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Ein Vortrag des Molekularbiologen Mathias HeikenwälderModeration: Nina Bust-Bartels**********Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen. Manche Menschen bekommen ihn im hohen Alter, andere schon in ihren 20ern oder 30ern. Warum, darüber spricht der Molekularbiologe Mathias Heikenwälder in seinem Vortrag. Der Vortrag des Molekularbiologen Mathias Heikenwälder heißt "Chronische Entzündung, fehlgeleiteter Metabolismus und Krebs: Wie Lifestyle unsere Genexpression und Ansprechen auf Therapien verändert". Er hat ihn am 21. Januar 2025 im Rahmen der Reihe Nature/Nurture: Das Zusammenspiel von Genen und Umwelt gehalten. Die Vortragsreihe ist Teil des Studium Generale der Universität Mainz.**********Mehr Vorträge aus der Reihe Nature/Nurture: Das Zusammenspiel von Genen und Umwelt bei Deutschlandfunk Nova:Epigenetik und Gesundheit: Wie wir unsere Gene beeinflussen könnenEpigenetik und Vererbung - Verhalten beeinflusst Gesundheit über Generationen**********Schlagworte: Deutschlandfunk Nova +++ Hörsaal +++ Vortrag +++ Krebs +++ Krebsforschung +++ Lifestyle +++ Ernährung +++ Antioxidantien +++ Darmflora +++ Entzündungen +++ Darmkrebs +++ Übergewicht +++ Genetik +++ Molekularbiologie**********Mehr zum Thema bei Deutschlandfunk Nova:Gene oder Gesellschaft: Der Streit über das, was uns prägtEpigenetik und Gesundheit: Wie wir unsere Gene beeinflussen könnenEpigenetik und Vererbung: Verhalten beeinflusst Gesundheit über Generationen**********Den Artikel zum Stück findet ihr hier.**********Ihr könnt uns auch auf diesen Kanälen folgen: TikTok und Instagram .
In diesem Podcast sprechen wir über Spermidin! Die Forschung zu diesem Wirkstoff und Nahrungsergänzungsmittel hat enorm zugenommen. Jede Menge neue Erkenntnisse zu möglichen Langlebigkeitswirkungen liegen auf dem Tisch und bahnen sich an. Mein Interview-Partner für diesen Podcast ist einer der Top-Experten für diesen Wirkstoff, Professor für Biochemie an der FU Berlin und an der Universitätsmedizin der Charité: Prof. Dr. Stephan Sigrist. ___________________________________________________ Dieser Podcast wurde gesponsort von LongevityLabs SpermidineLife. Mit dem Rabattcode Life15 erhältst du 15% auf die geprüften Spermidin-Produkte. Schau gleich rein: https://spermidinelife.com/de-de/products/spermidinelife-original-365-plus Wir freuen uns über dieses Sponsoring, denn so können wir aufwendige Inhalte ganz kostenlos auch für dich zur Verfügung stellen. Unsere Expertengespräche bleiben dabei natürlich unabhängig und sachlich! ___________________________________________________ In dieser Folge sprechen wir u.a. über folgende Themen: Spermidin und Longevity-Forschung: Spermidin gilt als einer der vielversprechendsten Wirkstoffe für die Langlebigkeit, da es in alternden Geweben die Funktionalität wiederherstellen oder den Alterungsprozess verlangsamen kann. Körpereigener Stoff: Spermidin ist ein körpereigener Stoff, dessen Konzentration in fast allen Lebewesen mit dem Alter abnimmt. Funktion in der Zelle: Es spielt eine wesentliche Rolle in der Stabilisierung und Funktion von DNA und RNA sowie in der Aktivierung der Autophagie, einem zellulären Reinigungsprozess. Epigenetische Wirkung: Spermidin beeinflusst epigenetische Marker, die die Genexpression steuern und Prozesse wie die Autophagie und Zellreparatur regulieren. Quellen von Spermidin: Rund 50 % des Spermidins stammen aus der Nahrung, 40 % werden im Körper synthetisiert, und etwa 10 % durch die Darmflora produziert. Spermidinreiche Lebensmittel sind z. B. Weizenkeime, Brokkoli und fermentierte Produkte wie Natto. Bioverfügbarkeit: Spermidin wird gut vom Körper aufgenommen, obwohl der genaue Transport in die Zellen erst kürzlich besser verstanden wurde. Herzgesundheit: Studien zeigen, dass Spermidin Herzschwäche, insbesondere diastolische Dysfunktion, vorbeugen oder deren Fortschreiten verlangsamen kann. Immunsystem und Alterung: Spermidin kann die Teilungsfähigkeit alternder Immunzellen verbessern und die Wirksamkeit von Impfungen, z. B. gegen Influenza, steigern. Kognitive Gesundheit: Erste Studien deuten darauf hin, dass Spermidin kognitive Funktionen bei älteren Menschen stabilisieren und das Risiko von Demenz verringern könnte. Parkinson und Neuroprotektion: Es gibt Hinweise, dass Spermidin über spezifische Transportmechanismen eine schützende Wirkung bei Parkinson und ähnlichen neurodegenerativen Erkrankungen haben könnte. Weitere Informationen zu Prof. Dr. Sigrist findest du hier: https://www.bcp.fu-berlin.de/biologie/arbeitsgruppen/genetik/ag_sigrist/mitarbeiter/leiter/sigrist/index.html Du interessierst dich für Gesunde Langlebigkeit (Longevity) und möchtest ein Leben lang gesund und fit bleiben, dann folge mir auch auf den sozialen Kanälen bei Instagram, TikTok, Facebook oder Youtube. https://www.instagram.com/nina.ruge.official https://www.tiktok.com/@nina.ruge.official https://www.facebook.com/NinaRugeOffiziell https://www.youtube.com/channel/UCOe2d1hLARB60z2hg039l9g Disclaimer: Ich bin keine Ärztin und meine Inhalte ersetzen keine medizinische Beratung. Bei gesundheitlichen Fragen wende dich bitte an deinen Arzt/deine Ärztin. STY-142
Gast: Fritjof Nelting, Gezeiten Haus - https://www.neltings-welt.de/ueber-uns/fritjof-benjamin-nelting In dieser packenden Episode von "Macht der Epigenetik" spricht Dr. Manuel Burzler mit dem außergewöhnlichen Gast Fritjof Nelting, einem visionären Klinikleiter und Experten für ganzheitliche Heilmethoden. Fritjof nimmt uns mit auf eine Reise, die die tiefen Verbindungen zwischen Geist, Körper und den Genen enthüllt. Gemeinsam tauchen sie in die faszinierende Welt der Epigenetik ein und zeigen auf, wie unsere Gedanken, Emotionen und Lebenserfahrungen direkten Einfluss auf unsere Genexpression nehmen können.
Tauche ein in die geheimnisvolle Welt der Methylierung – einem faszinierenden biochemischen Prozess, der das Grundgerüst des Lebens beeinflusst. Erfahre, wie Methylgruppen die Genexpression beeinflussen und welche Bedeutung dies für Gesundheit und Krankheit hat.
Hallo liebe Zukunftsmacher,nachdem mein Podcast seine 100. Folge so gebührend gefeiert hat, starten wir nun mit neuer Energie und noch mehr Freude auf zukünftige Innovationen und Trends in die nächsten 100 Folgen!Und wie lässt es sich besser beginnen, als mit einem weiteren interessanten Auftritt meines 2b Ahead Zukunftskongresses 2021. Wie ihr wisst, bietet der2b Ahead Zukunftskongress schon seit 20 Jahren eine Plattform für Networking, für die innovativen Köpfe dieser Welt und für neueste und zukünftige technologische Errungenschaften.In der heutigen Folge hören wir eine Unternehmerin, die mit ihrer Arbeit und ihrem Wissen eine ganz entscheidende Rolle für die Lösung des größten Problems unserer Welt spielt. Der Klimaschutz ist aktuell eines der wichtigsten Themen, welches alle Menschen der Erde nachhaltig betrifft. Wissenschaftler und Politiker arbeiten Hand in Hand, um anhand von Prognosen wichtige Maßnahmen festzulegen, die die Klimaerwärmung eingrenzen oder verlangsamen können. Doch was passiert eigentlich, wenn wir es nicht schaffen, das berühmte 1,5-Grad-Ziel des Pariser Klimaschutzabkommens einzuhalten? Wie können sich die Menschen anpassen, wenn das Klima um 1,5 Grad oder mehr ansteigt?Kinneret Shefer ist eine israelische Biotech-Unternehmerin aus Tel Aviv, Expertin für Molekularbiologie und CEO von GeneNeer, einem Agrar-Biotech-Unternehmen, das eine einzigartige Technologie zur Kontrolle der Genexpression in Pflanzen entwickelt.Sie hat eine Technologie entwickelt, die Getreidepflanzen gegen die Folgen der Klimaerwärmung, beispielsweise Dürren, resistent macht. Wie das Verfahren funktioniert und welche ethischen Konsequenzen es mit sich bringt, das erfahrt ihr heute in meiner neuen Folge!Bis dahin: Auf eine großartige Zukunft!Werde jetzt Teil der Zukunfts-Community und sichere Dir den exklusiven Probemonat in der Future.me Membership. Hier geht's zur AktionHier geht es zu den Janszky Days! Sichere Dir jetzt Tickets: https://janszky.de/digital/zukunfts-ich/Du interessierst Dich für Innovationsreisen? Dann klicke jetzt hier: https://reisen.2bahead.com/
Unser Kurs auf der Webseite: https://www.selbstorientiert.org/shop/Genregulation-I-Kurs-mit-Karteikarten-&-Texten-p429173265 Unser Kurs auf Amazon: Unser YouTube-Video: https://www.youtube.com/watch?v=bvZMjijl_ag --- Send in a voice message: https://anchor.fm/selbstorientiert/message
In der neuen Folge geht es um Epigenetik- genauer um die DNA-Methylierung! Grundlegende Fragestellungen: Warum unterscheiden sich eineiige Zwillinge, obwohl sie die gleiche Erbanlage haben? Welchen Einfluss hat das Futter auf die Gestalt von Mäusen? Vorab klären wir: Was ist Epigenetik? Welche Fachbegriffe musst du kennen, um die DNA-Methylierung zu verstehen? biologopodcast@gmail.com IG: biologopodcast
Unbedingt im Skript mitverfolgen (S. 29/30) Du erfährst... - wie Glücksgefühle beim Runners' High entstehen - wie es zu Abmilderung von Schmerzwahrnehmung kommt - wie Morphin, Opium und Heroin wirken! Fachbegriffe: präsynaptische Hemmung, postsynoptische Hemmung, Dopamin, Endorphin, Heroin, Opium, G-Protein, GTP, GDP, second messenger, cAMP, ATP, Calciumionenkanal, Adenylatzyklase, Silencer, Genexpression, Transkriptionsfaktor, Hypophyse, Nucleus accumbens, Area tegmentalis, sensorisches Neuron, Nozizeptoren, uvm.
Du erhältst Antworten auf folgende Fragen: 1.) Wie ähnlich bist du einem Schimpansen (nicht)? und: Welche Taxa gehören zu den Primaten? 2.) Wo lässt sich der Mensch innerhalb der Primaten finden? und: wie hängen Ordnung, Klasse & Co zusammen? 3.) Was macht den Menschen zum Primaten? und: welche plesiomorphe Merkmale haben alle Primaten gemeinsam? Skript zur Folge und zum Podcast: KLICK. Bewerte den Podcast bei iTunes, schreib Feedback/Fragen/Fehler an biologopodcast@googlemail.com Den allerbesten Lernerfolg wünsche ich dir! Fachbegriffe: Klasse, Ordnung, Gattung, Familie, Art, Rasse, Hominoidea, Hominidae, Homininae, plesiomorph, Genexpression, Mammalia, Homo, Opponierbarkeit, rezent.
In dieser Folge geht es um 1.) ...den Zusammenhang deiner Gene und deiner Proteinmaschinerie 2.) ... wie sich deine Gene ab- und anschalten lassen 3.) ...was Epigenetik mit der Synthetischen Evolutionstheorie zutun hat 4.) ... wie du deine Genexpression beeinflussen kannst. Viel Spaaaaß :-) Fachbegriffe in dieser Folge: Proteinbiosynthese, Genexpression, Methylierungsmuster, mRNA, Hormone, Synthetische Evolutionstheorie, Darwin, Lamarck.
Der 2020 Nobelpreis für Chemie ging an Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna für "die Entwicklung einer Methode der Genomeditierung“. Ihre Arbeit hat die Werkzeuge, die einem Forscher in den Biowissenschaften zur Verfügung stehen, signifikant erweitert. Deswegen will ich mir die Zeit nehmen, um ein bißchen darüber zu reden, was an dieser Arbeit so besonders ist. Damit das auch klappt, muss man erst mit ein paar Folgen einsteigen, die den Kontext bieten. In dieser zweiten Episode geht es darum, wie genetische Informationen in unserem Erbgut übersetzt werden in Funktionen und Merkmale. Willst du einen Kommentar zu dieser Episode oder zu diesem Podcast abgeben, dann gibt es zwei Möglichkeiten. Entweder schreibe mir auf Twitter unter @alltagschemie oder schicke mir einfach altmodisch eine email auf chem.podcast@gmail.com. Quellen https://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_(biology) https://en.wikipedia.org/wiki/Gene_expression https://en.wikipedia.org/wiki/Central_dogma_of_molecular_biology https://www.thoughtco.com/dna-versus-rna-608191 https://en.wikipedia.org/wiki/Gene https://en.wikipedia.org/wiki/TATA_box https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_codon_table
Sind wir Opfer unsere Gene? Die Genetik gibt uns eine Richtung vor, doch letztlich sind wir der Steuermann: Gene können mithilfe der Epigenetik an- und abgeschaltet werden. Bewegung, Schlaf, Ernährung, Umwelteinflüsse, Mindset und Toxine sind wichtige Faktoren, die unsere Genexpression steuern. Sebastian Dietrich ist Health & Performance Coach und Gründer von INEX Health und entwickelt auf Basis von Genanalysen personalisierte Lebensstil- und Ernährungsempfehlungen. Gentests sind nicht mehr teuer und können dir verraten, welche Fette du verträgst, wie du auf Kaffee reagierst, mit Stress umgehen kannst und vieles mehr. www.inex-health.com/ www.instagram.com/inex_health/ Shownotes: „Wir sind nicht unsere Gene, sondern unser Lifestyle“ Genetik muss nicht zum Tragen kommen: Gene können an- und abgeschaltet werden. Die Epigenetik schaltet Gene an und ab. Epigenetische Einflüsse sind Lifestylefaktoren: Schlaf, Ernährung, Bewegung, Umwelteinflüsse, Toxine Tim Böttner Personal Training und Coaching www.thinkflowgrow.com Hinweis: In den Shownotes findest du Produkte und Links, über die wir sprechen. Ich bin von allen Produkten selbst überzeugt und habe alle getestet. Wenn du über meine Links bestellst, unterstützt du dieses Projekt und sparst mit den Codes selbst etwas. Dafür bin ich dir sehr dankbar! Wenn du Fragen zu den Produkten hast, kannst du mich gern kontaktieren. Hier findest du alle meine Empfehlungen. Ich habe meinen Gentest übrigens vor mehreren Jahren bei www.23andme.com gemacht und bei www.dnafit.com und http://go.strategene.org/genetic-analysis ausgewertet. Das Genom kann für 200 bis 500 € analysiert werden, das Epigenom ist noch nicht für die Masse erschwinglich. Einen Heimtest findest du bei Lykon: https://shop.lykon.de/products/mydna-slim?variant=31460524720185 [Mit dem Code thinkflowgrow15 gibt es 15 % Rabatt] „Anti-Kokosfett-Gen“ oder Anti-Gesättigte-Fette-Gen (ApoE4): Wer diese Genvariante hat, verträgt gesättigte Fette schlechter (Kokosöl, Tierisches Fett, Palmfett, …). Das betrifft ca. 25 % der Bevölkerung. Olivenöl wird von jedem vertragen. Achte auf hochwertiges Olivenöl. Unter 15 bis 20 € gibt es fast kein gutes Olivenöl! NEW YORK International Olive Oil Competition (NYIOOC) – Gold Standard bestoliveoils.com https://www.essentialstuff.org/2016/01/03/Cat/adulterated-fake-olive-oil/ Koffein Abbau: CYP1A2 baut Koffein und Melatonin ab. Schneller Koffein-Verstoffwechsler bauen Koffein schnell ab. Langsame Koffein-Verstoffwechsler bauen Koffein langsamer ab und können wahrscheinlich nach Kaffeekonsum schlechter schlafen. Sebastian ist langsamer Katecholamin-Verstoffwechsler (COMT-Gen): Er baut Stresshormone langsamer ab. Obwohl er Koffein schnell abbaut, können die durch Kaffee hervorgerufenen Stresshormone langsam abgebaut werden und lange wirken. Deshalb kann der Kaffee bei Sebastian auch negativ wirken. COMT deaktiviert auch Östrogene. Kaffee-Hacks: Theanin puffert die Wirkung von Koffein. Beugt Koffeinflattern vor! Theanin ist in grünen Tee enthalten. Ich füge gern etwas Theanin meinem Kaffee hinzu. Magnesiumbiglycinat regelt die Aktivität von COMP hoch, sodass Stress reduziert werden kann. Eine Genmutation besteht nur, wenn sie in der Bevölkerung nur unter 1 % vorkommt. Sonst sprechen wir von einer Genvariante. MTHFR ist ein „High-Impact-Gen“. Den Einfluss von diesem Gen kann man bspw. durch mehr B-Vitamine (grünes Blattgemüse, Leber) kompensieren. Adaptogene können Stress reduzieren. Viele blockieren Rezeptoren für Cortisol. Cordyceps für Energiesystem, Schilddrüse Rhodiola Rosea wirkt positiv aufs Nervensystem (Spare 20 % mit dem Code GROW20 ) Brainperformance: Acetyl-Choline Acetyl-Tyrosin und Phenylalanin sind Vorstufen von Dopamin Huperzine A verzögert Abbau der Wirkstoffe und verlängert somit ihre Wirkung Stacks: Braineffect Focus Insulinausschüttung: Apfelessig kann Insulinantwort reduzieren. Sehr viele Wirkstoffe aus der russischen Heilmedizin, TCM oder Ayurveda. Neurotransmittertest: https://www.bravermantest.com/ Was kann jeder für sich tun? Was tun wir zu wenig? Reflektieren, Meditation, Atmung, Dankbarkeit, Achtsamkeit Sebastian startet seinen Tag mit 10 – 15 min Yoga und Priming Mindset kann sich auf die Gene auswirken: Bruce Lipton – Intelligente Zellen
Sind wir Opfer unsere Gene? Die Genetik gibt uns eine Richtung vor, doch letztlich sind wir der Steuermann: Gene können mithilfe der Epigenetik an- und abgeschaltet werden. Bewegung, Schlaf, Ernährung, Umwelteinflüsse, Mindset und Toxine sind wichtige Faktoren, die unsere Genexpression steuern. Sebastian Dietrich ist Health & Performance Coach und Gründer von INEX Health und entwickelt auf Basis von Genanalysen personalisierte Lebensstil- und Ernährungsempfehlungen. Gentests sind nicht mehr teuer und können dir verraten, welche Fette du verträgst, wie du auf Kaffee reagierst, mit Stress umgehen kannst und vieles mehr. www.inex-health.com/ www.instagram.com/inex_health/ Shownotes: „Wir sind nicht unsere Gene, sondern unser Lifestyle“ Genetik muss nicht zum Tragen kommen: Gene können an- und abgeschaltet werden. Die Epigenetik schaltet Gene an und ab. Epigenetische Einflüsse sind Lifestylefaktoren: Schlaf, Ernährung, Bewegung, Umwelteinflüsse, Toxine Tim Böttner Personal Training und Coaching www.thinkflowgrow.com Hinweis: In den Shownotes findest du Produkte und Links, über die wir sprechen. Ich bin von allen Produkten selbst überzeugt und habe alle getestet. Wenn du über meine Links bestellst, unterstützt du dieses Projekt und sparst mit den Codes selbst etwas. Dafür bin ich dir sehr dankbar! Wenn du Fragen zu den Produkten hast, kannst du mich gern kontaktieren. Hier findest du alle meine Empfehlungen. Ich habe meinen Gentest übrigens vor mehreren Jahren bei www.23andme.com gemacht und bei www.dnafit.com und http://go.strategene.org/genetic-analysis ausgewertet. Das Genom kann für 200 bis 500 € analysiert werden, das Epigenom ist noch nicht für die Masse erschwinglich. Einen Heimtest findest du bei Lykon: https://shop.lykon.de/products/mydna-slim?variant=31460524720185 [Mit dem Code thinkflowgrow15 gibt es 15 % Rabatt] „Anti-Kokosfett-Gen“ oder Anti-Gesättigte-Fette-Gen (ApoE4): Wer diese Genvariante hat, verträgt gesättigte Fette schlechter (Kokosöl, Tierisches Fett, Palmfett, …). Das betrifft ca. 25 % der Bevölkerung. Olivenöl wird von jedem vertragen. Achte auf hochwertiges Olivenöl. Unter 15 bis 20 € gibt es fast kein gutes Olivenöl! NEW YORK International Olive Oil Competition (NYIOOC) – Gold Standard bestoliveoils.com https://www.essentialstuff.org/2016/01/03/Cat/adulterated-fake-olive-oil/ Koffein Abbau: CYP1A2 baut Koffein und Melatonin ab. Schneller Koffein-Verstoffwechsler bauen Koffein schnell ab. Langsame Koffein-Verstoffwechsler bauen Koffein langsamer ab und können wahrscheinlich nach Kaffeekonsum schlechter schlafen. Sebastian ist langsamer Katecholamin-Verstoffwechsler (COMT-Gen): Er baut Stresshormone langsamer ab. Obwohl er Koffein schnell abbaut, können die durch Kaffee hervorgerufenen Stresshormone langsam abgebaut werden und lange wirken. Deshalb kann der Kaffee bei Sebastian auch negativ wirken. COMT deaktiviert auch Östrogene. Kaffee-Hacks: Theanin puffert die Wirkung von Koffein. Beugt Koffeinflattern vor! Theanin ist in grünen Tee enthalten. Ich füge gern etwas Theanin meinem Kaffee hinzu. Magnesiumbiglycinat regelt die Aktivität von COMP hoch, sodass Stress reduziert werden kann. Eine Genmutation besteht nur, wenn sie in der Bevölkerung nur unter 1 % vorkommt. Sonst sprechen wir von einer Genvariante. MTHFR ist ein „High-Impact-Gen“. Den Einfluss von diesem Gen kann man bspw. durch mehr B-Vitamine (grünes Blattgemüse, Leber) kompensieren. Adaptogene können Stress reduzieren. Viele blockieren Rezeptoren für Cortisol. Cordyceps für Energiesystem, Schilddrüse Rhodiola Rosea wirkt positiv aufs Nervensystem (Spare 20 % mit dem Code GROW20 ) Brainperformance: Acetyl-Choline Acetyl-Tyrosin und Phenylalanin sind Vorstufen von Dopamin Huperzine A verzögert Abbau der Wirkstoffe und verlängert somit ihre Wirkung Stacks: Braineffect Focus Insulinausschüttung: Apfelessig kann Insulinantwort reduzieren. Sehr viele Wirkstoffe aus der russischen Heilmedizin, TCM oder Ayurveda. Neurotransmittertest: https://www.bravermantest.com/ Was kann jeder für sich tun? Was tun wir zu wenig? Reflektieren, Meditation, Atmung, Dankbarkeit, Achtsamkeit Sebastian startet seinen Tag mit 10 – 15 min Yoga und Priming Mindset kann sich auf die Gene auswirken: Bruce Lipton – Intelligente Zellen
Jeder weiß, dass negative Gedanken und Gefühle uns in eine unglückliche Gemütsverfassung versetzen können. Sie wirken sich auf unsere psychische und auch körperliche Gesundheit aus. Ebensogut können positive Gedanken und Gefühle sich positiv auf unsere Gesundheit auswirken. Jeder Gedanke, den wir denken, wird von einem Gefühl begleitet. Jedes dieser Gefühle ist mit einer bestimmten biochemischen Reaktion verknüpft. Gedanken, die mit Stärkung, Liebe und Unterstützung zu tun haben, fühlen sich nicht nur gut an, sie stärken unser Immunsystem. Gedanken der Rache, des Kummers, der Wut und der Angst fühlen sich schlecht an. Im Körper führen sie zu entzündlichen Prozessen. Sie sind Hauptursache für die meisten degenerativen Erkrankungen. Wird ein Gedanke immer wieder gedacht, führt er zu einer Überzeugung. Überzeugungen, die über eine längere Zeit bestehen bleiben, werden zu unserer Biologie. Unsere Überzeugungen haben die Macht unsere Genexpression zu verändern. Biologische und neurochemische Veränderungen in unserem Körper, die mit diesen Überzeugungen zusammenhängen, bestimmen darüber, welche Gene eingeschaltet werden und welche im Schlafmodus bleiben. Wir haben demnach mehr Kontrolle über unsere Biologie, als uns bisher glauben gemacht wurde. Mit diesen Dingen haben sich Wissenschaftler wie Dr. Bruce Lipton und Dr. Mario Martinez beschäftigt. Daraus folgt: Es ist äußerst wichtig, die Fähigkeit zu entwickeln, mit der wir unsere Gedanken und Gefühle beobachten und bestimmen können. Dann können wir im wahrsten Sinne des Wortes unsere Gesundheit selbst erschaffen. In dieser Folge teile ich mit Dir meine persönlichen beiden Energiesätze, die mich in meine Heilung gebracht haben und die mich immer wieder in eine gute, positive und lebensbejahende Stimmung versetzen. Hier findest Du mich: Praxis Dr. Jasper: https://drjasper.deMuskanadent: https://muskanadent.comYouTube: http://bit.ly/drjasper-youtube Podcast iTunes: https://bit.ly/drjasperFacebook Dr. Jasper: https://www.facebook.com/ZahnarztpraxisJasper/ Facebook Muskanadent: https://www.facebook.com/muskanadent/ Instagram Dr. Jasper: https://www.instagram.com/zahnarztpraxis_drannettejasper/ Instagram Muskanadent: https://www.instagram.com/drannettejasper_muskanadent/ Gratis Checkliste “So halten Deine Zähne ein Leben lang”: https://verzahnt.online Buche deine persönliche Sprechstunde mit mir: https://drannettejasper.de/online-sprechstunde/ Buch “Verzahnt”: https://www.m-vg.de/riva/shop/article/15075-verzahnt/?pl=3887e229-9ea5-4043 Buch "Yoga sei Dank" von Dr. Annette Jasper: https://www.komplett-media.de/de_yoga-sei-dank-_112788.html
Folge 038 - Genexpression (Proteinbiosynthese) | Genetik Teil 10 Show Notes: Bitte unterstützt den Biologie Passion Podcast finanziell ➤ paypal.me/biologiepassionpdcst Hier gehts zum zugehörigen Blogartikel auf meiner Webseite. Wenn dir die Podcastfolge gefallen hat, würde mich eine kurze Bewertung auf iTunes freuen. Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst. Vielen Dank fürs Zuhören!
