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Unzureichende Möglichkeiten in Diagnose und Behandlung von epithelialen Ovartumoren führen zu einer niedrigen Überlebensrate der Patientinnen. Die molekularen Zusammenhänge, die der Progression dieser Krankheit zugrunde liegen, sind noch weitgehend unbekannt und erschweren Verbesserungen in der Früherkennung und Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der Affymetrix Genchip-Technologie die Genexpressionsprofile von elf Ovartumor-Zelllinien mit denen von zwei IOSE-Zelllinien, die aus normalen Epithelzellen des Ovars etabliert wurden, verglichen. So sollten Gene identifiziert werden, welche die Tumorzellen von den normalen Zellen unterscheiden und eventuell als diagnostischer Marker oder als Zielgen für therapeutische Zwecke dienen können. Mit besonderem Augenmerk auf Transmembran- bzw. sezernierte Proteine wurden zunächst 21 bzw. sieben Gene in den beiden Gruppen identifiziert, deren Überexpression in Karzinomen des Ovars zum ersten Mal ermittelt wurde. Die Ergebnisse der Affymetrix-Analyse wurden mittels RT-PCR in sieben ausgewählten Genen bestätigt. Die Expressionsanalysen von drei ausgewählten Genen, NMU, JAG2 und L1CAM, wurden auf Ovartumor-Gewebeproben ausgeweitet und eine mögliche Rolle in der Tumorgenese des Ovarkarzinoms diskutiert. Da für L1CAM spezifische Antikörper zur Verfügung standen, konnte gezeigt werden, dass die Abundanz der L1CAM-mRNA mit der Protein-Abundanz korrelierte und die Lokalisierung in der Zelle wie erwartet in der Plasmamembran erfolgte. Die Expression von L1CAM konnte immunhistochemisch in Paraffinschnitten von Ovarkarzinomen nachgewiesen werden. Zu einem geringeren Prozentsatz konnte das Zelladhäsionsmolekül auch in Borderline-Tumoren, die in der Regel durch eine gute Prognose gekennzeichnet sind, und Fibromen identifiziert werden. In malignen Ovartumoren nicht epithelialer Herkunft konnte keine L1CAM-Expression festgestellt werden. Zeitgleich wurde die Überexpression von L1CAM in Ovarkarzinomen beschrieben und das Molekül als prognostischer Marker in Karzinomen des Ovars, Uterus und des Endometriums identifiziert. Durch funktionelle Analysen sollte die Funktion von L1CAM in Ovartumorzellen untersucht werden. Bei der Klonierung von L1CAM wurde festgestellt, dass aus den verwendeten Ovartumor-Zelllinien nur eine Isoform des Gens isoliert werden konnte, in der die Exons 2 und 27 deletiert sind. In stabilen L1CAMΔ2,27-Transfektanten konnte gezeigt werden, das die Expression dieser Isoform zu erhöhter Adhäsion an Laminin im Vergleich zu Vektor-Transfektanten führt. Die Invasionsfähigkeit der Transfektanten wurde durch die ektopische L1CAMΔ2,27-Expression nicht verändert. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit unter der Verwendung der Genchip-Technologie die zwei potenziellen Markergene NMU und JAG2 identifiziert, die in weiteren Analysen auf ihre Bedeutung in Ovarkarzinomen untersucht werden müssen. L1CAM wurde in immunhistochemischen Studien als Marker identifiziert, dessen prognostischer Wert in Zukunft die Diagnose und Therapie dieser aggressiven Erkrankung verbessern könnte. Zudem bieten die vielfältigen Funktionen von L1CAM Möglichkeiten bei der therapeutischen Intervention durch monoklonale Antikörper, die durch die Expression einer Spleißvariante in Ovartumorzellen spezifiziert werden könnte.

