Podcasts about expressionsstudien

Der humane Thyreotropin-Rezeptor (TSH-R) steuert die zentralen Funktionen der Schilddrüse und ist der wichtigste Regulator für deren Wachstum und Differenzierung. Er gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und kann nach einer Stimulation mit TSH die G-Proteine aller vier Familien (Gs, Gi/o, Gq/11 und G12/13) aktivieren. Dabei werden die meisten zellulären Reaktionen wie die Proliferation der Schilddrüsenepithelzellen und die Bereitstellung der Schilddrüsenhormone einer Aktivierung von Gs zugeordnet. Zu Gs-unabhängigen Signalwegen des TSH-R war dagegen erst wenig bekannt. Da der Gq/11-vermittelte Signalweg durch die Aktivierung der Phospholipase C und Proteinkinase C in maligne Prozesse von Schilddrüsenzellen involviert sein könnte, sollten in der vorliegenden Arbeit Gq/11-abhängige Effektoren des TSH-R in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen identifiziert und näher charakterisiert werden. Als Modellsystem wurden FTC 133 wt TSH-R Zellen verwendet, eine follikuläre Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie, die den humanen TSH-R überexprimiert. In diesen wurde die Aktivierung des Calcium/Calcineurin-abhängigen Transkriptionsfaktors NFAT nach TSH-Stimulation erstmalig beschrieben. Bei einer anschließenden Reihenuntersuchung der NFAT-abhängigen Zielgene Autotaxin, VEGF, c-Myc, Regulator von Calcineurin 1 (RCAN1) und Cyclooxygenase-2 (Cox-2) wurden c-Myc, RCAN1 und Cox-2 als TSH-regulierte Gene identifiziert. Die Induktion von c-Myc war unabhängig von NFAT, dagegen bestätigten Expressionsstudien mit Calcineurin-Inhibitoren und dem spezifischen NFAT-Inhibitor INCA-6, dass RCAN1 und Cox-2 durch eine NFAT-Aktivierung induziert wurden. Diese Aktivierung wurde durch Gq/11-Proteine vermittelt, denn nach spezifischer Herunterregulation der Gq- und G11-α-Untereinheiten mittels siRNA konnten die Zielgene nicht mehr TSH-abhängig induziert werden. Weitere Analysen zum Mechanismus der NFAT-Aktivierung zeigten, dass eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration ([Ca2+]i) allein über intrazelluläre Speicher nicht ausreichend war. Um NFAT zu aktivieren, mussten zusätzlich Calciumionen aus dem Extrazellulärraum einströmen. Untersuchungen mit dem STIM1-Inhibitor SKF-96365 wiesen dabei auf einen Calciumioneneinstrom über Speicher-operierte Ionenkanäle hin. Zusätzlich zur NFAT-regulierten Genexpression wurde in dieser Arbeit die TSH-induzierte Expression des Metallothioneins MT1X in FTC 133 wt TSH-R Zellen und in primären Thyreozyten analysiert. Die mRNA Induktion dieses Cystein-reichen und zytoprotektiven Proteins war ebenfalls abhängig von einer Expression der Gq/11-Proteine. Eine Erhöhung der [Ca2+]i reichte jedoch nicht aus, um MT1X signifikant zu induzieren. Zur gesteigerten Expression war darüber hinaus auch die Aktivierung der Proteinkinase C notwendig. In der vorliegenden Dissertation konnten somit RCAN1, Cox-2 und MT1X als Gq/11-regulierte Zielgene des humanen TSH-R charakterisiert werden. Dabei wurde eine NFAT-regulierte Genexpression nach einer TSH-Stimulation erstmalig gezeigt. Die präsentierten Ergebnisse weisen damit auf eine bisher unbeachtete biologische Rolle von Gq/11-abhängigen Signalwegen des humanen TSH-R in der Schilddrüse hin.

