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Desmosomen sind spezialisierte Haftstrukturen, die die Stabilisierung des Zellverbundes gegenüber Zug- und Scherkräften gewährleisten. Dazu binden desmosomale Cadherine extrazellulär an Haftmoleküle benachbarter Zellen und sind intrazellulär unter anderem über Desmoplakin (DP) und Plakoglobin (PG) an Keratinfilamenten verankert. Insbesondere für das desmosomale Cadherin Desmoglein 3 (Dsg3), das sowohl innerhalb als auch außerhalb der Desmosomen vorkommt, wurde eine wichtige Bedeutung als Adhäsionsprotein in Keratinozyten nachgewiesen. Trotz ihrer Funktion, Widerstand gegen hohe mechanische Belastungen zu vermitteln, sind Desmosomen dynamische Strukturen, die einem stetigen Umbau unterliegen. Die Notwendigkeit einer genauen Regulierung des desmosomalen Auf- und Abbaus wird durch das Vorkommen zahlreicher vererbbarer und autoimmuner Erkrankungen unterstrichen. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen, die der geordneten Assemblierung der Desmosomen und der Disassemblierung nach Störung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung unterliegen, untersucht. Im ersten Teil der vorliegenden Studien standen die Vorgänge der Desmosomenbildung in humanen Keratinozyten im Fokus. Adhärenskontakte und deren Zusammenwirken mit Actinfilamenten spielen eine wichtige Rolle in der Ausbildung der Desmosomen. Für die Actin-Bindeproteine Adducin und Cortactin wurde durch siRNA-Interferenzstudien eine essentielle Funktion für die Vermittlung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung nachgewiesen. Die siRNA-induzierte Depletion von Adducin verursachte eine Reduktion der zytoskelettal-gebundenen Dsg3-Moleküle, was mit einer reduzierten Membranmobiltät korrelierte. Für Cortactin wurde eine direkte Interaktion mit Dsg3 mittels zweier unabhängiger molekularbiologischer Methoden nachgewiesen. Dies deutet auf eine direkte Rolle des Cortactins in der Regulierung der Desmosomen hin. Die siRNA-induzierte Depletion von E-Cadherin führte zum Verlust der membranständigen Lokalisation von Dsg3 und zu einer verminderten Verankerung der Dsg3-Moleküle innerhalb der zytoskelettalen Proteinfraktion. Es wurde ein Signalkomplex aus extradesmosomalen Dsg3, E-Cadherin und der Tyrosinkinase Src identifiziert, dessen Stabilität durch Src reguliert wurde. Hierbei wurden Dsg3 und E-Cadherin an Tyrosinresten durch Src phosphoryliert, deren Aktivität sowohl für die Inkorporation von Dsg3 in die Desmosomen als auch für die Reifung der Desmosomen zu stabilen Haftkontakten essentiell war. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Prozesse der desmosomalen Disassemblierung nach Inkubation mit Pemphigus vulgaris-Autoantikörpern (PV-IgG) analysiert.PV ist eine etablierte Modellerkrankung zur Untersuchung der Desmosomen-vermittelten Zelladhäsion in Keratinozyten. Die Bindung der gegen Dsg1 und Dsg3 gerichteten PV-IgGs induziert eine Reduktion der Dsg3-Proteinmengen und eine Aktivierung verschiedener Signalwege, u.a. von RhoA und PKC. Da diese Signalwege ebenfalls Adducin regulieren und PV-IgGs eine Umorganisierung des Actin-Zytoskeletts verursachen, die durch exogene Aktivierung von RhoA verhindert wird, wurde das Zusammenspiel von PV-IgGs, RhoA und Adducin untersucht. Die protektive Wirkung der RhoA-Aktivierung auf die Zell-Zell-Haftung und die Verteilung von Dsg3 nach Applikation der PV-IgGs war sowohl von der Expression als auch von der Phosphorylierung von Adducin an Serin726 abhängig. Interessanterweise verursachten PV-IgGs über den Ca2+-Einstrom und über PKC, unabhangig von RhoA, eine schnelle Phosphorylierung von Adducin an Serin726. Die durch den Ca2+-Einstrom- und PKC-vermittelte Phosphorylierung von Adducin könnte somit einen Rettungsmechanismus der Keratinozyten darstellen, der in Reaktion auf die PV-IgG-Bindung einsetzt und die desmosomale Assemblierung induziert. Ferner wurde die reduzierte Verankerung der Keratinfilamente an Desmosomen, ein weiteres Merkmal der PV-Pathogenese, mit der Aktivität von PKC korreliert. Keratinfilamente, die einer dynamischen Regulierung durch p38MAPK unterliegen, lösen sich in Reaktion auf PV-IgGs von den Desmosomen und akkumulieren perinukleär. Dieses Phänomen der Zytokeratin-Retraktion wurde durch Inkubation mit Tandempeptid (TP), das die Transinteraktion von Desmogleinen stärkt, verhindert. Zusammenfassend liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Daten neue Erkenntnisse über die Mechanismen des desmosomalen Umsatzes. Adducin und E-Cadherin nehmen eine essentielle Rolle in der Ausbildung und Aufrechterhaltung der desmosomalen Haftstrukturen ein. Untersuchungen der pathogenen Effekte der PV-IgGs unterstreichen die hohe Relevanz eines intakten Actin- und Keratin-Stützgerüsts für die interzelluläre Haftung von Keratinozyten. Diese Befunde könnten in Zukunft auch von medizinischer Relevanz für die Therapie von Pemphigus-Patienten sein.

Die Gegenwart von Kohlenhydraten in biologischen Systemen ist von großer Bedeutung für eine Reihe von zellulären Zyklen, so z.B. die Zell-Zell-Erkennung, die Regulation von Proteinaktivitäten oder die Funktion von Kohlenhydraten als Liganden für die Zelladhäsion. Ferner besitzen eine Reihe von mucinartigen O-Glycanen vielfältige Funktionen in immunologischen Prozessen, welche mit unterschiedlichsten Krankheitsbildern, wie z.B. der Karzinogenese sowie Autoimmun- und Infektionskrankheiten einhergehen. Im Besonderen nehmen viele mucinartige Glycane mit funktionellen Oligosaccharidketten, einschließlich Sialinsäure-tragenden Strukturen wie z.B. Glycophorin, Leukosialin (CD 43 oder auch Sialophorin), Sialyl-Lewis x und Sialyl-Lewis a eine entscheidende Rolle als Liganden in Zell-Zell-Erkennungsmechanismen bei inflammatorischen Prozessen, T-Zell-Differenzierung und Krebsmetastasierung ein. Jüngst wurde eine Reihe innovativer Ansätze für die Immuntherapie von Krebs durch ein besseres Verständnis der abweichenden Glycosylierungsmuster von Glycoproteinen und Glycolipiden auf der Oberfläche von Krebszellen entwickelt, wobei ein Schwerpunkt der Arbeiten auf der Herstellung von kohlenhydrat-basierten Krebsvakzinen ruht. Vor diesem Hintergrund beschäftigt sich die folgende Arbeit mit der Synthese von Epitopen des Sialophorin (CD 43), einem bedeutenden O-Glycan-enthaltenden Sialoglycoprotein, welches auf Leukozyten exprimiert vorliegt und mit einer Reihe von Krankheitsbildern, wie rheumatoider Arthritis, Leukämie, dem Wiskott-Aldrich-Syndrom (WAS) und dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS), einhergeht. Der Aufbau komplexer Hexasaccharid-tragender Glycokonjugate konnte hierbei ausgehend von kommerziell erhältlichen Startmaterialien erfolgen. Im Vordergrund stand dabei die Entwicklung eines biomimetischen Synthesewegs, mit dessen Hilfe neben der natürlichen Struktur auch eine Reihe fluorierter Sialophorin-Derivate mit unterschiedlich fluorierten D-Galactose-Bausteinen in den beiden Trisaccharid-Einheiten hergestellt werden können. Dabei sollten sämtliche Glycosylaminosäuren mit einem zur Festphasensynthese kompatiblen Schutzgruppenmuster ausgestattet vorliegen, um einen Einbau in die N-terminale Partialsequenz des Glycoproteins Sialophorin (CD 43) zu erlauben. Beginnend mit der Synthese der unterschiedlich fluorierten D-Galactose-Derivate, der Glucosamin- und der Sialinsäure-Bausteine sollten die regio- und stereoselektiv notwendigen Di- und Trisaccharid-Bausteine chemisch verknüpft werden. Zu diesem Zweck wurden literaturbekannte Königs-Knorr- und Schmidt-Glycosylierungsreaktionen sowie stereoselektive Sialylierungsreaktionen unter Ausnutzung des Nitrileffekts genutzt. Ein weiterer Meilenstein war die regioselektive Glycosylierung der beiden Trisaccharid-Bausteine zu den geschützten Hexasaccharid-Threonin-Konjugaten, die damit für den Einbau in die N-terminale Partialsequenz des Sialoglycoproteins Sialophorin zur Verfügung stehen. Zudem wurden fluorierte sialylierte Trisaccharid-Threonin-Konjugate in die tandem repeat-Sequenz des epithelialen Mucins MUC1 eingebaut, die als potentielle Kandidaten neuer Antitumorvakzine eingesetzt werden können.