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist weltweit der zweithäufigste bösartige Tumor. Fernmetastasen eines CRC treten zumeist in Leber und Lunge auf, sind nur in seltenen Fällen operativ entfernbar und sprechen nicht auf derzeit verfügbare Chemotherapien an. Die Identifizierung von Genen und die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, durch welche sie zur Tumorprogression eines CRC beitragen, liefert eine Grundlage für die Prävention oder Behandlung der zumeist tödlich verlaufenden Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des metastatischen Phänotyps in Kolonkarzinomzellen verantwortlich sind. Hierzu wurden mittels der Genchip-Technologie die Transkriptionsprofile von insgesamt fünf Tumor-Zelllinien erstellt und nach stringenten Auswahlkriterien miteinander verglichen. Zuerst wurde ein CRC-Zellmodell verwendet, das aus einer in der Nacktmaus nicht-metastasierenden humanen Primärtumor-Zelllinie KM12C und zwei davon abgeleiteten, stark zur Leber metastasierenden Zelllinien, KM12SM und KM12L4A bestand. In diesem überwiegend isogenen Zellmodell wurden 145 Gene in beiden metastasierenden Zelllinien als dereguliert im Vergleich zu der nicht-metastasierenden Zelllinie identifiziert. Die Transkriptionsprofile eines weiteren humanen CRC-Zellmodells, bestehend aus einer nicht-metastasierenden Zelllinie HCT116 und einer stark zur Lunge metastasierenden Zelllinie HCT116U5.5 wurden ebenfalls verglichen und 72 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Ein Vergleich der Datensätze aller Transkriptionsprofile ermöglichte die Identifizierung von Vimentin und Trop-2 (TACSTD2, „Tumorassoziierter Vermittler von Kalziumsignalen“) als in allen metastasierenden Zelllinien überexprimiert. Die hohe Homologie des bisher noch weitestgehend unerforschten Trop-2 zu Trop-1 (Ep-CAM), einem regulatorischen Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das überwiegend von aggressiven Tumorarten exprimiert wird und die Proliferation von Tumorzellen stimulieren kann, machten Trop-2 für weiterführende Expressions- und Funktionsstudien zu einem interessanten Zielgen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Expressionsstudien in einer Vielzahl von Tumorbiopsien zeigten deutlich erhöhte mRNA- und Proteinspiegel von Trop-2 in Metastasen aus CRC im Vergleich zu den Primärtumorgeweben. Zusätzlich zu diesem neuen Befund in CRC wurde in dieser Arbeit erstmalig eine erhöhte Expression von Trop-2 in Schild-drüsenkarzinomen und in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben nachgewiesen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Trop-2 für die Metastasierung von Karzinomzellen des Kolons wurden stabile Transfektanten für Trop-2 in der nicht-metastasierenden Zelllinie KM12C generiert. Die konstitutiv Trop-2 exprimierenden Zellklone zeigten erhöhte Cyclin D1-Proteinspiegel bei unveränderter Zellproliferation gegenüber den Vektorkontrollen. Die Induktion von Cyclin D1 könnte mit der Identifizierung eines ebenfalls erhöhten Proteinspiegels von ß-Catenin in den Trop-2 exprimierenden Transfektanten in Zusammenhang stehen. Somit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Einfluss von Trop-2 auf den Tcf/ß-Catenin Signalweg. Zusätzlich demonstrierte ein Migrationstest erhöhte mobile Eigenschaften von Trop-2 exprimierenden Zellen in vitro, während sich die invasive Fähigkeit der Transfektanten, in vitro durch eine Matrigelschicht zu wandern, nicht von den Vektorkontrollen unterschied. Die induzierte Expression von Trop-2 in der Mehrzahl von Metastasen des kolorektalen Karzinoms sowie in Tumoren von Lunge und Schilddrüse war eine neue Beobachtung. Diese Ergebnisse demonstrieren das Potential von Hochdurchsatzmethoden wie die hier verwendete Genchip-Technologie in Kombination mit geeigneten Zellmodellen. In der vorliegenden Arbeit führte sie zur Identifizierung von Trop-2 als einen Marker der Tumorprogression und Metastasierung von verschiedenen humanen Karzinomen.