Atherosklerose wird heute als entzündliche Gefäßerkrankung verstanden, an deren Beginn ein Funktionsverlust des Endothels steht. Genablationsversuche zeigen, dass der Protease-aktivierte Rezeptor 2 (PAR-2) eine Rolle bei der Vermittlung inflammatorischer Reaktionen des Endothels spielt. PAR-2 gehört zur Familie der heptahelikalen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und wird durch proteolytische Spaltung seines N-Terminus aktiviert. Zusätzlich zu bekannten PAR-2-Liganden wie Trypsin und Gerinnungsfaktoren Xa und Tissue Factor/VIIa wurde mittels positional scanning synthetic combinatorial library die Typ II transmembrane Serinprotease Matriptase/MT-SP1 als PAR-2-aktivierende Protease identifiziert. MT-SP1/Matriptase wird bislang ausschließlich eine Rolle bei Tumorinvasion und Metastasierung zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde eine entzündungsfördernde Wirkung der katalytischen Domäne von MT-SP1/Matriptase in primären Gefäßendothelzellen und der daran beteiligte Rezeptormechanismus untersucht. MT-SP1/Matriptase induzierte die de novo-Synthese der proinflammatorischen Mediatoren Interleukin-8 (IL-8), IL-6 und Monocyte Chemoattractant Protein (MCP)-1 abhängig von der katalytischen Aktivität und über die Aktivierung von PAR-2. Die MT-SP1/Matriptase-induzierten Signalwege beinhalteten die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB in Abhängigkeit von der Aktivität der MAPK p38 und p42/44. Die IL-8-Induktion durch MT-SP1/Matriptase erforderte dabei lediglich die Aktivität von p38. Zusätzlich wurde ein zweiter, PKCalpha-abhängiger Signalweg zur MT-SP1/Matriptase-induzierten IL-8-Expression nachgewiesen, der unabhängig von p38, p42/44 und NF-kB war. Die endotheliale Dysfunktion in der Atherosklerose kennzeichnet sich nicht nur durch Inflammation, sondern auch durch prothrombotische Veränderungen. MT-SP1/Matriptase induzierte zusätzlich zu inflammatorischen Zytokinen die Neusynthese des Gerinnungsfaktors Tissue Factor und könnte dadurch proatherogen wirken. Tissue Factor selbst induzierte wiederum IL-8 unabhängig von seinem Liganden FVIIa, aber abhängig von den Serinresten 253 und 258 in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors. Expressionsstudien zeigten die erhöhte Expression von MT-SP1/Matriptase in der endothelialen Innenwand atherosklerotischer Gefäße im Vergleich zu gesundem Gefäß. Auch am Endothel adhärierte Blutzellen wiesen MT-SP1/Matriptase-Expression auf. Die Basalexpression von MT-SP1/Matriptase war nicht in Endothelzellen, aber in Monozyten nachweisbar, die im atherosklerotischen Prozess mit dem Endothel interagieren können. MT-SP1/Matriptase könnte daher eine Rolle bei der PAR-2-vermittelten Entzündungsreaktion in der atherosklerotischen Gefäßwand spielen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob die Aktivität der 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 4 (ein Enzym, das die Umwandlung von Östradiol in Östron katalysiert) in gesunden Brusdrüsenepithelzellen der Frau menstruationszyklusabhängig variiert und ob orale Kontrazeptiva Änderungen hervorrufen. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenasen repräsentieren eine Gruppe von mehreren Isoenzymen, welche vor allem Östrogene und Androgene umsetzen. 17ß-HSD 4, die als steroidumsetztendes Enzym identifiziert wurde, konnte immunhistochemisch in Drüsenepithelien und biochemisch generell im Brustgewebe nachgewiesen werden. Weiterhin wurde geprüft, ob ein Zusammenhang zwischen der Expression von Progesteron- und Östrogenrezeptoren in Brustdrüsengewebe und Verlauf des weiblichen Zyklus besteht und ob sich Unterschiede durch die Einnahme oraler Antikonzeption ergeben. Für unsere Studie untersuchten wir Brustdrüsengewebe von 47 prämenopausalen Frauen, die sich einer Mammareduktionsplastik unterzogen. Da wir postoperativ eine Zyklusananmese erhoben, konnten wir den Tag der Operation entweder der follikulären oder lutealen Menstruationszyklusphase zuordnen. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 4 ließ sich immunhistochemisch mit zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern in den Gängen und Tubuloalveoli des normalen Brustdrüsenepithels nachweisen. Angefärbt haben sich zytoplasmatische granuläre Strukturen in Drüsenepithelzellen und in Myoepithelzellen. Wir stellten leicht unterschiedliche Tendenzen in der Signalstärke der Expression von 17ß-HSD 4 mit dem Menstruationszyklus fest. Auch bei Einnahme oraler Kontrazeptiva ergaben sich leicht unterschiedliche Tendenzen in der Signalstärke der Expression von 17ß-HSD 4. Man sah die Tendenz einer höheren 17ß-HSD 4 Färbe-Intensität in der follikulären Phase und die Einnahme oraler Kontrazeptiva bewirkte eine niedrigere 17ß-HSD 4 Färbe-Intensität in der lutealen und eine höhere in der follikulären Phase. Expressionsstudien mit mRNA ergaben keine Zyklusabhängigkeit der 17ß-HSD 4. Die Ergebnisse geben keine klare Aussage darüber, ob 17ß-HSD 4 primär mit dem Umsatz von Östrogenen betraut ist, oder ob die Hauptfunktionen in Fettsäure- und Gallensäuremetabolismus liegen, Funktionen, die das Enzym auch ausüben kann. Insgesamt war die Östrogen-und Progesteronrezeptorexpression in der follikulären Phase geringfügig höher als in der lutealen Phase. Es ergaben sich Unterschiede in der Expression von Östrogen- und Progesteronrezeptoren durch orale Antikonzeption. Frauen die die „Pille“ regelmäßig einnehmen, zeigten in beiden Phasen (luteal und follikulär) eine geringere Expression von Östrogen-und Progesteronrezeptoren als bei Frauen die keine Hormone einnehmen. Alle Unterschiede waren jedoch statistisch nicht signifikant.