Am 28. Juli 2014 rief die Weltgesundheitsorganisation (WHO) erneut zum World Hepatitis Day auf. Zusammen mit der World Hepatitis Alliance kämpft die WHO für das aktive Einschreiten der Regierungen gegen Infektionserkrankungen auf der ganzen Welt, für bessere Präventionsprogramme und den Zugang zu Impfstoffen und Medikamenten auch für die Menschen in Entwicklungsländern. Ein Hauptvertreter der Krankheit ist das Hepatitis-B-Virus (HBV). Warum hat HBV eine solche Relevanz für die gesamte Weltbevölkerung? Die globale Ausbreitung dieses Erregers ist immens und betrifft zur Zeit etwa zwei Milliarden Menschen. Diese sind an einer akuten oder chronischen Form erkrankt oder haben eine HBV-Erkrankung überstanden. Über 600.000 Menschen sterben jährlich daran. Schätzungsweise 350 Millionen Menschen weltweit leben mit einer chronischen HBV-Infektion und tragen ein sehr hohes Risiko, an Leberzirrhose oder dem hepatozellulärem Karzinom (HCC) zu erkranken (Ott et al., 2012; Teh and Sasadeusz, 2014). Durch die ubiquitäre Verteilung des Virus weisen Regionen wie Südostasien und Subsahara-Afrika eine hohe Prävalenz auf. Weniger als 1 % der Bevölkerung in Westeuropa, Nordamerika und Australien sind Träger einer chronischen Hepatitis-B-Virusinfektion (Janahi, 2014). Trotz der präventiven Impfung und Behandlung von Patienten mit antiviralen Langzeittherapien ist die Entwicklung von Methoden der Resistenzvermeidung und das Aufstellen neuer Konzepte zum Schutz von non-respondern in der Zukunft unumgänglich (Zuckerman, 1996). Nicht nur die Suche nach einem therapeutischen Impfstoff und effizienteren Medikamenten treibt die Forschung voran, auch sind viele Fragen des Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus nur teilweise entschlüsselt. Die Wissenschaft kann noch keine Antwort über den genauen Viruseintritt in die Leberzellen sowie die komplexe Bedeutung der subviralen Partikel geben. Auf diesem Gebiet ist Grundlagenforschung unerlässlich. Für eine gute Replikation benötigt das Hepatitis-B-Virus eine sessile Zelle. Es sind fokale Adhäsionen vorhanden, welche eine entscheidene Rolle bei der Zelladhäsion und Zellwanderung spielen (Gallant et al., 2002). Das Protein Paxillin (PXN) ist ein wichtiger Baustein bei der Koordination der Signaltransduktion zwischen extrazellulärer Matrix (EZM), den fokalen Adhäsionen und dem Aktin-Zytoskelett. Paxillin agiert als Vermittler zwischen vielfältigsten biologischen Makromolekülen (Schaller, 2001; Brown and Turner, 2004). Diese Erkenntnisse sind Ausgangspunkt für die weitere Forschung nach der Verbindung des signaltransduzierenden Adapterproteins Paxillin und dem Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus.

Sat, 20 Jul 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16042/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16042/1/Klose_Natascha.pdf Klose, Natascha

Eine kritische Vorraussetzung für eine effektive Krebstherapie stellt die Identifizierung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) dar. Diese Antigene sollten Peptidsequenzen besitzen, die an MHC-Moleküle binden. Auch sollten diese von Tumorzellen prozessiert und auf MHC-Molekülen präsentiert werden. Ein weiteres TAA-Kriterium stellt die Überexpression im Tumor dar, was eine Erkennung durch T-Zellen ermöglicht und folglich eine Tumor-spezifische Immunantwort nach sich ziehen soll. Bei der B-chronischen lymphatischen Leukämie (B-CLL) wurden bislang nur wenige Tumorantigene identifiziert, die als potentielle Zielstrukturen für eine Generierung einer spezifischen T-Zellantwort in Frage kommen. Daher sind die Bestrebungen groß, neue B CLL-assoziierte Antigene zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden die Moleküle hTERT, CD23 und CD229 hinsichtlich ihrer Möglichkeiten untersucht, als TAAs bei der B-CLL zu fungieren. Die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase Reverse Transkripase (hTERT), stellt ein universelles Tumorantigen dar, das in einer Vielzahl verschiedener Krebstypen, einschließlich hämatopoetischer Erkrankungen, exprimiert wird, jedoch nicht oder nur in geringem Maße bei adulten, gesunden, differenzierten Zellen detektierbar ist. Der humane Niedrig-Affinitätsrezeptor für IgE, auch bekannt als CD23, ist auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen zu finden. Bei der B-CLL wird CD23 konstitutiv exprimiert und atypisch auf den malignen B-Zellen reguliert im Vergleich zu normalen B-Lymphozyten. Dies hat eine starke Überexpression des Moleküls zur Folge. Das Humane Ly9 oder CD229, das Homolog zum murinen Ly9, ist ein Mitglied der SLAM- (signaling lymphocyte activation molecule) Familie, die Singnalrezeptoren repräsentieren. CD229 interagiert mit Antigen-spezifischen Rezeptoren und vermittelt so die Zelladhäsion zwischen Lymphozyten und anderen Zellen. Die Überexpression von CD229 auf hämatopoetischen Zellen wurde in einer Publikation beschrieben, die gezeigt hat, dass 12/15 B-CLL Patienten positiv für das Molekül waren. Ein Merkmal eines Tumorantigens/TAAs stellt die Überexpression in einem Tumor im Vergleich zum Normalgewebe dar. Alle drei Antigene wurden bezüglich ihres Expressionsprofils untersucht, und es konnte eine eindeutige Überexpression verglichen mit normalen Zellen nachgewiesen werden (RT-PCR, FACS-Analysen). Die Immunogenität und MHC-Restriktion (hier HLA-A0201) der ausgewählten Peptide wurde mit Hilfe in vitro generierter zytotoxischer T-Zellen (CTLs) von gesunden Spendern gezeigt, die Antigen-spezifisch durch Stimulation mit autologen, Peptid-beladenen Dendritischen Zellen (DCs) expandiert wurden. Die endogene Prozessierung und Präsentation der potentiellen Tumorantigene, genauer der verschiedenen hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide, konnte mit Hilfe Antigen-spezifischer CTLs von gesunden Spendern nachgewiesen werden, da diese spezifisch die HLA-A0201+ B-Zell-abstammende Zelllinie Ramos, HLA-A0201+ naive B-CLL Zellen und Peptid-beladene T2-Zellen in MHC-I-restringierter Weise erkannten (IFN-γ-ELISPOT Assays, [Cr51]-release Assay). Diese Experimente lassen auf eine natürliche Prozessierung und Präsentation der hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide via HLA-A0201 auf den B-CLL Zellen schließen. Des Weiteren konnten autologe hTERT-, CD23- and CD229-spezifische T-Zellen von B-CLL Patienten in Gegenwart von autologen CD40L-aktivierten B CLL Zellen und interessanterweise auch durch autologe, naive, maligne B-Zellen expandiert werden, die einen deutlichen Anti-leukämischen Effekt zeigten (IFN-γ-ELISPOT Assays, Dimerfärbungen). Ein möglicher Grund für die Generierung einer T-Zellantwort mit autologen naiven B-CLL Zellen als Stimulatoren scheinen das von den B-CLL Zellen vermittelte Mikromilieu (Zytokinprofil) darzustellen. Anhand der Quantität und Qualität der erzielten CTL-Reaktivitäten gegen die drei unterschiedlichen Moleküle zeigte sich, dass vor allem die Oberflächenmoleküle CD229 und CD23 als neue TAAs bei der B-CLL geeignet scheinen. hTERT ist ebenfalls in der Lage, eine Antigen-spezifische T-Zellreaktion zu induzieren, jedoch mit geringerer Effizienz. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD229 und CD23 natürlich prozessiert und als TAAs bei der B-CLL präsentiert werden, die die Expansion autologer Tumor-spezifischer T-Zellen erlauben. Daher stellen sie geeignete Zielstrukturen für T-Zellbasierte, immuntherapeutische Strategien und ein Immunmonitoring bei dieser hämatologischen Erkrankung dar. Für hTERT gilt dies jedoch nur bedingt.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine häufige (10%), spontane, immun-mediierte, wiederkehrende Entzündung des inneren Pferdeauges, die letztendlich zur Erblindung des betroffenen Auges führt. Neben ihrer Bedeutung für die Veterinärmedizin stellt die ERU das einzige spontane Tiermodell für die autoimmun-mediierte Uveitis des Menschen dar, so dass Fortschritte in der Erforschung der ERU auch einen Beitrag für ein besseres Verständnis dieser Erkrankung beim Menschen leisten. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen am Zielorgan, die zur Entstehung der ERU und den rezidivierenden Entzündungsschüben führen, sind bis heute nicht geklärt. Durch seinen unmittelbaren Kontakt zur Retina ermöglicht der Glaskörper einen indirekten Einblick auf die in der Retina ablaufenden pathophysiologischen Prozesse und stellt ein wertvolles Probenmaterial bei der Erforschung vitreoretinaler Erkrankungen wie der ERU dar. Ziel dieser Arbeit war es, Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 119 Glaskörperproteine mittels LC-MS/MS identifiziert. Hiervon konnte durch eine Label-free Quantifizierung für 79 Proteine eine differenzielle Expression nachgewiesen werden. 17 Proteine zeigten eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben von an ERU erkrankten Pferden, wohingegen 62 Proteine in ihrer Expression vermindert waren. Durch die mit der Software STRING (Search Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins) durchgeführte Protein-Interaktionsnetzwerk-Analyse konnten vier Cluster von Proteinen identifiziert werden, die bei der ERU verändert exprimiert werden. Neben einer Gruppe von Plasmaproteinen, einer aus Zelladhäsions-Proteinen bestehenden Gruppe und Proteinen des Wnt-Signalweges wurde erstmalig eine funktionell mit den Matrix-Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 assoziierte Gruppe identifiziert, für deren Vertreter ebenfalls eine differenzielle Expression in der Pferderetina nachgewiesen wurde. Der Wnt-Inhibitor SFRP-2 war in den Glaskörpern von an ERU erkrankten Pferden vermindert nachweisbar und zeigte eine Assoziation mit der Expression seines Interaktors Wnt3a in der gesunden Pferderetina. Mit A2M konnte durch SF-TAP Aufreinigung ein bislang unbekannter Interaktor für SFRP-2 identifiziert und in Bezug zur ERU weiter charakterisiert werden. Für das Protein Osteopontin konnte eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben und Retinae der Kontrollpferde nachgewiesen werden. Rückblickend erwies sich die Protein-Netzwerkanalyse der durch LC-MS/MS identifizierten, differenziell exprimierten Proteine als geeignete Methode, um Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Weitere Experimente sind nun notwendig, um die funktionelle Bedeutung der neu identifizierten Proteine und der mit ihnen assoziierten Signalwege in der ERU zu evaluieren.