Das nicht polymorphe HLA-Klasse-I-Antigen HLA-G wird hauptsächlich in der Plazenta exprimiert, wo es vermutlich den semiallogenen Fötus vor Angriff des mütterlichen Immunsystems schützt. Eine Besonderheit von HLA-G ist das Auftreten von mehreren verkürzten Isoformen, die von alternativ gespleißten Transkripten translatiert werden. Neben dem kompletten membranständigen HLA-G1 mit den extrazellulären Domänen a1, a2 und a3 existieren die verkürzten Isoformen HLA-G2 (∆a2), HLA-G3 (∆a2, ∆a3) und HLA-G4 (∆a3). Außerdem wurden die löslichen Isoformen HLA-G5 (HLA-G1s), HLA-G6 (HLA-G2s, ∆a2) und HLA-G7 (HLA-G3s, ∆a2, ∆a3) beschrieben. Um die Expression und Funktion einzelner Isoformen getrennt voneinander und ohne Beeinflussung durch andere MHC-Klasse-I-Moleküle untersuchen zu können, wurden Transfektanten für die Isoformen HLA-G1, HLA-G2, HLA-G4 und HLA-G5 in der HLA-Klasse-I-negativen humanen Zellinie K-562 generiert. HLA-G kann mit inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren auf NK- und T-Zellen in Wechselwirkung treten und so Effektorfunktionen beeinflussen. Die Expression von HLA-G kann außerdem indirekt über HLA-E auf die Zytotoxizität von NK-Zellen und T-Zellen einwirken. Die HLA-E-Expression ist abhängig von Peptiden aus den Signalsequenzen von HLA-Klasse-I-schweren Ketten. Zum Ausschluß der Koexpression des HLA-Klasse-I-Antigens HLA-E auf der Zelloberfläche wurden HLA-G1mut- und HLA-G4mut-cDNA-Vektoren eingesetzt, deren Exon 1 so verändert ist, daß kein Ligand für HLA-E zur Verfügung gestellt wird. Während in der Zellinie K-562 HLA-G1 und HLA-G5 auf der Zelloberfläche exprimiert bzw. sezerniert werden, waren die verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 mittels FACS-Analyse mit einer Reihe HLA-Klasse-I- und HLA-G-spezifischer Ak nicht auf der Zelloberfläche nachweisbar. Diese Ergebnisse korrelieren mit der Sensitivität dieser verkürzten Isoformen gegenüber Endo H. Aus der fehlenden Resistenz der HLA-G2- und HLA-G4-Polypeptide gegenüber Endo H ergibt sich kein Hinweis auf ihren Transport zur Zelloberfläche. Diese fehlende Oberflächenexpression von HLA-G2 und HLA-G4 könnte auf einer gestörten Assoziation mit b2m oder Bestandteilen der MHC-Klasse-I-Prozessierungsmaschinerie beruhen. Kopräzipitationsexperimente ergaben, daß nur die HLA-G1-schwere Kette mit b2m und TAP assoziiert ist. HLA-G2 ließ sich zwar mit TAP, jedoch nicht mit b2m kopräzipitieren und HLA-G4 ließ sich weder in Assoziation mit b2m noch mit TAP nachweisen, so daß diesen Isoformen ein wichtiger Bestandteil der vollständigen HLA-I-Komplexe fehlt und bei HLA-G4 außerdem die Beladung mit Peptiden gestört ist. Diese Daten sprechen gegen eine Zelloberflächenexpression der verkürzten HLA-G-Isoformen. Im Unterschied zu HLA-G1 war HLA-G5 nicht in Kopräzipitaten mit TAP zu finden. Daher scheint für diese Isoform eine stabile Assoziation mit TAP für die Peptidbeladung nicht essentiell zu sein. Zum funktionellen Nachweis von HLA-G wurden Zytotoxizitätstests mit der Zellinie NKL sowie mit PBL, NK-Zellen und LAK-Zellen aus dem peripheren Blut mehrerer Donoren durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die Expression der verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 die Zytotoxizität der verschiedenen Effektorzellen nicht beeinflußte. HLA-G1 inhibierte die Lyse von K-562 in Abhängigkeit von der HLA-G1-Expressionsstärke und wirkte sich weniger deutlich als eine entsprechende HLA-E-Expression auf die Zytotoxizität aus. Neben der Plazenta wird HLA-G auch in zahlreichen anderen Geweben exprimiert und kann in Tumoren induziert oder hochreguliert werden. Da