Der isolierte 3-Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase (MCC)-Mangel ist eine angeborene Störung im Abbau der Aminosäure Leucin. Die Erweiterung des Neugeborenen-Screenings (NGS) führte zu der Erkenntnis, dass der MCC-Mangel eine der häufigsten organischen Azidämien darstellt. Das klinische Bild ist sehr heterogen und eine Genotyp-Phänotyp Korrelation ist nicht möglich. Über die Prognose der im NGS identifizierten und bisher asymptomatischen Mutationsträger kann bisher keine Aussage gemacht werden. Das mitochondriale Enzym besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit. In dieser Arbeit wurden die mitochondrialen Signalpeptide beider Untereinheiten identifiziert. Hierzu wurden Fusionsproteine aus Fragmenten der Untereinheiten mit dem fluoreszierenden Protein YFP generiert. Nach Expression in humanen Hautfibroblasten wurden Kolokalisationsstudien durchgeführt. Zunächst wurde experimentell bestätigt, dass jede Untereinheit ein mitochondriales aminoterminal lokalisiertes Signalpeptid besitzt. Für MCCα befindet sich dieses in den Aminosäuren 1-39, für MCCβ in den Aminosäuren 1-20. Beide Untereinheiten haben keine weiteren Importsignale. Somit sind die aminoterminalen Targetingsequenzen ausreichend und gleichzeitig notwendig, um einen mitochondrialen Import zu ermöglichen. In einer Western Blot Analyse konnte die Abspaltung der Signalpeptide beider Untereinheiten gezeigt werden. Durch Veränderung der positiv geladenen Aminosäuren wurden die strukturellen Erfordernisse der identifizierten Signalpeptide näher charakterisiert. Es wurden Argininreste gegen Glutamin in verschiedenen Kombinationen ausgetauscht. Eine Mutation der aminoterminalen vier Argininreste im Signalpeptid von MCCα führte zum Importverlust. Bei einer Mutation der in der Targetingsequenz vom Aminoterminus weiter entfernt liegenden zwei Argininreste fand ein Import statt. Bei Mutationen der Argininreste im Signalpeptid von MCCβ kam es regelhaft zu einem Importverlust. Damit wurde die Relevanz der positiv geladenen Aminosäuren für den Import der MCC-Untereinheiten belegt. Die Identifizierung der Signalpeptide stellt die Grundlage weiterer Funktionsuntersuchungen dar, da nur reife Proteine ohne Signalsequenz für prokaryontische Expressionsstudien verwendet werden können. Durch solche Untersuchungen könnten die Auswirkungen von Mutationen auf die Enzymfunktion besser verstanden werden. In diesem Zusammenhang können möglicherweise diejenigen Veränderungen in der Funktionsweise des Enzyms aufgeklärt werden, die eine klinische Symptomatik nach sich ziehen. Hierdurch könnte die bisher schwierige Beratungssituation betroffener Familien hinsichtlich Prognose und Therapie erheblich verbessert werden.