Formine spielen eine wichtige Bedeutung bei der Regulierung polarisierter Aktin-gesteuerter Prozesse. Dies betrifft beispielsweise die Zellmigration, den Vesikeltransport, die Morphogenese und die Zytokinese (Faix und Grosse 2006). In früheren Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass das Protein Formin-like 1 (FMNL1) in Zellen von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), anderen Leukämien und Lymphomen und in Zelllinien, die von soliden Tumoren stammen, überexprimiert wird. Im gesunden Gewebe wird es fast ausschließlich in hämatopoetischen Zellen exprimiert. Diese selektive Expression macht FMNL1 zu einem attraktiven Ziel für neuartige Immuntherapien bei malignen und entzündlichen Erkrankungen (Krackhardt, Witzens et al. 2002; Schuster, Busch et al. 2007). In Vorarbeiten der Gruppe wurde ein allorestringierter T-Zellklon mit einem definierten T-Zellrezeptor identifiziert, der ein Peptid von FMNL1 erkennt und eine starke Antitumor-Aktivität gegen Lymphom- und Nierenzellkarzinom-Zelllinien, Epstein-Barr-Virus (EBV)-transformierte B-Zellen und von CLL-Zellen zeigt (Schuster, Busch et al. 2007). Allerdings sind die Funktion und Regulation von FMNL1 – beide wichtig für die Validierung dieses Proteins als Antigen – noch nicht gut untersucht. Frühere Arbeiten haben eine Beteiligung von FMNL1 bei der Neuausrichtung des MTOC (Mikrotubulin-organisierendes Zentrum) in Richtung der immunologischen Synapse und zusätzlich bei der Zytotoxizität von T-Zellen beschrieben (Gomez, Kumar et al gezeigt. 2007). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das murine FRL, das zu 85% homolog zum menschlichen FMNL1 ist, an der Zelladhäsion und Motilität von Makrophagen sowie an der Fc-Rezeptor-vermittelten Phagozytose beteiligt ist (Yayoshi-Yamamoto, et al Taniuchi hat. 2000; Seth, Otomo et al. 2006). Das Ziel dieses Projekts war es, die Funktion von FMNL1 für die weitere Validierung dieses Proteins als mögliche Zielscheibe für neue Anti-Tumor-Therapien zu untersuchen. Wir haben eine neue Spleißvariante (FMNL1) identifiziert, die am C-terminalen Ende ein residuelles Intron aufweist, welches einen Einfluss auf die Diaphanous-autoinhibierende-Domäne (DAD) hat. Im Gegensatz zu anderen FMNL1-Spleißvarianten, die eine zytoplasmatischen Lokalisierung aufweisen, zeigt diese Speißvariante eine kortikale und membranständige Lokalisation in verschiedenen Zelllinien. Eine FMNL1 Mutante, bei der die DAD-Domäne fehlt (FMNL1ΔDAD), weist eine ähnliche Lokalisierung auf. Das weist darauf hin, dass es bei FMNL1 zu einer Deregulierung der Autoinhibition kommt, die zu einer konstitutiv aktiven Form von FMNL1 führt, die möglicherweise bei der zellulären Transformation eine Rolle spielen könnte. FMNL1 und FMNL1ΔDAD können eine polarisierte, nicht mit einer Apoptose-assoziierten Blasenbildung an der Membran hervorrufen, die von Myosin, Aktin undTubulin abhängig ist, aber unabhängig von Src und ROCK zu sein scheint. Wir haben außerdem nachgewiesen, dass FMNL1 als myristoyliertes Protein vorliegt und konnten zeigen, dass die N-terminale Myristoylierung wichtig für die Regulierung der Funktion von FMNL1 ist, indem sie eine schnelle und reversible Membran-Lokalisierung ermöglicht. Des Weiteren haben wir gezeigt, dass FMNL1, das auch am kontraktilen Ring und Kortex von FMNL1-transfizierten mitotischen Zellen lokalsiert ist, die Zellproliferation moderat verstärkt. Eine gemeinsame Lokalisierung von menschlichem endogenem FMNL1 und -Tubulin am Kortex und den mitotischenden Spindeln von sich teilenden T-Zellen weist ebenfalls auf eine Rolle von FMNL1 in der Mitose und dem Zellwachstum hin. Überexpression von FMNL1 konnte eine höhere Konzentration von intrazellulärem freiem Calcium nach Zell-Stimulation induzieren, was auf eine Beteiligung von FMNL1 am Calcium-Signalweg deutet. Unsere Ergebnisse eröffnen neue Einblicke in die Regulation und Funktion von FMNL1 und zeigen dessen Beteiligung an unterschiedlichen Polarisierungsprozessen. Die Identifizierung von Interaktionspartnern von FMNL1 in verschiedenen hämatopoetischen Zellen sowie die weitere funktionelle Charakterisierung der Spleißvarianten wird von besonderer Bedeutung sein, und möglicherweise zur Entwicklung einer spezifischen therapeutischen Beinflussung maligner und entzündlicher Erkrankungen beitragen.

Epilepsien sind die häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen bei Hund, Katze und Mensch. Die bedeutendste Therapieform von Epilepsien ist die langfristige, kausale Pharmakotherapie mit dem Ziel der Anfallsreduktion bzw. Anfallssuppression. Diese zumeist lebenslang andauernde Behandlung mit Antiepileptika ist häufig mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Aus diesen Gründen wäre eine prophylaktische Therapie, die die Entstehung von Epilepsien (Epileptogenese) verhindert, wünschenswert. Die Mehrzahl der Epilepsien wird durch symptomatische Ursachen, wie Schädelhirntraumen oder Schlaganfälle bedingt. Diese initialen Insulte verursachen in der Folge, über nur unzureichend bekannte Mechanismen, die Generierung eines neuronalen Netzwerkes, das die Manifestation einer Epilepsie begünstigt. Verschiedene Untersuchungen der letzten Jahren gaben Hinweise, dass Veränderungen der neuronalen Plastizität insbesondere massive Neuronenverluste sowie eine gestörte Neuronenneubildung eine zentrale Bedeutung im Rahmen der Epileptogenese einnehmen könnten. Bisherige Forschungsarbeiten bestätigen eine Modulatorfunktion des neuronalen Zelladhäsionsmoleküls (NCAM) und des Hormons Erythropoetin (EPO) für die neuronale Plastizität. Auf Grund dessen wurden in dieser Arbeit die Effekte des NCAM-mimetischen Peptids Plannexin sowie der beiden EPO-mimetischen Peptide Epotris und Epobis auf anfallsinduzierte neuronale Veränderungen, insbesondere auf neurodegenerative Vorgänge und auf die Neubildung von Neuronen untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen konnten eine modulierende Funktion des NCAM-mimetischen Peptids Plannexin und des EPO-mimetischen Peptids Epotris auf die neuronale Plastizität insbesondere auf die anfallsinduzierte gestörte Neuronenneubildung demonstrieren. Die dringende Notwendigkeit einer prophylaktischen Therapie ergibt sich vor allem aus der Tatsache, dass ungeachtet einer Vielzahl von Antiepileptika in der Tier- und Humanmedizin etwa ein Drittel aller Veterinär- und Humanpatienten nicht auf eine Pharmakotherapie anspricht. Diese pharmakoresistente Form der Epilepsie stellt ein gravierendes, bisher ungelöstes Problem dar und geht mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Als eine Ursache für das Auftreten von Pharmakoresistenzen bei Epilepsiepatienten wird eine Überexpression verschiedener sogenannter Multidrug-Transporter diskutiert. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (Pgp) wird im Zusammenhang mit transporterbasierten Pharmakoresistenzen bei Epilepsien eine besondere Bedeutung beigemessen. Im Rahmen dieser Dissertation konnte anhand unterschiedlicher Versuchsansätze erstmals in vivo gezeigt werden, dass eine Reduktion der Pgp-Expression in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke mittels RNA-Interferenz möglich ist.

Beim Multiple Myelom sind die Myelomzellen hauptsächlich im Knochenmark lokalisiert, wo sie akkumulieren und durch ihr verdrägendes Wachstum zur Knochendestruktion und Beeinträchtigung der Hämatopoese führen. Die Wechselwirkung zwischen Myelomzellen und Knochenmarkmicroenvironment ist für die Pathogenese und Pathophysiologie des Multiplen Myeloms von entscheidender Bedeutung. In den letzten Jahren haben sich Hinweise gehäuft, dass durch direkten Zell-Zell-Kontakt zwischen Myelomzellen und Knochenmarkstromazellen die Empfindlichkeit der Myelomzellen gegenüber Zytostatika reduziert wird. Die zelladhäsionsvermittelte Chemoresistenz stellt in der Therapie des Multiplen Myeloms eine große Herausforderung dar. Die Fähigkeit der Bisphosphonate, die osteoklastäre Aktivität zu hemmen, hat sie zu einem festen Bestandteil der Myelomtherapie gemacht. Bisphosphonate und Statine greifen in den Mevalonatsignalweg ein und hemmen diesen an unterschiedlichen Stellen. In der Literatur wird beschrieben, dass in adhärenten, de novo resistenten Zellen die HMG-CoA-Reduktase hoch reguliert wird. Basierend auf diesem Phänomen wurde Simvastatin bezüglich einer potentiellen Antimyelomwirkung getestet. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass Statine antiproliferativ wirken und in Myelomzellen Apoptose induzieren. Darüber hinaus überwinden sie im Kokulturmodell die zelladhäsionsvermittelte Chemoresistenz. Dabei wirken Statine in der Kokultur über eine Hemmung des HMG-CoA-Reduktase/GG-PP/Rho/Rho-Kinase-Signalweges. Obwohl bekannt ist, dass Bisphosphonate mit dem Mevalonatsignalweg interferieren, zeigten sie weder in der Monokultur noch in der Kokultur einen Antimyelomeffekt. Da Dosiserhöhungen im Menschen aufgrund der damit einhergehender Nebenwirkungen nicht möglich sind, wurde in der vorliegenden Arbeit Zoledronsäure in Kombination mit Simvastatin in niedrigen, klinisch einsetzbaren Dosen verabreicht. In dieser Zusammensetzung zeigten sie einen synergistischen proapaoptotischen Effekt sowohl in der Monokultur als auch in der Kokultur. Die erhobenen Daten können in der Therapie des Multiplen Myeloms als Grundlage für eine Kombinationschemotherapie aus Bisphosphonaten und Statinen dienen. Die Blockade von CAM-DR durch eine kombinierte Verabreichung von Bisphosphonaten und Statinen könnte auch bei anderen Tumorentitäten zu besseren Therapieergebnissen führen.