bei verschiedenen Tumoren die MHC-Klasse-I-Expression aufgrund von Mutationen im b2m-Gen gestört ist, wurden HLA-G1-Transfektanten in der b2m-negativen humanen Zellinie Daudi etabliert. Daudi HLA-G1-Transfektanten weisen gegenüber K-562 HLA-G1-Transfektanten eine reduzierte HLA-G-Proteinmenge auf. In Abwesenheit von b2m ist HLA-G1 außerdem nicht resistent gegenüber Endo H und kann auch nach Inkubation der Zellen bei niedrigen Temperaturen und Zugabe von b2m oder Ligand nicht auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Da von HLA-B27 bekannt war, daß b2m-freie Homodimere auf der Zelloberfläche exprimiert werden können und eine Dimerisierung von HLA-G über ungepaarte Cysteinreste möglich ist, wurden die Daudi HLA-G1-Transfektanten auf Anwesenheit von HLA-G1-Dimeren untersucht. In Abwesenheit von b2m waren jedoch keine Dimere nachweisbar. Auch in funktionellen Experimenten mit LAK oder gd T-Zellen hatte die HLA-G-Expression in Daudi HLA?G1-Transfektanten keine Auswirkung auf die Zytotoxizität oder Proliferation der Effektorzellen. Die HLA-G1-Expression in b2m-negativen Tumoren trägt daher nicht zur Tumorprogression bei. Eine Analyse der Unterschiede in der Expression und der Auswirkungen der HLA-G-Isoformen in verschiedenen Zellinien könnte Hinweise auf die Regulation und die Funktion der HLA-G-Expression liefern.

Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen. Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter Wichtigkeit. PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs- assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen Melanom beschrieben. Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht. Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden: In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien, die aus Melanommetastasen etabliert wurden. In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1- spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1- Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert wird. Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1- Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere Kontaktinhibition. Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1- Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten. Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1 im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47- Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations- initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig geklärt. Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1- Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom.

Im Unterschied zu den HLA-Klasse-Ia-Molekülen ist das nicht-polymorphe Klasse-Ib-Molekül HLA-G v.a. in der Plazenta exprimiert. Es wird postuliert, daß HLA-G die Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegen den „semiallogenen“ Fetus mitreguliert. In allen anderen Zellen und Geweben, in denen es gefunden wurde, ist die Menge im Vergleich zu klassischen Klasse-I-Molekülen um Größenordnungen geringer. Auch in der Genexpression unterscheidet sich HLA-G drastisch von allen übrigen Klasse-I-Molekülen. Am auffallendsten ist dabei das Auftreten verschiedener alternativer Spleißformen. Neben dem Volle-Länge-Transkript G1m gibt es eine Reihe verkürzter Isoformen: G2 (G2m, Da2-Domäne), G3 (Da2/Da3-Domäne), G4 (Da3-Domäne) sowie zwei Formen, die für lösliche Proteine kodieren, da die nicht-entfernte Intron-4-Sequenz zu einem vorzeitigen Translationsstop führt, G5 (G1s), G6 (G2s, Da2-Domäne, + In4). Die schwache Expression von HLA-G bestätigte sich auch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Haut- und