Die Familie der Geruchsrezeptoren ist zwar ein zentrales Forschungsgebiet, dennoch ist wenig über sie bekannt. Im Folgenden wird dargestellt, worin die beiden Hauptursachen für die Problematik der Analyse von Geruchsrezeptoren bestehen und welche Strategien in dieser Arbeit gewählt wurden, um einen experimentellen Ansatz zur Untersuchung von Geruchsrezeptoren zu finden: 1. Erst wenigen Geruchsrezeptoren konnten Liganden zugeordnet werden . Da noch keine Struktur eines Geruchsrezeptors bekannt ist, können bislang Modellvorstellungen nur über Sequenzhomologien innerhalb der Rezeptorgruppe oder anhand verwandter Rezeptoren, z. B. dem Rinderopsin, erstellt werden. Offensichtlich reichen diese Modelle jedoch nicht aus, um effektiv Liganden zuzuordnen oder Struktur-Funktion-Zusammenhänge zu erkennen. Das HEK-293-Zellsystem erwies sich zwar als das bisher effektivste heterologe Expressionssystem für diese Art von Rezeptoren, doch auch hier ist die Zahl beschriebener, funktionell exprimierter ORs begrenzt . Es gibt also nur wenige Möglichkeiten, Geruchsrezeptoren funktionell zu exprimieren, und daher besteht ein Bedarf an weiteren Expressionssystemen, um diese Rezeptoren in vivo untersuchen zu können. 2. Neben der Problematik einer funktionellen Expression gibt es bislang kein Expressionssystem, welches die Herstellung geeigneter Mengen für eine Strukturaufklärung dieser Rezeptoren ermöglicht. Die Menge der synthetisierten Rezeptoren ist in der Regel zu gering oder die Zielproteinspezies liegt in Einschlusskörpern vor. Zu 1) Die funktionelle Expression mit korrekter Translokation des Membranproteins sollte in Kombination mit einer Semliki Forest Virus-basierten Infektion in Säugetier P19-Zellen durchgeführt werden. Ausgewählt wurde diese Zelllinie aufgrund folgender Tatsachen: es handelt sich bei der P19-Zelllinie um Teratokarzinom-Zellen, welche ursprünglich aus embryonalen Stammzellen, implantiert in Hodengewebe, generiert wurden. Einem Gewebe also, in dem in vivo eine Geruchsrezeptor-Expression nachgewiesen wurde . Ein weiterer vielversprechender Umstand war die Differenzierbarkeit dieser Fibroblasten-ähnlichen Zellen in neuronale Zellen, dem Zelltyp, der auch in vivo für olfaktorische Neuronen vorliegt. Dementsprechend lautet die Annahme, dass es sich um eine optimale Zelllinie für die Expression rekombinanter ORs handeln kann, die zur zeitgerechten Expression aller für die olfaktorische Signalkaskade notwendigen Bestandteile befähigt ist. Die Zelllinie sollte bezüglich ihrer Eignung als Expressionsplattform für Geruchsrezeptoren charakterisiert und Expressionsstudien am Beispiel des Rezeptors OR5 durchgeführt werden. Zu 2) Die Überexpression des Membranproteins zur quantitativen Isolierung erfolgte in Hefe. Gegenüber E. coli ist der Hefeorganismus zur Durchführung posttranslationaler Modifikationen fähig. Ein Vorteil im Vergleich zu Säugerzellen sind die hohen erreichbaren Zelldichten. Primärgewebe kam für diese Fragestellung nicht in Frage: eine Isolierung wäre mit sehr geringen Ausbeuten verbunden, eine Problematik, die durch die Verwendung von heterologen Expressionssystemen umgangen werden kann. Es wurde eine „unfolded protein response“ (UPR)-kontrollierte Expression in Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, um zu gewährleisten, dass überwiegend korrekt gefaltetes Rezeptorprotein gebildet wird. Mit dieser Arbeit sollten erstmals durch eine optimierte Expression, Produktion und Isolierung ausreichende Proteinmengen des Geruchsrezeptors OR5 (aus R. norvegicus) mit einer Homogenität von >90% zur Verfügung gestellt werden, um biochemische und strukturelle Charakterisierungen durchzuführen. Zusätzlich sollten monoklonale OR5-Antikörper generiert werden, um eine spezifische Detektion und Immunopräzipitation des Geruchsrezeptors OR5 zu ermöglichen. Zusammengefasst tragen die etablierten Systeme dazu bei, die genaue Rolle der ORs in der Geruchswahrnehmung in Zukunft entschlüsseln zu können. Mit Hilfe der P19-Zelllinie wird die OR-Charakterisierung in einem heterologen System ermöglicht, und durch den Gebrauch des Hefeexpressionsystem und die optimierte Isolierungs-Strategie kann das Material für eine Strukturaufklärung bereitgestellt werden.

