Podcasts about zell zell adh

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist weltweit der zweithäufigste bösartige Tumor. Fernmetastasen eines CRC treten zumeist in Leber und Lunge auf, sind nur in seltenen Fällen operativ entfernbar und sprechen nicht auf derzeit verfügbare Chemotherapien an. Die Identifizierung von Genen und die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, durch welche sie zur Tumorprogression eines CRC beitragen, liefert eine Grundlage für die Prävention oder Behandlung der zumeist tödlich verlaufenden Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des metastatischen Phänotyps in Kolonkarzinomzellen verantwortlich sind. Hierzu wurden mittels der Genchip-Technologie die Transkriptionsprofile von insgesamt fünf Tumor-Zelllinien erstellt und nach stringenten Auswahlkriterien miteinander verglichen. Zuerst wurde ein CRC-Zellmodell verwendet, das aus einer in der Nacktmaus nicht-metastasierenden humanen Primärtumor-Zelllinie KM12C und zwei davon abgeleiteten, stark zur Leber metastasierenden Zelllinien, KM12SM und KM12L4A bestand. In diesem überwiegend isogenen Zellmodell wurden 145 Gene in beiden metastasierenden Zelllinien als dereguliert im Vergleich zu der nicht-metastasierenden Zelllinie identifiziert. Die Transkriptionsprofile eines weiteren humanen CRC-Zellmodells, bestehend aus einer nicht-metastasierenden Zelllinie HCT116 und einer stark zur Lunge metastasierenden Zelllinie HCT116U5.5 wurden ebenfalls verglichen und 72 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Ein Vergleich der Datensätze aller Transkriptionsprofile ermöglichte die Identifizierung von Vimentin und Trop-2 (TACSTD2, „Tumorassoziierter Vermittler von Kalziumsignalen“) als in allen metastasierenden Zelllinien überexprimiert. Die hohe Homologie des bisher noch weitestgehend unerforschten Trop-2 zu Trop-1 (Ep-CAM), einem regulatorischen Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das überwiegend von aggressiven Tumorarten exprimiert wird und die Proliferation von Tumorzellen stimulieren kann, machten Trop-2 für weiterführende Expressions- und Funktionsstudien zu einem interessanten Zielgen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Expressionsstudien in einer Vielzahl von Tumorbiopsien zeigten deutlich erhöhte mRNA- und Proteinspiegel von Trop-2 in Metastasen aus CRC im Vergleich zu den Primärtumorgeweben. Zusätzlich zu diesem neuen Befund in CRC wurde in dieser Arbeit erstmalig eine erhöhte Expression von Trop-2 in Schild-drüsenkarzinomen und in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben nachgewiesen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Trop-2 für die Metastasierung von Karzinomzellen des Kolons wurden stabile Transfektanten für Trop-2 in der nicht-metastasierenden Zelllinie KM12C generiert. Die konstitutiv Trop-2 exprimierenden Zellklone zeigten erhöhte Cyclin D1-Proteinspiegel bei unveränderter Zellproliferation gegenüber den Vektorkontrollen. Die Induktion von Cyclin D1 könnte mit der Identifizierung eines ebenfalls erhöhten Proteinspiegels von ß-Catenin in den Trop-2 exprimierenden Transfektanten in Zusammenhang stehen. Somit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Einfluss von Trop-2 auf den Tcf/ß-Catenin Signalweg. Zusätzlich demonstrierte ein Migrationstest erhöhte mobile Eigenschaften von Trop-2 exprimierenden Zellen in vitro, während sich die invasive Fähigkeit der Transfektanten, in vitro durch eine Matrigelschicht zu wandern, nicht von den Vektorkontrollen unterschied. Die induzierte Expression von Trop-2 in der Mehrzahl von Metastasen des kolorektalen Karzinoms sowie in Tumoren von Lunge und Schilddrüse war eine neue Beobachtung. Diese Ergebnisse demonstrieren das Potential von Hochdurchsatzmethoden wie die hier verwendete Genchip-Technologie in Kombination mit geeigneten Zellmodellen. In der vorliegenden Arbeit führte sie zur Identifizierung von Trop-2 als einen Marker der Tumorprogression und Metastasierung von verschiedenen humanen Karzinomen.