Muskelbiopsien sowie Gehirnproben. Transkripte für HLA-G und die verkürzten Isoformen waren in fast allen Proben nachweisbar, wobei das Volle-Länge-Transkript die dominante Form war. Bei den nach Krankheitsgruppen eingeteilten Hautbiopsien und den Muskelbiopsien mit definierten Diagnosen konnte keine Korrelation eines bestimmten Expressionsmusters mit einer bestimmten Krankheitsgruppe bzw. Diagnose festgestellt werden. Diese Heterogenität des Expressionsmusters sowie die selektive Hochregulation der Volle-Länge-Isoform G1m auf Transkriptions- und Proteinebene in Glioblastomzellinien und Myoblasten, die nur eine äußerst schwache konstitutive Expression von HLA-G aufweisen, nach Behandlung mit IFNg deutet auf eine differentielle Regulation hin. Um die einzelnen Isoformen getrennt voneinander untersuchen zu können, wurden Transfektanten für jede Form in der Klasse-I-negativen B-Zellinie 721.221 etabliert. Nur die Volle-Länge-Isoform G1m sowie deren lösliche Variante G1s konnten auf der Zelloberfläche bzw. im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Von den übrigen Isoformen konnten nur EndoH-sensitive Polypeptide gefunden werden, und auch Immunofluoreszenzfärbung mit einer Reihe von Klasse-I-Ak zeigte keine Zelloberflächenexpression. Es muß daraus geschlossen werden, daß die verkürzten Isoformen in der Zelle zurückgehalten werden. HLA-G kann auf zwei Wegen die Aktivität von Immuneffektorzellen regulieren: direkt über ILT2 und indirekt über HLA-E. Das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-E wird durch Bindung eines Nonamers (P3-11) aus dem Signalpeptid verschiedener Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen stabilisiert. Aus der Interaktion dieses funktionellen HLA-E/Peptid-Komplexes mit dem inhibitorischen Rezeptorkomplex CD94/NKG2A auf NK-Zellen resultiert ein Schutz dieser Zellen vor der NK-Lyse. Auch das entsprechende Peptid aus der Signalsequenz von HLA-G ist ein Ligand für HLA-E. Allerdings wurde gezeigt, daß die Stabilisierung von HLA-E auf der Zelloberfläche durch das Peptid G3﷓11 schwächer als mit anderen Klasse-I-Peptiden und auch weniger stabil ist. Effektive Inhibition der Lyse der NK-Zellinie NKL über diese Interaktion von HLA-E mit CD94/NKG2A findet man nur bei HLA-G1m-Transfektanten. Diese werden auch durch die direkte Interaktion von HLA-G1m mit einem weiteren inhibitorischen Rezeptor auf NKL - ILT2 - geschützt. In den 721.221-Transfektanten der verkürzten HLA-G-Isoformen war eine unphysiologisch hohe Konzentrationen an HLA-G-Polypetid notwendig, um die kritische Menge an HLA-E-Ligand für den Schutz dieser Zellen vor der Lyse durch NK-Zellen liefern zu können. Das war nur für eine äußerst stark exprimierende G3-Transfektante der Fall. Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in einer ineffizienteren Prozessierung des Signalpeptids von HLA-G und einer im Vergleich mit anderen HLA-E-Liganden geringeren Bindungsaffinität des Peptids G3-11 für HLA-E. Eine Funktion der verkürzten HLA-G-Isoformen durch die direkte Interaktion mit Rezeptoren auf NK-Zellen konnte nicht nachgewiesen werden und ist wegen ihrer intrazellulären Expression auch unwahrscheinlich. Vielmehr deuten erste Daten, die zeigen, daß die Isoformen, direkt oder indirekt, mit dem TAP-Komplex assoziiert sind, auf eine mögliche Funktion im Rahmen der Antigenpräsentation hin. Worin diese besteht, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Daher ist anzunehmen, daß HLA-G in vivo hauptsächlich über HLA-G-bindende KIR immunregulatorische Funktionen wahrnimmt und durch indirekte Wirkung über HLA-E-CD94/NKG2A modulierend eingreift.