Folge 038 - Genexpression (Proteinbiosynthese) | Genetik Teil 10 Show Notes: Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst!
Hast du dich schon mal gefragt, ob ein positives Mindset dich wirklich erfolgreicher macht? Oder ob das Ganze nur Bullshit ist? Und was haben eigentlich positive Gedanken mit deinen Genen zutun? Über diese super spannenden Themen sprechen wir in dieser Folge mit Dr. Akuma Saningong. Er ist promovierter Biochemiker, Buchautor und gefragter Coach und Keynote-Speaker. Er wuchs in Kamerun auf und kam 2001 nach Deutschland. An der Hochschule Darmstadt bzw. an der Technischen Universität München studierte er Biotechnologie und molekulare Biotechnologie. Schließlich promovierte er an der Universität Duisburg-Essen im Bereich Proteinbiochemie. Das faszinierende ist, dass er als einer der Wenigen seine Arbeit als Coach und Trainer mit biochemischen Ansätzen und der Quantenphysik kombiniert. Hier trifft Persönlichkeitsentwicklung auf Wissenschaft. Akuma entwickelte folgenden Leitsatz für sich: "Investiere in Dich selbst, denn wenn Du es nicht tust, wird niemand anderes es tun." Erfahre mehr über das richtige Mindset von Büroathleten, wie du mit deinen Gedanken deine Genexpression beeinflussen kannst und warum du dich bei deiner Mutter eigentlich für dein Energieniveau bedanken musst. Hole dir das neue Buch von Akuma hier: http://bit.ly/machwasdraussaningong Erfahre mehr zu spannenden Themen von Akuma: https://www.drsaningong.com Persönlichkeitsentwicklung auf Youtube: https://www.youtube.com/channel/UCtDA0O3WAmv2qDHovt2xdqg/videos Wir verlosen außerdem 2 Exemplare von Akumas Buch "MACH WAS DRAUS" in unserer Facebook-Community: https://www.facebook.com/groups/1841353319321412/ Trete bei und hinterlasse deinen Namen unter dem Podcast-Post. Viel Erfolg!
Deine Gene können wie die Lichter eines Weihnachtsbaums an- und ausgeschaltet werden und somit deine Gesundheit und Leistungsfähigkeit beeinflussen. Diesen Bereich der Forschung nennt man Epigenetik. Hierbei spielt unsere Ernährung eine ganz wichtige Rolle. Unsere Gene terminieren nicht nur was wir Essen sollten, sondern unsere Nahrung kann sich auch auf unsere Genexpression auswirken. In diesem Podcast sprechen wir mit einem Experten aus den Bereichen Epigenetik und personalisierte Ernährung, Sebastian Dietrich. Sebastian ist Gründer von INEX und Live Better, Sportwissenschaftler und beschäftigt sich täglich mit der Frage, inwieweit personalisierte Ernährung auf Basis des Genoms Sportler und Büroathleten gesünder und leistungsfähiger machen kann. In diesem fantastischen Podcast erfährst du ebenso was Epigenetik ist, wie du dein Genom analysieren lassen und was du mit diesen Daten anstellen kannst sowie die Antwort auf die Frage, warum es niemals eine allgemeingültige Diät für jeden geben kann. Sei gespannt! - Was sind unsere Gene? - Was ist Epigenetik ? - Welche Faktoren beeinflussen unsere Gene? - Inwieweit beeinflussen unsere Gene unsere Ernährung und wie wirkt sich unsere Ernährung auf die Genexpression aus? - Folat als wichtiges Beispiel - Wie können Nahrung und Supplemente unsere Genexpression beeinflussen? - Welche Rolle spielt Cholin? - Wie haben Ernährungsformen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit (Veg. & Veganer)? - Wie kann ich meine Gene analysieren lassen ? - Warum kann die Ernährung unserer Eltern unsere Gene beeinflussen? - Was mache ich mit den Daten? - Wie wendet Sebastian diese Daten im Alltag an? - Welche Faktoren beeinflussen unsere Genexpression noch? - Was sind die größten Fallen und schädlichsten Stoffe? - Was sind Sebastians Tipps und Tricks? INEX: https://www.inex-health.com/ INEX auf Instagram: https://www.instagram.com/inex_health/ Live Better https://www.live-better.com/ Bild Quelle: phil pham photo
Evolution Radio Show - Alles was du über Keto, Low Carb und Paleo wissen musst
In Folge #120 Das Video der aktuellen Folge direkt auf Youtube öffnen Bitte beachten Sie auch immer den aktuellen "Haftungsausschluss (Disclaimer) und allgemeiner Hinweis zu medizinischen Themen" auf https://paleolowcarb.de/haftungsausschluss/ #geNUSS[explosion] von [næhr:sinn] - das low carb knusper nuss müsli [næhr:sinn] geNUSS[explosion] ist ein hochwertiges low-carb* Müsli und besteht zu 100% aus natürlichen Zutaten. Es ist gut als Frühstück und Snack und hat nur 13,7g verwertbaren Kohlenhydraten auf 100g. Es ist getreidefrei und sojafrei. Perfekt für den Start in den Tag. Wir verarbeiten nur hochwertigste, nährstoffreiche Zutaten, die dich länger satt machen und nachhaltig mit Energie versorgen. Wir nutzen ballaststoffreiche Kokosnuss, Erdmandel und heimische Nüsse. Mehr darüber erfährst du auf lowcarbmüsli.at oder auf Amazon.de Und nicht vergessen: Wenn du uns auf Youtube siehst, und wenn du es noch nicht getan hast, dann abonniere unseren Kanal „Evolution Radio Show“ Wenn du das Podcast hörst, dann findest du die Links für Apple iTunes und Android hier auf unserer Homepage Kurze Zusammenfassung Moritz von der Borch ist Wissenschaftsjournalist, Gesundheits - und Personal Trainer mit besonderem Fokus auf Prävention und Rehabilitation. Nach seinem Studium für Gesundheitsmanagement, Prävention, Fitness und sportliche Rehabilitation, war Moritz von der Borch einige Jahre als Ausbilder und Bereichsleiter für die Trainer-Teams einer großen Fitnessstudiokette in Bayern und Baden-Württemberg. "Wie wertvoll ist Wissen, wenn man es nicht teilt?" Neben seiner Tätigkeit als Wissenschaftsjournalist und Coach schreibt Moritz ein tolles und informatives Blog. Auf yourfunctionalmedicine.com kann man sich wirklich verlieren. Tief recherchierte Artikel, die wirklich versuchen alle Aspekte eines Themas zu beleuchten und Interviews mit Experten - das erwartet dich auf yourfunctionalmedicine.com. "Menschen helfen, Ursachen erkennen und sinnvolle Veränderungen umsetzen – das war von Anfang an mein Leitsatz – und durch eine ständige umfassende Weiterbildung gelang es mir immer besser, gemeinsam mit meinen Klienten Ziele zu formulieren und gute bis beste Ergebnisse für sie zu erreichen. Bei meiner Arbeit sehe ich es als essentiell an, den Menschen bewusst zu machen, welche enormen Auswirkungen beispielsweise unser Hormonhaushalt, unsere Ernährung und unser Umfeld auf uns haben und dass Gesundheit, Schlaf, Stress, Leistung und vieles mehr unser Leben zwar einerseits ganz entscheidend prägen, wir aber andererseits durchaus sehr gut in der Lage sind, die mögliche Beeinflussung durch die genannten Faktoren in hohem Maße selbst zu bestimmen." -Moritz von der Borch ##Wir sprechen in dieser Folge über Unterschiedliche Formen von Stress und wieso chronischer Stress so gefährlich ist Was du gegen Stress tun kannst Elektromagnetische Felder, wie sie auf den Körper wirken Schlaf und die besten Supplemente bei Stress #Transkript Julia: Lieber Moritz, herzlich willkommen zur Evolution Radio Show. Moritz von der Borch: Hallo Julia, freut mich hier zu sein. Julia: Bevor wir mit unserem Thema heute loslegen, nämlich mit Stress, vielleicht kannst du einfach ein paar Worte zu dir, zu deinem Hintergrund sagen und was, ich finde es immer ganz spannend auch zu wissen, was hat jemanden dazu bewogen, sich tiefer mit Gesundheit und auch mit diesen Themen Stress und Bewegung zu beschäftigen? Moritz von der Borch: Das Nette ist eigentlich, werde ich jetzt heutzutage als Medicine Journalist bezeichnet und dann fragt man sich, wie man eigentlich dazu kommt und das Nette dabei ist eigentlich, dass ich gar nicht als Journalist angefangen hatte, sondern im Fitnessbereich, sprich, ich habe dort eine Ausbildung gemacht, ich habe Prävention und Gesundheitsmanagement studiert, das heißt man sollte meinen auf einem höheren Niveau sich damit beschäftigen. Und das Ziel war eigentlich, dass ich im präventiven Bereich arbeiten wollte, sprich, Menschen davor beschützen wollte, vielleicht schwere Erkrankungen zu bekommen und so weiter. Als ich dann im Fitnessbereich auch arbeiten durfte, sogar als Clubleiter und später als Regionalleiter, war immer noch, wahrscheinlich hat das jeder, der im Dienstleistungsbereich arbeitet, vor allem mit vielen Menschen, so ein leichtes Helfersyndrom, man möchte halt den Leuten wirklich helfen. Das kennen wahrscheinlich viele. Und du kommst schneller an deine Limits, an deine Begrenzung und überleg mal Julia, wie viele Trainer deiner Meinung nach haben ein wirklich gutes Wissen von Krankheiten, wie Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Autoimmunerkrankungen, Multiple Sklerose, meinetwegen auch Diabetes? Julia: Ja. Ein Bruchteil, 10 Prozent vielleicht. Moritz von der Borch: Höchstwahrscheinlich. Julia: Sowas in der Art. Moritz von der Borch: Ich hatte es auch da in dem Unternehmen, wo ich gearbeitet hatte, da hatte ich es versucht auch ein Netzwerk aufzubauen, sprich mit Schulungen zu arbeiten, sowohl für die Trainer, Trainingsleiter, auch für Firmen, um dort die Informationen weiterzugeben. Das Problem ist aber auch, dass im Fitnessbereich nicht an oberster Stelle steht, Menschen zu helfen, sondern sie dazu zu bringen ins Fitnessstudio zu gehen und auch zu bleiben. Das ist ein bisschen was anderes. Das heißt aber auch so ein Gewissenskonflikt, das heißt auf der einen Seite habe ich versucht Menschen zu helfen, auf der anderen Seite hatte ich meine eigenen Einschränkungen. Und das ist, wenn du so willst eine gute Einleitung auch zu dem Thema heute. Das war ein Stress. Wenn du Menschen helfen willst, du kannst es aber nicht, du hast sagen wir mal ein Loyalitätsproblem, deine Ideologie wird eingeschränkt, dann hast einen Gewissenskonflikt und im Endeffekt war das eine der großen Punkte, die mich auch dazu geführt haben, zu sagen, das geht nicht so weiter, weil ich, du hast eine Stunde Zeit für einen Menschen und sagen wir mal, der hat eine ordentliche Erkrankung, ordentlich, eine ernsthafte Erkrankung, was tust du dann? Kannst du wenig tun. In dem Laufe der Zeit, ich habe mich, also bei mir war das so, ich habe gearbeitet in meiner Freizeit, das klingt ein bisschen komisch, habe ich mich mehr und mehr mit, anfänglich natürlich nicht mit Studien, aber sobald das wissenschaftliche Arbeiten bei mir drin war, mich mehr mit den Studien beschäftigt und das ist jetzt sagen wir mal seit etwa 10 Jahren so. Das heißt, ich habe gelernt und mir beigebracht, wie kann ich mit wissenschaftlichen Studien mein Wissen vergrößern? Was kann ich lernen? Wie funktionieren Systeme? Und das Nette war auch, je mehr man sich damit beschäftigt hat, umso mehr hat man auch verstanden, das, was wir derzeit tun, sieht nicht so erfolgreich aus, in verschiedenen Bereichen. Und das hat auch seine verschiedenen Gründe, dass es da nicht so geht. Von dem Wissen, was ich hatte, konnte ich auch nicht diese Informationen weitergeben und so entstand eigentlich auch meine Webseite yourfunctionalmedicine.com, auf der ich einfach nur Interviews mit klugen Leuten oder selber Artikel schreibe, die einfach frei zugänglich sind für die Menschen, ohne dafür irgendwas zu erwarten. Weil das ist auch der Wunsch, wie das entstanden ist. Das Interessante dabei war dann, dass auch Leute auf mich zukamen, haben gesagt, hey, würdest du auch für uns schreiben? Anscheinend, weil meine vielleicht leicht zynische Art denen gefallen hat, weiß ich nicht? Und so bin ich mehr und mehr in diesen Bereich journalistisch arbeiten reingekommen. War auch vielleicht nicht einfach so der Gedanke, aber da habe ich mir gedacht, warum eigentlich nicht? Zusätzlich kam auch, dass ich bei einem Verein für Journalisten angefragt hatte, würde ich denn aufgenommen werden? Und die sind meine Arbeit durchgegangen, haben sich angeschaut, was ich getan habe und haben mir dann eine Mitgliedschaft gegeben. Was ein großer Schritt ist, das heißt, ich darf jetzt mit einem Presseausweis auf medizinische Vorträge gehen und kann mir noch toller vorkommen oder sonst irgendwas. Ist irrelevant. Aber so kam es zu diesem Schritt und ich bin sehr glücklich damit, weil ich auch mit Menschen zusammenarbeiten darf, die einen ähnlichen Gesichtspunkt haben, die mit mir zusammenarbeiten, die wenn ich zum Beispiel, wenn mir selber das auffällt über eine neue Substanz, wo ich sage, hey, da gibt's einen Kontext, dass die dementsprechend mit mir sprechen und sagen, wie können wir das denn verbessern? Was ist der Kontext, was sind die Sachen, (unv.) #00:06:26-4# und da ist ein Riesenthema dabei, das ist das heutige Thema, das ist Stress oder die Reaktionen, die Stress bedeutet. Julia: Genau. Ich meine, Stress, das ist ja so ein Wort, mit dem glauben zumindest viele Leute was anfangen zu können oder es wird sehr inflationär verwendet teilweise und du hast gesagt, Stress ist also ein zentrales Thema für dich, der Umgang mit Stress, einerseits aus deiner eigenen Erfahrung und aus dem, was du gelernt hast, das heißt, kannst du mal kurz beschreiben, was ist Stress eigentlich? Moritz von der Borch: Hm, also erstmal wahrscheinlich eine Wahrnehmung. Die meisten Leute verstehen Stress wahrscheinlich aber als eine Reaktion, sprich, ich habe irgendeinen Stressor, da gibt's verschiedene Versionen, verschiedene Arten von, kommen wir nachher wahrscheinlich noch drauf zu sprechen, und mit denen wird unser Körper konfrontiert. Da muss man erstmal unterscheiden: Ist es ein akuter Zustand? Ist es ein chronischer Zustand? Ist es ein sagen wir mal positives Erlebnis oder negatives Erlebnis? Ich kann positiven oder negativen Stress erleben und sagen, oh cool, sagen wir mal, ich freue mich auf mein Training. Training ist ein Stressor, aber ich habe Spaß dabei, ich freue mich dabei Gewichte zu bewegen oder sonst was, das passt auch ganz, habe ich oft genug selber erlebt bei Leuten natürlich und das ist ein Effekt. Auch akut könnte man im Training sagen, bleiben wir mal bei dem Beispiel. Wenn ich ein kurzes Training habe mit lang genug Pausen dazwischen, mit Wiederholung, dann ist es ein akuter Stressor, den ich auch gut einbauen kann. Und wenn ich nicht andere große Mengen an Stressoren habe und nochmal da auch wieder Kontext. Wie viele Stressoren habe ich? Ein anhaltender Stress, hm, gibt's verschiedene, emotional, Arbeit, ganz viele. Und die über Dauer und vor allem die Menge können dazu führen, dass oder kann da sein, dass das dann der Tropfen ist, der das Fass zum Überlaufen bringt und dann auch auf Dauer langfristig Probleme bewirken. Stress selbst, was die Menschen wahrscheinlich gehört haben, das hat irgendwas mit so einem Ding namens Cortisol zu tun, da gibt's eine Stimulierung über den Kopf, die HPA Axis (hypothalamic–pituitary–adrenal axis) - Hypothalamus-Zirbeldrüse glaube ich heißt das und dann über die Nieren. Dass es da zu einer Ausschüttung kommt von Cortisol und auch anderen Sachen wie zum Beispiel Katecholamine, Prolaktin und Hemmung von anderen Sachen, das ist auch meistens immer so ein negativer Feedback Loop, das heißt, schütten wir Cortisol aus, hemmt es die weitere Ausschüttung unter normalen Umständen bei einem akuten Stressor. Das hat Einflüsse auf verschiedene Sachen, da gibt es Unterschied zum Beispiel zwischen diesem positiven Stressor, wo sich das Blut verteil, man wird aktiv, man hat diese anregende Situation und man möchte Vollgas geben sozusagen und das funktioniert. Also ich kann mich auch austoben. Nochmal wie beim Sport, ich kann einen Sprint laufen und es gibt den Stressor, dass ich zum Beispiel auf der Arbeit sitze im Büro und der Chef kommt vorbei und macht mich zur (Julia: Schnecke) ja (lacht) macht mich zur Schnecke und ich sitze da und kann nichts tun, bin aber trotzdem na ja werde von dem niedergemacht oder sonst was. Kennen wahrscheinlich einige. Und das ist ein Zustand, wo ich nicht fliehen kann, wo ich nicht irgendwas Körperliches tun kann, wo auch der Blutfluss komplett anders ist, wo auch die Reaktion ein bisschen unterschiedlich ist. Und das ist eigentlich ein super interessantes Feld, weil Menschen unterschiedlich auf Stress reagieren und die Art und Weise, wie der Körper darauf reagiert auch unterschiedlich sein kann. Manche Sachen sind gleich wie Stress-, Cortisol Ausschüttung und ähnliche Sachen, aber im Endeffekt, wie wir damit umgehen, hat einen Rieseneinfluss darauf, was das für eine Wirkung auf uns haben kann, wie wir das wahrnehmen. Julia: Und weil du sagst, es hat einen Einfluss, wie wir das wahrnehmen, kann man das beeinflussen? Also kann man sagen, na ja ich bin halt einfach so und ich muss damit leben oder gibt's da eine Möglichkeit, dass ich aktiv beeinflusse, wie ich auf Stress reagiere oder vielleicht auch so, dass ich erkenne, welcher Stressor für mich ein Problem darstellt, dass ich das identifiziere und auch entsprechend lerne damit umzugehen? Also kann ich das beeinflussen? Moritz von der Borch: Ja. Immer noch ein bisschen, würde ich nicht ganz eindeutig, aber es gibt viele Sachen, die du machen kannst. Der erste Punkt ist, mir geht's schlecht und ich weiß nicht warum. Irgendwas stresst mich unterbewusst. Was du gesagt hast, war das Wort oder dieses Wissen zu haben, das Bewusstsein zu haben, weil manche Stressoren werden vielleicht vernachlässigt, obwohl die einen großen Einfluss haben können. Und der andere Punkt ist auch die eigene Einstellung zu einem Stressor. Da zu sitzen und zu sagen und auch die Frage, kann ich es kontrollieren oder nicht, also da gibt's ein paar Faktoren. Was mir aber noch eingefallen ist vorhin, was auch noch wichtig ist, ist, was Stress betrifft. Stress oder Cortisol wirkt eigentlich immunsuppressiv. Das macht in einem Zustand von Stress gewissermaßen Sinn, auch mit dem Blutfluss und so weiter, obwohl es eigentlich das Immunsystem, ja, das ist eine Wechselwirkung es setzt das Immunsystem auf Kriegsführung, am Anfang ist es bereit zu kämpfen und dann gibt es noch eine Veränderung. Chronisch anhaltend kann es da durchaus zu anderen Ergebnissen kommen, sprich, dass, da gibt's eine Theorie von 2003, 2002 muss das ungefähr gewesen sein. Da gab's eine schöne Studie, das auch vermutet wird, dass unter chronischen Stress Cortisol Rezeptoren, insgesamt das System schlechter, weniger sensibler [reagiert] und dadurch