Zelladhäsion wird durch definierte Erkennungsepitope der extrazellulären Matrixproteine vermittelt. Diese werden durch Plasmamembranproteine erkannt und gebunden. Unter den Zelladhäsionsrezeptoren dominieren Integrine. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung eines Modellsystems, das eine detaillierte Untersuchung von Zell-Oberflächen-Interaktionensprozessen ermöglicht.

Das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM ist in der Tumorentstehung von Plattenepithelkarzinomen über- oder de novo exprimiert. Zudem korreliert die EpCAM-Expression in Tumorzellen positiv mit Proliferation und Entdifferenzierung. Es wurde in Vorarbeiten ein 1100 bp epcam-Promotorfragment kloniert, das spezifisch in EpCAM-positiven Zellen transkriptionell aktiv ist und durch TNFα in der Promotoraktivität reprimiert wird. In meiner Arbeit untersuchte ich, ob das 1100 bp epcam-Promotorfragment zur gezielten heterologen Genexpression geeignet ist. Zu diesem Zweck wurden drei Proteine ausgewählt: Grünes Fluoreszenz Protein (GFP), TNF receptor associated death domain Protein (TRADD) und Herpes Simplex Virus 1 Thymidinkinase (HSV1-TK). GFP diente der Visualisierung der Promotoraktivität im Fluoreszenzmikroskop. TRADD sollte die Apoptose in EpCAM-positiven Tumorzellen induzieren. Mit Hilfe der spezifischen Expression der HSV1-TK in EpCAM-positiven Zellen sollten Tumorzellen für Ganciclovir sensitiviert werden. Eine Therapie mit Ganciclovir sollte das Absterben der Tumorzellen bewirken. Die heterologe Genexpression wurde an einem zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen getestet. Dabei zeigten EpCAM-positive Zellen eine deutliche GFP-Expression, während EpCAM-negative Zellen sporadisch eine minimale Fluoreszenzintensität aufwiesen. Die EpCAM-spezifische Expression von GFP konnte im Immunoblot bestätigt werden. Um den Zusammenhang zwischen EpCAM- und GFP-Expression zu veranschaulichen, wurden die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen der EpCAM-Oberflächenexpression mit der GFP-Fluoreszenz verglichen. Damit konnte im zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen gezeigt werden, dass die epacm-Promotoraktivität zu einer heterologen Genexpression von GFP führt. Das zelluläre Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen wurde auf die Expression weiterer funktioneller Gene untersucht. Für das Funktionsgen TRADD konnte dabei weder eine EpCAM-spezifische heterologe Genexpression in der RT-PCR noch im Immunoblot nachgewiesen werden. In beiden Untersuchungen führten die Positivkontrollen zu einem Nachweis von TRADD. Da TRADD über komplexe Signalwege zur Bildung von TNFα führen kann, findet möglicherweise eine Inaktivierung des epcam-Promotors durch TNFα statt. Die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors konnte im zellulären Modellsystem in der RT-PCR nachgewiesen und auf die EpCAM-positive Tumorzelllinie SKBR3 übertragen werden. Durch die Genexpression von HSV1-TK wurden EpCAM-positive HEK293 Transfektanten sensitiv gegenüber einer Behandlung mit Ganciclovir und zeigten eine deutlich reduzierte metabolische Aktivität im MTT-Ansatz bei Ganciclovirgabe. Dabei gewonnene Erkenntnisse wurden an der EpCAM-positiven Tumorzellinie SKBR3 bestätigt. Zusammengefasst konnte gezeigt werde, dass die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors zu Ganciclovirsensitivität in EpCAM-positiven Zellen führte, jedoch nicht in EpCAM-negativen Zellen. Somit ist es denkbar, das 1100 bp epcam-Promotorfragment für die therapeutische Genexpression letaler Gene zur Elimination EpCAM-positiver Tumorzellen zu verwenden.

Das Epithelial Cell Adhesion Molecule, kurz EpCAM, ist ein transmembranes Zelladhäsionsmolekül, dessen Expression mit einer erhöhten Proliferation epithelialer Zellen einhergeht. Die veränderten proliferativen Eigenschaften werden durch eine EpCAM-vermittelte Signaltransduktion hervorgerufen, die u.a. die Transkription des Proto-Onkogens c-myc induziert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EpCAM die Transkription weiterer „down stream“-Zielmoleküle reguliert. Die mRNA-Synthese des Transkriptions-faktors Egr-1 wird durch EpCAM reprimiert. Dagegen induziert EpCAM die Transkription der Gene für RhoB und Calmodulin I. Außerdem korreliert in unterschiedlichen Karzinomzelllinien die native EpCAM-Expression mit der Transkriptionsrate von Calmodulin I. Zur Identifikation intrazellulärer Interaktionspartner wurde mit der kurzen zytoplasmatischen Domäne (26 Aminosäuren) von EpCAM ein Two-Hybrid Screening in Hefen durchgeführt. Es konnten 17 potentielle Interaktionspartner aus einer humanen cDNA-Bank identifiziert werden. Für die zwei Signaltransduktions-moleküle FHL2 und Cyclophilin A war es möglich, eine Interaktion mit EpCAM in humanen Zellen nachzuweisen. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass die C-terminale LIM-Domäne von FHL2 für eine Assoziation mit EpCAM notwendig ist. Somit konnte in dieser Arbeit die Grundlage für eine weitere Analyse der EpCAM-vermittelten Signaltransduktion geschaffen werden.

Das Karzinoembryonale Antigen Zelladhäsionsmolekül CEACAM-1 ist an interzellulären Adhäsionen beteiligt und begünstigt die Tumorangiogenese. In dieser Studie wurde die Expression von CEACAM-1 bei operablen nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen und ihr prognostischer Einfluss untersucht. Primärtumoren von 145 Patienten mit operablen nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen wurden mittels eines monoklonalen anti-CEACAM-1 Antikörpers immunhistochemisch untersucht. Die CEACAM-1 Expression wurde in 3 Kategorien eingeteilt: niedrig: £33% gefärbte Tumorzellen, intermediär: >33% und

Molekulare Interaktionen an biofunktionalisierten Grenzflächen werden in zwei Ansätzen analysiert. Zum einen wird an einer artifiziellen Modellmembran mit inkorporierten nativen Zelladhäsionsrezeptoren Integrin alphaV beta3 deren unterschiedliche Bindung an photoschaltbare Peptidliganden mit Oberflächenplasmonen-Fluoreszenzspektroskopie (SPFS) nachgewiesen. Weiterhin wird das Verfahren der SPFS erstmals an lebenden Zellen angewendet, um die Insertion von heterolog exprimiertem Rhodopsin als Modell eines Membranproteins in die Plasmamembran zeitaufgelöst zu detektieren.

Die Beschichtung von glutaraldehydfixierten porcinen Herzklappen mit humanen Endothelzellen konnte bisher nicht befriedigend gelöst werden. In dieser Arbeit wurde die Hydrophilie der zu beschichtenden Matrix mittels einer starken organischen Säure wieder hergestellt und außerdem ein physiologischer Untergrund durch die Vorbeschichtung mit humanen Fibroblasten geschaffen, um eine stabile Zelladhäsion über 21 Tage zu ermöglichen. Indem das Klappenmaterial einer kombinierten Behandlung aus Spülung in M199, Inkubation in 10 %iger Zitronensäure und Beschichtung mit vaskulären Fibroblasten unterzogen wurde, konnte eine stabile Endothelialisierung des Klappenlumens erreicht werden.

Im Rahmen der Arbeit wurde ein zelluläres System etabliert mit dem die transkriptionelle Aktivität des EpCAM-Promotors, ausgehend von der bisherig bekannten Promotorsequenz, beurteilbar ist. Experimentelle Basis war der Luziferase-Assay für den ein Luziferase-Reporterplasmid unter transkriptioneller Kontrolle der bisher bekannten EpCAM-Promotorsequenz generiert wurde. Es konnte mit Hilfe von FACS-Analysen und Immunoblots gezeigt werden, daß sich die gemessene transkriptionelle Aktivität in der tatsächlichen EpCAM-Expression widerspiegelt. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß die kanzeromodulierenden Substanzen TNFalpha und TPA auf den EpCAM-Promotor reprimierend wirken. Im Falle von TNFalpha konnte experimentell belegt werden, daß die Repression über die spezifische Signaltransduktion über den NF-kappa-B-Signalweg zustande kommt, in dem letztlich NF-kappa-B über eine Kompetition um den wichtigen Transkriptionskoaktivator p300/CBP eine Repression des EpCAM-Promotors vermittelt.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Literatur aus vielen aktuellen Forschungsarbeiten zur Entwicklung der Oligodendrozyten und der dabei einwirkenden Faktoren während der embryonalen und frühen postnatalen Phase gesammelt und kritisch ausgewertet. Die Neuronen und Gliazellen des ZNS entstehen im sich entwickelnden Neuralrohr aus multi- bzw. pluripotenten neuroepithelialen Stammzellen. Dabei ist die Genese dieser unterschiedlichen Zellarten einer strengen zeitlichen Regulation unterworfen: zunächst bildet sich die Radialglia aus, die als Leitschiene für die Neuronenmigration fungiert. Nachfolgend entwickeln sich Neuronen, Astrozyten und zuletzt die Oligodendrozyten. Die Ursprungsorte dieser myelinbildenden Zellen sind die ventrikulären bzw. subventrikulären Zonen im ventralen Neuroepithel. Die Hochregulation von Sonic hedgehog, einem Signalprotein, welches von der mesodermalen Chorda dorsalis bzw. der Prächordalplatte exprimiert wird, spielt dabei eine entscheidende Rolle. Es bedingt sowohl die dorsoventrale Segmentierung des Neuralrohres als auch die Entstehung der ersten Oligodendrozyten-Precursorzellen in Interaktion mit einer Vielzahl anderer Einflussfaktoren. Von ihren Ursprungsorten aus besiedeln die Zellen die gesamte weiße und, in geringerem Maße, auch die graue Substanz des ZNS. Dabei müssen teilweise beträchtliche Distanzen überwunden werden. Auch hier ist wiederum das ungestörte Zusammenspiel vieler Faktoren, z. B. Moleküle der extrazellulären Matrix, Zelladhäsionsmoleküle und sekretorische Proteine, erforderlich, um eine physiologische Verteilung der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zu gewährleisten. Zeitgleich entwickeln sich die Precursorzellen über eine Reihe von Differenzierungsstadien weiter bis hin zum reifen, myelinproduzierenden Oligodendrozyten. Über den Nachweis stadienspezifischer Markermoleküle lassen sich die verschiedenen Phasen unterscheiden. Die Differenzierungs- und Proliferationsvorgänge unterliegen ebenfalls der Kontrolle vieler Regulationsmechanismen. Untersuchungen aus jüngerer Zeit zeigten u.a. die Fähigkeit von bereits determinierten Oligodendrozyten-Precursorzellen auf, sich unter bestimmten Bedingungen zu Stammzellen zurück zu entwickeln. Außerdem fanden sich in jüngsten Studien Hinweise auf eine wesentlich engere Verflechtung von Gliazellen und Neuronen als bislang angenommen.