Adenosin-Rezeptoren (AdoR) zeigen als Komponenten des Adenosin-Signalweges komplexe Interaktionen untereinander, sowie mit weiteren Komponenten, wie der Ecto-5´-Nukleotidase (CD73) und der Adenosin-Desaminase (ADA). Diese Rezeptoren sind zudem mit den verschiedensten Signaltransduktionswegen verschaltet. Innerhalb dieser Arbeit sollten mögliche Mechanismen gemeinsamer potentieller Regulationen dieser Komponenten anhand von eukaryontischen Modellsystemen, wie auch anhand einer klinischen Studie zur chronisch lymphatischen Leukämie (CLL) untersucht werden. Für die Untersuchung transkriptioneller Regulationen wurde eine semiquantitative RT-PCR mit Hilfe eines heterologen Standards für alle 4 AdoR-Subtypen (A1, A2a, A2b, A3) etabliert. Die Spezifität dieser Systeme konnte mittels Restriktionsverdaus sowie Untersuchung von Transfektanten in AdoR-freien Zelllinien („Chinese Hamster ovary“ CHO) nachgewiesen werden. Densitometrische Auswertung der Amplifikate ermöglichte eine gute Quantifizierung der untersuchten mRNS-Niveaus, die noch Unterschiede in den subtypspezifischen cDNS-Niveaus von weniger als 40% deutlich auflöste. Für Untersuchungen in eukaryontischen Modellsystemen wurden C-terminale EGFPFusionskonstrukte aller 4 AdoR in pEGFP-N1 (Clontech) etabliert und in CHO- bzw. HeLa-Zelllinien transfiziert. Erfolgreicher Nachweis der Etablierung der Konstrukte erfolgte über Sequenzierung der neusynthetisierten Adaptersequenzen und über spezifische Restriktionsverdaus. Desweiteren konnte über die membranorientierte Fluoreszenzverteilung der Fusionskonstrukte in den Transfektanten auf eine erfolgreiche posttranslationale Prozessierung und Transport des Konstruktes in die Zellmembran zurückgeschlossen werden. RT-PCR-Analyse von RNS-Präparationen dieser Transfektanten zeigte eine erfolgreiche Transkription der Konstrukte. Innerhalb der HeLa-Zelllinie konnten alle 4 Subtypen erfolgreich exprimiert werden, wobei jedoch inhibitorische AdoR (A1AdoR; A3AdoR) leichter zu transfizieren waren als die excitatorischen A2aAdoR/A2bAdoR-Konstrukte. Letztere Transfektanten zeigten deutlich höhere Tendenzen zum Absterben, was mit einem erhöhtem cAMPNiveau dieser Zellen zusammenhängen könnte. Physiologische Aktivität des A3AdoR-Konstruktes konnte durch Verminderung der Teilungsrate der Transfektante beobachtet werden. Innerhalb der einzelnen Transfektanten konnten keine großen Änderungen der mRNS-Niveaus des entsprechenden transfizierten Subtypen festgestellt werden, was mit einer „Downregulation“ des nativen Subtypes erklärbar sein könnte. Jedoch zeigten sich zum Teil deutliche Niveau-Änderungen in den jeweils anderen Subtypen der Transfektante, was auf eine Interaktion der AdoR-Subtypen auf der Transkriptionsebene hindeutet. Verschiedene Wechselbeziehungen könnten mit - zum Teil von physiologischen Interaktionen her- bekannten Beziehungen der AdoR in verschiedenen Zelltypen in Zusammenhang gebracht werden. Induktion der Transfektanten mit AdoR-Agonisten, wie 5`-N-Ethyl-Carboxamido- Adenosin (NECA) oder (R)-N6-(1-Methyl-2-phenylethyl)-Adenosin (R-PIA) ergab einen Anstieg aller AdoR-cDNS-Niveaus im Falle der Aktivierung der Adenylylcyclase (A2a/A2bAdoR), bzw. eine Abnahme bei deren Inhibierung (A1/A3AdoR), die auch zum Teil subtypabhängige Modulationen und deutliche Abweichungen zur Kontrolllinie (EGFP-HeLa) zeigte. Behandlung der Zellen mit Alkohol als apoptosisstimulierendes Signal führte zu einer starken Erhöhung aller Subtyp-Niveaus, wobei