tiell für die Funktion des Dhh1 Proteins ist.

Der isolierte 3-Methylcrotonyl-CoA: Carboxylase (MCC) Mangel ist eine angeborene Störung im Abbau der Aminosäure Leucin. Es sind sowohl bis ins Erwachsenenalter asymptomatische als auch frühe letale Verläufe beschrieben. Die Ursachen des variablen Phänotyps sind nicht verstanden. Das Enzym ist zusammengesetzt aus α- und β - Untereinheiten. Die kodierenden humanen Gene MCCA und MCCB wurden kürzlich in unserer Arbeitsgruppe kloniert. Die Erweiterung des Neugeborenen-Screenings mittels Tandem-Massenspektrometrie in Bayern erbrachte die überraschende Erkenntnis, daß der MCC Mangel wahrscheinlich die häufigste organische Azidämie (etwa 1 : 40 000) darstellt und asymptomatische Mutationsträger existieren. Über Risiko und Prognose dieser metabolischen Störung ist derzeit noch keine Aussage möglich. In dieser Arbeit sollte daher eine Methode zur molekulargenetischen Charakterisierung von Patienten mit MCC Mangel etabliert werden, um den prognostischen Wert des Genotyps studieren und damit die Beratung und Betreuung der betroffenen Familien verbessern zu können. Es wurden 3 asymptomatische Patienten aus dem Neugeborenenscreening sowie ein Patient, der mit cerebralen Krampfanfällen aufgefallen war, untersucht. Die Diagnose war bei allen Patienten durch Bestimmung der typischen Metabolite in Urin (3-Hydroxyisovaleriansäure und 3- Methylcrotonylglycin) und Blut (3-Hydroxyisovaleryl-Carnitin) gestellt worden. Für die molekulargenetische Diagnostik des MCC Mangels wurde die Mutationsanalyse auf genomischer und cDNA Ebene für MCCA und MCCB etabliert. Es wurden zwei Patienten mit veränderten Allelen im MCCA- und zwei Patienten mit Mutationen im MCCB-Gen identifiziert. Ein Patient war compound-heterozygot für die Missense-Mutation S535F (1604C>T) und die Nonsense-Mutation V694X (2079delA) im MCCA Gen. Bei einem zweiten Patienten wurde S535F (1604C>T) heterozygot nachgewiesen. Ein Patient mit konsanguinen Eltern war homozygot für die Missense-Mutation S535F (1604C>T). Ein weiterer wies die Missense-Mutation E99Q (295G>C, cDNA: homozygot; gDNA: heterozygot) mit einen Allelverlust auf. In zwei Fällen werden zusätzliche Mutationen in der Promotorregion bzw. in einem Intron angenommen. Für alle gefundenen Mutationen kann von phänotypischer Relevanz ausgegangen werden. Drei davon waren bisher unbekannt und wurden von uns erstbeschrieben. Unsere Ergebnisse bestätigen die Rolle von MCCA und MCCB azielführende Methode zur molekulargenetischen Charkterisierung von Patienten mit MCC Mangel dar und bildet damit die Grundlage für Expressionsstudien und Studien zur Untersuchung der Genotyp-Phänotypkorrelation.ls humane Krankheitsgene. Die hier etablierte Mutationsanalyse stellt eine

Die X-chromosomal gebundene Adrenoleukodystrophie stellt eine vererbte Störung der peroxisomalen ß-Oxidation von Fettsäuren dar, die zu einer Akkumulation von überlangkettigen Fettsäuren in allen Körperflüssigkeiten führt. X-ALD wird durch Mutationen im ALD-Gen verursacht, welches ein peroxisomales Membranprotein aus der Superfamilie der ABCTransporter (ATP-binding cassette) kodiert. Die Erkrankung führt zu einer fortschreitenden Demyelinisierung des ZNS, einer peripheren Neuropathie sowie adrenokortikaler Insuffizienz. Es findet sich jedoch eine sehr hohe Variabilität phänotypischer Verlaufsformen. Aus bislang unklaren Gründen zeigt ein Großteil der heterozygoten Überträgerinnen - im Gegensatz zu der überwiegenden Mehrzahl anderer X-chromosomal vererbter Erkrankungen - sowohl die biochemischen als auch die klinischen Merkmale einer X-ALD in abgemilderter Form. Zur Erklärung dieses Phänomens sollte die Untersuchung der X-Inaktivierung heterozygoter Überträgerinnen beitragen, da in der Vergangenheit postuliert wurde, daß eine zugunsten des mutierten ALD-Allels verschobene X-Inaktivierung (mit-)verantwortlich sei für das Auftreten erhöhter Konzentrationen überlangkettiger Fettsäuren und neurologischer Symptome bei ALDÜberträgerinnen. Zur Untersuchung der X-Inaktivierung wurde der hochinformative Androgenrezeptor-Test etabliert und in einigen Punkten modifiziert und verbessert. Das Testprinzip beruht auf der PCRAmplifikation eines hochpolymorphen CAG-Repeats im Exon 1 des Androgenrezeptor-Gens nach einer Inkubation von genomischer DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen. Die Verwendung eines fluoreszenz-markierten Primers in der PCR ermöglichte eine präzise automatisierte Auswertung mittels Fragmentanalyse. Neben einer Bestimmung der überlangkettigen Fettsäuren im Plasma wurde der Heterozygotenstatus der ALD-Überträgerinnen durch eine Mutationsanalyse des ALD-Gens eindeutig belegt. Dabei konnten in allen 15 untersuchten Familien Mutationen im ALD-Gen identifiziert werden. Bei 8 Familien fanden sich neue, bislang unveröffentlichte Mutationen. Das Mutationsspektrum umfaßte 10 Missense- (67 %), zwei Nonsense- (13 %), zwei Splice-Site- Mutationen (13 %) und eine Frameshift-Mutation (6 %). Die X-Inaktivierungsmuster in Leukozyten heterozygoter ALD-Überträgerinnen wurden erstmals im Vergleich zu einem verwandten und einem nicht-verwandten Kontrollkollektiv untersucht. Bei 7 von 22 Überträgerinnen (32 %) zeigte sich eine ausgeprägte Verschiebung der X-Inaktivierung (Skewing) zugunsten eines Allels (> 80:100). Im Gegensatz dazu war ein ausgeprägtes Skewing weder bei den Nicht-Überträgerinnen aus ALD-Familien noch bei den Kontrollen zu beobachten. In diesen Gruppen fanden sich nur random X-Inaktivierung und mildes Skewing zu annähernd gleichen Teilen. Bei beiden Gruppen glich die Verteilung der XInaktivierungsmuster einer Gauss’schen Normalverteilungskurve. Die Unterschiede zwischen ALD-Überträgerinnen und unverwandtem Kontrollkollektiv erwiesen sich als statistisch hochsignifikant. Eine Korrelation zwischen dem Grad der X-Inaktivierung in Leukozyten heterozygoter ALDÜberträgerinnen und deren biochemischen Parametern (Konzentration überlangkettiger Fettsäuren im Plasma) war nicht nachweisbar. Unsere Daten belegen, daß das häufige Auftreten einer Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten eines Allels bei ALD-Überträgerinnen mit dem mutierten ALD-Allel in Zusammenhang steht und wahrscheinlich durch Selektionsmechanismen verursacht wird. Diese Selektionsmechanismen wirken nach dem primären X-Inaktivierungsprozeß. Andere sekundäre Einflußvariablen wie Alter oder genetische Faktoren des X-Inaktivierungsprozesses selbst wurden mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen. Anhand von Transkriptanalysen in kultivierten Fibroblasten konnte darüberhinaus gezeigt werden, daß einerseits eine Selektion zugunsten des Wildtyp-Allels, andererseits jedoch auch eine Selektion zugunsten des mutierten Allels vorkommt. Der bislang in der Literatur postulierte Selektionsvorteil des mutierten ALD-Allels wird somit in Frage gestellt.