Unzureichende Möglichkeiten in Diagnose und Behandlung von epithelialen Ovartumoren führen zu einer niedrigen Überlebensrate der Patientinnen. Die molekularen Zusammenhänge, die der Progression dieser Krankheit zugrunde liegen, sind noch weitgehend unbekannt und erschweren Verbesserungen in der Früherkennung und Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der Affymetrix Genchip-Technologie die Genexpressionsprofile von elf Ovartumor-Zelllinien mit denen von zwei IOSE-Zelllinien, die aus normalen Epithelzellen des Ovars etabliert wurden, verglichen. So sollten Gene identifiziert werden, welche die Tumorzellen von den normalen Zellen unterscheiden und eventuell als diagnostischer Marker oder als Zielgen für therapeutische Zwecke dienen können. Mit besonderem Augenmerk auf Transmembran- bzw. sezernierte Proteine wurden zunächst 21 bzw. sieben Gene in den beiden Gruppen identifiziert, deren Überexpression in Karzinomen des Ovars zum ersten Mal ermittelt wurde. Die Ergebnisse der Affymetrix-Analyse wurden mittels RT-PCR in sieben ausgewählten Genen bestätigt. Die Expressionsanalysen von drei ausgewählten Genen, NMU, JAG2 und L1CAM, wurden auf Ovartumor-Gewebeproben ausgeweitet und eine mögliche Rolle in der Tumorgenese des Ovarkarzinoms diskutiert. Da für L1CAM spezifische Antikörper zur Verfügung standen, konnte gezeigt werden, dass die Abundanz der L1CAM-mRNA mit der Protein-Abundanz korrelierte und die Lokalisierung in der Zelle wie erwartet in der Plasmamembran erfolgte. Die Expression von L1CAM konnte immunhistochemisch in Paraffinschnitten von Ovarkarzinomen nachgewiesen werden. Zu einem geringeren Prozentsatz konnte das Zelladhäsionsmolekül auch in Borderline-Tumoren, die in der Regel durch eine gute Prognose gekennzeichnet sind, und Fibromen identifiziert werden. In malignen Ovartumoren nicht epithelialer Herkunft konnte keine L1CAM-Expression festgestellt werden. Zeitgleich wurde die Überexpression von L1CAM in Ovarkarzinomen beschrieben und das Molekül als prognostischer Marker in Karzinomen des Ovars, Uterus und des Endometriums identifiziert. Durch funktionelle Analysen sollte die Funktion von L1CAM in Ovartumorzellen untersucht werden. Bei der Klonierung von L1CAM wurde festgestellt, dass aus den verwendeten Ovartumor-Zelllinien nur eine Isoform des Gens isoliert werden konnte, in der die Exons 2 und 27 deletiert sind. In stabilen L1CAMΔ2,27-Transfektanten konnte gezeigt werden, das die Expression dieser Isoform zu erhöhter Adhäsion an Laminin im Vergleich zu Vektor-Transfektanten führt. Die Invasionsfähigkeit der Transfektanten wurde durch die ektopische L1CAMΔ2,27-Expression nicht verändert. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit unter der Verwendung der Genchip-Technologie die zwei potenziellen Markergene NMU und JAG2 identifiziert, die in weiteren Analysen auf ihre Bedeutung in Ovarkarzinomen untersucht werden müssen. L1CAM wurde in immunhistochemischen Studien als Marker identifiziert, dessen prognostischer Wert in Zukunft die Diagnose und Therapie dieser aggressiven Erkrankung verbessern könnte. Zudem bieten die vielfältigen Funktionen von L1CAM Möglichkeiten bei der therapeutischen Intervention durch monoklonale Antikörper, die durch die Expression einer Spleißvariante in Ovartumorzellen spezifiziert werden könnte.

Adhäsionsvorgänge von Leukozyten spielen eine wichtige Rolle bei den verschiedensten biologischen Prozessen. Die Adhäsionsinteraktionen können Signalkaskaden aktivieren, die Funktionen wie die Zellmigration, Proliferation und Reifung von T-Lymphozyten steuern. Die Zellen des Immunsystems müssen schnell auf körperfremde Eindringlinge reagieren können und Adhäsionsvorgänge zwischen Zellen bzw. zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix effektiv regulieren. Um jeden Infektionsherd im Körper zu erreichen, benutzen die Immunzellen die Lymph- und Blutbahnen, können diese Systeme aber verlassen (Diapedese) und durch Gewebe migrieren. Am Infektionsort interagieren die Immunzellen mit infizierten Zellen und starten Vernichtungsprogramme. Weiterhin präsentieren antigenpräsentierende Zellen im Lymphknoten ihre Antigene vorbeiziehenden T-Zellen, die bei korrekter Antigenerkennung zu T-Effektorzellen proliferieren. Bei all diesen regulierten Adhäsionsreaktionen spielen besonders die Integrine eine große Rolle. Von besonderem Interesse ist hierbei das Heterodimer LFA-1 (CD11a/CD18). LFA-1 wird nur auf Leukozyten exprimiert und bindet an die Liganden ICAM-1,-2,-3 der Immunglobulinsuperfamilie. Die kontrollierte Adhäsion bzw. Deadhäsion von Leukozyten bedarf einer spezifischen Regulation des LFA-1-Integrins und die Aufklärung der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge ist von großem Interesse. Die LFA-1-vermittelte Zelladhäsion kann über den intrazellulären Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Cytohesin-1 aktiviert werden. Die Aktivierung wird dabei u.a. über Inositid-abhängige Membranrekrutierung von Cytohesin-1 kontrolliert. In dieser Arbeit wurde ein mit Cytohesin-1 interagierendes Protein, CYTIP, identifiziert, welches durch Cytokine in hämatopoetischen Zellen vermehrt exprimiert wird. CYTIP interagiert über seine „coiled-coil“-Proteininteraktionsdomäne direkt mit der N-terminalen „coiled-coil“-Domäne von Cytohesin-1 und inhibiert vollständig die Zelladhäsion auf Integrinliganden. Aufgrund der zwei Proteininteraktionselemente („coiled-coil“-Domäne, PDZ-Domäne) stellt CYTIP ein Adaptermolekül dar, um verschiedene Signalkomponenten in einem Multiproteinkomplex zu koppeln. CYTIP (Cytohesin-1 interacting protein) stellt eine neue Molekülklasse dar, die durch direkte Interaktion mit Cytohesin-1 die LFA-1 vermittelte Zelladhäsion negativ regulieren kann.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, (i) die regulatorische Funktion bestimmter integraler Membranproteine im Dictyostelium Zytoskelett und (ii) die biochemische Interaktion einer Kinase eines infektiösen Bakteriums mit Aktin aus der Wirtszelle genauer zu analysieren. (i) Die ubiquitären Mitglieder der CD36/LIMPII-Familie sind integrale Membranproteine, die als Lipidrezeptoren und Zelladhäsionsproteine in der Plasmamembran oder - mit bisher unbekannter Funktion - in Membranen endosomaler Vesikel vorkommen. In Dictyostelium discoideum führte die Inaktivierung eines lysosomalen Membranproteins aus dieser Gruppe zur Suppression des Phänotyps einer Profilin-minus Mutante. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des D. discoideum-Genoms konnte festgestellt werden, daß es neben diesem DdLmpA noch die beiden weiteren homologen Proteine DdLmpB und DdLmpC gibt. Da der Mechanismus der Suppression des Profilin-minus Phänotyps ungeklärt ist, wurden die beiden Isoformen im Rahmen der vorliegenden Arbeit genauer charakterisiert. Sowohl für DdLmpB wie auch für DdLmpC konnte die familientypische Membran-Topologie einer Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Dabei weist die zentrale, lumenale Domäne beider Proteine zahlreiche Glykosylierungen auf. Durch Immunofluoreszenz und Saccharosegradienten wurde die Lokalisation der drei Isoformen an endolysosomalen Vesikeln nachgewiesen. Es stellte sich dabei heraus, daß die drei DdLmp-Proteine in unterschiedlichen Vesikelpopulationen auftraten. Auch “pulse-chase“-Experimente mit TRITC-Dextran und nachfolgender Markierung der Vesikel mit DdLmp-spezifischen Antikörpern ergaben unterscheidbare Zeitmuster für die Rekrutierung der Membranproteine in Vesikeln. Die für DdLmpA oft beobachtete Kolokalisation mit Makropinosomen konnte z.B. für DdLmpB und DdLmpC nur selten festgestellt werden. Nach zahlreichen Versuchen und der Konstruktion von verschiedenen Vektoren konnte am Ende der praktischen Arbeiten eine DdLmpB-minus Mutante im Wildtyp-Hintergrund isoliert werden. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Aktin und der Kinase YopO, die durch Yersinia enterocolitica als Effektorprotein in die Wirtszelle transloziert wird, biochemisch genauer untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß G-Aktin und nicht F-Aktin für die Aktiverung der YopO-Kinase verantwortlich ist. Dabei tritt Nichtmuskel-Aktin im Vergleich zum Muskel-Aktin als ein deutlich besserer Aktivator von YopO auf. Obwohl die aktivierte Kinase in vivo das Aktin-Zytoskelett beeinflußt, ist Aktin offensichtlich kein Substrat von YopO. Mittels Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß sowohl die native Kinase YopO als auch das durch Punktmutation inaktivierte YopO K269A die Polymerisierungskinetik von Aktin behindern. Für eine mutmaßliche Aktin-Binderegion von 20 Aminosäuren aus dem C-terminalen Ende konnte hingegen kein Effekt beobachtet werden. Der Einfluß von aktinbindenden Proteinen, aktinmodifizierenden Substanzen und YopO-bindenden GTPasen auf die Aktivierung der Kinase durch Aktin deutet darauf hin, dass die Aktivität der Kinase in der Wirtszelle nicht nur durch Aktin alleine, sondern auch durch weitere Zytoskelett-Komponenten reguliert wird.