wird dieser immunsuppressive Effekt von Cortisol nicht mehr richtig wahrgenommen, wenn proinflammatorische Zytokine, also die Signale weiter stark laufen, und dadurch haben wir irgendwann ein stark laufendes dysfunktionales Immunsystem durch chronischen Stress. Das kann natürlich dann wiederum zu anderen Problemen führen. Immunsystem ist gewaltig, das ist eine unheimlich mächtige Waffe in unserem Körper. Positiv, wenn sie gut funktioniert, negativ, wenn sie dysfunktional ist. Und das wolle ich nur mal zu bedenken geben, da das ein ziemlich großer Punkt ist für viele Menschen. Julia: Ja. Nein, was mir nur bekannt war, war, dass zum Beispiel, dass das Immunsystem eher, unterdrückt ist. Und das ja vielleicht auch viele kennen, dann während dem Urlaub, der 1. Urlaubstag oder am Wochenende, wird man auf einmal krank. Warum? Weil das Immunsystem auf einmal sich eine Antwort leisten kann, weil der Stress sinkt und der Körper mit einer Immunantwort endlich mal reagieren kann. Oder siehst du ...? Moritz von der Borch: Ja, nein. Da stimme ich auf jeden Fall zu, vor allem, weil es auch von dir gesagt ist, das System entspannt sich nicht, sondern wie du gesagt hast, das System hat die Möglichkeit endlich mal auf die ganzen Probleme im Körper zu reagieren und dadurch werden wir krank. Vermutlich. Typische Eigenart von Medizinjournalisten keine klaren Aussagen machen wollen. Julia: Gibt es kein möglicherweise? Moritz von der Borch: Man könnte sagen, laut der Studien ist folgendes Ergebnis zu vermuten. Das scheint es auch zu sein. Das ist der eigene Schutz wahrscheinlich. Ja, auf jeden Fall. Würde ich auf jeden Fall zustimmen. Julia: Ja. Aber wäre dann das, was du gesagt hast, dass über, wenn eben dieser Zustand über lange Zeit andauert und sozusagen die Rezeptoren weniger empfindlich auf Cortisol reagieren, ist das dann eine Art von Cortisol-Resistenz oder? Moritz von der Borch: Ich habe vorhin überlegt, ob man das vielleicht mit einer Form von Insulinresistenz vergleichen könnte. Der Gedanke kam mir auch so, hm, das kenne ich doch irgendwoher. Ich denke mal, man kann das in dem Sinne sehen, ich denke auch, weil da gehen wir jetzt tief in den Bereich rein, dass auch wieder ein Umdrehen möglich wäre. Vielleicht. Müsste ich selber auch nochmal genau nachsehen, also da kann ich keine eindeutige Aussage machen. Was aber der wichtige oder der super interessante Punkt ist, was Stress betrifft, das ist durchaus und so wie wir es wahrnehmen und die Art von Stress, gibt's unterschiedliche Arten von, hat eine Veränderung Genexpression, was immens ist, also wenn man sowas hört, denkt man sich, wow, das, was wir psychisch wahrnehmen, verändert die Expression von Genen in unseren Zellen. Das heißt das ist eine ... Julia: Also wie Gene ausgelesen, also welche ausgelesen werden und ob sie ausgelesen werden, (Moritz: Werde ich aktiv...) weil nur, nicht jeder weiß, was Expression bedeutet. Moritz von der Borch: Ja genau. Also das heißt, wir verändert die Aktivität oder wir verändern die Ausschüttung von verschiedenen Systemen, wie wir mit dem ganzen Aufbau umgehen, durch das, was wir erlebt haben. Das ist unglaublich spannend aus meiner Sicht. Dass man das auch wieder reversibel beeinflussen kann, das ist ja das Schöne an Genetik, ist durchaus denkbar. So sind wir dann erstmal in diesem Zustand, sprich, zum Beispiel epigenetische Depression könnte man fast sagen, dann ist es auch wieder schwierig für diesen Menschen, da wieder rauszukommen, weil dann sitzt du drin. Und dann gibt's andere Faktoren wie soziale Unterstützung, die dann helfen können. Julia: Das Interessante ist ja, dass selbst epigenetische sage ich Veränderungen auch vererbt werden (Moritz: Ja) und ich glaube, das ist vielleicht auch ein Punkt, der oft unterschätzt wird, weil, wenn man halt hört: Ja, meine Großmutter oder sogar die Urgroßeltern, die hatten ja auch viel Stress und die haben kein Problem gehabt. Ich meine, nicht nur, dass da viele, viele andere Umweltfaktoren, auf die ich jetzt dann noch gerne eingehen möchte, nicht da waren, aber ich denke, dass auch das auf eine Art und Weise akkumuliert möglicherweise und vielleicht auch Generationen später weniger stressresistent einfach sind als die Generation davor. Moritz von der Borch: Das ist absolut richtig, Julia. Da gab's Studien oder Untersuchungen zu Menschen nach dem 2. Weltkrieg, nach oder bei Menschen mit posttraumatischem Stresssyndrom, PTSD auf Englisch, und die wurden untersucht und auch also die nachfolgenden, die Kinder, wurden untersucht und man hat festgestellt, okay, die haben eine andere Ausschüttung von Cortisol, die haben eine andere Art und Weise im Körper auf Stress zu reagieren. Und der Stress vererbt oder die Reaktion von Stress, nachdem man das als Vater oder Mutter erlebt hat, übertragbar dann ist auf das Kind wie vieles andere auch, ist, na ja lässt einen dazu bringen, vielleicht ganzheitlich zu denken oder das Ganze mit einem größeren Blickfeld zu betrachten. Und deshalb kannst du auch erklären, warum Kinder zum Beispiel dann auch anders reagieren als andere, obwohl sie in der gleichen Straße leben. Julia: Ja. Absolut. Und vor allem, aber das Wichtige ist, was man auch gleich wieder eben sagen sollte und was du eben auch gesagt hast, ist, das ist reversibel, das ist etwas, was man (Moritz: Wahrscheinlich reversibel) man kann und das sollte auch Hoffnung geben und wir werden ja sicherlich, hast du dann sicher noch ein paar Tipps, was man da alles machen kann. Aber ich würde es noch gerne auf ein Thema eben zu sprechen kommen, das auch in ein sehr wie soll ich sagen auch ein zentrales Thema in deiner Arbeit ist und jetzt auch ganz aktuell einfach immer wieder in den Medien herumkreist und auch sowieso in den einschlägigen Blogs zu lesen ist und zwar elektromagnetische Strahlung. Auf das würde ich jetzt nochmal gerne eingehen, weil ... Moritz von der Borch: Ist so ein bisschen Pandoras Box. Ja. Julia: Was ist das überhaupt? Weil manche sagen, also man hat so diese zwei Seiten, es ist alles irgendwie nur Voodoo und Einbildung und die Leute sollen sich nicht so anstellen. Auf der anderen Seite habe ich vielleicht dann so den Alufolienhut auf und (Moritz: Sehr schön ...) wo kann man das jetzt einordnen in diesem Spektrum? Ist es relevant, wenn ja, wie wirkt es und was kann ich tun? Moritz von der Borch: Jetzt muss ich kurz überlegen, wie ich das Thema anfange, weil das ist ein Riesenthema. Du hast Recht, viele Menschen sagen so, ja, ja, das hat keinen Effekt und was auch noch dazu führt, dass viele Menschen das als Voodoo betrachten oder esoterisch oder spirituell, ist, dass es auch und ich wurde selber damit schon konfrontiert, viele unseriöse Herangehensweisen an das Thema gibt. Im Grunde genommen, was ein elektromagnetisches Feld ist: Jede Ladung, ein Elektron, ein Proton, besitzt ein elektrisches Feld, das heißt das sagt an seine Umgebung, hey, ich bin positiv oder negativ geladen. Und sobald diese Ladung in Bewegung kommt, entsteht dazu ein Magnetfeld und das koppelt aneinander und somit entsteht ein elektromagnetisches Feld. Das ist in der Physik bekannt, das weiß wahrscheinlich jeder, der irgendwie damit zu tun hat. Und das ist völlig okay. Und wenn diese kleinen Dinger einfach gesagt schwingen, oszillieren und diese Schwingung äußert sich auch, das ist alles jetzt einfach gesagt, äußert sich in einer Frequenz, also zum Beispiel 50 Hertz, 500 Hertz, 100 Hertz, je nachdem, Hertz bezeichnet, wie oft schwing das in der Sekunde. Wenn es 50 Mal pro Sekunde schwingt, dann ist es 50 Hertz und diese Schwingung oder diese Frequenz ist eigentlich nichts anderes als ein Photon, was Energie, Wärme und Informationen weitertransportiert. Wärme wäre ein Beispiel. Hast du zuhause eine Induktionsherdplatte oder sowas? Ist es warm, wenn du mit dem Kopf drüber bist zum Beispiel. Nicht drauflegen, aber drüber sein. Das ist Wärme, das ist infrarotes Licht, das ist eine elektromagnetische Frequenz, da haben wir ein Beispiel dafür. Oder der Ofen selbst, ganz einfach. Informationen ich meine darauf basiert unsere Kommunikation. Handy, WLAN, das ist alles Information, die transportiert wird, von einem elektrischen Gerät zum nächsten. Das Schöne ist, hast du schon mal ein EKG oder ein EEG benutzt oder gesehen, mitbekommen? Julia: Ja. Moritz von der Borch: Weißt du, was da gemessen wird? Das elektromagnetische Feld des Menschen. Julia: Okay. Moritz von der Borch: Du hast inzwischen Messmethoden, das dauert bis zu 10 Meter Entfernung, dass du das elektromagnetische Feld des Menschen feststellen kannst. Ein MRT arbeitet mit der Schwingung von Protonen im Körper und macht daraus ein bildgebendes Verfahren. Das heißt, wir arbeiten schon intensiv mit dem elektromagnetischen Feld des Körpers. Die Erde selbst hat ein Magnetfeld und auch größere Dinge haben es auch noch. Das sind so die natürlichen Sachen. Auch hier nochmal, elektromagnetische Felder sind nichts Schlechtes an sich, sie sind wie sie sind und je nachdem, wie wir sie einsetzen, können sie therapeutisch oder pathologisch wirken. Und ich habe bei einem Event oder bei dem FlowFest, wo ich selber auch noch Redner war, war genau dieses Topic mein Thema. Da habe ich ein Beispiel herangezogen. Es gibt in jeder, in fast allen Zellen unseres Körpers gibt es solche Pumpen oder Kanäle an den Zellen und die lassen bestimmte Sachen rein oder raus. Und hier ging es um das Thema Kalziumkanäle, also Kanäle, die dafür zuständig sind, dass man Kalzium rein lässt. Netterweise haben sehr schwache Frequenzen, sprich, unsere Stromspannung zum Beispiel, die auf 50 Hertz arbeiten oder Mikrowellen, haben die Fähigkeit an den Kalziumkanälen anzudocken, diese in Schwingungen zu bringen, weil sie resonieren, sie sind auf der gleichen Frequenz. Übrigens, ich habe jetzt keine Möglichkeit Studien irgendwie vorzuzeigen, aber das habe ich selber aus Studien heraus, die sind sehr gut dargestellt und die dann andocken an die geladenen Aminosäure-Resten, wenn man es genau wissen will, das System in Schwingung bringt, sie öffnet. Das Problem dabei ist halt, dass es nicht von unserem Körper selbst gemacht wird, sondern das ist ein externer Faktor, der dazu führt, dass unsere Zellen Kalzium reinlassen. So das mag jetzt nicht besonders klingen, wer vielleicht aber sich ein bisschen Biochemie beschäftigt hat, der weiß dann auch, Kalzium ist ziemlich wichtig eigentlich für unsere Zellen und hat viele Effekte, unter anderem durch massiven Kalziumeinfluss kommt es über Stickstoffoxid und andere Sachen auch zu oxidiertem Stress. So oxidierter Stress, ungeschützt, unkontrolliert, hat eine große Menge an Problemen. Insgesamt das System, das, was eigentlich dadurch passiert, ist vergleichbar mit einer Stressreaktion, einer Stimulierung der Zellen. Wir haben Kalzium als Signal für den Tod von Zellen, sprich die hauen ihr (Cytochrom4?) glaube ich raus aus, das geht glaube ich zu weit. Aber es führt dazu, dass einfach die Zellen den Löffel abgeben. Was nicht gut ist, weil wir diese Zellen, solange sie noch intakt sind, eigentlich sogar verwenden wollen. Unser Körper soll selber entscheiden, wann es zur Apoptose kommt oder zur ... Julia: Das heißt übermäßiges Absterben. Moritz von der Borch: Richtig, Absterben. Julia: Also übermäßiges Absterben. Moritz von der Borch: Genau. (22:50) Dann gehen wir einen Schritt weiter, oxidativer Stress oder Radikale Produktion in der Zelle führt natürlich dazu, dass manche Sachen geschädigt werden. Das kann auch dazu führen, dass die DNA Stränge im Nukleus, im Zellkern, beschädigt werden oder noch viel einfacher, weil exponierter, die DNA in den Mitochondrien. Alle Leute, die sich jetzt heutzutage ein bisschen mehr mit der Gesundheit beschäftigt haben, wissen, dass die Dinger relativ wichtig sind, weil die sind zuständig für die Energieproduktion von uns. Und wenn die nicht gut laufen, sind wir selber, ist die Wahrscheinlichkeit höher, dass wir an einer Krankheit leiden.(23:16) Julia: Ja. Auf jeden Fall. Moritz von der Borch: Dass wir krank werden. Du hast, es kam in der Tagesschau, da hatte ich sehr gestaunt, durch die DNA-Schäden ist es möglich Tumorwachstum zu kriegen. Im April dieses Jahres kam eine Meldung in der Tagesschau, dass jemand, der beruflich viel mit dem Handy gearbeitet hat, das der Grund war, warum er einen Gehirntumor entwickelt hat an der Stelle, wo er halt immer telefoniert hatte. Und das ist soweit okay, ich meine, schon mal interessant, dass es rauskam in der Tagesschau. Das Interessante da dran war aber, dass das Gericht in Italien ihm Recht gegeben hat. (Julia: Okay) Der erste Fall auf Tagesschau, auf Spiegel Online und so weiter, wo sie gesagt haben, ja, dem Mann geben wir Recht. Das heißt, es wurde zugestimmt, das Handy zuständig sind für Tumorwachstum in der Birne. Das war vielleicht dann doch sehr überraschend für mich, weil das war ein offizielles ... Julia: Absolut. Wirklich. Ja. Moritz von der Borch: Zugeständnis. Julia: Vor allem ich glaube, dass sogar irgendwo, dass sogar in der Betriebsanleitung sogar drinnen steht, dass man eigentlich nicht so nah hinhalten sollte zum Ohr oder am besten mit Freisprecheinrichtung telefonieren. Moritz von der Borch: Wenn das die Lösung, der Fall ist, Julia, dann wäre ich sehr glücklich. Aber es stimmt schon, dass der Abstand zu dieser Quelle immer noch den Effekt reduziert, aber bei dem Event. Julia: Man merkt ja auch, dass es warm wird, also ... Moritz von der Borch: Ja, aber das Beispiel, was ich gerade gesagt habe, war nicht ionisierende Strahlung wie Röntgenstrahlung, das hat nichts mit dem thermalen Effekt selber zu tun, das war ein weiterer Effekt. Also das mit dem, dass der Kopf glüht wie ein Weihnachtsbaum ist noch was ganz anderes. Das ist noch ein weiterer Faktor. Die beiden wurden da komplett rausgelassen. Das ist Dr. Martin Paul, das war der Veröffentlicher der Studie, hingewiesen hat, das ein Effekt, der eigentlich gar nicht besprochen wird. Und das Schöne ist auch, die ganzen Ärzte sagen, ja, hier die Frequenzen sind allzu schwach, die haben keine Effekte. Doch. Wenn es sozusagen auf der gleichen Welle schwingt, wie manche Bereiche in unserem Körper, dann hat das einen Effekt. Also ja, absolut. Das, vor allem bei dem Event war meine erste Frage ins Publikum, wer von euch hat alles ein Handy und mal Hand hoch. Und dann überlege mal, wer alles die Hand hochgemacht hat. Weil es so überall ist, ist es ein Problem oder aus meiner Sicht ein Problem. Und was hier auch nochmal wichtig zu betonen ist, elektromagnetische Felder können einen therapeutischen Effekt haben. Was ein Riesenschritt wäre, wenn wir uns mal hinsetzen würden und drüber nachdenken würden, okay, wie können wir positive Effekte nach oben bringen und negative Effekte nach unten bewegen, das wäre ein Riesenfaktor. Und ich hoffe auch, dass sich damit einige beschäftigen werden. Julia: Wenn man elektromagnetische Felder therapeutisch nutzen möchte, gibt, also hängt das dann mit der Frequenz zusammen oder? Moritz von der Borch: Ja. Da gibt's verschiedene Sachen, die Frequenz selbst, also da nochmal kurz, weil ich das ein paar Mal jetzt angeschnitten habe, verschiedene Systeme zum Körper arbeiten mit verschiedenen Frequenzen oder reagieren drauf am stärksten. Das heißt, sie sind in Resonanz damit, kann man es gerne so sagen. Das heißt, wenn ich eine Frequenz benutze, die auf der gleichen Welle ist sozusagen wie das Organ oder wie sagen wir mal die Schilddrüse irgendein System davon, dann reagiert die besonders stark darauf mit dieser Schwingung und wir haben eine Veränderung von Strukturen, wir haben Veränderungen der Bewegungen, bei positiven elektromagnetischen Feldern, das heißt es wird immer wieder ein Signal gesendet, kommt das System in Bewegung und fängt an aktiv zu werden? Das kann gut sein, das kann schlecht sein. Das heißt, es kommt die Frequenz an, Riesenpunkt auf jeden Fall und wenn ich eine Frequenz von 25 Hertz habe zum Beispiel, dann ist 50 eine harmonische, weil die sich in diesen Sinuskurven immer wieder treffen. Jetzt ist 50 Hz aber stärker als 25. Das heißt auch die Stimulierung, die Menge der Stimulierung wäre auch ein Punkt, das heißt, wir wechseln jetzt von 4G auf 5G zum Beispiel mit unseren Handys, ich habe einen stärkeren Puls. Da wird schon festgestellt, okay, bei der Frequenz reagieren die Schweißdrüsen besonders stark zum Beispiel. Mal gucken, was passiert. Julia: Ich meine, ich weiß jetzt nicht, ob du dich damit auch beschäftigt hast, weil es gibt ja diese Magnetfeldmatten. Was hältst du davon? Weil ich möchte ja dann die einstellen können, also spezifisch möchte ich erstmal wissen, welche Frequenz ich verwende und dann dürfte ich die die ja nur eben für jede Körperteile entsprechend eigentlich oder pro Organ oder je nachdem für den einen Anwendungsbereich dann spezifisch praktisch kalibrieren? Moritz von der Borch: Also erstens würde ich wahrscheinlich keinem Menschen, der sich nicht damit beschäftigt, die Möglichkeit geben, die Frequenzen einzustellen, weil das ist komplex. Hier muss ich auf jeden Fall auf einen Menschen oder einen Menschen hervorheben, das ist Daniel Knebel, der sogar im Mikrostrom und abhängig davon, was er stimulieren möchte, benutzt er verschiedene Frequenzen. Den habe ich auf dem FlowFest getroffen, wir haben uns sehr gut verstanden. Das ist ein unheimlich wertvoller Mensch. Wir werden wahrscheinlich da noch ein bisschen mehr weiter drüber reden, das heißt das ist zum Beispiel eine Möglichkeit das zu benutzen. Und es gibt wie gesagt auch genügend Studien, die sagen, es gibt positive Effekte. Was die Matten betriff, es gibt etwas, was generell als positiv bezeichnet wird und das ist die Schuhmann Resonanz, also 7,8 Hertz, auf die wir stark reagieren, die einen positiven Effekt hat. Und es gibt Matten, die zum Beispiel auf Gleichstrom arbeiten, das ist ein weiteres Thema, sollten wir vielleicht nicht zu stark drauf eingehen, aber es ist ein ganz guter Faktor, wenn ab und zu Gleichstrom verwendet wird statt Wechselstrom. Die arbeiten mit der Frequenz von der Schuhmann Resonanz, haben andere Effekte. Und du siehst gute, kardiovaskuläre