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist weltweit der zweithäufigste bösartige Tumor. Fernmetastasen eines CRC treten zumeist in Leber und Lunge auf, sind nur in seltenen Fällen operativ entfernbar und sprechen nicht auf derzeit verfügbare Chemotherapien an. Die Identifizierung von Genen und die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, durch welche sie zur Tumorprogression eines CRC beitragen, liefert eine Grundlage für die Prävention oder Behandlung der zumeist tödlich verlaufenden Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des metastatischen Phänotyps in Kolonkarzinomzellen verantwortlich sind. Hierzu wurden mittels der Genchip-Technologie die Transkriptionsprofile von insgesamt fünf Tumor-Zelllinien erstellt und nach stringenten Auswahlkriterien miteinander verglichen. Zuerst wurde ein CRC-Zellmodell verwendet, das aus einer in der Nacktmaus nicht-metastasierenden humanen Primärtumor-Zelllinie KM12C und zwei davon abgeleiteten, stark zur Leber metastasierenden Zelllinien, KM12SM und KM12L4A bestand. In diesem überwiegend isogenen Zellmodell wurden 145 Gene in beiden metastasierenden Zelllinien als dereguliert im Vergleich zu der nicht-metastasierenden Zelllinie identifiziert. Die Transkriptionsprofile eines weiteren humanen CRC-Zellmodells, bestehend aus einer nicht-metastasierenden Zelllinie HCT116 und einer stark zur Lunge metastasierenden Zelllinie HCT116U5.5 wurden ebenfalls verglichen und 72 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Ein Vergleich der Datensätze aller Transkriptionsprofile ermöglichte die Identifizierung von Vimentin und Trop-2 (TACSTD2, „Tumorassoziierter Vermittler von Kalziumsignalen“) als in allen metastasierenden Zelllinien überexprimiert. Die hohe Homologie des bisher noch weitestgehend unerforschten Trop-2 zu Trop-1 (Ep-CAM), einem regulatorischen Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das überwiegend von aggressiven Tumorarten exprimiert wird und die Proliferation von Tumorzellen stimulieren kann, machten Trop-2 für weiterführende Expressions- und Funktionsstudien zu einem interessanten Zielgen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Expressionsstudien in einer Vielzahl von Tumorbiopsien zeigten deutlich erhöhte mRNA- und Proteinspiegel von Trop-2 in Metastasen aus CRC im Vergleich zu den Primärtumorgeweben. Zusätzlich zu diesem neuen Befund in CRC wurde in dieser Arbeit erstmalig eine erhöhte Expression von Trop-2 in Schild-drüsenkarzinomen und in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben nachgewiesen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Trop-2 für die Metastasierung von Karzinomzellen des Kolons wurden stabile Transfektanten für Trop-2 in der nicht-metastasierenden Zelllinie KM12C generiert. Die konstitutiv Trop-2 exprimierenden Zellklone zeigten erhöhte Cyclin D1-Proteinspiegel bei unveränderter Zellproliferation gegenüber den Vektorkontrollen. Die Induktion von Cyclin D1 könnte mit der Identifizierung eines ebenfalls erhöhten Proteinspiegels von ß-Catenin in den Trop-2 exprimierenden Transfektanten in Zusammenhang stehen. Somit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Einfluss von Trop-2 auf den Tcf/ß-Catenin Signalweg. Zusätzlich demonstrierte ein Migrationstest erhöhte mobile Eigenschaften von Trop-2 exprimierenden Zellen in vitro, während sich die invasive Fähigkeit der Transfektanten, in vitro durch eine Matrigelschicht zu wandern, nicht von den Vektorkontrollen unterschied. Die induzierte Expression von Trop-2 in der Mehrzahl von Metastasen des kolorektalen Karzinoms sowie in Tumoren von Lunge und Schilddrüse war eine neue Beobachtung. Diese Ergebnisse demonstrieren das Potential von Hochdurchsatzmethoden wie die hier verwendete Genchip-Technologie in Kombination mit geeigneten Zellmodellen. In der vorliegenden Arbeit führte sie zur Identifizierung von Trop-2 als einen Marker der Tumorprogression und Metastasierung von verschiedenen humanen Karzinomen.