Fri, 30 Aug 2002 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/539/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/539/1/Muenz_Markus.pdf Münz, Markus ddc:570, ddc:500

Die Integrinrezeptor-vermittelte Zelladhäsion wird durch intrazelluläre Signalkaskaden kontrolliert. Cytohesin-1 ist ein integrinbindendes Protein und ein Guanin-Nukleotid- Austauschfaktor (GEF). Dieser aktiviert das b2-Integrin LFA-1 und induziert dessen Bindung an ICAM-1. Cytohesin-1 enthält eine PH-Domäne, diese ist an der funktionalen Regulation des Proteins beteiligt und vermittelt die Membranrekrutierung über Phosphatidylinositol- (3,4,5)-trisphosphat, dem Produkt der Phosphatidylinositol-3-Kinase. Die Phosphoinositidvermittelte Membranbindung wird primär von der PH-Domäne bewirkt, jedoch wird diese Funktion von der carboxyterminalen polybasischen c-Domäne gestützt. In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, daß ein Serin/Threonin-Motiv innerhalb dieser c-Domäne durch gereinigte PKCd in vitro und in vivo nach Phorbolesterstimulierung phosphoryliert wird. Biochemische und funktionale Analysen zeigten, daß phosphoryliertes Cytohesin-1 mit dem Aktinzytoskelett assoziiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß durch Phosphorylierung von Cytohesin-1 der Guanin-Nukleotid-Austausch an ARF1 in vitro reguliert wird. ARF-Proteine sind entscheidend an der Zytoskelettreorganisation beteiligt, die während Zelladhäsionsprozessen stattfindet. In Zellen zeigte sich, daß die LFA-1-abhängige Zelladhäsion an ICAM-1 durch phosphoryliertes Cytohesin-1 drastisch gesteigert wird. Zusammengefaßt zeigen diese Erkenntnisse, daß intrazelluläre Signalkaskaden über Phosphatidylinositol-3-Kinase und Protein-Kinase-C in Cytohesin-1 als funktionalem Integrator münden. Cytohesin-1 reguliert über diese Prozesse die b2-Integrin-vermittelte Zelladhäsion von T-Lymphozyten.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK) FGFR4 (Fibroblast Growth Factor Rezeptor 4) in der Tumorentwicklung untersucht. Der FGFR4 besteht aus einer extrazellulären ligandenbindenen Domäne, einer einspännigen Transmembrandomäne und einem intrazellulären Bereich, der neben zwei Kinasedomänen auch eine Reihe von Bindungsmotiven für Adapterproteine mit und ohne enzymatische Aktivität enthält. Die Tyrosinkinase Funktion des FGFR4 wird durch lösliche Liganden, die FGFs, stimuliert. Die häufig starke Aktivität des FGFR4 Gens in Tumorgeweben lässt eine Funktion des FGFR4 in der Tumorentwicklung vermuten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine Mutation in der Transmembrandomäne des FGFR4 nachgewiesen, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 führt (Gly388Arg). Diese Mutation ist homolog zu der seltenen GlycinIn der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK) FGFR4 (Fibroblast Growth Factor Rezeptor 4) in der Tumorentwicklung untersucht. Der FGFR4 besteht aus einer extrazellulären ligandenbindenen Domäne, einer einspännigen Transmembrandomäne und einem intrazellulären Bereich, der neben zwei Kinasedomänen auch eine Reihe von Bindungsmotiven für Adapterproteine mit und ohne enzymatische Aktivität enthält. Die Tyrosinkinase Funktion des FGFR4 wird durch lösliche Liganden, die FGFs, stimuliert. Die häufig starke Aktivität des FGFR4 Gens in Tumorgeweben lässt eine Funktion des FGFR4 in der Tumorentwicklung vermuten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine Mutation in der Transmembrandomäne des FGFR4 nachgewiesen, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 führt (Gly388Arg). Diese Mutation ist homolog zu der seltenen Glycin dem Wildtyprezeptor (Gly388) und der Rezeptormutante. Die in vitro Kinase Assays der MAP-Kinase ERK2, die nach FGFR4 Stimulierung in L6 Myoblasten aktiviert wird, bestätigen diese Ergebnisse. In der Fähigkeit zu migrieren, unterschieden sich Brustkrebszellen, die stabil den mutierten FGFR4 exprimierten, dagegen deutlich von vergleichbaren Zellen, die den Wildtyprezeptor exprimierten. Daneben ergab die cDNA Array Analyse in den oben genannten Brustkrebszelllininen unterschiedliche Expressionsstärken für eine Reihe von Genen, die in der Tumorentwicklung eine bedeutende Rolle spielen. Des weiteren gelang es mit einem Fusionsprotein zwischen der extrazellulären FGFR4 Domäne und dem Glutathion-S-Transferase (GST) Protein eine ungewöhnliche Funktion des FGFR4 in der Zelladhäsion nachzuweisen. Nur wenige RTKs waren bis dahin als Vermittler von Zelladhäsion bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass verschiedene Zelltypen exklusiv auf Zellkulturplatten, die mit dem FGFR4-GST Fusionsprotein beschichtet sind, adherieren können. Im Gegensatz zu früheren Befunden ist dieser Prozess abhängig von zweiwertigen Kationen und kann nicht durch einen Überschuss von löslichen Heparin blockiert werden. Weiterhin konnten die spezifische Bindung von zwei Proteinen, deren Identität noch unbekannt ist, an das FGFR4-GST Fusionsprotein nachgewiesen werden, so dass von einer direkten Wechselwirkung zwischen der extrazellulären Domäne des FGFR4 mit weiteren Molekülen ausgegangen werden kann. Die Untersuchungen ergaben außerdem Hinweise auf eine Intgrin-vermittelte Signalkette, die während der Adhesion an FGFR4-GST induziert wird. Es wurde sowohl die Zunahme der Tyrosinphosphorylierung der “Focal Adhesion Kinase” (FAK) als auch die Aktivierung der MAP-Kinasen ERK2 und JNK gezeigt. Die hier erarbeiteten Daten ermöglichen also, eine Funktion des FGFR4 als morpho-regulatorisches Protein zu diskutieren. Darüberhinaus erlauben die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse erstmals eine Diskussion über die Funktion von Sequenzvarianten im FGFR4 in der humanen Pathogenese und insbesondere in der Tumorprogression. Sie zeigen, dass das vererbte FGFR4 Arg388 Allel mit einer schlechten klinischen Prognose in Brust- und Darmkrebs assoziiert ist und weisen auf einen Mechanismus hin, in dem der klinische Verlauf von Tumorerkrankungen durch vererbliche Parameter moduliert wird.