Effekte, also das System kann sich auch entspannen, wie gesagt guter Effekt. Es gibt gute und es gibt unseriöse Konstrukte, die gemacht werden. Was auch zeigt und da stimme ich voll zu, dass wir immer noch sehr wenig über das Thema wissen. Wir beschäftigen uns damit, es gibt langsam Fortschritte, aber ich bin noch nicht der Meinung, dass wir das wirklich die Weisheit mit Löffeln gegessen haben. Ja, die Möglichkeit ist, dass es manche Matten gibt, die durchaus gut sind. Julia: Ja. Aber du hast jetzt da keine sonst irgendwelche Empfehlungen oder Selbsterfahrungen vielleicht? Moritz von der Borch: Also Empfehlungen werde ich versuchen eh immer zu vermeiden, einfach, weil ich selber den Wunsch habe ... Julia: Beziehungsweise worauf man achten muss, wenn man sich sowas kauft. Hast du da eine, ich frage das jetzt nur so, ob du da was hast, eine Art von, ja du musst schauen, dass das XY draufsteht oder wenn, aber es muss auch nicht sein, wenn das jetzt zu, wenn du jetzt gerade nichts ... Moritz von der Borch: Welche Frequenzen benutzen sie? Das ist schon mal super wichtig. Und wenn das natürliche Frequenzen sind, dann kann es selten schlecht sein. Wenn sie diese Frequenzen benutzen, sollten sie Gleichstrom benutzen. Absolut wichtiger Faktor. Vor allem, wenn man, ich glaube um Mitte des 20. Jahrhunderts, jetzt gehe ich doch noch ein bisschen drauf ein, weil man Mitte des 20. Jahrhunderts festgestellt hat, oh pulsierend oder Wechselstrom hatte massive, teils sehr negative Effekte bei Lebewesen und Gleichstrom fast gar nicht. Auch den Wechselstrom kann man positiv benutzen, nur es ist alles „weird“ es gibt ja und nein. Immer noch nicht. Es gibt so ja wahrscheinlich und nein eigentlich nicht. Aber grundsätzlich bei den Matten, vor allem, wenn man versucht zu imitieren, draußen auf dem Boden zu liegen, Erdung zu imitieren, dann sind auf jeden Fall zwei der wichtigsten Faktoren die Frequenz und Gleichstrom. Und ich möchte oder was ich auch häufig feststelle, dass die Leute, dass diese Matten nicht über die Steckdose funktionieren. Wenn ich darüber die Erdung beziehen möchte, das betrifft auch Erdungsmatten und solche Sachen, würde ich auf jeden Fall davon abraten, wenn diese Matten oder wenn diese Matten funktionieren, nicht die Erdung einstecke von der Steckdose. Der Punkt ist der, ich habe zwar eine Erdung, das stimmt, aber gleichzeitig laufen auf dieser Erdung alle möglichen Frequenzen, Magnetfelder übertragen sich, koppeln sich an diese Autobahn zum Körper selber hin. Das heißt die ganzen Spannungen in den elektrischen Stromleitungen in unserer Wand übertragen sich mit der Erdung auf dieses Band und führen sich wie zu einer Achterbahn auf unseren Körper hin. Das heißt wir haben die ganzen, da gibt's dann Sachen wie Dirty Electricity, aber auch die 50 Hertz, alles wird direkt zum Körper geführt. Und das ist nicht gut. Das heißt, nicht über Steckdose, vielleicht mit Batterie, Gleichstrom und welche Art von Frequenz. Julia: Ah so, super. Moritz von der Borch: Das wären so die ersten Punkte. Julia: Okay. Ja, weil es ist einfach eben, es ist einfach toll, wenn man mal jemand hat, der sich da so tief damit beschäftigt und auskennt und wie du weißt, es gibt so viel Zeugs da draußen. Moritz von der Borch: Man bekommt ein gutes, ich nenne das, ja so heißt das offiziell, mein BS-Meter, also dass ich ein bisschen verstehe, okay, was kann sein, was kann ich logisch erklären.Ich würde mich niemals als Mensch beschäftigen, äh bezeichnen, der viel drüber weiß. Nochmal, weil wir einfach zu wenig drüber wissen. Aber es gibt sehr gute Informationen. Julia: Im Verhältnis zu den 90 Prozent der Leute weißt du viel und bist da ein Experte und es ist einfach gut eben so eine Art von BS-Meter zu haben, um zu sagen, kann das sein? Ja, das ist so auch immer für jede Art von weiß nicht Claim, den ich höre, da läuft bei mir immer ab, all mein Wissen über Psychologie und Biochemie und ich denke mir und über Evolution und ich denke mir, kann das sein? Passt das da hinein in diese Basis, in dieses Basiswissen und wenn es da grobe Dissonanz gibt, dann denke ich mir: Hm. Moritz von der Borch: Hm, genau. Hier auch nochmal ein Danke an dich, Julia, weil das Thema ist Stress und EMF sind da ein Bestandteil, auf jeden Fall. Wie ich gerade beschrieben habe mit den Kalziumkanälen. Und ich möchte mich nur mal bei dir bedanken, dass du das Thema noch extra angesprochen hast, denn ich finde, dass es viel zu wenig diskutiert wird. Julia: Ja. Es ist einfach, also es ist super spannend, aber es ist auch nicht so leicht eben vernünftige und wissenschaftlich fundierte Aussagen zu bekommen. Deswegen mein Dank an dich zurück. Moritz von der Borch: Dankeschön. Julia: Wir haben jetzt, also du hast jetzt erklärt wie EMF wirkt und was die Problematik dran ist beziehungsweise, dass sie einfach da ist, vielleicht nicht gut oder schlecht ist, sondern vielleicht wie soll ich das jetzt sagen, es beeinflusst auch, wie und da können wir sozusagen wieder andocken an auch unser voriges Thema, wie unser Körper damit umgehen kann. Moritz von der Borch: Da fällt mir noch schön ein. Kalzium in den Zellen oder VGTC, das sind die Kalziumkanäle, sind zuständig für die Expression von so ziemlich allen Neurotransmittern im Gehirn, das heißt, die beeinflussen Depressionen, neuropsychiatrische ... Sagen wir so nebenbei erwähnt, das könnte vielleicht doch nicht so schön sein. Oder hier auch der wichtigste Punkt und da reden wir eigentlich über den, wie man mit Stress vor allem umgeht, ist auch, wenn man jetzt genau drüber nachdenkt und sagt, okay, jetzt habe ich diesen Input bekommen über elektromagnetische Felder, dann kommt der nächste Punkt, oh, das ist ja überall. (Julia: Eben) Was tue ich jetzt, oh mein Gott? Und so, also dann kommt diese Reaktion, dann habe ich, das habe ich auch ein paar Mal dann gesagt bei dem Event, sich über einen Stressor zu stressen noch zusätzlich, ist vielleicht nicht unbedingt die beste Idee. Sprich, wenn ich so viel Stress habe, kann man das glaube ich auf der Kamera sehen. (Julia: Ja?) Und ich kann so viel davon durch mein Wissen momentan reduzieren. Cool! Dann wäre das schon mal geschafft. So jetzt ist diese Menge aber noch über und daran kann ich gerade nichts ändern. Jetzt könnte ich mich voll drüber aufregen und sagen, oh mein Gott, die Welt ist eine Scheibe oder ich könnte einfach sagen, okay, das ist mein momentaner Stand, gut, dass ich was reduziert habe. Mal gucken, wenn ich irgendwas wieder reduzieren kann, was mein Ziel wäre, dann werde ich das tun. Wenn es aber nicht der Fall ist, okay. Und das war's. Und das ist bei allem auch ein wichtiger Punkt, weil oben drauf noch psychisch drauf zu reagieren, ist vielleicht nicht so die klügste Idee. Julia: Das ist klar. Aber wie gesagt, welche Möglichkeiten gibt's denn jetzt sozusagen sich einerseits vielleicht auf organischer Ebene sich fitter zu machen oder den Körper vorzubereiten beziehungsweise resilienter zu machen und natürlich habe ich eine vielleicht durch weiß ich nicht kann ich meine Mitochondrien irgendwie unterstützen, kann ich was ändern, wie der Körper oder wie sensibel der Körper vielleicht auf EMF reagiert? Moritz von der Borch: Es gibt Theorien über Kalziumblocker, also was jetzt EMF betrifft. Julia: Oder überhaupt, es muss jetzt nicht nur EMF sein, sondern generell Stress, Stressoren aus der Umwelt. Moritz von der Borch: Ja, das, ich glaube, das Coolste wäre wahrscheinlich jetzt erstmal so ein bisschen zu überlegen: Was gibt es eigentlich alles für so Stressoren? Mir fallen so ein paar Sachen ein, aber die sind unterschiedlicher Quelle, ob das jetzt die Arbeit ist selbst, ich meine, nicht jeder arbeitet in einem Bereich, wo er sagt "Ja!", steht morgens auf, springt aus dem Bett und sagt "Ja! Ich darf wieder einen Tag arbeiten.". Das passiert wahrscheinlich eher selten. Julia: Ja! Montag. Moritz von der Borch: Yeah! Montag. Voll gut. Das heißt, das ist ein potentieller Stressor für viele Leute auch da, von zum Beispiel 9 to 5, also von 9 Uhr bis 17 Uhr vorm Rechner zu sitzen oder sonst was. Und dann haben wir, da haben wir vorhin kurz drüber gesprochen, Schwermetalle, wir haben Toxine, wir haben Xenoöstrogene und so weiter, diese ganze toxische Belastung, die wir da haben aus Plastikflaschen, aus Kosmetika, aus dem ganzen System da, das sind alles Stressoren auch für unseren Körper. Unser Körper muss das entgiften können. Dann haben wir ein großes Thema, was auch zum Thema EMF kommt oder dazu gehört, das ist Licht und zwar der falsche Umgang mit Licht auch. Künstliches Licht, wenn draußen die Sonne, herumspringen. Schlaf, Riesenthema. Absolut und auch eine der Möglichkeiten, wenn man das gut macht, da auch wieder Toleranz aufzubauen. Schlaf ist einer der wichtigsten Faktoren überhaupt. Aber auch generell die Reizüberflutung, da möchte ich dir ein Beispiel geben. Ich war letztes Jahr von Weihnachten und Silvester hin, war ich in Tasmanien, extrem cooles Land, wunderbar, wunderschön, vor allem aber auch, weil es komplett Bereiche gibt, erstens, du kannst alles haben, vom Strand bis hin zu Tundra und Gebirge ist alles da. Gewaltige Seen und wunderschöne Natur. War absolut genial. Jetzt bin ich mit einer Freundin zusammen vom Norden von Tasmanien über den Westen runtergefahren nach Hobart, das ist die Hauptstadt und dann von Hobart wieder zurück. Und wir waren konstant, voll im Drive, haben in dem Auto geschlafen, haben auf Camping Sites übernachtet, komplett Wildnis, kaum ein Mensch. Und dann sind wir in Hobart angekommen, in der Hauptstadt von Tasmanien. Das war schon sowieso so ein bisschen seltsam, weil auf einmal waren überall Menschen. Aber den stärksten Effekt hatten wir beide, als wir, das gab's eine Einkaufsmeile in Hobart und da sind wir in die Unterführung rein und ich habe sehr, sehr schnell Kopfschmerzen bekommen, mir wurde übel, mir wurde schlecht, einfach nur, weil überall Lichter geblinkt haben, laute Musik, Signale und mein Kopf war nach diesen anderthalb Wochen Wildnis nicht mehr darauf gewöhnt, er hatte dieses System nicht mehr die ganze Zeit präsent gehabt und jetzt kam das mit voller Macht auf uns zu. Das Interessante ist, wir bekommen das vor allem, wenn ich in einer Stadt wie Berlin zum Beispiel lebe oder auch München, in größeren Städten, haben wir das jeden Tag. Also es ist nicht so, dass unser Körper sagt: Ah ja, das passt schon, sondern das bekommt man immer noch mit. Weil er über die Zeit übt, oder sich adaptiert, unheimlich cool eigentlich, damit zurechtzukommen. Die Reizüberflutung in der heutigen Zeit ist unglaublich. Julia: Ja. Ich glaube, das ist eben den wenigsten Leuten bewusst, wie belastend das tatsächlich ist auch ... Moritz von der Borch: Fahrt mal anderthalb Wochen in der Wildnis und fahrt dann in die Stadt zurück, macht das einfach mal. Julia: Ich denke, das hat auch sowas mit einer Art von Desensibilisierung zu tun, dass man einfach, wie wenn ich, ich meine, wenn ich mir eine Kleidung anziehe, spüre ich kurz den Stoff auf der Haut und irgendwann spüre ich ihn nicht mehr, weil da eine ständige Reizung da ist und ... Moritz von der Borch: Schönes Beispiel. Ja. Julia: Das würde mich wahnsinnig machen, wenn ich das jetzt ständig fühlen würde, aber es ist da und die Reizung passiert, meine Nerven wissen, dass Stoff da ist, aber es wird halt runter reguliert und ich glaube, sehr ähnlich passiert oder ist das auch, dass, wir sind in der Stadt oder wir haben dauernd Licht, Lärm, Leute um uns herum. Die Reize sind da, sie treffen auf uns ein, aber es wird von der Wahrnehmung her ... Moritz von der Borch: Gefiltert. Julia: Gefiltert. Ja. Moritz von der Borch: Genau. Julia: Und ich glaube, wenn man so ein schönes Detox macht, so einen menschlichen Detox, Zivilisations-Detox, dann ist das wie so ein weiß nicht, wie so ein Reset. Moritz von der Borch: Ja. Hat sehr viele positive Effekte auch. Man ist danach schon ein bisschen anders drauf. Von den Themen gibt es aber immer noch eines, was wahrscheinlich viele kennen, das ist Ernährung. Jetzt da zu sagen, welche derzeitige in „Favour“ stehende Ernährung eine gute Idee ist, da möchte ich mich davon zurückhalten. Was ich aber schon sagen kann, dass das zum Beispiel eine übergroße Ernährung mit Omega 6 negative Effekte auf den Körper zu haben scheint. Und da sind sich auch sehr, sehr viele einer Meinung. Künstliche Transfettsäuren. Es gibt natürliche, die ganz okay sind und auch gut sind, aber künstliche Transfettsäuren oder auch eine dogmatische Ernährung, sprich, wenn ich jetzt eine Ernährung materiell oder mental gekauft habe, die funktioniert nicht und ich habe langfristige Folgen. Dann kann das passieren, dass ich dann völlig genervt oder gestresst und überzeugt, das noch härter mache, und alles muss ja funktionieren. Und das kann durchaus auch ein Stressor sein für viele Menschen. Julia: Ganz sicher. Ja. Moritz von der Borch: Und zuletzt natürlich auch ganz großer Faktor, weil der Mensch ein soziales Wesen ist, sind soziale Interaktionen positiv oder in diesem Fall negativ oder Isolation. Und vor allem bei Menschen mit Depressionen kann das häufig auch dazu kommen, dass diese Menschen sich isolieren. Das ist in der Regel auch keine so gute Idee und es ist schwer da auch wieder rauszukommen. Aber definitiv ein Riesenfaktor. Die Psyche hat einen enormen Effekt auf unseren Körper. Julia: Ich glaube, das ist eben auf der einen Seite haben wir so viele Menschen um uns herum, aber auf der anderen Seite haben wir keine wirklichen sozialen Gruppen mehr. Also wir haben keinen Tribe mehr, keine Familie mehr. Moritz von der Borch: Ich wollte dich gerade fragen, wie viele Menschen haben wir heutzutage um uns herum? Wir haben Facebook, das sind keine Menschen, das sind soziale digitale Interaktionen. Das ist nichts mit Berühren, das ist nichts mit, dementsprechend dann auch, nehmen wir als Beispiel, was recht bekannt ist, Oxytocin oder sonst was, wir haben einfach nur, wir bekommen auf Facebook einen Daumen nach oben und haben eine Dopamin-Ausschüttung, das freut uns. Julia: Es ist halt super belohnend sofortig. Moritz von der Borch: Richtig. Additiv. Das hat nichts mit sozialen Interaktionen wirklich zu tun. Julia: Genau. Ich habe mal gelesen, dass das auch ein Grund ist, also auch natürlich das Fernsehen am Abend zum Beispiel, es suggeriert einem sozusagen dieses Sitzen ums Lagerfeuer gemeinsam eigentlich den Abend zu verbringen. Das ist ja auch das, was eigentlich evolutionär sicherlich heißt, dass man am Abend zusammensitzt und das im Kreise seiner Gruppe verbringt und ich glaube, das ist auch ein Grund, warum viele Leute einfach den Fernseher laufen haben, weil es wie ein Surrogate ist, wie ein Ersatz für Interaktion oder für menschliche Stimmen, dass man nicht einsam in seinem Wohnzimmer sitzt. Moritz von der Borch: Ja, ich meine, genau, nehmen wir das Beispiel mal, wenn kein Fernseher da wäre und du wärst alleine zuhause. Dann würdest du auf dem Sofa sitzen, ist vielleicht nicht so schön. Kannst noch ein Buch nehmen, dann ist wieder gut. Aber denkbar, klar. Ich meine, abgesehen davon, weshalb ein Fernseher seine eigenen Effekte hat zum Thema Licht zum Beispiel am Abend. Aber am Lagerfeuer zu sitzen und gemeinsam vielleicht irgendwie den Abend zu verbringen hat wahrscheinlich Gänsehaut-Effekt. Julia: Geschichten erzählen, musizieren, ist glaube ich auch extrem wichtig, Musik zu machen, Musikinstrumente sind auch schon ganz lange Teil unserer Geschichte und das ist, man hat manchmal gerade, wenn man jetzt so vielleicht im Paleo-Bereich unterwegs ist oder wo auch immer, ist oft ganz gerne eben der Fokus zu sehr vielleicht auf Ernährung oder es geht nur um die Nahrung. Die ist wichtig und das ist eine der Säulen sicherlich, weil wenn ich entzündungsfördernde Lebensmittel zu mir nehme, wird das einfach nicht positiv sein oder Nährstoffe, ich denke, so einerseits von der Ernährung her kann man sagen, sie sollte wenig möglichst entzündungsfördernd sein und nährstoffdicht. Ich glaube, da kann man vielleicht sich drauf einigen, aber dass einfach auch diese anderen Aspekte, wie du sie angesprochen hast, das Stressmanagement, der Schlaf, aber auch diese Sachen wie soziale Interaktion, wieder gemeinsam was tun, auch kreativ sein, was zeichnen, basteln, was herstellen ... Moritz von der Borch: Hobbys, Kunst. Ja. Julia: Was manuell machen und Musizieren. Moritz von der Borch: Und das, was du gesagt hast mit der Säule, fand ich schön. Da könnte man auch direkt mal die Zuhörer fragen: Hm, könnt ihr ein Haus auf einer einzigen Säule bauen? Julia: Genau. Moritz von der Borch: Und das ist vielleicht dann doch ein großer Punkt. Jetzt wegen Stressor, ach so ja, auch wichtiger Punkt ist zum Beispiel auch, kann ich den Stressor kontrollieren oder nicht? Riesenpunkt. Nehmen wir mal als Beispiel für einen kontrollierbaren Stress. Ich habe die Tendenz jetzt wieder zum Training zurückzugehen. Julia: Ja, hätte ich jetzt auch gedacht. Moritz von der Borch: Wahrscheinlich schon so. Das ist ein, ich meine, ich kann aufhören, wann ich möchte. Sowas zum Beispiel. Ich kann ein Ende setzen, ich kann die Intensität steuern, das ist alles gut. Ist wahrscheinlich auch ein gutes Beispiel, weil das können viele Menschen sich mit verbinden. Unkontrollierbarer Stress ist einfach etwas, was ich nicht auswählen kann. Da können wir wieder zu der Arbeit zurückgehen. Wenn mein Chef sich einen Spaß draus macht, mich jeden Morgen erstmal zur Sau zu machen, das zur Routine macht, hm, dann und ich dem nicht ausweichen kann, glaubt man, dann ist das ein sehr negativer Stress, vor allem, wenn er es jeden Tag macht, dann ist es ein chronischer Stress. Dann stehe ich auch morgens nicht auf und sage "Yeah! Montag", sondern sage "Oh nein!". Das sind zum Beispiel zwei Unterschiede. Ob man einen Stressor kontrollieren kann, ist enorm wichtig. Oder sich selbst bewusst zu machen, dass man ihn kontrollieren kann. Beispiel. Und da reden wir jetzt auch über Toleranz. Ich habe für das Unternehmen gearbeitet damals im Sportbereich und für mich war das so ein Zustand, so ja das ist nun mal so. Ich versuche mein