Die Aktivierung von T-Lymphozyten ist ein essentieller Prozeß für die Regulation der adaptiven Immunantwort. Hierbei werden in Folge einer Antigen-Exposition über verschiedene Oberflächenrezeptoren intrazelluläre Signaltransduktionsprozesse initiiert, welche in einer klonalen Expansion von T-Lymphozyten sowie deren Differenzierung zu Effektor- oder Gedächtniszellen resultieren. Die Spezifität dieser Prozesse wird durch die Wechselwirkung zwischen dem jeweiligen T-Zell-Antigenrezeptor (TCR) und einem Antigen-beladenen MHC-Molekül vermittelt, einer Interaktion, die allerdings nicht hinreichend für eine vollständige und dauerhafte Aktivierung der T-Zelle ist. Hierzu ist die Aktivierung sogenannter akzessorischer Oberflächenrezeptoren nötig, welche sowohl zur Verstärkung der Zell-Zell-Adhäsion als auch zur Induktion intrazellulärer Signalwege beitragen. Ein costimulatorisches Signal für naive T-Lymphozyten vermittelt zum Beispiel das CD28-Molekül, wodurch der Übergang dieser Zellen in einen anergischen Zustand verhindert und Zellproliferation ermöglicht wird. Zur Verstärkung der Zell-Zell-Interaktion tragen demgegenüber vor allem Adhäsionsmoleküle wie Selektine, Cadherine und Integrine bei. Der einzige Vertreter der β2-Integrinfamilie auf Lymphozyten, LFA-1, stand im Zentrum der im Folgenden beschriebenen Analysen. Es gab bereits Anhaltspunkte dafür, daß LFA-1 neben seiner Adhäsionsfunktion auch in Signaltransduktionsprozesse involviert ist. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der LFA-1-vermittelten Signalwege bislang unvollständig charakterisiert. Dies liegt vor allem darin begründet, daß eine hochaffine Ligandenbindung erst nach einer Konformationsänderung des Integrins erfolgen kann. Eine solche Aktivierung des Integrins wird beispielsweise durch Stimulation der T-Lymphozyten über den T-Zell-Antigenrezeptor induziert, wodurch sich jedoch LFA-1-abhängige Signale mit denen des TCRs überlagern. Daher wurde im Verlauf der hier vorliegenden Arbeit ein auf Fusionsproteinen basierendes experimentelles System etabliert, welches eine aktivierungsunabhängige Untersuchung der LFA-1-vermittelten Signaltransduktion ermöglicht. Hierdurch wurde gezeigt, daß in humanen T-Lymphozyten die Aggregation der zytoplasmatischen Domäne der Integrin β2-Kette (CD18-Untereinheit) zur Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, zur IL-2-Promotoraktivierung sowie zum Anstiegs des Phosphotyrosingehalts zellulärer Proteine führte. Die Modulation dieser charakteristischen T-Zell- Aktivierungsparameter wird durch die zytoplasmatische Domäne der β2-Untereinheit von LFA-1 induziert, nicht aber durch die intrazellulären Anteile der Integrin αL- bzw. β1-Kette. Weiterhin konnte demonstriert werden, daß ein für die β2-Untereinheit spezifisches NPXFSequenzmotiv für deren Signalfunktion erforderlich ist. Dieselbe Region ist ebenso für die Signaltransduktion des nativen LFA-1-Gesamtmoleküls von elementarer Bedeutung. Überdies zeigten Untersuchungen in TCR-defizienten T-Zellen, daß die Oberflächenexpression des T-Zell-Rezeptors für den LFA-1-induzierten Signalweg essentiell ist. Demgegenüber erfolgte die intrazelluläre Calciummobilisierung durch das CD28-Molekül auch unabhängig von einer Expression des TCRs. Insgesamt konnte durch die vorliegenden Analysen die wesentliche Bedeutung des zytoplasmatischen Anteils der β2-Untereinheit des LFA-1-Integrins für den Prozeß der T-Zell-Aktivierung dokumentiert werden. Darüberhinaus wurde eine bisher unbekannte funktionelle Kooperativität zwischen LFA-1 und Komponenten des T-Zell-Antigenrezeptors aufgezeigt.

Muc18/MCAM/CD146, ein Zelloberflächenglykoprotein von 113 kD, wurde ursprünglich als Melanom-Antigen identifiziert, dessen Expression mit Tumorprogression und der Fähigkeit zur Metastasierung assoziiert ist. Es ist ein Mitglied der Immunglobulinsuperfamilie und vermittelt homotypische und heterophile Adhäsion. Aus diesem Grund wurde vermutet, dass Muc18, wie auch andere Zelladhäsionsmoleküle, der Beginn einer Signalkette ist. Da der zugehörige Ligand immer noch unbekannt ist, wurden zur Untersuchung dieser Vermutung monoklonale α-Muc18-Antikörper verwendet, um die Bindung des Liganden zu imitieren. Nach Kreuzvernetzung von Muc18 in Muc18-Transfektanden und in natürlich Muc18- exprimierenden Melanomzellen mit verschiedenen α-Muc18-Antikörpern konnte kein Calcium-Einstrom festgestellt werden, aber eine Reihe von neu Tyrosin-phosphorylierten Proteinen wurden mittels Western Blot detektiert. Diese lagen bei etwa 50, 70 – 90, 128 und 146 kD. Zwei dieser neu phosphorylierten Proteine wurden als das Adapterprotein p130Cas (crk-associated substrate) und sein Ligand p105CasL identifiziert. Eine Muc18-assoziierte Phosphorylierung von fak („focal adhesion kinase“) und fyn (eine Proteintyrosinkinase der src-Familie) wurde nicht beobachtet. P130Cas und p105CasL, sowie nck, ein weiteres Adapterprotein, wurden mit Muc18, unabhängig von Muc18-Aktivierung, kopräzipitiert. Fak, fyn und Paxillin konnten nicht kopräzipitiert werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der Muc18-Signalweg ähnlich, aber nicht identisch mit dem β1-Integrin-Signalweg ist. Zusätzlich zu diesen zytosolischen Interaktionspartnern konnten noch weitere, im Zellkern wirksame Signalpartner von Muc18 identifiziert werden. Bei transienter Transfektion von Melanomzellen mit Luziferase-Reporterkonstrukten, die jeweils verschiedene Transkriptionsfaktor- responsive Elemente enthielten, führte Kreuzvernetzung von Muc18 zur Aktivierung von CRE (cAMP responsive element) und der NF-κB-responsiven Elemente aus dem ICAM- 1-Promotor. Damit sind wahrscheinlich auch CRE-bindende Proteine und NF-κB am Muc18- Signalweg beteiligt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Bindung von Muc18 an seinen Liganden nicht nur zur Muc18-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion führt, sondern auch zu Veränderungen in der Genexpression und vielleicht zu verstärkter Expression von anderen Zelladhäsionsmolekülen. Somit konnte in dieser Arbeit die Frage, ob Muc18 ein Signalweg-Initiator ist, bejaht, und die ausgelöste Signalkette punktuell aufgeklärt werden.