besonders die A2aAdoR- und die A3AdoR-Transfektante die größten apoptotischen Tendenzen und auch die größten Modulationen der Subtyp-Niveaus zeigten. Transfektion der Konstrukte in die CHO-Zelllinie ergab gut exprimierende Klone der A1AdoR- und A3AdoR-Transfektante, die über membranorientierte Fluoreszenz des EGFP-Anhanges, wie auch über Nachweis der mRNS nachgewiesen werden konnten. Im Falle der excitatorischen AdoR erhielt man nur schwach exprimierende Klone der A2aAdoR-Transfektante, die deutliche Tendenzen zum Absterben zeigte. Wiederum fand man bei der A3AdoR-Transfektante einen erheblich verlangsamten Zellzyklus, was auf einer zellzyklusmodulierenden Wirkung des A3AdoR in verschiedenen Zelltypen beruht und somit auf eine erfolgreiche Signalfortleitung in der Transfektante hindeutet. Induktion der A1AdoR-Transfektante führte zu einer zeitabhängigen Konzentrierung und Internalisierung der Fluoreszenz, was auf eine intakte Regulation und Desensibilisierung dieses Subtypes innerhalb dieses Klones hindeutet. Die B-lymphoblastoide Zelllinie Raji wurde als Modellsystem für AdoR-Signalwege innerhalb des lymphatischen Systems untersucht. Eine starke Präsenz des A2aAdoR konnte mittels RT-PCR nachgewiesen werden, dessen Stimulation mit dem AdoR-Agonisten NECA wiederum zu einem Anstieg der mRNS-Niveaus aller AdoR-Subtypen führte. Behandlung mit Alkohol führte zu einem größeren Anteil an absterbenden Zellen sowie zu einem leichten Anstieg aller AdoR-Subtypen und deutet wiederum auf eine Beteiligung der AdoR an apoptotischen Antworten hin. Inwiefern substratmodulierende Komponenten des AdoR-Signalweges, insbesondere CD73 und ADA, in Regulationsmechanismen dieses Weges integriert sind, wurde in einem induzierbaren B-lymphoblastoiden Modellsystem, der 493-6-Zelllinie untersucht. Hierbei wurden durch induzierbare transkriptionelle Aktivierung zweier Mitogene, c-myc und EBNA2, vier unterschiedliche proliferative Zustände erzeugt und die Auswirkungen auf die Komponenten des Ado-Signalweges untersucht. Northern Blot-Analyse der 4 Zustände zeigten eine Zunahme der CD73- und A2aAdoR-mRNS-Niveaus mit sukzessiver Abschaltung der Mitogene, wobei EBNA2- Abschaltung den deutlichsten Effekt zeigte. ADA-mRNS-Niveaus zeigten meistens eine leichte Abnahme mit Abschaltung der Mitogene, was aber nicht eindeutig bestätigt werden konnte. Untersuchung der Zustände mit semiquantitativer RT-PCR ergaben eine Präsenz aller AdoR mit einer starken Überrepräsentierung des A2aAdoR. Wiederum konnte mit sukzessiver Abschaltung der Mitogene ein deutlicher Anstieg des A2aAdoR beobachtet werden, der wiederum deutlicher bei Abschaltung von EBNA2 ausfiel. Andere AdoR-Subtypen zeigten jedoch so gut wie keine Respons. Abschaltung der Mitogene führte sowohl bei EBNA2, wie auch bei cmyc nach ca. 3 bis 6 Stunden zu einem deutlichen Anstieg der A2aAdoR-Niveaus, sowie generell zu einer Abnahme des ADA-Niveaus im Falle der c-myc-Abschaltung. NECA-abhängige Erhöhung des cAMP-Niveaus korrelierte mit den A2aAdoRNiveaus der entsprechenden Proben. Ebenso konnte in diesem Labor eine Erhöhung der CD73-Aktivität mit Abschaltung der Mitogene nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle des A2aAdoR bei der Bereitstellung mitogener Signale und einer damit verbundenen Gewährleistung des Überlebens dieser Zelllinie bei inaktivierten Mitogenen, sowie auf modulatorische Interaktionen zwischen der CD73 und A2aAdoR hin. Modulierte CD73-Aktivitäten und Beteiligung