Bestes damit umzugehen, versuche selber den Menschen zu helfen und das damit zu verbinden. Was übrigens cool war, weil dadurch hatten wir, ich war auch immer mit meinen Leuten da, hatten wir eine extrem geringe Fluktuation, weil die Menschen einfach glücklich waren. Schöner Seiteneffekt gewesen. Ich habe das auch so dann immer gemacht. Aber es gab andere Sachen, die mich immer wieder in einen Konflikt gebracht hatten und eigentlich war der für mich nicht kontrollierbar, weil ich hatte ja schließlich meine Arbeit bei diesem Unternehmen. Aber es gab eine Möglichkeit das zu kontrollieren und das war zu der Geschäftsführung zu gehen und zu sagen "Tschüss!". Das ist eine harte Entscheidung, aber ich habe mir selber oft gedacht, ich möchte nicht mit 30 an einem Herzinfarkt sterben. Das ist jetzt vielleicht ein bisschen stark gesagt, aber das ist doch meine Entscheidung, die ich dadurch getroffen habe. Aber sich selber auch immer bewusst zu machen, ich kann diesen Stressor kontrollieren, indem ich diese Entscheidung mache. Julia: Ich meine, noch schlimmer oder noch schwieriger wird es hat dann, wenn der Stressor halt in der eigenen Familie ist. Moritz von der Borch: Ja, also soziale Probleme oder soziale Konflikte in der Familie, ich meine heutzutage gibt's wahrscheinlich ziemlich viele von wie sagen wir mal einfach sowas wie, dass sich die Eltern scheiden oder streiten und nicht scheiden oder sonst etwas. Das ist ein Bereich, da würde ich fast sagen, wahrscheinlich ist ein Medizinjournalist nicht die richtige Person für den Bereich. Ich könnte höchstens sagen, was so meine eigene Einsicht darin ist und wie meine Meinung dazu ist und die ist auch nicht unbedingt von mir, sondern auch von Freunden oder durch Gespräche mit Freunden entstanden. Und der erste Punkt, ich meine, wenn ich jetzt einen Konflikt mit einem anderen Menschen habe und das ist jetzt mal nicht von zwei anderen, sondern sagen wir irgendwie, der eine denkt, ich bin doof, ich denke, dass der doof ist, und das stresst uns, wäre der erste Punkt an sich selbst zu arbeiten. Das mag schwierig sein, vor allem in dem Moment, weil man die ganze Schuld auf den anderen schiebt, aber häufig ist es so, dass für einen Konflikt zwei Menschen zuständig sind, nicht einer. Und deswegen sollte man vielleicht auch selber sich überlegen, ob man sich komplett fair verhalten hat, ob man, ob es nicht vielleicht auch ein Missverständnis war. Dass man, man denkt A und der andere bekommt B mit und das macht ihn sauer, obwohl A wäre für ihn auch lustig gewesen. Und so kommt es auch zu Konflikten und was nicht auszusprechen, sich mit dem anderen auszusprechen, ist ein Riesenfehler, weil man dann warum auch immer sich davor zurückhält, es könnte ja doof sein, ich möchte mich mit dem Menschen nicht konfrontieren, es gibt das Vermeidungsverhalten. Ich versuche es dann eher, in die Konfrontation zu gehen, kann auch schwierig sein, weil der andere vielleicht zurückschreckt, aber dann muss man so ein bisschen gucken, wie das mit der Situation ist. Und der wichtigste Punkt ist erstmal, über sich selbst nachzudenken oder das von dem anderen wahrzunehmen. Und was mir auch oder was mir auch, eine gute Freundin von mir erzählt hat, das ist Jasmin Emrich von NeoOsteo, ist eine sehr gute Freundin von mir, und sie hat auch gesagt, zu überlegen, was das Bedürfnis des anderen ist, sprich, warum verhält der sich so? Und sich darüber Gedanken zu machen, das ist unheimlich wertvoll, weil man sich in die Lage des anderen versetzt. Das ist Konfliktlösung und zwar das erfordert eine Offenheit von einem selbst, aber es ist enorm wichtig, um Konflikte zu lösen. Und hier auch, schlimmstenfalls, gut, familiär ist jetzt was Anderes, aber sagen wir unter Freundschaften, habe ich wirklich eine Art Energievampir oder sonst irgendwas anderes, dann muss man halt auch drüber nachdenken, egal wie sehr man diesen Menschen schätzt, diesen Kontakt abzubrechen, ihn zu konfrontieren, eine gewisse Zeit zu lassen und sagen wir mal, man hat einen Konflikt und der läuft schon eine Weile hin und sagt, okay, ich werde das noch 2 Monate versuchen zum Beispiel durch das, was ich gerade gesagt habe, diesen Konflikt zu lösen. Wenn das nicht funktioniert und das mich viel Kraft kostet, dann ist immer noch, um es zu kontrollieren, diese Möglichkeit da. Das ist zumindest inzwischen meine Denkweise über das Ganze. Wenn jetzt zum Beispiel, wenn man jetzt der Sohn ist und eine Mutter und ein Vater streiten sich, dann wird es schwierig. Und da sehe ich mich selber nicht an der Stelle das beurteilen zu können. Julia: Ja. Aber das war schon sehr gut. Ich denke, die Punkte, die Selbstreflexion, ist sicherlich wichtig, auch mal drüber nachzudenken, was ist von mir ausgegangen, weil wie gesagt, es gehören sicherlich immer zwei dazu und die andere Seite ist sicherlich auch, dass man sich versucht in die andere Person hineinzuversetzen und einfach diesen, im Blickwinkel des anderen versucht zu verstehen und ich meine, das ist auch eine wichtige persönliche Schulung denke ich, zu versuchen andere Menschen zu verstehen und sich hineinzuversetzen. Moritz von der Borch: Und das muss ich mir ständig auch immer selber sagen. Also ich bin absolut menschlich dabei. Wenn ich irgendwie genervt bin durch irgendwas, dann muss ich auch erstmal tief durchatmen, übrigens auch eine Möglichkeit Stresstoleranz zu beeinflussen, ist Atmung. Einfach mal, ich meine, es gibt verschiedene Techniken, die angepriesen werden, ich finde die Blockatmung ganz gut, also das heißt 4 Sekunden einatmen zum Beispiel, 4 Sekunden halten, 4 Sekunden ausatmen, 4 Sekunden halten und so weiter, weil sie einen dazu zwingt bewusst zu atmen, aber auch einfach mal tief einzuatmen und wieder auszuatmen ist schon ein Riesenfaktor. Weil, wenn ich gestresst bin, aufgeregt bin, dann vergesse ich, so komisch das auch klingt, oder vergesse ich richtig zu atmen, sonst würde ich umfallen, aber es ist dann meistens so eine Schlüsselbeinatmung, so dieses (Hechel-Geräusch simuliert) und das merkt man nicht ganz oder eine sehr flache Atmung, diese ganze Luft kommt eigentlich nicht ganz rein. Dann einfach das mal tief einatmen und wieder ausatmen, hat einen Rieseneffekt, kann jeder gerne jetzt auch machen, wenn er es hört. Einfach mal tief einatmen, tief ausatmen. Genau. Hat einen sehr angenehmen Effekt, einfach nur (Julia: Absolut), weil es, man merkt es auch sofort. (Julia: Ja) Und noch ein Punkt zu diesem, was ich gerade gemeint hatte, Vater zu Mutter und Kind, ich meine, da wäre das Problem nicht das Kind, was drüber nachdenken soll, sondern da sollen die Eltern mal drüber nachdenken. Wenn wir über Stress reden und wie das die Kinder beeinflusst, wenn die Eltern streiten, gibt allein, gut, da gibt's jetzt Versuche mit Mäusen, weil man das mit Menschen nicht unbedingt machen möchte, so jetzt streitet euch mal und setzt jetzt euch mal zu, hat man das Kind nur für ein paar Stunden am Tag von der Mutter entfernt, hat es eine ganz andere und viel extremere Stressreaktion als Mäuse, die nicht da war waren. Also der Bezug ist enorm wichtig. Und auch wieder in der heutigen modernen Zeit wird das stark vernachlässigt. Julia: Ja. Ich denke jetzt gerade an zwei Wochen nach der Geburt schon in die, zur Tagesmutter oder und ja et cetera, et cetera. Es ist eben leider ein zweischneidiges Schwert. Auf der einen Seite möchte man vielleicht zurück in den Beruf und nicht zu lange weg sein, aber auf der anderen Seite ist halt das Kind und die Beziehung zum Kind extrem wichtig und ich denke, so die ersten 3 Jahre sollte man, ist es wirklich zentral, dass man engsten Kontakt mit dem Kind hat (Moritz: Stimme ich zu. Ja.) und man schiebt immer alles auch so gerne auf, jetzt sind es halt die bösen Computerspiele und davor waren es vielleicht Krimis oder sonst was, aber ich denke, das ganze Bild ist wesentlich komplexer als das jetzt nur auf Computerspiele zu reduzieren, warum Kinder aggressiv sind und sich nicht konzentrieren können oder schwieriger sind. Moritz von der Borch: Da sind wir wieder bei dem Punkt, erstmal vielleicht an sich selbst arbeiten, erstmal überlegen, was habe ich vielleicht, bin ich ein Teil davon, bin ich ein Teil dieses Problems. Nun ja, was kann ich verbessern? Aber wenn wir jetzt zum Beispiel daran arbeiten wollen mit Stressoren besser umzugehen, ist der erste Schritt auch hier die Wahrnehmung von Stress. Da gibt's einige Studien dazu, die sich mit dem Thema beschäftigen und sagen, okay, wie reagiert jemand, wenn jemand zum Beispiel das eher als eine Herausforderung sieht als ein Problem? Das ist jetzt psychologische Tricks, das heißt, man sagt, okay, ich versuche bewusst zu sagen, dass es kein Problem ist, sondern ich sage, dass es eine Herausforderung ist. Das kann jeder auch wieder für sich versuchen. Das ist, mit Wörtern sich selbst zu beeinflussen und das funktioniert auf Dauer wirklich erstaunlich gut. Aber auch einfach so Sachen wie Optimismus und Pessimismus. Ja, das funktioniert eh nicht oder ja, jetzt machen wir es erstmal, jetzt schauen wir wie es funktioniert, erstmal Gas geben, was kann schlimmstenfalls passieren oder sonst was, einfach mal tun. Julia: Genau. Das ist super. Das finde ich auch immer sehr wichtig zu sagen, was ist das Schlimmste, was passieren kann? Moritz von der Borch: Und hier auch immer der Punkt, natürlich ist es leicht gesagt. Das weiß ich auch. Also ich kann das jetzt auch sagen, ich werde aber auch wöchentlich, monatlich, täglich vielleicht mit solchen Sachen konfrontiert und dann ist es aber auch wieder zu diesem Punkt, dass ich dann auch zu solchen Schritten zurückkehre, mich selber dran erinnern, zu sagen: Okay, es ist kein Problem, ich kriege das hin, mal gucken, wie es ist, das ist eine Herausforderung. Julia: Genau. Moritz von der Borch: Solche Schritte sind enorm wichtig. Das sind Steps, die kann jeder machen. Ich muss kein teures Auto dafür kaufen oder sonst irgendwas, eine Rieseninvestition machen, sowas wie Auto kaufen. Aber es ist einfach umzusetzen, man kann es Stück für Stück für sich einarbeiten. Und auch, wenn es am Anfang nicht klappt, einfach Zeit geben und im Laufe der Zeit versuchen umzusetzen. Julia: Super. Ja. Moritz von der Borch: Dann auch und da immer wieder das Mittelmaß finden, die Bewegung selbst, sich auszutoben ist eine gute Idee, exzessiv das als Rechtfertigung für irgendwas anderes zu finden, um sich mit körperlicher Betätigung selbst zu zerstören, ist keine Behandlung von Stress, sondern ein Stressor. Aber jetzt meinetwegen und wenn es auch nur ein Spaziergang im Wald ist, was eine coole Idee ist, ist ein sehr, sehr schöner Ausgleich. Und wenn ich sage, viele Menschen lieben die Natur, dann würdest du mir wahrscheinlich zustimmen, weil es einen beruhigenden Effekt auf uns hat. Einfach mal im Wald spazieren gehen, wenn man die Zeit hat und die Zeit findet man höchstwahrscheinlich. Dann das einfach mal nutzen, macht dann ruhiger. Meditieren wäre auch so ein Punkt, da muss ich sagen, es gibt manche Menschen wie mich, die vielleicht Schwierigkeiten damit haben könnten. Ich habe es ein paar Mal gemacht, ich habe auch mal, das war am Sonntag da gab's mal so ein Treffen, da haben wir auch zusammen meditiert und das ist auch immer ganz gut, wenn man es alleine nicht unbedingt machen möchte, vielleicht in einer Gruppe mit Freunden, mit denen man gerne zusammen ist. Da hat man gleich wieder soziale Interaktion auch dabei. Julia: Genau. Moritz von der Borch: Stressresistenz kann aber auch durch bestimmte Stimuli verbessert werden. Muss jeder für sich auch entscheiden, ob das gut funktioniert. Ich bin ein großer Freund von kalten Duschen und wer fortgeschrittener ist, kalt baden. Da gibt's einige Studien dazu, Stress Resilienz gehört auch dazu. Das ist auch oder zum Thema Kälte werde ich auch, du bist auch auf der Paleo-Convention? (Julia: Ja) Dann sehen wir uns da, das ist so ein Teil, den ich dann machen werde. Ich werde ein bisschen über Kälte erzählen. (Julia: Ah super) Das ist ein sehr, sehr interessantes Thema. Julia: (unv.) #00:56:28-1# Thema sein wird da über Kälte. Moritz von der Borch: Genau. Und ja, es gibt auch Supplemente, die man benutzen kann. Wobei ich bei den Supplementen oder Nahrungsergänzungsmitteln immer sage, ist so die erste Regel, first do no harm. Also erstmal keinen bewirken. Natürlich kann ich Sachen nehmen wie Serotonin Wiederaufnahmehemmer, um meine Depressionen zu verbessern, aber mit Vorsicht, weil wir wissen über diese Serotonin-Rezeptoren, wir kennen nicht mal alle und es kann, letztes Jahr Working Nature, also einem sehr anerkanntem medizinischen Journal kam raus, dass es zum Beispiel andere Rezeptoren gibt von Serotonin, die 5-HT1A war das glaube ich im Hirn, die durch Serotonin andocken bei einem Zustand von Angst zu haben. Also das ist so das Gegenbeispiel von füge keinen Schaden zu. Was man benutzen kann, wären zum Beispiel sogenannte Adaptogene. Adaptogene sind, haben ein paar Regeln, zum Beispiel, dass sie keinen Schaden anrichten dürfen, dass sie regulierend wirken und dass sie auf zellulärer Ebene arbeiten. Ein Beispiel dafür wären, gut das kennen die meisten, Gingko zum Beispiel, aber auch andere wie Rhodiola Rosea oder Ashwaganda. Ashwaganda klingt wunderbar vom Namen her, hat aber einen, also ich habe es, eines der wenigen Supplemente, die ich zuhause habe, wenn wirklich der Tag voller Herausforderung ist. Julia: Ja, das Wording ist alles. Moritz von der Borch: Absolut. Dass ich zum Beispiel davon etwas nehmen kann, einfach nur, weil es regulierend wirkt. Das heißt, es fährt mich nicht komplett runter, es putscht mich nicht komplett hoch, sondern es bringt mich auf ein normales Level. Super interessante Substanzen, die ich doch empfehlen kann, einfach nur, weil sie erstmal keinen Schaden zufügen. (Julia: Super) Und das eine Regel ist, damit man sozusagen als Adaptogen gelten darf. Julia: Ja. Moritz von der Borch: Hm, Schlaf. Riesenthema. Und da können wir gleich ein paar Sachen zusammenbringen. Was ist wichtig, damit du gut schläfst, was meinst du? Julia: Ähm ein ruhiges Umfeld. Dunkelheit. Moritz von der Borch: Ja. Dunkel, Licht. Julia: Und vor allem, also auf was ich achte, das kann ich dir jetzt da gleich zeigen. Moritz von der Borch: Yeah! Das ist auch so ein Ding. Ach stimmt, hatten wir auch die Dinger. Ich werde jetzt nicht das Ding über meine Brille, übrigens sieht sehr lustig aus, wenn
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19
Die Alzheimer Demenz (AD) ist eine degenerative zerebrale Erkrankung, die klinisch durch den Verlust vielfältiger kognitiver Fähigkeiten gekennzeichnet ist. Ein geringer Prozentsatz (65 Jahre) erfolgte im Sinne einer homogeneren Subgruppierung und sollte eine aussagekräftigere Assoziation der genetischen Vulnerabilitätsmarker ermöglichen. In die Kontrollgruppe wurden ausschließlich gesunde Probanden ohne demenzielle Erkrankungen in der Familie eingeschlossen. Neben einer grundsätzlichen Assoziation mit der AD wurde in einem zweiten Schritt der Zusammenhang zwischen den 19 Polymorphismen und der individuellen Gedächtnisleistung als intermediärer Phänotyp untersucht. Die Gedächtnisleistung wurde mittels standardisierter Tests erhoben. Die 19 SNPs (rs4412638, rs12024093, rs12043872, rs3009113, rs913858, rs12113404, rs12672536, rs4722589, rs10998072, rs10998076, rs1162757, rs16925347, rs1162756, rs1683152, rs784566, rs11170562, rs784563, rs2249381, rs1716966) wurden mittels iPLEX-Verfahren genotypisiert und die massenspezifischen Produkte im MALDI-TOF Massenspektrometer ausgewertet. Signifikante Assoziationen konnten dabei insbesondere zwischen den drei Genen HNRNPA2B1, PCBP2, ELAVL4 und der Alzheimer Demenz, sowie der Gedächtnisleistung festgestellt werden. Auf diesen drei Genen zeigten sich fünf Marker mit dem Phänotyp der AD bzw. insbesondere mit der EOAD assoziierbar: Auf ELAVL4 ließen sich rs3009113 und rs12024093 in der Patienten-Gesamtgruppe, sowie im EOAD-Kollektiv mit der AD assoziieren; auf PCBP2 waren rs784563 und rs2249381 in der Gesamtgruppe der Patienten auffällig; auf HNRNPA2B1 ließ sich rs4722589 mit der EOAD assoziieren. Diese und weitere Polymorphismen der angeführten drei Gene konnten sowohl in der EOAD- als auch in der LOAD-Gruppe mit einer verminderten Gedächtnisleistung assoziiert werden. In der Haplotypanalyse ließen sich diese Befunde grundsätzlich bestätigen. Zusammenfassend lassen die Resultate der vorliegenden Untersuchung einen Zusammenhang zwischen drei der untersuchten RBPs (HNRNPA2B1, PCBP2 und ELAVL4) und dem Phänotyp Alzheimer Demenz, sowie dem intermediären Phänotyp Gedächtnisleistung vermuten. SNPs in intronischen Bereichen können regulatorische Sequenzen wie die Polyadenylierung- oder Spleißfaktorbindungsstellen beeinflussen und zu Veränderungen in der Transkriptionsrate oder im Spleißprozess führen. Zudem kann durch Muationen die natürliche Aggregationsbereitschaft RNA-bindender Proteine, sich in RNA-granules zusammenzulagern, verstärkt werden und damit direkt zellschädigend wirken. Da über Funktion und Struktur der untersuchten RBPs gegenwärtig noch relativ wenig bekannt ist und es bislang keine vergleichbaren Referenzstudien bezüglich Alzheimer gibt, ist weiterführende Forschungsarbeit zur abschließenden Interpretation der Ergebnisse notwendig. Aufgrund der bis dato vorliegenden Ergebnisse stellen RNA-bindende Proteine insgesamt einen interessanten Kandidaten für die Alzheimerforschung dar.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19
Thu, 21 May 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18271/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18271/1/Rothe_Kathrin.pdf Rothe, Kathrin ddc:610, ddc:600, M
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19
Thu, 26 Mar 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18125/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18125/1/Sautner_Anna_Maria_Elisabeth.pdf Sautner, Anna Maria Elisabeth
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07