Das Leukocyten-spezifische Integrin LFA-1 spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort, durch die Vermittlung dynamischer Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen. Die kontrollierte Adhäsion bzw. Deadhäsion von Leukocyten bedarf einer spezifischen Regulation des LFA-1-Integrins und die Aufklärung der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge ist von großem Interesse. Cytohesin-1 war unmittelbar vor Beginn dieser Arbeit als cytoplasmatischer Regulationsfaktor der durch LFA-1 vermittelten Zelladhäsion identifiziert worden und seine spezifische Interaktion mit der cytoplasmatischen Domäne von CD18 konnte in vitro dokumentiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zunächst, die Assoziation von Cytohesin-1 und LFA-1 auch endogen, im intakten Zellverband, mittels Kolokalisationsstudien in der lymphoblastoiden B-Zellinie LCL-721, zu demonstrieren. Ferner konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen die, für die Interaktion kritische Region in der cytoplasmatischen Domäne von CD18 lokalisiert werden. Sie befindet sich im aminoterminalen Bereich und umfaßt die Aminosäuren WKA(723 - 725). Die Mutation dieser Aminosäurereste nach TRG resultierte in einem vollständigen Interaktionsverlust mit Cytohesin-1. Die Inhibition der Cytohesin-1/CD18-Bindung konnte dabei sowohl durch Protein-Protein-Interaktionsanalysen in Hefe als auch durch biochemische Bindungsstudien in vitro dokumentiert werden, wobei jeweils Fusionsproteine der cytoplasmatischen Domäne von CD18 charakterisiert wurden. Funktionale Analysen der WKA(723-725)-Region von CD18 ergaben, daß die Mutation von WKA(723-725) nach TRG im intakten LFA-1-Molekül eine signifikante Reduktion der Integrin- Aktivität zur Folge hatte. Sowohl T-Zellklone als auch nicht hämatopoetische Zellen, wie HeLa, wiesen nach Expression von LFA-1(TRG), mit Hilfe rekombinanter Vaccinia- Viren, eine stark reduzierte Adhäsionsfähigkeit an immobilisiertes ICAM-1 auf. Ferner ergaben funktionale Studien mit HeLa-Zellen, die LFA-1 stabil exprimierten, daß Cytohesin-1 nur dann eine gesteigerte Adhäsion dieser Zellen an ICAM-1 induzierte, wenn sie Wildtyp-LFA-1 exprimierten. HeLa-Zellen, die LFA-1(TRG) exprimierten, ließen sich durch Cytohesin-1 zu keiner verstärkten Adhäsion aktivieren. Diese Ergebnisse demonstrierten die Bedeutsamkeit der Cytohesin-1/CD18-Interaktion für eine effiziente, durch LFA-1 vermittelte Zelladhäsion. Unklar war jedoch der Mechanismus, durch den Cytohesin-1 die Integrin/Liganden-Bindung regulierte. Studien mit dem Reporterantikörper 24 ließen darauf schließen, daß Cytohesin-1 durch die Bindung an CD18 eine Konformationsänderung in der extrazellulären Domäne des LFA-1-Integrins induzieren konnte, die möglicherweise die Affinität des Rezeptors modulierte. Diese Modulation der LFA-1-Konformation schien jedoch nicht hinreichend für eine stabile Bindung an ICAM-1 zu sein, wie eingehendere Analysen von Dr. W. Kolanus zeigten. Vielmehr erforderte eine effiziente Zelladhäsion zusätzlich die Guaninnukleotid-Austauschfunktion (GEF-Funktion) von Cytohesin-1, da die GEF-defekte Punktmutante, Cytohesin-1(E157K), nicht mehr in der Lage war, die Adhäsion von Jurkat E6-Zellen an ICAM-1 stabil zu induzieren. Biochemische Interaktionsstudien konnten dabei zeigen, daß die Mutante weiterhin fähig war, die cytoplasmatische Domäne von CD18 zu binden. Diese und weitere Ergebnisse von Dr. W. Nagel, die einen Zusammenhang zwischen der GEF-Funktion von Cytohesin-1 und dem „Spreading“ von adhärenten Jurkat E6-Zellen aufzeigten, legen die Vermutung nahe, daß Cytohesin-1 durch einen dualen Mechanismus in die LFA-1-Regulation involviert ist. Sowohl die direkte Interaktion von Cytohesin-1 und dem Integrin als auch seine GEF-Funktion stellen essentielle Faktoren für eine stabile Zelladhäsion, die durch LFA-1 vermittelt wird, dar. Welche funktionalen Mechanismen dabei durch den Guaninnukleotid-Austausch und der damit verbundenen Aktivierung einer GTPase induziert werden, ist noch unklar. Primär wäre eine Modulation des Aktin-Cytoskelettes und eine damit verbundene erhöhte laterale Mobilität der Integrine denkbar, die eine verstärkte Rezeptormultimerisierung und dadurch eine Aviditätsänderung des Integrins ermöglicht. Weitere Studien dieser Arbeit analysierten die Regulation von Cytohesin-1 selbst. Es konnte gezeigt werden, daß PI3-Kinase in die Kontrolle der Cytohesin-1-Funktion involviert war. Die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form dieser Kinase (P110*) führte zu einer gesteigerten Adhäsion von Jurkat E6-Zellen an ICAM-1. Eine Inkubation dieser Zellen mit dem PI3-Kinase-spezifischen Inhibitor Wortmannin resultierte dagegen in einer signifikanten Reduktion der Zelladhäsion. Weitere funktionale Analysen, die die Zelladhäsion von Jurkat E6-Zellen nach Koexpression von P110* und der PH-Domäne von Cytohesin-1 untersuchten, sowie eingehendere Studien von Dr. W. Nagel, ermöglichten die Entwicklung eines Modells zur Regulation von Cytohesin- 1. Demzufolge führt die Aktivierung der PI3-Kinase zu einer verstärkten Rekrutierung von Cytohesin-1 an die Plasmamembran. Als Rekrutierungsmodul fungiert dabei die PHDomäne, die durch Bindung von PtdIns(3,4,5)P3, einem Produkt der PI3-Kinase, die Assoziation mit der Membran gewährleistet. Die Rekrutierung von Cytohesin-1 an die Plasmamembran führt zur Aktivierung von LFA-1 und der damit verbundenen stabilen Zelladhäsion an ICAM-1.

Das Kraftmikroskop hat sich in vieler Hinsicht als effizientes Gerät für Untersuchungen und Manipulationen auf molekularer Ebene erwiesen. Dabei wird selbst unter physiologischen Bedingungen eine Auflösung erreicht, die Proteinsubstrukturen erkennen läßt. Als Kraftspektroskop kann es mechanische Eigenschaften wie Dehnungsverhalten und Reißfestigkeit einzelner Moleküle, die zwischen der Sensorfeder und der Unterlage eingespannt werden, untersuchen. Sogar die Bindungskräfte zwischen einem Molekül am Kraftsensor und einem anderen am Substrat können mittels Kraftspektroskopie mit etwa 3 pN Genauigkeit ermittelt werden. Von besonderem Interesse solcher Untersuchungen sind Moleküle mit spezifischer Affinität nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip, wie Rezeptor-Ligand- Systeme und Adhäsionsmoleküle. Bisher waren hauptsächlich wasserlösliche Moleküle solchen Messungen zugänglich. Bindungen zwischen amphiphilen Proteinen oder Membranproteinen zu messen, die durch hydrophobe Wechselwirkungen in der Membran verankert sind, erfordert neue Konzepte. Diesen Molekülen gilt das Augenmerk dieser Arbeit. Da die Verankerung in sogenanten „supported bi-layern“ und Vesikeln nicht immer zum gewünschten Erfolg führt, wird hier eine ungewöhnliche, aber sehr natürliche Alternative vorgestellt: Das Adhäsionsmolekül wird nicht aufwendig isoliert und der Meßmethode zugänglich gemacht, sondern bleibt in seiner natürlichen Umgebung, der Zelle, wohingegen die Methode angepasst wird. Dies ist durch die Befestigung einer Zelle am Kraftsensor eines Kraftspektroskopes geglückt und es gelang damit erstmals die Adhäsionskraft eines einzelnen Adhäsionsmoleküls in einer lebenden Zelle zu messen. So einfach diese Methode beschrieben ist, so viele Unwägbarkeiten treten dabei durch die hohe Komplexität der Zelle und der Zelloberfläche im Besonderen auf. Daher wird einleitend eine grobe Einführung in die Funktionen und den Aufbau einer Zelle und die üblichen Meßmethoden im Bereich der Zelladhäsionsmessung vorgestellt. Die Beschreibung der Meßmethode und der Umrüstung des Kraftmikroskopes zum Zelladhäsionskraftspektroskop sind durch technische Details im Anhang vervollständigt. Etwas aufwendig ist die Zusammenstellung der Daten, Theorien und Annahmen zum Aufbau eines semi-empirischen Modells zur Beschreibung der Adhäsionskraftmeßkurven beim Trennen adhärierender Zellen, auf der Basis vieler unabhängiger Einzelmolekülbindungen. Mit dem Zelladhäsionkraftspektroskop wurden dafür die Youngs-Moduli und die viskoelastischen Kelvin-Modell-Parameter verschiedener Zellen in dem eigens entwickelten „visko-elastic-response-mode“ vermessen. Ebenso wurden die Einflüsse der Zellkontaktkraft und der Kontaktzeit, sowie der Zuggeschwindigkeit auf die Zelladhäsionsantwort studiert und in Formeln gefaßt. Das Modell simuliert diese Meßdaten in guter Übereinstimmung und gibt dadurch einen Einblick in die physikalischen Randbedingungen für das einzelne Adhäsionsmolekül während solcher Experimente unter Berücksichtigung des zelltypischen Phänomens der Tetherbildung. Insbesondere kann damit die Bindungsdichte bei Adhäsionen auf verschiedenen Oberflächen berechnet werden. Demnach schließt eine Epithelzelle etwa vier Bindungen pro Quadratmikrometer mit einer Glasoberfläche, zwei mit einer anderen Epithelzelle und nur 0,8 mit einer passivierten Oberfläche. Mit kraftspektroskopischen Messungen der Adhäsionskräfte bei der Einnistung eines Trophoblasten in die Gebärmutter an einem naturnahen Laborsystem kann eine andersartige - mit dem Modell unabhängiger Bindungen nicht beschreibbare - Wechselwirkung identifiziert werden. Die Meßergebnisse deuten auf einen kooperativen Prozeß der molekularen Adhäsionsinselbildung hin. Kontrollmessungen an funktionalisierten Oberflächen erhärten diese Hypothese. Mit ersten Ergebnissen von Adhäsionsmessungen zwischen Knochenzellen und potentiellen Implantatoberflächen wird neben dem Einfluß der Oberflächenbeschaffenheit auch der des Meßmediums nachweisbar, wodurch die Generalität dieser Methode verdeutlicht wird. Im letzten Kapitel über die Interaktionen einzelner Zellen wird anhand der induzierten Lektinwechselwirkung zwischen roten Blutkörperchen die prinzipielle Möglichkeit der Zelladhäsionskraftspektroskopie Einzelmolekülereignisse zu vermessen nachgewiesen. Die dafür nötigen geringsten Kontaktkräfte von unter 40 pN, konnten durch extrem weiche Kraftsensoren (