der AdoR an apoptotischen Vorgängen in der chronisch lymphatischen Leukämie sind bereits länger bekannt. Innerhalb einer klinischen Studie zur CLL wurden 48 Patienten und 10 Kontrollpersonen auf Modulationen der AdoR-, sowie c-myc- als auch ADA-Niveaus, untersucht und auf eine klinische Relevanz hin überprüft. Im Bezug auf den Mittelwert der Kontrollgruppe konnten oft Modulationen der mRNSNiveaus der untersuchten Komponenten innerhalb der Patientengruppe gefunden werden. Korrelationsanalyse der Patientendaten ergab verschiedene Zusammenhänge der AdoR, wie auch der c-myc und der ADA untereinander, die zum Teil gegenläufig zu denen in der Kontrollgruppe waren. A2aAdoR-Niveaus korrelierten negativ mit der Leukozytenanzahl, einem Marker der CLL. Es konnte auch ein deutlicher Zusammenhang zwischen der CD73-Aktivität und der Leukozytenanzahl in diesem Labor gezeigt werden. Ebenso fand man einen starken Zusammenhang zwischen den c-myc- und ADANiveaus, sowie zwischen der ADA bzw. c-myc und diversen AdoR-Subtypen. Diverse, aus physiologischen Zusammenhängen bekannte Korrelationen fand man auch in der CLL wieder, was auf eine geregelte Modulation der AdoR-Niveaus in der CLL hindeutet, wobei jedoch keine Zusammenhänge mit den prognostischen Stadien nach Binet gefunden werden konnten. Ein aktive Modulation des A2aAdoR bei der Expansion der malignen B-Lymphozyten konnte anhand der Ergebnisse von 4 Folgeuntersuchungen vermutet werden. Wiederholung der Untersuchung nach 6 Monaten bis zu 1,5 Jahren zeigte eine deutliche negative Korrelation der Leukozytenzahl mit dem A2aAdoR-Niveau.

IL-6 spielt eine entscheidende Rolle für die Entstehung vieler Krankheiten, ins-besondere des Plasmozytoms. Über die molekularen Mechanismen die daran be-teiligt sind, lagen allerdings bisher wenig Daten vor. Aufgrund eigener Vorarbei-ten war bekannt, dass IL-6 die Src-Kinasen Hck, Fyn und Lyn aktiviert. Ziel die-ser Arbeit war es, genauere Erkenntnisse über die genauen Mechanismen dieser Aktivierung zu gewinnen. Mittels Mutationsanalysen wurde eine „saure Domäne“ zwischen den Aminosäu-ren 771 und 811 von gp130 als Bindungsregion für die Src-Kinase Hck identifi-ziert. Dieses Bindungsmotiv wurde bisher noch nicht für gp130 beschrieben. Die Bindung von Hck an gp130 war unabhängig von den benachbarten Bindungsstel-len für Shp-2 (Y759) und STAT3 (Y767, Y814). In faktor-abhängig wachsenden Baf-B03 Zellen resultierte die Deletion der Hck-Bindungsdomäne (d 771-811) in einem deutlich reduzierten Wachstum nach Stimulation von gp130. Die Aktivität der Src-Kinase Hck war in d-771-811 Transfektanten im Vergleich zu wt gp130 exprimierenden Zellen (Eg) deutlich reduziert. In d 771-811 exprimierenden Zel-len war außerdem die Aktivierung von Erk sowie die Deaktivierung und Dephosphorylierung von Pyk2 unterbrochen. Daher scheint der Signalweg an dem Hck beteiligt ist einen wesentlichen Einfluss auf die Vermittlung von Wachstumssignalen, die über gp130 stimuliert werden, zu besitzen. Zur Zeit werden die weiteren Signale untersucht, die durch über den Hck/gp130-Komplex vermittelt werden. Da IL-6 der ein wesentlicher Wachstumsfaktor in der Entstehung des Plasmozy-toms und die Expansion von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen ist, sollen diese Untersuchungen zur Identifizierung krankheits-relevanter Signalproteine oder -domänen führen. Diese Signalproteine würden dann wichtige Ziele für eine molekular definierte Therapie des Plasmozytoms darstellen.