Ein Schädel-Hirn-Trauma (SHT) kann zu langfristigen neuropathologischen Störungen führen. Diese Veränderungen zeigen sich klinisch u. a. als motorische Ausfälle, kognitive Einschränkungen, erhöhte Neigung zu Krampfleiden, Veränderungen des Sozialverhaltens und vermehrtes Auftreten von neuropsychiatrischen Erkrankungen. Ziel der vorliegenden Studie ist eine verhaltensbiologische, histologische und molekularbiologische Charakterisierung der Langzeitauswirkung eines SHT im Mausmodell. Dabei soll festgestellt werden, welche der etablierten Testverfahren zur Validierung eines SHT nach mehreren Monaten genutzt werden können und wie sich ein verhaltensbiologisches Schadensmuster ohne Behandlung in diesem Zeitraum entwickelt. Histologische und molekularbiologische Analysen sollen erste Erklärungen für beobachtete verhaltensbiologische Effekte liefern. Als Modell für das SHT dient der Controlled Cortical Impact (CCI), Testobjekte sind geschlechtsreife männliche Mäuse vom Stamm C57BL/6, die zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (Testbeginn der verhaltensbiologischen Untersuchungen 14 Tage und ca. 6 Monate nach CCI) gemeinsam mit je einer Kontrollgruppe untersucht wurden. Folgende Testverfahren werden in chronologischer Reihenfolge durchgeführt: Elevated Plus Maze (EPM), Open Field (OF), Social Interaction (SI), Prepulse Inhibition (PPI), Rotarod, Morris Water Maze (MWM), Catwalk® XT, Pentylentetrazol-induzierte Krampfanfälle (PTZ) und der Visual Cliff Test (VC). Ergänzt werden diese Untersuchungen durch die Bestimmung des Schadens- und Gehirnvolumens (Nissl-Färbung), der Mikrogliazellaktivierung (Iba-1-Färbung) sowie der Genexpression einer Reihe von Inflammations-, Astrozyten-, Plastizitäts-, Mikroglia- und Neuritenwachstumsmarkergene. Wenige Wochen nach CCI zeigen sich Störungen der kognitiven (MWM) und motorischen (Rotarod; Catwalk) Fähigkeiten sowie eine erhöhte Auslösbarkeit von epileptischen Krämpfen (PTZ). Ein Teil der auf Angststörungen gerichteten Tests (OF; TST) zeigt ebenfalls signifikante Abweichungen zwischen den Testgruppen, wogegen andere Angstindikatoren (EPM; PPI) sowie das Sozialverhalten (SI) unbeeinflusst vom SHT bleiben. Mehrere Monate nach CCI ist keine bzw. nur eine deutlich abgeschwächte motorische Beeinträchtigung nachweisbar (Rotarod; Catwalk). Die erhöhte Krampfneigung (PTZ) und die kognitive Störungen (MWM) bleiben bestehen. Im Vergleich zum frühen Testzeitpunkt zeigt sich nach 6 Monaten eine verminderte Akrophobie (EPM). Demgegenüber können zum späten Testzeitpunkt keine Beeinträchtigung der Angst vor freien Flächen (OF) und depressive Verhaltensmuster (TST) mehr nachgewiesen werden. Lediglich das mit Schizophrenie-assoziierte Verhalten (PPI), die visuelle Wahrnehmung (VC) und das Sozialverhalten (SI) bleiben zu beiden Zeitpunkten ohne Beeinflussung durch das SHT. Die histologischen und molekularbiologischen Untersuchungen zeigen im Schadensbereich eine konstante Atrophie zu beiden Untersuchungszeitpunkten, nachlassende Inflammation, Mikrogliazellaktivierung und Astrogliose mit einem Maximum zum frühen Untersuchungszeitpunkt sowie eine lediglich mehrere Monate nach SHT geringfügig gesteigerte neuronale Plastizität. In der contralateralen Hemisphäre fällt Hypertrophie und Inflammation zum frühen Untersuchungszeitpunkt auf, wogegen mehrere Monate nach CCI keine Abweichung von der Kontrollgruppe mehr feststellbar ist. Die beobachtete Regeneration motorischer Defizite erklärt sich vermutlich mit zunehmender Adaptation an diese Einschränkung und damit verbundener zentralnervöser Plastizität u. a. auch in der contralateralen Hemisphäre. Dagegen wurde keine Rehabilitation der Störungen hippocampaler Funktionen (Beeinträchtigung der Orientierung und Kognition bzw. Neigung zu Krampfleiden) beobachtet, was auf eine eingeschränkte regenerative Plastizität des Hippocampus nach SHT hindeutet. Eine traumatisch bedingte Veränderung der Neurogenese oder der Balance zwischen synaptischer Inhibition und Exzitation können diesem Phänotyp zu Grunde liegen. Die Angst-assoziierten Veränderungen zeigen deutliche Abweichungen zu beiden Testzeitpunkten. Allerdings lässt sich hier festhalten, dass sich die Art der Beeinträchtigung weiterentwickelt und je nach Untersuchungszeitpunkt in einem anderen neuropsychiatrischen Muster sichtbar wird. Eine Einflussnahme bereits bestehender Störungen auf die Entwicklung neuer Defizite könnte dies erklären. Eine Beeinflussung des sozialen und Schizophrenie-ähnlichen Verhaltens, der visuellen Wahrnehmung sowie der klassischen Konditionierung durch das SHT kann nicht festgestellt werden. Zusammenfassend ermöglicht die Studie eine verbesserte Prognose bzgl. der Entwicklung von Verhaltensstörungen nach einem SHT in der kurativen Praxis und liefert zugleich eine Messbasis für die zukünftige Erforschung neuer Behandlungsstrategien des SHT. Die hier erworbenen Erkenntnisse konnten bereits erfolgreich als Grundlage für die Untersuchung von Propofol bzw. Xenon zur Therapie des SHTs genutzt werden.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19
Die diabetische Nephropathie ist derzeit weltweit der häufigste Grund für die terminale Niereninsuffizienz mit einem Anteil von einem Drittel aller Fälle. Im Verlauf der diabetischen Nephropathie kommt es zu einer zunehmenden Glomerulosklerose. Die Fähigkeit der parietalen Epithelzelle zur Ausbildung von extrazellulärer Matrix und ein möglicher Beitrag zur Glomerulosklerose ist bislang unklar. Daher sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle bei der diabetischen Nephropathie vermehrt extrazelluläre Matrix bildet und dadurch die Bowman’sche Kapsel verdickt. Diese Frage wurde unter Verwendung einer immortalisierten murinen parietalen Epithelzelllinie und einer primären humanen parietalen Epithelzelllinie im Zellversuch und Stimulation dieser Zellen mit hoher Glukosekonzentration (30mM), TGF-β1 und „advanced glycation endproducts“ nachgegangen. Außerdem wurde retrospektiv die Bowman’sche Kapsel von sechs humanen Nierenbiopsien mit diabetischer Nephropathie per Licht- und Transmissionselektronen-mikroskopie untersucht. Im ersten Schritt war die Aktivierung der parietalen Epithelzelle unter diabetischer Kondition Fokus der experimentellen Untersuchung. Hier lag ein zellspezifischer Effekt vor. Während für die humanen parietalen Epithelzellen keine funktionellen oder morphologischen Zeichen der Aktivierung gefunden werden konnte, zeigten murine parietale Epithelzellen eine Aktivierung nach Stimulation mit TGF-β1. Der zweite Schritt bestand in der Untersuchung der Bildung von TGF-β1 in parietalen Epithelzellen. Auch hier konnten unterschiedliche Stimulationseffekte bei den murinen und humanen parietalen Epithelzellen beobachtet werden. Während die humanen parietalen Epithelzellen weder auf Transkriptions-, noch auf Translationsebene eine geänderte Expression zeigten, exprimierten die murinen parietalen Epithelzellen in einem positiven Feedback-Mechanismus auf Transkriptionsebene verstärkt TGF-β1 nach Stimulation mit TGF-β1. Auf Translationsebene konnte eine verstärkte Bildung von TGF-β1 nach Stimulation mit „advanced glycation endproducts“ und eine verminderte Bildung nach Stimulation mit Glukose beobachtet werden. Der dritte Schritt beinhaltete die Untersuchung der Kollagenbildung in den parietalen Epithelzellen und die Vermessung der Bowman’schen Kapsel. Während Glukose in keiner der Zelltypen zu einer Änderung der Kollagengenexpression führte, induzierte TGF-β1 in den humanen und murinen parietalen Epithelzellen eine Hochregulation der Genexpression verschiedener Ketten von Kollagen IV und Kollagen I α 1. „Advanced glycation endproducts“ verstärkten die Transkription der Kollagene in den humanen parietalen Epithelzellen, wohingegen sie diese in murinen parietalen Epithelzellen herunterregulierten. In der retrospektiven histologischen Untersuchung von sechs Patienten mit diabetischer Nephropathie und sechs Vergleichspatienten wurde per Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie die Dicke der Bowman’schen Kapsel vermessen. In den lichtmikroskopischen Messungen zeigte sich für die Patienten mit diabetischer Nephropathie eine signifikant verdickte Bowman’schen Kapsel. Diese Verdickung konnte bei Patienten mit diabetischer Nephropathie in den transmissionselektronenmikroskopischen Messungen bestätigt werden. Letztlich ist die Lichtmikroskopie die geeignetere Messmethode, weil hier eine höhere Anzahl an Glomeruli gemessen werden kann und sie einen Selektionsbias ausschließt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle unter diabetischer Kondition verstärkt extrazelluläre Matrix bildet und diese basal ablagert. In den murinen parietalen Epithelzellen ergaben sich Hinweise auf den Mechanismus der Aktivierung und einen positiven Feedbackmechanismus von TGF-β1 bei der diabetischen Nephropathie. Die Verdickung der Bowman’schen Kapsel ist von klinischer und diagnostischer Bedeutung, da die Ausbildung der parietalen Fibrose viele Funktionen der parietalen Epithelzellen und Bowman’schen Kapsel einschränkt und der Glomerulus letztlich sklerosiert bzw. verödet. Diagnostisch werden künftige Studien den Wert der Dickenmessung der Bowman’schen Kapsel als zusätzliches pathologisches Kriterium der Stadieneinteilung der diabetischen Nephropathie zeigen.
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Das Mammakarzinom ist weltweit mit über 508.000 Sterbefällen die häufigste krebsbedingte Todesursache. Um dennoch eine Heilung erzielen zu können, existiert ein multimodales Therapiekonzept mit kurativer Absicht. Zu diesem Konzept gehört unter anderem auch die gezielte Krebstherapie, bei welchem sich ein Pharmakon spezifisch gegen Tumorantigene richtet. Da viele Tumorantigene jedoch nicht von allen Mammakarzinomen exprimiert werden, ist die Suche nach weiteren potentiellen Zielen für dieses Konzept sinnvoll. In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Expressionsverhalten einiger relevanter Antigene analysiert. Dabei wurden die Antigene Mucin1, sein Epitop, das Thomsen-Friedenreich Antigen und die Tyrosinkinase Her4, beziehungsweise seine aktivierte, phosphorlierte Form phospho-Her4 untersucht. Mucin1, einem beim Mammakarzinom überexprimierten Transmembranprotein wird dabei eine wichtige Rolle in der Tumorprogression zugeschrieben, indem es sich während der Tumorgenese anreichern und somit die Genexpression beeinflussen kann. Das TF-Antigen wird hauptsächlich von Karzinomen und embryofetalem Gewebe gezeigt. Als Oberflächenepitop wird ihm Einfluss auf Adhäsions- und damit Metastasierungsprozesse zugeschrieben. Die Rolle von Her4 in der Tumorprogression dagegen ist trotz Verwandschaft zum bekannten Onkogen Her2/neu nicht ganz geklärt. Sowohl tumorsupressives, wie auch onkogenes Potential sind beschrieben. In der vorliegenden Studie wurden nun die genannten Antigene zu ihrem Verhältnis zur Zelldifferenzierung und zu ihrer Verteilung bezüglich des histologischen Subtyps, sowie der Herdverteilung untersucht. Des Weiteren wurden die Korrelationen der Antigene untereinander analysiert. Dabei wurde Tumorgewebe von 235 operierten Mammakarzinompatientinnen untersucht. Die in Paraffin eingebetteten Gewebeproben wurde dabei per ABC-Methode immunhistochemisch gefärbt, mittels IRS-Score nach Remmele und Stenger bewertet und danach mit dem Kruskal-Wallis Test, dem Mann-WhitneyTest und der Korrelationsanalyse nach Pearson statistisch ausgewertet. Des Weiteren wurde das Überleben der Patientinnen in Abhängigkeit ihres Mucin1-Expressionsmusters mittels Kaplan Meier Analyse und Cox-Regression untersucht. 6. Zusammenfassung - 69 - Bei der optischen Auswertung von Mucin1 fallen zwei verschiedene Färbereaktionen auf, sodass bei der weiteren Analyse eine membranständige von einer zytoplasmatischen Expression differenziert werden konnten. Auch bei Her4/phospho-Her4 ist die Expression vor allem intrazellulär auszumachen, trotz der Tatsache, dass es sich bei Her4 um ein Transmembranprotein handelt. Eine Erklärung hierfür könnten Veränderungen der Zellstruktur bei Tumoren liefern. Verschiedene Autoren konnten diesbezüglich zeigen, dass in Karzinomen sowohl Mucin1 als auch Her4/phopho-Her4 ihre Lokalisation von der Zellmembran ins Zellinnere verlegen können, um sich dadurch über Beeinflussung der Genexpression am Tumorwachstum zu beteiligen. Das Thomsen-Friedenreich Antigen befindet sich dagegen wie bei einem Oberflächenepitop zu erwarten an der Zellmembran. Die statistische Auswertung beschreibt vor allem bei schlecht differenzierten (G3), duktal-klassifizierten Mammakarzinomen hochsignifikante, positive Korrelationen des zytoplasmatischen Mucin1 mit dem TF-Antigen und mit phosho-Her4. Jenes zytoplasmatische Mucin1 zeigt dabei ein schlechteres Überleben als die membranständige Mucin1-Expression. Diese signifikanten Korrelationen und die Erkenntnis, dass zytoplasmatisch-exprimiertes Mucin1 die Genexpression zu beeinflussen vermag, könnten einen Erklärungsansatz für die TF-Expression bei Karzinomen liefern, deren Regulation noch nicht vollständig geklärt ist. Genauer gesagt, eine Interaktion der beiden Akteure untereinander bei schlecht differenzierten, duktalen Karzinomen ist durchaus denkbar. Die Regulation der proteolytischen Verlagerung von Her4/phospho-Her4 ins Zellinnere, welche Her4 erst ein onkogenes Potential verleiht, ist ebenfalls auf weiten Strecken unerforscht. Auch hier könnte durch die beschriebene Korrelation eine Interaktion mit Mucin1 mitverantwortlich gemacht werden. Wenn eine Zusammenarbeit der beschriebenen Antigene auch auf molekularer Ebene nachgewiesen werden könnten, würden diese ein denkbares, potentes Ziel für die beschriebene „targeted therapy“ darstellen. Denn eine antagonisierende Therapie gegen Proteine, die sich gegenseitig beeinflussen lässt eine Verstärkung der Therpiewirkung, im Sinne eines pharmakodynamischen Synergismus erhoffen. Die intrazelluläre Lage der Antigene könnte dagegen ein pharmakokinetisches Hindernis bei einer monokloalen Antikörpertherapie darstellen.
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Thu, 31 Jul 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17266/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17266/1/Boehmer_Jens.pdf Böhmer, Jens ddc:610, ddc:600, Medizinisch
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Der humane Thyreotropin-Rezeptor (TSH-R) steuert die zentralen Funktionen der Schilddrüse und ist der wichtigste Regulator für deren Wachstum und Differenzierung. Er gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und kann nach einer Stimulation mit TSH die G-Proteine aller vier Familien (Gs, Gi/o, Gq/11 und G12/13) aktivieren. Dabei werden die meisten zellulären Reaktionen wie die Proliferation der Schilddrüsenepithelzellen und die Bereitstellung der Schilddrüsenhormone einer Aktivierung von Gs zugeordnet. Zu Gs-unabhängigen Signalwegen des TSH-R war dagegen erst wenig bekannt. Da der Gq/11-vermittelte Signalweg durch die Aktivierung der Phospholipase C und Proteinkinase C in maligne Prozesse von Schilddrüsenzellen involviert sein könnte, sollten in der vorliegenden Arbeit Gq/11-abhängige Effektoren des TSH-R in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen identifiziert und näher charakterisiert werden. Als Modellsystem wurden FTC 133 wt TSH-R Zellen verwendet, eine follikuläre Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie, die den humanen TSH-R überexprimiert. In diesen wurde die Aktivierung des Calcium/Calcineurin-abhängigen Transkriptionsfaktors NFAT nach TSH-Stimulation erstmalig beschrieben. Bei einer anschließenden Reihenuntersuchung der NFAT-abhängigen Zielgene Autotaxin, VEGF, c-Myc, Regulator von Calcineurin 1 (RCAN1) und Cyclooxygenase-2 (Cox-2) wurden c-Myc, RCAN1 und Cox-2 als TSH-regulierte Gene identifiziert. Die Induktion von c-Myc war unabhängig von NFAT, dagegen bestätigten Expressionsstudien mit Calcineurin-Inhibitoren und dem spezifischen NFAT-Inhibitor INCA-6, dass RCAN1 und Cox-2 durch eine NFAT-Aktivierung induziert wurden. Diese Aktivierung wurde durch Gq/11-Proteine vermittelt, denn nach spezifischer Herunterregulation der Gq- und G11-α-Untereinheiten mittels siRNA konnten die Zielgene nicht mehr TSH-abhängig induziert werden. Weitere Analysen zum Mechanismus der NFAT-Aktivierung zeigten, dass eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration ([Ca2+]i) allein über intrazelluläre Speicher nicht ausreichend war. Um NFAT zu aktivieren, mussten zusätzlich Calciumionen aus dem Extrazellulärraum einströmen. Untersuchungen mit dem STIM1-Inhibitor SKF-96365 wiesen dabei auf einen Calciumioneneinstrom über Speicher-operierte Ionenkanäle hin. Zusätzlich zur NFAT-regulierten Genexpression wurde in dieser Arbeit die TSH-induzierte Expression des Metallothioneins MT1X in FTC 133 wt TSH-R Zellen und in primären Thyreozyten analysiert. Die mRNA Induktion dieses Cystein-reichen und zytoprotektiven Proteins war ebenfalls abhängig von einer Expression der Gq/11-Proteine. Eine Erhöhung der [Ca2+]i reichte jedoch nicht aus, um MT1X signifikant zu induzieren. Zur gesteigerten Expression war darüber hinaus auch die Aktivierung der Proteinkinase C notwendig. In der vorliegenden Dissertation konnten somit RCAN1, Cox-2 und MT1X als Gq/11-regulierte Zielgene des humanen TSH-R charakterisiert werden. Dabei wurde eine NFAT-regulierte Genexpression nach einer TSH-Stimulation erstmalig gezeigt. Die präsentierten Ergebnisse weisen damit auf eine bisher unbeachtete biologische Rolle von Gq/11-abhängigen Signalwegen des humanen TSH-R in der Schilddrüse hin.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19
Tue, 18 Mar 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16790/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16790/1/Limbeck_Elisabeth.pdf Limbeck, Elisabeth ddc:610, ddc:6
Der Streit, ob den Genen oder der Umwelt die größere Bedeutung für den Phänotyp zukommt, ist alt. Die relativ junge Wissenschaft der Epigenetik zeigt, dass die Interaktion zwischen Genen und Umwelt weit dynamischer und komplexer ist als gedacht. Denn epigenetische Modifikationen können die Genexpression und damit den Phänotyp modulieren, ohne dass Mutationen vorliegen.