Bei Patienten, die mit dem humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) infiziert sind, kommt es häufig zu krankhaften Veränderungen des Endothels, die zu einer Fehlfunktion des Gefäßsystems führen. Klinischer Ausdruck dieser als acquired immune deficiency syndrome (AIDS)-assoziierten Vaskulopathie bezeichneten Veränderungen sind Schädigungen des Aortenendothels, die mit einer erhöhten Adhäsion mononukleärer Zellen an das Endothel einhergehen, Defekte der Blut-Hirn-Schranke, die zur Entstehung von Demenz beitragen, sowie das Kaposi-Sarkom (KS), das durch eine sehr starke Extravasation von T-Zellen und Monozyten gekennzeichnet ist. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass das regulatorische HIV-1-Tat-Protein und das inflammatorische Zytokin TNF-a synergistisch die Adhäsion der promonozytären Zelllinie U937 und von PBMZ an humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVEZ) erhöht. Die adhäsionsfördernde Wirkung wurde selektiv bei HIV-1-Tat beobachtet, andere virale Proteine des HIV-1, wie Negativfaktor (Nef) und das Glykoprotein gp41, hatten keinen Einfluss auf die Adhäsion. Anhand zellspezifischer Marker wurde gezeigt, dass HIV-1-Tat in periphere mononukleäre Blutzellen (PBMZ) spezifisch die Adhäsion von Monozyten und T-Zellen erhöhte, jedoch nicht von B-Zellen. Intravital-mikroskopische Untersuchungen an der Maus bestätigten in vivo, dass HIV-1-Tat und TNF-a synergistisch die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel erhöhten. HIV-1-Tat reguliert die Expression einer großen Anzahl zellulärer Gene. Diese Fehlregulation durch HIV-1-Tat könnte an der Enstehung der AIDS-assoziierten Vaskulopathie beteiligt sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die parakrine Wirkung von HIV-1-Tat auf die Genexpression in Monozyten mittels der suppressed subtractive hybridization (SSH)-Methode untersucht. Hierbei wurde O-linked N-Acetylglucosamine-transferase (OGT) als Gen identifiziert, dessen Expression durch HIV-1-Tat unterdrückt wird. Bisher ist bekannt, dass OGT ein Repressor der basalen Transkription und der SP-1-regulierten Transkription ist. Die Expression von OGT wurde sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Protein-Ebene durch HIV-1-Tat und VEGF121 gehemmt, wobei die Regulierung über den VEGF-Rezeptor Flt-1 vermittelt wurde. Weitere Faktoren wie inflammatorische Zytokine (TNF-a, IL-1b, IFN-g und IL-2), angiogene Wachstumsfaktoren (bFGF und VEGF165) und Chemokine (IL-8, MIP-1a, IP-10, MCP-1 und SDF-1a) hatten keine hemmende Wirkung auf die OGT-Expression. Die schnelle Abnahme von intrazellulärem OGT-Protein wurde weder durch lysosomale Proteasen noch durch Proteasen des Proteasoms verursacht. Expressionsstudien an PBMZ von fünf verschiedenen Probanden zeigten, dass bei zwei Probanden die OGT-Konzentration durch HIV-1-Tat zunahm, bei zweien nahm sie ab und bei einer Person gab es keine Veränderung. Diese Ergebnisse belegen, dass HIV-1-Tat entscheidend an der Entstehung der AIDS-assoziierten Vaskulopathie, insbesondere von KS, beteiligt sein könnte. Die Repression von OGT durch HIV-1-Tat könnte die weitreichende Wirkung des HIV-1-Tat-Proteins auf zelluläre und virale Gene erklären.