Muc18/MCAM/CD146, ein Zelloberflächenglykoprotein von 113 kD, wurde ursprünglich als Melanom-Antigen identifiziert, dessen Expression mit Tumorprogression und der Fähigkeit zur Metastasierung assoziiert ist. Es ist ein Mitglied der Immunglobulinsuperfamilie und vermittelt homotypische und heterophile Adhäsion. Aus diesem Grund wurde vermutet, dass Muc18, wie auch andere Zelladhäsionsmoleküle, der Beginn einer Signalkette ist. Da der zugehörige Ligand immer noch unbekannt ist, wurden zur Untersuchung dieser Vermutung monoklonale α-Muc18-Antikörper verwendet, um die Bindung des Liganden zu imitieren. Nach Kreuzvernetzung von Muc18 in Muc18-Transfektanden und in natürlich Muc18- exprimierenden Melanomzellen mit verschiedenen α-Muc18-Antikörpern konnte kein Calcium-Einstrom festgestellt werden, aber eine Reihe von neu Tyrosin-phosphorylierten Proteinen wurden mittels Western Blot detektiert. Diese lagen bei etwa 50, 70 – 90, 128 und 146 kD. Zwei dieser neu phosphorylierten Proteine wurden als das Adapterprotein p130Cas (crk-associated substrate) und sein Ligand p105CasL identifiziert. Eine Muc18-assoziierte Phosphorylierung von fak („focal adhesion kinase“) und fyn (eine Proteintyrosinkinase der src-Familie) wurde nicht beobachtet. P130Cas und p105CasL, sowie nck, ein weiteres Adapterprotein, wurden mit Muc18, unabhängig von Muc18-Aktivierung, kopräzipitiert. Fak, fyn und Paxillin konnten nicht kopräzipitiert werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der Muc18-Signalweg ähnlich, aber nicht identisch mit dem β1-Integrin-Signalweg ist. Zusätzlich zu diesen zytosolischen Interaktionspartnern konnten noch weitere, im Zellkern wirksame Signalpartner von Muc18 identifiziert werden. Bei transienter Transfektion von Melanomzellen mit Luziferase-Reporterkonstrukten, die jeweils verschiedene Transkriptionsfaktor- responsive Elemente enthielten, führte Kreuzvernetzung von Muc18 zur Aktivierung von CRE (cAMP responsive element) und der NF-κB-responsiven Elemente aus dem ICAM- 1-Promotor. Damit sind wahrscheinlich auch CRE-bindende Proteine und NF-κB am Muc18- Signalweg beteiligt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Bindung von Muc18 an seinen Liganden nicht nur zur Muc18-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion führt, sondern auch zu Veränderungen in der Genexpression und vielleicht zu verstärkter Expression von anderen Zelladhäsionsmolekülen. Somit konnte in dieser Arbeit die Frage, ob Muc18 ein Signalweg-Initiator ist, bejaht, und die ausgelöste Signalkette punktuell aufgeklärt werden.

Methoden der multidimensionalen konfokalen Mikroskopie wurden für die in vivo Beobachtung dynamischer Prozesse in der Amöbe Dictyostelium discoideum verwendet. Um diese Vorgänge sichtbar zu machen, wurde Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter von Genexpression und als Fusionsprotein eingesetzt. Mit Hilfe von 4D-Mikroskopie und Mehrkanal-Detektion konnten dabei in vivo die Zellsortierung in vielzelligen Aggregaten und die intrazelluläre Lokalisierung des Zytoskelett-Proteins Severin visualisiert und analysiert werden. Es wurde eine Methode entwickelt, spektral unterschiedliche GFP-Varianten im Konfokalmikroskop simultan zu detektieren und verläßlich zu trennen. Aufgrund der Anregungswellenlänge und der Verwendung nur eines Aufnahmevorgangs zur Erfassung beider GFP-Varianten eignet sich dieser Ansatz zur schonenden Beobachtung lebender Zellen auch über längere Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen darüber hinaus die Verwendung dieser Konfiguration bei den wiederholten Aufnahmen einer 4D-Messung. In D. discoideum-Slugs wurde die Lokalisierung von Prestalk-Zellen (pstA- und pst0-Zellen) während der Migration und der Spitzenneubildung mit GFP als Reporter für spezifische Genexpression untersucht. In migrierenden Slugs fallen Prestalk-Zellen aus dem pstA-Bereich der Spitze in den Prespore-Bereich zurück. Dieses Zurückfallen in der zentralen Längsachse läßt sich durch die Organisation der Spitzenregion durch cAMP-Spiralwellen mit einem Zentrum in der Längsachse erklären. Prestalk-Zellen gelangen über diesen Weg aus der Spitze in den Prespore-Bereich. An der Neubildung von Spitzen im Prespore-Bereich sind ehemalige Prestalk-Zellen gemeinsam mit den Anterior-like-Zellen des Prespore-Bereichs maßgeblich beteiligt. Diese Zelltypen bewegen sich an die Slugoberseite und bilden dort rotierende Zentren, aus denen sich neue Spitzen bilden. Das Verhalten dieser Zellgruppen und die 4DTrajektorien einzelner Zellen deuten auf eine Organisation dieser Zentren durch cAMPSignale. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß es innerhalb dieser Zellen Gruppen gibt, die zu unterschiedlichen Zeiten in neue Spitzen rekrutiert werden. PstA-Zellen sind in neuen Spitzen wieder im vordersten Bereich lokalisiert, obwohl sie aus dem Prespore-Bereich kommen, während pst0-Zellen im gesamten Prestalk-Bereich zu finden sind. Artspezifische Zellsortierungsprozesse gemeinsam vorkommender Dictyostelium-Arten wurden mittels der Markierung von Zellen der beteiligten Arten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Sortierung von D. discoideum/D. mucoroides-Mischungen schon in den Aggregationsströmen anfängt und im Mound abgeschlossen wird. Die Trennung erfolgt über Unterschiede in der Zelladhäsion. Erheblich beschleunigt wird dieser Sortierungsvorgang durch die gerichtete chemotaktische Bewegung beider Arten auf dieselben Signale, die bei den sich in den Zellströmen schneller bewegenden D. mucoroides-Zellen zu einer Anreicherung im Moundzentrum führt. Somit sind in vivo zwei Faktoren gemeinsam für die artspezifische Sortierung von D. discoideum und D. mucoroides verantwortlich. In Mischungen von D. discoideum und Polysphondylium spec. geschieht die Aussortierung über die Nutzung unterschiedlicher Botenstoffe für die Chemotaxis, so daß die Arten getrennt aggregieren. Es konnte gezeigt werden, daß diese getrennte Aggregation sehr spezifisch ist und es dennoch zu einer Interaktion zwischen D. discoideum und fortgeschrittenen Polysphondylium-Aggregaten kommt, da in Polysphondylium in späten Aggregationsphasen cAMP für die interzelluläre Kommunikation verwendet wird. In dieser Phase wird von Polysphondylium sowohl cAMP als auch Glorin sekretiert. Severin ist ein mit Gelsolin verwandtes 40 kDa Protein, das F-Aktin-Filamente fragmentiert und an das (+)-Ende des entstehenden Fragments bindet. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurde die intrazelluläre Lokalisierung dieses Proteins in vivo während einer Vielzahl zellulärer Aktivitäten untersucht. Severin ist in den aktiven Bereichen des F-Aktin Zellkortex angereichert. Obwohl die Morphologie von D. discoideum-Zellen in den verschiedenen Phasen der Entwicklung sehr unterschiedlich ist, ist die Lokalisierung von Severin in allen Stadien primär von der Bildung neuer Zellfortsätze trennbar. Die Anreicherung von Severin ist hingegen mit der Bewegung der Zelle in diese neu gebildeten Fortsätze assoziiert. Erstmals wurde im Rahmen dieser Arbeit der Effekt von cAMP-Signalen auf das Zytoskelett einzelner Zellen in Aggregationsströmen ausführlich dargestellt.

In dieser Arbeit werden Anwendungen der Kraftspektroskopie zur Erforschung und Anwendung von nicht-kovalenten biologischen Bindungen vorgestellt. Analysiert wurde die Bindungsstärke einzelner Rezeptor-Ligand Bindungen und die Wechselwirkung von Zellmonolayern. Als Anwendung der molekularen Erkennung wird die Lokalisation von Zellen auf Grund ihrer spezifischen Wechselwirkung vorgestellt. Durch den Vergleich der Bindungskräfte mehrerer Rezeptoren zu einem Liganden lassen sich Aussagen über die biologische Wirkung und Aufgabe einer Rezeptor-Ligand Bindung treffen. Die Analyse der Trennkurven von biologisch relevanten Zell/Zellmonolayer- oder großflächigen Zell/Protein-Kontakten ergeben Einblicke in zeitliche Abläufe und involvierte Proteine bei der Zelladhäsion. • Dynamische Kraftspektroskopie mit drei verschiedenen Lektinen und zwei Liganden zeigten, daß die jeweilige Bindungskraft in dem experimentell zugänglichen Bereich der Ladungsrate über 3 Größenordnungen (100-10000 pN/sec) eine lineare Abhängigkeit vom Logarithmus der Ladungsrate aufweist. Zusätzlich sind die einzelnen Rezeptor-Ligand Systeme auf Grund ihrer Bindungsstärke bei Ladungsraten größer als 700 pN/sec eindeutig zu unterscheiden. Die Bindungsstärke, die für das schwächste Paar 34 pN und für das stärkste 58 pN bei 3000 pN/sec Ladungsrate beträgt, läßt sich in Relation zur biologischen Wirkung setzen. • Mit Monte Carlo und Wahrscheinlichkeitsdichte Simulationen konnte wegen der experimentell gemessenen linearen Abhängigkeit der Bindungskraft vom natürlichen Logarithmus der Ladungsrate die Breite oder Reichweite des Bindungspotentials der jeweiligen Rezeptor-Ligand Bindung bestimmt werden (4-10 Å). Die für die verschiedenen Bindungen durchgeführten Simulationen zeigten, daß die berechnete Breite des Potentials reziprok mit der gemessenen Dynamik der Bindungsstärke korreliert. • Am Beispiel von Uterusepithel- und Trophoblastzellen wurde gezeigt, daß mit dem Kraftmikroskop die Bindungsfähigkeit von Zellen gemessen werden kann. Experimente mit verschiedenen Modelloberflächen und die Variation der Kontaktzeit machten deutlich, daß die Präsenz von Rezeptoren für Zelladhäsionsproteine, wie z.B. Integrine für Fibronektin, in der apikalen Membran und Kontaktzeiten länger als 20 min die notwendige Voraussetzung für stabile interzelluläre Kontakte zwischen Epithelzellen sind. Für kürzere Kontaktzeiten ist ein Modell mit nicht vernetzten, membrangebundenen Bindungspartnern und deren möglicher viskoser Anbindung an die Zelle erstellt worden. • In einem gemischten Zellmonolayer aus Erythrozyten der Blutgruppe A und O, sind die Zellen der Gruppe A, auf Grund der spezifischen Wechselwirkung mit dem funktionalisierten Kraftsensor, mit einer Affinitätsabbildung lokalisiert worden. Die spezifische Lokalisation von Liganden an lebenden Zellen mit dem Kraftmikroskop ist demnach mit dieser Technik möglich.