Der isolierte 3-Methylcrotonyl-CoA: Carboxylase (MCC) Mangel ist eine angeborene Störung im Abbau der Aminosäure Leucin. Es sind sowohl bis ins Erwachsenenalter asymptomatische als auch frühe letale Verläufe beschrieben. Die Ursachen des variablen Phänotyps sind nicht verstanden. Das Enzym ist zusammengesetzt aus α- und β - Untereinheiten. Die kodierenden humanen Gene MCCA und MCCB wurden kürzlich in unserer Arbeitsgruppe kloniert. Die Erweiterung des Neugeborenen-Screenings mittels Tandem-Massenspektrometrie in Bayern erbrachte die überraschende Erkenntnis, daß der MCC Mangel wahrscheinlich die häufigste organische Azidämie (etwa 1 : 40 000) darstellt und asymptomatische Mutationsträger existieren. Über Risiko und Prognose dieser metabolischen Störung ist derzeit noch keine Aussage möglich. In dieser Arbeit sollte daher eine Methode zur molekulargenetischen Charakterisierung von Patienten mit MCC Mangel etabliert werden, um den prognostischen Wert des Genotyps studieren und damit die Beratung und Betreuung der betroffenen Familien verbessern zu können. Es wurden 3 asymptomatische Patienten aus dem Neugeborenenscreening sowie ein Patient, der mit cerebralen Krampfanfällen aufgefallen war, untersucht. Die Diagnose war bei allen Patienten durch Bestimmung der typischen Metabolite in Urin (3-Hydroxyisovaleriansäure und 3- Methylcrotonylglycin) und Blut (3-Hydroxyisovaleryl-Carnitin) gestellt worden. Für die molekulargenetische Diagnostik des MCC Mangels wurde die Mutationsanalyse auf genomischer und cDNA Ebene für MCCA und MCCB etabliert. Es wurden zwei Patienten mit veränderten Allelen im MCCA- und zwei Patienten mit Mutationen im MCCB-Gen identifiziert. Ein Patient war compound-heterozygot für die Missense-Mutation S535F (1604C>T) und die Nonsense-Mutation V694X (2079delA) im MCCA Gen. Bei einem zweiten Patienten wurde S535F (1604C>T) heterozygot nachgewiesen. Ein Patient mit konsanguinen Eltern war homozygot für die Missense-Mutation S535F (1604C>T). Ein weiterer wies die Missense-Mutation E99Q (295G>C, cDNA: homozygot; gDNA: heterozygot) mit einen Allelverlust auf. In zwei Fällen werden zusätzliche Mutationen in der Promotorregion bzw. in einem Intron angenommen. Für alle gefundenen Mutationen kann von phänotypischer Relevanz ausgegangen werden. Drei davon waren bisher unbekannt und wurden von uns erstbeschrieben. Unsere Ergebnisse bestätigen die Rolle von MCCA und MCCB azielführende Methode zur molekulargenetischen Charkterisierung von Patienten mit MCC Mangel dar und bildet damit die Grundlage für Expressionsstudien und Studien zur Untersuchung der Genotyp-Phänotypkorrelation.ls humane Krankheitsgene. Die hier etablierte Mutationsanalyse stellt eine

Die Identifizierung von Genen, deren Expression Einfluß auf die Metastasierung von Tumoren nimmt, stellt eine Möglichkeit zur Verbesserung sowohl diagnostischer als auch therapeutischer Ansätze in der Behandlung von Krebs dar. Jede achte Frau in westlichen Industrienationen erkrankt an Brustkrebs, wobei die Entwicklung neuer Methoden zur frühzeitigen Erkennung von Metastasen und deren zielgerichtete Behandlung entscheidend ist, um eine Therapie von Patientinnen mit progressivem Mammakarzinom zu ermöglichen. Entwickelt sich eine Zelle eines Primärtumors zu einer invasiven metastasierungsfähigen Zelle, so ist für diese Veränderung des Phänotyps eine grundlegende Modifizierung in der Expression zahlreicher Gene zu erwarten. In einem zellulären Modellsystem für die Progression des Mammakarzinoms wurde in der invasiven Zellinie MCF-7ADR das „Progressions-assoziierte Protein“ (PAP) identifiziert, in der nicht-invasiven Zellinie MCF-7 konnte dagegen keine Expression nachgewiesen werden. Die Aufgabenstellung dieser Arbeit ist die Klärung der Bedeutung der Expression dieses Gens für die Veränderung einer Zelle von einem nicht invasiven hin zu einem invasiven Phänotyp. PAP stellt ein Protein mit 157 Aminosäuren dar und gehört zur PMP22-Genfamilie, deren Mitglieder putative Viertransmembran-Rezeptoren sind. Neben der Hypothese der Einflußnahme von PAP auf die Metastasierungsfähigkeit einer Zelle werden für die Homologen eine Vielzahl zellulärer Funktionen postuliert, wie z.B. die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten, Adhäsionsvermittlung, Zellzyklusregulation, Tumorgenese und Apoptose. Die in dieser Arbeit durchgeführten Expressionsstudien zeigten, daß PAP in einer Vielzahl von Normalgeweben exprimiert wird, mit Ausnahme von Geweben des Zentralen Nervensystems (ZNS) und peripherer Blutlymphozyten. Erste vergleichende Prävalenzstudien mittels Northern-Blot- Analysen zwischen Tumor- und Normalgewebe einzelner Patienten wiesen im Fall von Gewebeproben aus Organen des Zentralnervensystems eine positive Korrelation der PAP-Expression mit den Tumorproben auf. Eine Untersuchung von Mammakarzinom-Zellinien mit unterschiedlichem Metastasierungsgrad in der Nacktmaus belegte, daß PAP lediglich in den als metastasierend eingestuften Zellen exprimiert wurde. Über gekoppelte in vitro Transkription/Translation konnte gezeigt werden, daß die in einen Expressionsvektor klonierte PAP-cDNS für ein Protein mit einer Größe von etwa 18 kDa kodierte. Auch mittels Immunfluoreszenzstudien transient transfizierter COS-7-Zellen konnte die Expression eines Epitop-markierten Proteins und die Lokalisierung an der Zellmembran nachgewiesen werden. PAP exprimierende Zellen waren nicht apoptotisch, jedoch oft auffallend abgerundet. Einzelne Klone stabil transfizierter MCF-7-Zellen, die PAP konstitutiv exprimierten, zeigten kein anderes Wachstumsverhalten in Proliferationstests gegenüber der untransfizierten oder den mocktransfizierten MCF-7-Zellen. Auch ihr Verhalten in in-vitro-Invasionstests unterschied sich nicht von dem der Ursprungszellen, während MCF-7ADR hier starke Invasivität aufwies. Eine endgültige Aussage über eine Funktion von PAP bei der Invasion von Tumoren kann jedoch erst nach der Auswertung von Experimenten in Nacktmäusen gemacht werden. Durch Serumentzug wachstumsarretierte humane Primärzellen zeigten für PAP eine inverse Regulation im Vergleich zu dem homologen Protein PMP22. PAP wurde in proliferierenden Zellen stärker exprimiert als in arretierten, während für PMP22 ein Anstieg der RNS in arretierten Zellen zu beobachteten war. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß alleine die Expression von PAP nicht ausreicht, um MCF-7- Zellen in vitro zur Invasion zu befähigen. Dafür könnten allerdings sowohl extrazelluläre Stimuli, als auch intrazelluläre Interaktionspartner fehlen, die zur Änderung des Phänotyps der Zellen und zur Invasion notwendig sein könnten. Da Rezeptoren jedoch in allen Schritten der Metastasierung von grundlegender Bedeutung sind, kann auch für PAP nicht ausgeschlossen werden, daß es in diesen komplexen zellulären Mechanismen eine Rolle spielt. Ein Einfluß auf die Proliferationsfähigkeit von Zellen konnte durch die konstitutive Expression von PAP nicht nachgewiesen werden. Eindeutig belegt werden konnte aber eine Korrelation mit dem Zellzyklus. Durch Serumentzug arretierte primäre Zellen zeigten eine verminderte PAP-Expression im Vergleich zu proliferierenden Zellen. Die Überexpression von PAP in COS-7-Zellen läßt allerdings die Vermutung zu, daß PAP, ebenso wie das homologe PMP22, einen Einfluß auf die Zellmorphologie und auf die Adhäsion von Zellen haben könnte. PAP könnte dabei in einen Adhäsion-regulierenden Mechanismus eingebunden sein, der bei einer Überexpression von PAP zu einem Abrunden der Zellen und einem Substratkontaktverlust führen könnte. Unter physiologischen Bedingungen könnte dies für das Loslösen der Zellen während der G2-Phase des Zellzyklus notwendig sein. Bei einer fehlerhaften Regulation (einer gesteigerten Expression von PAP) unter pathologischen Bedingungen könnte eine leichtere Loslösung von Tumorzellen die Metastasierung begünstigen. Denkbar wäre eine Interaktion von PAP mit Integrin- Rezeptoren, wodurch die Affinität des Integrins beeinflußt werden könnte. Diese Hypothese bietet einen Ansatzpunkt für weitere Studien bezüglich des Einflusses von PAP auf zelluläre Vorgänge, wie Zellzyklus-Regulation und Zellwanderung.