Der Streit, ob den Genen oder der Umwelt die größere Bedeutung für den Phänotyp zukommt, ist alt. Die relativ junge Wissenschaft der Epigenetik zeigt, dass die Interaktion zwischen Genen und Umwelt weit dynamischer und komplexer ist als gedacht. Denn epigenetische Modifikationen können die Genexpression und damit den Phänotyp modulieren, ohne dass Mutationen vorliegen.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19
Die Schizophrenie ist eine psychiatrische Erkrankung,die phänotypisch in vielgestaltigen Querschnittsbildern auftreten kann.Die Äthiopathogenese der Schizophrenie ist bis heute nicht geklärt.Es wird aber davon ausgegangen, dass sie einem polygenen Erbgang folgt und multifaktorielle Bedingungen zum Ausbruch der Krankheit führen.Ein alternativer Ansatz versucht nun mithilfe von klar definierten Endophänotypen Gene zu identifizieren, die mit neuroanatomischen, neurophysiologischen oder biochemischen Korrelaten einer Erkrankung assoziiert sind.In Zusammenhang mit der Schizophrenie gehören Lern- und Gedächtnisfunktionen zu den häufig untersuchten Endophänotypen. Das Gen für den Brain-Derived-Neurotrophic-Factor (BDNF) auf Chromosom 11 ist ein Neurotrophin, das im adulten ZNS protektiv und regenerativ auf Neuronen und Motoneuronen wirkt. BDNF wird stark im Hippocampus exprimiert, einer Hirnregion, die in Lern- und Gedächtnisfunktionen involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass BDNF in die hippocampalen Funktionen der Langzeitpotenzierung eingreift. Unter Berücksichtigung der Omnipräsenz des BDNF im humanen Gehirn liegt auch die Vermutung nahe, dass veränderte Genexpression oder Funktionalität dieses Neurotrophins neuronale Krankheiten begünstigen oder bedingen können. In diesem Zusammenhang wird auch eine Assoziation von BDNF mit Schizophrenie diskutiert. Ein im humanen BDNF-Gen häufig vorkommender Polymorphismus ist der SNP rs6265 an Position 196 der mRNA. Er bewirkt einen Aminosäureaustausch von Valin nach Methionin und wurde bereits intensiv in Zusammenhang mit Schizophrenie untersucht. Die vorliegende Studie untersuchte an 135 schizophrenen Patienten kaukasischer Abstammung und 313 gesunden Kontrollprobanden deutscher Abstammung, ob ein Zusammenhang zwischen dem rs6265 und Schizophrenie oder Gedächtnisleistungen nachzuweisen ist. Mit einer adaptierten deutschen Fassung der Welcher Memory Scale Revised (WMS-R) wurde bei allen Studienteilnehmern Gedächtnisleistungen erfasst. Anschließend erfolgten die Analysen der Allel- und Genotypfrequenzen sowie die Zuordnung zu den Ergebnissen aus den Gedächtnistests. Im Ergebnis konnte in der Fall-Kontroll-Assoziationsstudie keine signifikante Assoziation zwischen dem rs6265 und Schizophrenie festgestellt werden. Darüber hinaus konnte in der Endophänotypenstudie keine Assoziation zwischen rs6265 und Gedächtnisleistungen nachgewiesen werden. Ein Trend zeigte sich aber im Untertest „Verbales Gedächtnis“ des WMS-R. Dabei erzielten Met-Homozygote im Durchschnitt bessere Leistungen als Träger des Val-Allels. Ob der rs6265 die Gedächtnisleistungen oder die Suszeptibiltät für Schizophrenie beeinflusst, konnte mit dieser Arbeit nicht abschließend geklärt werden. Folgestudien mit strikten Ein- und Ausschlusskriterien und größeren Stichproben sind nötig, um diese Frage abschließend zu klären.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/07
Typ I Interferon stellt einen essentiellen Teil der angeborenen Immunantwort dar und besitzt antivirale und immunmodulatorische Eigenschaften. Diese Funktionen werden durch die Induktion sogenannter Interferon-regulierter Gene (IRGs) vermittelt, deren Expression in der Zelle nach Bindung von IFN an seinen Rezeptor reguliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es mit Hilfe verschiedener Ansätze erstmals, eine umfassende Anzahl Typ I Interferon-regulierte Gene beim Huhn zu identifizieren. Hierzu wurden umfangreiche Datenbankrecherchen und Transkriptomanalysen von Milz und Lunge sowohl nach Applikation von rekombinanten Hühner Interferon alpha, als auch einer Infektion mit Newcastle Disease Virus, einem starken IFN Induktor, durchgeführt. Etwa 30% der hierbei gefundenen IRGs wurden auch im Säugetier als solche beschrieben (allgemeine IRGs), weitere 1.900 Gene, die im Huhn nach Injektion von rekombinanten Hühner Interferon alpha exprimiert wurden sind jedoch beim Säuger in dieser Form nicht bekannt (neu identifizierte IRGs). Die eingehende Charakterisierung der Hühner-IRGs zeigte, dass „neu identifizierte“ und „allgemeine IRGs“ an ähnlichen immunrelevanten Prozessen und Signalwegen beteiligt waren, wie der Komplement Kaskade, der TLR Signalkaskade und Zytokin-Interaktionen. Auch durch Netzwerkanalysen konnte gezeigt werden, dass die Expression von „allgemeinen“ und „neu identifizierten IRGs“ in engem Zusammenhang miteinander steht. Durch die Untersuchung von verschiedenen Zeitpunkten konnte nachgewiesen werden, dass manche der im Huhn identifizierten IRGs in Milz und Lunge nur drei Stunden nach IFN Injektion stark exprimiert wurden, und andere IRGs über einen Zeitraum von neun Stunden konstante oder auch dynamische Expressionsprofile aufwiesen. Auch fiel eine Dynamik in der Genexpression in den verschiedenen Organen auf, da viele IRGs schon drei Stunden nach IFN Injektion in der Milz, aber erst neun Stunden nach IFN Injektion in der Lunge stark exprimiert wurden. Dabei unterschieden sich zahlreiche nach IFN Injektion und NDV Infektion regulierten IRGs in Milz und Lunge, während andere IRGs in beiden Organen exprimiert wurden, was darauf schließen lässt, dass viele IRGs gewebespezifisch und andere eher global exprimiert werden. Eine Vielzahl der nach IFN Applikation identifizierten IRGs konnte auch im Infektionsmodell mit lentogenem Newcastle Disease Virus bestätigt werden. Zudem gelang es, weitere „allgemeine IRGs“ zu identifizieren, was vermutlich auf die zusätzliche Expression von Typ II und Typ III IFN nach NDV Infektion zurückzuführen ist. Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass sich die durch IFN induzierten Gene beim Huhn zwischen den untersuchten Geweben und je nach Stimulus unterscheiden und neben den auch beim Säuger beschriebenen, eine Vielzahl an weiteren IRGs identifiziert werden konnte. Die erhaltene Übersicht von IRGs im Huhn kann nun als Grundlage genutzt werden, um potentielle antiviral wirksame IRGs auszuwählen und sie funktionell näher zu charakterisieren. Ein besseres Verständnis der IFN-Wirkungsweise beim Vogel könnte wesentlich zum Schutz von Huhn und Mensch vor gefährlichen Pandemien beitragen.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/07
In dieser Studie wurde die Kompetenz des Immunsystems von Turopolje (TxT), Deutsche Landrasse x Pietrain (LxP) und Deutsche Landrasse x Turopolje (LxT) verglichen. Die verschiedenen Rassen sind Vertreter einer alten und einer modernen Rasse und einer Kreuzung von beiden. Hauptziel war es zu untersuchen, ob sich die verschiedenen Rassen in ihrer Immunabwehr gegenüber einer Infektion unterscheiden und wie das Immunsystem durch Stressoren belastet wird. Außerdem wurde untersucht, ob sich LxT zur kommerziellen Mast eignet. Unterschiede in der Sekretion von Immunglobulin G und M im Kolostrum und reifen Milch der Deutsche Landrasse und Turopolje Sauen, sowie deren Aufnahme durch die Ferkel wurde mittels ELISA untersucht. Nach dem Absetzen der Ferkel wurden zwei getrennte Gruppen gebildet: Die erste Gruppe wurde mit einem attenuierten Lebendimpfstoff gegen das Porzine Reproduktive und Respiratorische Syndrom Virus (PRRS MLV) immunisiert, um eine Infektion zu simulieren. Die Fragmente des PRRS MLV wurden aus dem Serum, den Leukozyten, den Tonsillen und dem Lymphonodus tracheobronchale extrahiert und mittels qRT-PCR gemessen. Durch ELISA wurden die Konzentrationen der Interleukine-1β, 6, 10 und 12 gemessen. Die Genexpression von CD163, SIGLEC1, Mx1, TLR7 und TLR8, TRAF6, Myd88, Interleukin 1, 6, 8, 10, 12, TNFα, TGFβ und CXCL12 wurde näher untersucht. Innerhalb der nicht geimpften Gruppe untersuchte man den Einfluss von Stress auf das Immunsystem. Hierbei wurde die Konzentration von Interleukin 6, 10, 12 im Plasma mittels ELISA, die Genexpression in den Lymphozyten durch qRT-PCR von Interleukin 1β, 6, 10, 12 und TNFα bestimmt. Außerdem wurde eine mitogenstimulierte Lymphozytenproliferation mittels Lumineszenzmessung durchgeführt. Bei beiden Gruppen wurde ein Differentialblutbild angefertigt, um Veränderungen im weißen Blutbild untersuchen zu können. Weiterhin wurde mittels ELISA die Immunglobulinkonzentration G und M im Serum untersucht. Es wurde in der Gruppe der immunisierten Tiere sichtbar, dass die Rassen unterschiedlich auf die Vakzination reagierten. TxT zeigt keine Konzentrationsveränderung von Interleukin 1β im Plasma. Durch die unveränderte Konzentration des Interleukins könnten vermehrt zytotoxische T Zellen gebildet werden. Als Folge wird TNFα aufreguliert. TNFα inhibiert CD163, daher wird nur eine geringe Anzahl von B-Zellen aktiviert und es werden spezifische Antikörper gebildet. Im Gegensatz dazu reagieren die beiden anderen Rassen mit einer Immunantwort des Typs 2. Die oben beschriebene Inhibierung kann nicht stattfinden und es kommt zur Synthese der B-Zellen und zu einer erhöhten Konzentration an Immunglobulinen und spezifischen Antikörpern. Die Ergebnisse meiner Studie können tendenziell den Einfluss des Stresses auf das Immunsystem bestätigen. So deuten bei TxT die geringere Immunglobulinkonzentration und das Differentialblutbild darauf hin, dass die Immunreaktion auf Stress eher auf T-Zellen basiert (Immunreaktion Typ 1). Auch bei LxT und LxP scheint es, dass die Immunantwort Typ2 und eine Hochregulation der Genexpression von IL6 und die Konzentration im Plasma dominieren. Weiterhin besteht eine Tendenz, dass TxT auf Stress robuster reagieren als die beiden anderen Rassen. Nach der Schlachtung wurden die Schweinehälften aller Rassen und Gruppen mittels der SEUROP-Klassifizierung eingeteilt und bewertet. Bei Schweinen, die in der 25. Lebenswoche geschlachtet wurden, untersuchte man zusätzlich den Tropfsaftverlust und das intramuskuläre Fett. Im Vergleich der Schachtkörper und Fleischqualität schnitten die Tiere der Kreuzungsrasse (LxT) qualitativ am besten ab. Schlussfolgernd ist die Kreuzungsrasse (LxT) zur Mästung als Nutzungsrasse geeignet. Sie stellt eine Bereicherung innerhalb der kommerziellen Schweinefleischproduktion dar.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 15/19
Die Magnetresonanztomografie (MRT) ist ein wichtiges diagnostisches Mittel um kartilaginäre Läsionen frühzeitig erkennen und effektiv behandeln zu können. MRT Untersuchungen erlauben die Diagnose von kartilaginären Schäden ohne den Einsatz von radioaktiver Strahlung, wie sie im Röntgen oder CT Verwendung findet. Obwohl MRT Untersuchungen als generell sicher gelten, gibt es bisher keine eindeutigen Untersuchungen über die Auswirkung von hochfrequenten, starken Magnetfeldern auf humane Zellen. Die Wirkung von Magnetfeldern, wie sie in der MRT Diagnostik verwendet werden, auf Chondrozyten und den unter anderem von Chondrozyten gebildeten Knorpel ist bis jetzt nur unzureichend untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Auswirkungen eines 3 Tesla Magnetfeldes auf die Proliferationsrate und Genexpression humaner Chondrozyten zu evaluieren. Dafür wurden humane Chondrozyten einer 3 T MRT Sequenz ausgesetzt, wie sie zur Untersuchung am Knie verwendet wird. Die Proliferationsrate 1, 5 und 10 Tage nach Exposition wurde mit Hilfe eines WST-1 Proliferations Assay bestimmt und mit jener einer Kontrollgruppe verglichen. Gleichzeitig wurde die RNA Expression von Proteinen bestimmt, die entweder Chondrozyten- oder Apoptosespezifisch sind. Beim Betrachten der Ergebnisse zeigte sich, dass Chondrozyten, die einem 3 T Magnetfeld ausgesetzt waren, 10 Tage nach Exposition eine im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant gesteigerte Proliferationsrate aufwiesen. Apoptose spezifische RNA wurde an den Tagen 1 und 5 nach Exposition im Vergleich zur Kontrollgruppe geringer exprimiert
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/07
Bei Kühen werden die fetalen Membranen physiologischerweise innerhalb weniger Stunden nach der Abkalbung abgestoßen. In 3 - 12 % allerdings gelingt die Abstoßung der fetalen Membranen auch 12 bis 24 Stunden nach der Abkalbung nicht. Diese verspätete Ablösung wird Placentaretention genannt. Obwohl mehrere Faktoren (z. B. Trächtigkeitslänge, Zwillingsträchtigkeit, Abkalbeprobleme, Ernährung, metabolische Erkrankungen) bereits mit einem erhöhten Risiko für das Entstehen einer Placentaretention assoziiert wurden, sind die zugrunde liegenden Pathomechanismen noch immer unklar. Um das Verständnis dieser Pathomechanismen zu verbessern, zielte die vorliegende Studie darauf ab, genetische Loci zu identifizieren, die die Genexpression im Bezug auf Placentaretention beeinflussen. Transkriptomdaten aus Placentagewebe (19 404 Expressionsprofile pro Kuh) von 20 Fall- und 20 Kontrolltieren sowie 40 860 informative SNPs wurden in eine Methode zur kombinierten Linkage/Linkage disequilibrium-Kartierung integriert, um expression QTL (eQTL)-Effekte zu schätzen. Mittels zweistufiger Varianzkomponentenanlyse konnten schließlich elf trans-eQTL detektiert werden, die einen signifikanten Zusammenhang mit dem Merkmal Placentaretention zeigten. Mit dieser Studie konnte eine wahrscheinliche Beteiligung der biologischen Prozesse Immunantwort, Apoptose und Degradation der Extrazellularmatrix and der Auslösung einer Placentaretention bestätigt werden. Zudem wurde MIR379 als neues Target innerhalb der Pathogenese der Placentaretention aufgedeckt. Diese erste eQTL-Kartierungsstudie in Rindern zeigte weiterhin, dass die Placentaretention als sehr heterogenes Merkmal aufgefasst werden darf.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 15/19
In der Studie PAULINA konnte ein Zusammenhang zwischen mütterlicher Atopie und der Funktion von aus dem Nabelschnurblut stammenden regulatorischen T-Lympho-zyten aufgezeigt werden. Die regulatorischen T-Zellen sind bei Vorliegen mütterlicher Atopie nach Stimulation in ihrer Genexpression funktionell beeinträchtigt und beeinflus-sen somit möglicherweise das frühkindliche Immunsystem und die Entwicklung von allergischen Erkrankungen. Zunehmend wird in zahlreichen Studien der mögliche Zusammenhang zwischen müt-terlicher Atopie und allergischer Prädisposition der Kinder dieser atopisch erkrankten Mütter beschrieben (Amoudruz et al. 2005, Williams et al. 2000). Das frühkindliche, angeborene Immunsystem steht dabei im Vordergrund der wissenschaftlichen Ansätze; die Entwicklung dieses noch „unreifen“ Systems wird, wie in den letzten Jahren nachgewiesen wurde, maßgeblich durch den Kontakt mit mikrobiellen Substanzen im peri- und postpartalen Zeitraum und auch bereits in der Phase der Schwangerschaft beeinflusst. Es ist bekannt, dass bereits die Exposition der Schwangeren gegenüber bestimmten Stimuli im Sinne von Allergenen und Erregern die Modulation und das Gleichgewicht immunologischer Prozesse der Feten, Neugeborenen und heranwach-senden Kinder dadurch in eine Sensibilisierungsbereitschaft gegenüber Allergien gelenkt werden können. Diese Erkenntnis weist bereits darauf hin, dass nicht nur postpartale Infektionen und Allergen-Kontakte Auswirkungen nach sich ziehen, sondern schon in utero die Entwicklung der kindlichen Immunantwort für später gebahnt wird. Welche Konsequenzen nun in diesem Zusammenhang die mütterliche Atopie für den Fetus bzw. das Neugeborene haben kann, ist Gegenstand der PAULINA-Studie gewe-sen. In dieser Dissertation wurden mit Hilfe der Real Time RT-PCR Expressionsanalysen der Treg assoziierten Gene FoxP3, LAG-3, GITR, CTLA-4 und TGFβ im Nabelschnurblut von 50 Probanden (ausgewählt aus urspr. 118 Probanden) durchgeführt. Differenziert wurde zwischen den beiden Gruppen mononukleärer Zellen (CBMCs) aus dem Nabelschnurblut atopischer [CBMCs (A)] und nicht atopischer [CBMCs (NA)] Mütter. Die regulatorischen T-Zellen, eine spezielle Gruppe von Lymphozyten, innerhalb der Zellreihe der mononukleären Zellen sind hinsichtlich ihrer regulierenden Funktion im-munologischer Prozesse von besonderem Interesse. Im Nabelschnurblut der Neugeborenen von atopischen Müttern zeigt sich nach Stimu-lation eine niedrigere Genexpression sämtlicher Treg-assoziierter Gene. Die Stimu-lation der CBMCs erfolgte mit Stimuli des angeborenen Immunsystems (LpA und Ppg) und des erworbenen Immunsystems (D und OVA) und mit dem Mitogen PHA. Signifikant waren die Ergebnisse nach Stimulation mit Ppg und LpA für die Gene GITR (TNFRSF18) und LAG3. Auch bei Stimulation mit Mitogen PHA und Hausstaubmilbe D konnte eine geringere Expression (nicht signifikant) der Treg Marker nachgewiesen werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass sich die mütterliche Atopie bereits intrauterin auf regulierende Faktoren des Immunsystems auswirken kann. Zusätzlich konnte von der Arbeitsgruppe anhand der Durchflusszytometrie in den CBMCs von Neugeborenen mit mütterlicher Atopie eine geringere Anzahl von regulato-rischen T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Durch Messung der Proliferationsrate wurde deutlich, dass diese bei CBMCs atopischer Mütter erhöht ist; besonders konnte dies unter dem Mitogen PHA aufgezeigt werden, jedoch auch alle anderen Stimuli führten zu einem erhöhtem Stimulationsindex bei mononukleären Zellen aus dem Nabelschnurblut atopischer Mütter [CBMCs (A)]. Die signifikanten Daten in Bezug auf die höher ausfallenden Geburtsparameter der Neugeborenen atopischer Mütter und die ebenfalls signifikante Kombination aus müt-terlicher und parallel vorhandener väterlicher Atopie zeigte keinen Einfluss auf die Ex-pression der Oberflächenmarker „CD4+ CD25 + hoch“ regulatorischer T-Zellen. Die Ergebnisse der PAULINA-Studie zeigen, dass mütterliche Atopie das intrauterine Milieu des Neugeborenen beeinflusst, indem die Anzahl und Funktion der regulatori-schen T-Zellen im Nabelschurblut gemindert und beeinträchtigt wird und die Expression der mit diesen Zellen in funktionellem und immunologischen Zusammenhang stehenden Gene ebenfalls herabgesetzt wird; diese Resultate lassen vermuten, dass das Vorliegen mütterlicher Atopie die Entwicklung von allergischen Krankheitsbildern bei Kindern fördern könnte, da es Hinweise gibt, dass bereits pränatale Reifungsprozesse im kindlichen Immunsystem durch mütterliche Einflussfaktoren moduliert werden können.
Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/05
Genexpression that is the cellular synthesis of proteins is comprised of the sub-steps tran- scription (mRNA synthesis based on the DNA master), translation (protein synthesis based on the mRNA) and protein folding. Owing to the large number of interactions between individual components this process is very complex in vivo and therefore mathematical modeling is extremely laborious. By means of simpli�ed in vitro model systems individual aspects of cellular gene expression can be studied in detail. Cell-free gene expression denotes the biochemical synthesis of proteins in vitro. Cell-free systems are comprised of the predominant components of the cellular transcription and translation machinery like polymerases, ribosomes, amino acids and nucleotides dissolved in bu�er. These systems are either cellular extracts or are reconstituted from puri�ed components. In this thesis gene expression in a cell-free system was used to develop a quantitative model system of the gene expression kinetics in vitro. To this end techniques were developed that enable reproducible quantitative fuorescence measurements of mRNA and protein synthesized in a cell-free system.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Für das Überleben von Bacillus subtilis ist eine verlässliche Überwachung der Integrität der Zellhülle essentiell, um diese zu schützen und bei Schäden adäquat zu reagieren. Neben den ECF � Faktoren spielen Zwei-Komponenten-Systeme (2KS) in der Zellhüllstressantwort von B. subtilis eine zentrale Rolle. Eines dieser Systeme, das LiaRS- 2KS reagiert auf eine große Anzahl verschiedener Zellwand-Antibiotika sowie andere zellhüllstress-auslösende Substanzen. Die zelluläre Funktion und Rolle des Lia-Systems konnte bisher nicht genau definiert werden. In der hier vorliegenden Dissertation wurde das Lia-System erstmals hinsichtlich seiner funktionalen Rolle in B. subtilis untersucht. Im ersten Teil der Ergebnisse wurde eine detaillierte Analyse der LiaR-vermittelten Zellhüllstressantwort in B. subtilisvorgenommen. Transkriptom-Studien dienten zur Identifizierung des LiaR-Regulons. Hierbei wurde die Genexpression des Wildtyps mit zwei Mutanten, die den „ON“ (�liaF) und „OFF“ (�liaR) Zustand des Lia-Systems repräsentierten, verglichen. Von den dabei identifizierten drei potentiellen LiaR-Zielloci (liaIH, yhcYZ-ydhA, ydhE) konnten durch anschließende Folgeuntersuchungen nur die Gene liaI und liaH als in vivo relevante Zielgene für LiaR verifiziert werden. Umfangreiche phänotypische Analysen zeigten, dass �liaIH-Mutanten nur schwach sensitiv auf einige Antibiotika sowie oxidativen Stress reagierten. Ebenso vermittelt eine Überexpression von LiaH in einer �liaF-Mutante keine Resistenz gegenüber stressauslösenden Substanzen. LiaH gehört zur Familie der Phagenschock-Proteine. Weitere Mitglieder dieser Familie sind PspA aus Escherichia coli und Vipp1 aus Arabidopsis thaliana, die große oligomere Ringstrukturen bilden. Die strukturelle Untersuchung von LiaH ergab, dass auch dieses Protein große Ringe bildet (>1MDa). Der zweite Ergebnisteil befasst sich mit der Untersuchung der Stimuluswahrnehmung der Zellhüllstress-detektierenden Systeme in B. subtilis. Die Zellhüllstressantwort auf das Antibiotikum Bacitracin wurde hierbei mittels �-Galaktosidase-Assay sowie Western Blot- Analyse erforscht. Das Bce-System reagiert dabei am stärksten und spezifischsten auf Bacitracin-Stress. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass der ABC-Transporter BceAB essentiell für die Stimuluswahrnehmung ist und dass das Bce-System an sich eine Resistenzdeterminante in B. subtilis darstellt. Das Lia-System hingegen wird erst bei höheren Bacitracin-Konzentrationen induziert. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Bce-System Bacitracin direkt wahrnimmt (drug sensing) und das LiaSystem in indirekter Weise auf Zellhüllstress ausgelöst durch Bacitracin reagiert (damage sensing). Im dritten Teil der Ergebnisse wurdendie zelluläre Lokalisation von LiaI, LiaH und LiaG sowie die Beziehung der Proteine untereinander mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und biochemische Ansätze untersucht. Die Membranproteine LiaI und LiaG sind unter Stressbedingungen in der Zellmembran lokalisiert. LiaH, ein cytoplasmatisches Protein verändert unter Stressbedingungen seine Lokalisation vom Cytoplasma an die Membran. Die Funktion von LiaH scheint sich also an der Zellmembran zu vollziehen, wobei LiaI als Interaktionspartner identifiziert wurde. Da in einer �liaI-Mutante LiaH unter Stressbedingungenebenfallsnoch an die Zellmembran assoziert ist, wurde nach weiteren Interaktionspartnern von LiaH gesucht. Eine umfangreiche bacterial-two-hybrid-Analyse ergab, dass sowohl LiaH als auch LiaI und LiaG in ein Interaktionsnetzwerk eingebettet sind, in welchem das bisher uncharakterisierte Protein YvlB eine Schlüsselrolle spielt.Die ebenso in dieses Netzwerk involvierten Proteine YjoB, DnaK und HtpG üben als Proteasen/Chaperone Funktionen in der Faltung und Degradierung von Proteinen aus. Ein Zusammenspiel des Lia-Systems und des Schlüsselproteins YvlB mit den Proteasen/Chaperonen als Reaktion auf Zellhüllstress ist denkbar. Die Phagenschock-Homologe PspA in Streptomyces lividans und E. coli üben einen erheblichen Einfluss auf die Proteinsekretion sowie die elektronenmotorische Kraft der Zelle aus. Daher wurde im letzten Teil der Ergebnisse die Rolle von LiaH in der Proteinsekretion sowie im Energiestoffwechsel näher analysiert. Ein Einfluß des Lia- Systems in der Aufrechterhaltung der elektronenmotorischen Kraft der Zelle konnte nicht bestätigt werden. Durch die Analyse des Sekretoms in B. subtilis konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Proteom einer �PliaI-liaIH-Mutante im Vergleich zum Wildtyp signifikante Veränderungen in der Komposition aufwies.So wurde im Sekretom der �PliaIliaIH- Mutante vor allem das Zellwand-assoziierte Protein WapAidentifiziert, welches im Wildtyp oder in einer �liaF-Mutante nicht auftrat. Das Lia-System beeinflußt somit auch die Proteinsekretion von B. subtilis, wobei die molekularen Mechanismen noch unbekannt sind.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/07
Sat, 21 Jul 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15497/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15497/1/Schamber_Paz.pdf Schamber, Paz Chantal ddc:590, ddc:500, Tierärztliche Fakultät
Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/05
Genregulation gibt der Zelle die Kontrolle über Struktur und Funktion, und ist die Basis für zelluläre Differenzierung, Morphogenese und die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit von jedem Organismus. Um zu begreifen, wie eine Zelle ihre Funktion organisiert und wie sich ganz individuelle Organismen ausbilden, obwohl die gleichen genetischen Informationen vorhanden sind, muss man die Regulation der Genexpression im Detail verstehen. Diese Regulation wirkt an verschiedenen Stellen der Genexpression und besteht aus einer Vielzahl von komplexen Prozessen, die untereinander verbunden sind. Somit ist das Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und ihres Zusammenspiels für Biologie und Biophysik von großer Bedeutung. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von Wechselwirkungen und Wechselwirkungskräften zwischen Biomolekülen, die an der Genregulation und der Epigenetik, auf der Ebene der Transkription beteiligt sind. Insbesondere konnten Protein-DNA-Wechselwirkungen und der Einfluss epigenetischer DNA-Modifikationen quantifiziert werden. Für die Messungen wurde ein molekularer Kraftsensor und als dessen Erweiterung ein molekularer Analog-Digital-Wandler entwickelt. Diese molekularen Sensoren ermöglichen die direkte Messung der Wechsel- wirkungskräfte zwischen DNA und Liganden. Mit dem molekularen Kraftsensor können außerdem hochparallel Messungen durchgeführt werden, wobei durch den symmetrischen, molekularen Aufbau zudem eine sehr hohe Sensitivität erreicht wird. Die Verwendung dieser Methode ermöglichte es, den Einfluss der epigenetisch modifizierten Basen Methylcytosin und Hydroxymethylcytosin („5. und 6. Base der DNA“) auf die mechanische Stabilität der DNA- Doppelhelix zu untersuchen. Es wird gezeigt, dass mit dem aus DNA-Oligomeren aufgebauten molekularen Kraftsensor Protein-DNA-Wechselwirkungen detektiert und deren Dissoziationskonstanten bestimmt werden können. Unter anderem wird die Wechselwirkung der Endonuklease EcoRI mit ihrer DNA- Erkennungssequenz quantifiziert. Hierfür wurden molekulare Kraftsensoren in Zipper- und Scher-Geometrie entworfen. Bei dem neu entwickelten Aufbau des Kraftsensors mit integriertem Förster-Resonanzenergietransfer-Farbstoffpaar genügt schon eine Fläche von 25 !m2, um die Stärke von Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmen zu können. Diese Fläche liegt deutlich unterhalb der Messfleckgröße aktueller DNA-Mikroarrays. Damit erfüllt der molekulare Kraftsensor bezüglich der Messfleckdichte die Voraussetzung für moderne Hochdurchsatz- Methoden. In einem zweiten Schritt wird der molekulare Kraftsensor zu einem „molekularen Analog- Digital-Wandler“ erweitert. In Analogie zum elektronischen Flash-Analog-Digital-Wandler, bei dem mehrere Komparatoren mit unterschiedlichen Referenzschaltungen parallel geschaltet sind, werden beim molekularen Analog-Digital-Wandler parallel räumlich getrennte, molekulare Kraftsensoren mit unterschiedlich stabilen Referenz-Wechselwirkungen zur Bestimmung einer unbekannten molekularen Wechselwirkung verwendet. Durch eine Kompensationsmessung wird dann die Kraft von Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmt. Es werden die Wechsel- wirkungen eines Pyrrol-Imidazol Hairpin-Polyamides, der Endonuklease EcoRI und des Transkriptionsfaktors p53 zur jeweiligen DNA-Erkennungssequenz vermessen. Eine hoch- parallele Version mit Messfleckgrößen mit einem Durchmesser von minimal 15 !m konnte realisiert werden. Abgeleitet vom Bell-Evans-Modell wurde ein analytisches Modell zur Beschreibung des molekularen Analog-Digital-Wandlers entwickelt. Neben den Protein-DNA-Wechselwirkungen werden die epigenetisch modifizierten DNA- Basen Methylcytosin (mC) und Hydroxymethylcytosin (hmC) untersucht. Es wird der Nachweis erbracht, dass sich die mechanische Stabilität der DNA-Doppelhelix bei Separation in zwei Einzelstränge in beiden Fällen signifikant um mehrere Pikonewton ändert. Die Stärke des Effekts ist abhängig von der DNA-Sequenz und der Richtung der angelegten Kraft. Durch Einzelmolekül-Kraftspektroskopie wird eine Reduzierung der Potentialweite durch mC aufgezeigt. Außerdem konnte mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen der Effekt für mC und teilweise auch für hmC auf molekularer Ebene aufgeklärt werden. Es wird ein Modell entwickelt, das erklärt, wie dieser Effekt einen Einfluss auf die Genregulation ausüben kann.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06
Im Zellkern einer jeden Zelle besteht eine gewisse Ordnung der darin vorhandenen DNA und Proteine. Diese Ordnung wird unter dem Begriff „Zellkernarchitektur“ zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit ging es um die nähere Betrachtung einiger Aspekte der Zellkernarchitektur. Diese Aspekte betrafen 1. die Anordnung von Genen, 2. die Anordnung von Chromatin mit Hilfe unterschiedlicher Histonmodifikationen und 3. die Anordnungen von Chromosomenabschnitten, die mit komplexen messenger RNA-Sonden hybridisiert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mittels 3D FISH die dreidimensionale Positionierung von drei auf dem Chromosom 1 lokalisierten Genen in Zellkernen der Burkitt- Lymphom Zelllinie DG75 bestimmt. Diese Zelllinie wurde von Stefan Bohlander zur Verfügung gestellt und enthielt einen induzierbaren episomalen Vektor für das CALM-AF 10 Gen. Messungen der Genexpression, die in der Bohlander Gruppe mit Hilfe eines Affymetrix- Chips durchgeführt wurden, zeigten das die Induktion des Transgens zu genomweiten Veränderungen der Expressionsmuster hunderter Gene in dieser Zelllinie führten. Die für die 3D FISH Experimente ausgewählten Markergene zeigten nach der Induktion eine signifikant veränderte Expression. Dennoch änderte sich die radiale Positionierung dieser Gene, darunter versteht man die mehr innere oder mehr periphere Position der Gene, nicht. Dieses Ergebnis schien zuerst darauf hinzuweisen, dass die Transkriptionsstärke keine bedeutsamer Faktor im Hinblick auf die radiale Positionierung ist. Die Befunde der Affymetrix-Chip Analyse für diese Gene konnten jedoch in einer anschließende Untersuchungen der Genexpression mit Real-Time-PCR nicht bestätigt werden, obwohl der Vergleich von Affymetrix-Chip und Real- Time-PCR Daten insgesamt eine klare Korrelation zwischen den Datensätzen zeigte. Bei Diskrepanzen gehen wir davon aus, dass Real-Time-PCR die zuverlässigeren Ergebnisse liefert. Bei der hier durchgeführten Real-Time-PCR Untersuchung wurden auch die Expressionsstärken aller in einer Nachbarschaft von etwa 1 Mbp um die Markergene annotierten Gene ermittelt. Dieses Fenster wurde gewählt, weil Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Thomas Cremer und anderen Gruppen gezeigt haben, dass ~1 Mbp Chromatindomänen die Basisstruktur der Chromatinorganisation darstellen. Als Maß für die gesamte Genexpression einer Chromatindomäne wurde eine „Total Expression Strength“ (TES) berechnet. Dieser Wert basiert auf den Real-Time-PCR Werten der annotierten Gene und berücksichtigt auch die Länge der ungespleissten RNA, die von einem Gen transkribiert wird. Dabei zeigte sich, dass das Markergen in der Domäne mit dem höchsten TES Wert am weitesten innen im Zellkern lokalisiert ist. Dieser Befund unterstützt Befunde aus der wissenschaftlichen Literatur, dass die radiale Positionierung von individuellen Genen von Eigenschaften der lokalen Umgebung abhängt. Da sich die Nachbarschaft der untersuchten Markergene nicht nur im Hinblick auf die TES Werte sondern auch im Hinblick auf die Dichte der dort annotierten Gene und den GC-Gehalt unterscheidet, bleibt offen, welcher dieser Parameter als Prädiktor für die zu erwartende radiale Position individueller Gene eine entscheidende Rolle spielt. Möglich ist auch, dass alle Parameter zusammenwirken oder dass je nach den speziellen Umständen einer Untersuchung verschiedene Parameter die radiale Positionierung eines Gens bevorzugt beeinflussen. Die Stabilität der radialen Positionierung der Markergene trotz einer genomweiten Veränderung des Genexpressionsmusters nach CALM-AF 10 Induktion stimmt mit Befunden verschiedener Arbeitsgruppe überein, die für einen hohen Grad an räumlicher Stabilität der Chromatinanordnung während der Interphase sprechen; ~1 Mbp Chromatindomänen zeigen dementsprechend meist nur sehr begrenzte lokale Bewergungen (
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 13/19
Thu, 26 Jan 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13965/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13965/1/Lob_Felice.pdf Lob, Felice
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 13/19
Thu, 24 Nov 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13754/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13754/1/Richter_Peter.pdf Richter, Peter ddc:610, ddc:600, Med
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 13/19
Maligne Zellen wachsen in einem komplexen zellulären und extrazellulären Umfeld, welches die Initiierung und Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps bedeutend beeinflusst. Tumore bestehen zum einen aus den Tumorzellen, zum anderen aus dem unterstützenden Stroma, das Fibroblasten, Endothelien, Perizyten, Lymphgefäße, ein mononukleäres Infiltrat und die Extrazellulärmatrix einschließt. Dieses Tumor-Mikromilieu hat einen großen modulierenden Einfluss auf das Tumorwachstum, die Invasivität und das Metastasierungspotential. Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind pluripotente Vorläuferzellen, die an der Aufrechterhaltung und Wiederherstellung der Gewebeintegrität beteiligt sind. Geschädigtes Gewebe führt zur Mobilisation von MSC und deren Rekrutierung an den Ort der Schädigung. Tumore werden vom Organismus als nicht-heilende Wunden angesehen, so dass MSC in das tumorassoziierte Stroma rekrutiert werden. Dort tragen die Zellen zu verschiedenen Aspekten des Tumorwachstums bei, indem sie als Progenitorzellen für die Tumorgefäße und stromale fibroblastenartige Zellen dienen. Im Rahmen dieses Ausdifferenzierungsprozesses werden gewebespezifische Gensets wie das CC-Chemokin CCL5 in den mesenchymalen Stammzellen aktiviert und zur Expression gebracht. Das Pankreasadenokarzinom ist eines der aggressivsten soliden Malignome des Menschen und ist gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Proliferation des Stromas. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zum einen die Rolle mesenchymaler Stammzellen im Stroma des Pankreaskarzinoms zu evaluieren und zum anderen eine gewebespezifische stammzellbasierte und promoterkontrollierte Suizidgentherapie mit dem Stroma als Angriffspunkt zu etablieren. Mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Knochenmark von C57BL/6 p53-/- Mäusen isoliert und sowohl mit den Reportergenen des rot fluoreszierendem Proteins (RFP) und des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) als auch mit dem Suizidgen der Herpes Simplex I Thymidinkinase (HSV-TK) unter Kontrolle des CCL5-Promoters transfiziert. Die HSV-TK führt zu einer Phosphorylierung und Aktivierung der Prodrug Ganciclovir, welches zytotoxisch auf Thymidinkinase-positive (TK+) Zellen und über den sogenannten „Bystandereffect“ auf umgebende Thymidinkinase-negative (TK-) Zellen wirkt. Diese Stammzellen wurden C57BL/6 Mäusen intravenös injiziert, die orthotope und syngene panc02- Pankreastumore trugen. Die i.v. Applikation von nativen MSC führte zu einer Verdopplung der Tumormasse und einer gesteigerten lokalen Aggressivität im Sinne einer Peritonealkarzinose im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei zeigten sich erhöhte Ccl5-Expressionsniveaus im Tumorgewebe von Tieren, die MSC erhalten hatten. In-vitro konnte gezeigt werden, dass MSC bei adäquater Stimulation zur Ccl5 Expression angeregt werden und somit als Quelle des beobachteten Ccl5-Anstiegs in Frage kommen. Die stromale Aktivierung des CCL5-Promoters in den mesenchymalen Stammzellen konnte durch Verwendung von CCL5-Promoter/Reportergen Stammzellen direkt nachgewiesen werden. Dabei zeigten sich spezifisch im Tumorgewebe Fluoreszenzsignale, die sich in der Immunhistochemie morphologisch genauer darstellen ließen. Eine Reportergenexpression war spezifisch im stromalen Kompartiment der panc02- Tumore nachweisbar, andere untersuchte Organe mit Ausnahme der Milz zeigten keine Reportergenexpression. Der Einsatz der therapeutischen CCL5-Promoter/HSV-TK MSC in Kombination mit der intraperitonealen Gabe von Ganciclovir führte zu einer Tumormassenreduktion um 50%. Darüberhinaus konnte die Therapie die Metastasierungsrate in Milz, Leber und Peritoneum signifikant senken. Es wurden keine systemischen Nebenwirkungen beobachtet. Bei der Untersuchung von humanen Pankreaskarzinomen und korrespondierenden Pankreasnormalgeweben aus den gleichen Patienten zeigte sich bei der Mehrheit eine Hochregulation von CCL5-mRNA. Im immunhistochemischen Nachweis konnte die CCL5 Expression auf Proteinebene im Tumorstroma gezeigt werden, entsprechendes Normalgewebe zeigte bis auf vereinzelte Zellen keine CCL5 Produktion. Das Tumorstroma stellt aufgrund seiner vitalen Bedeutung für die Tumorprogression einen vielversprechenden Ansatzpunkt künftiger therapeutischer Interventionen dar. Mesenchymale Stammzellen eigenen sich hierbei im Rahmen einer Suizidgentherapie als zellbasierte Vehikel. Dank der gezielten Migration und des Einsatzes gewebespezifischer Promoter kann dabei eine hohe Selektivität der Genexpression im Tumorgewebe mit Minimierung der systemischen Nebenwirkungen erreicht werden. Der CCL5-Promoter wird im stromalen Kompartiment des murinen pankreatischen Adenokarzinoms aktiviert und eignet sich daher für die selektive und spezifische Expression von therapeutischen Genen wie der HSV-TK. Dieser Ansatz kann eine mögliche Therapieoption des ansonsten therapieresistenten humanenPankreaskarzinoms darstellen.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Der Transfer von Genen ist eine unverzichtbare Methode für die Erforschung von Genfunktionen in vivo, für die gezielte Expression von Proteinen oder RNA-Molekülen, sowie für die Entwicklung von Gentherapien z.B. gegen Krebserkrankungen oder genetische Defekte. Gerade unter gentherapeutischen Gesichtspunkten sind virale Gentransfervektoren von Interesse, mit deren Hilfe beispielsweise fehlende bzw. eingeschränkte Genfunktionen wiederhergestellt werden können. Ebenso vorstellbar ist der Einsatz viraler Vektoren für Immunisierungen, die z.B. zur Auslösung tumorspezifischer zellulärer Immunantworten führen. Wünschenswert ist in diesem Zusammenhang besonders eine zellspezifische Expression von Transgenen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb lentivirale Vektoren entwickelt, mit deren Hilfe eine konstitutive Genexpression in B-Zellen ermöglicht wurde. Die Beschränkung der Genexpression auf B-Zellen wurde durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Lentivirale Vektoren haben sich in jüngster Zeit zu interessanten Werkzeugen für die Gentherapie sowie zu vielversprechenden Vakzinkandidaten entwickelt. Mit Hilfe dieser Gentransfervektoren können zahlreiche verschiedene Zelltypen, darunter auch hämatopoetische Zellen einschließlich der Immunzellen, in vitro und in vivo transduziert werden, wobei die Spezifität der Antigenexpression auf der Wahl eines entsprechenden Promotors beruht. Als Transgene wurden das verbesserte grün-fluoreszierende Protein eGFP (enhanced green fluorescent protein; im Folgenden als „GFP“ bezeichnet) und das Hühnerei-Albumin (im Folgenden als „OVA“ bezeichnet) exprimiert. Anhand umfangreicher Analysen der GFP-Expression in Knochenmarkschimären konnte die B-Zellspezifität der generierten Vektoren überprüft werden. Desweiteren wurden die lentiviralen Vektoren auch systemisch (intravenös) angewandt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Spezifität der Genexpression mit dieser Applikationsroute erhalten bleibt, wohingegen die Expressionsstärke im Vergleich zu den Chimären erheblich zurückgeht. Funktionelle Studien mit B-zellspezifischen, OVA-kodierenden lentiviralen Vektoren konnten jedoch belegen, dass die Expressionsstärke nach systemischer Anwendung noch ausreichend war, um eine OVA-spezifische zelluläre Immunität zu stimulieren. Damit erwies sich das System auch hinsichtlich möglicher therapeutischer Anwendungen, z.B. als Vakzine, als funktionell. Eine humorale Antikörperantwort gegen virale Hüllproteine bzw. gegen OVA konnte nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend belegen diese Daten, dass die systemische Anwendung B-zellspezifischer lentiviraler Vektoren möglich ist und einen interessanten Ansatz zur Generierung neuer Vakzine bieten kann. Denkbar wäre beispielsweise eine Anwendung bei der Unterstützung therapeutischer Vakzinierungen. Ein weiterer interessanter Aspekt in diesem Zusammenhang ist die Rolle der B-Zelle als antigenpräsentierende Zelle, die mit Hilfe einer temporären Kontrolle der Genexpression genauer untersucht werden könnte. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch ein induzierbares gammaretrovirales Genexpressionssystem entwickelt, um ein gezieltes An- und Abschalten der Genexpression in B-Zellen zu erreichen. Die Beschränkung auf B-Zellen wurde hier ebenfalls durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Detaillierte in vivo-Analysen des Expressionssystems in Knochenmarkschimären zeigten jedoch, dass es einerseits nach Induktion nur zu einer schwachen Transgenexpression kam und es andererseits eine unerwünschte Hintergrundexpression sowohl in B-Zellen als auch in Nicht-B-Zellen gab. Aus diesen Gründen musste von der Anwendung dieses Systems für geplante Studien zur Rolle der Genexpression während verschiedener Stadien der B-Zellentwicklung abgesehen werden.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse tragen aus dem Blickwinkel der Evolutionsbiologie zu unserem Verständnis der Regulation von Genexpression bei. Ich verwende einen bestens bekannten Modellorganismus, die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, nicht nur als Objekt der Beobachtung, sondern auch als ein genetisches Manipulationswerkzeug, und untersuche drei verschiedene Aspekte des Prozesses, durch den die in der DNA gespeicherte Information förmlich „entfesselt“ oder umgesetzt wird zu biologischem Sinn, letztlich also zu Form und Funktion. In Kapitel 1 zeige ich zunächst, dass eine Inaktivierung des X-Chromosomes (und somit Genregulation auf chromosomaler Ebene) in der männlichen Keimbahn von D. melanogaster stattfindet. Im Gegensatz zur X-Inaktivierung in weiblichen Säugetieren, wo dies in den somatischen Zellen als Mechanismus zur Dosiskompensation auftritt, ist diese Art der Inaktivierung auf die Spermatogenese beschränkt und wurde wahrscheinlich während der Genomevolution als eine Möglichkeit etabliert, schädliche Auswirkungen in Zusammenhang mit Sexualantagonismus zu umgehen. Durch P-Element-vermittelte Keimbahntransformation erhielt ich fast 50 unabhängige Insertionen eines testisspezifischen Reportergenkonstrukts und untersuchte die dazugehörigen Reportergenaktivitäten durch Messung der Enzymaktivität und durch quantitative RT-PCR. Autosomale Insertionen dieses Konstrukts zeigten das erwartete Muster hoher männchen- und testisspezifischer Expression. Insertionen auf dem X-Chromosom zeigten dagegen wenig bzw. gar keine Expression des Transgens. Da die X-chromosomalen Insertionen die euchromatischen Abschnitte des Chromosoms abdeckten (bestimmt durch inverse PCR), konnte eine systematische Bevorzugung bestimmter Regionen bei Insertionen, die ein Fehlen von Expression auf dem X-Chromosom hätte erklären können, ausgeschlossen werden. Der Effekt scheint eine globale Eigenschaft des X-Chromosomes zu sein. Lediglich die Testisspezifität des transgenen Konstrukts ist für das Erscheinen des Effekts erforderlich, was somit eine Selektionshypothese für die X-Inaktivierung erhärtet sowie einige Beobachtungen erklären könnte, die im Zusammenhang mit der Verteilung von im Männchen und Testis exprimierten Genen im Drosophila-Genom gemacht wurden. In Kapitel 2 untersuche ich dann mutmaßliche cis-regulatorische Sequenzen und ihr Vermögen, allelspezifische Genexpression zu steuern. Nachdem Microarray-Studien umfangreiche Variabilität im Primärmerkmal Genexpression in unterschiedlichsten Taxa aufgedeckt haben, ist eine naheliegende Frage, mit der sich Evolutionsbiologen konfrontiert sehen, die nach der dieser Variabilität zugrunde liegenden genetischen Quelle. Neben epigenetischen Mechanismen gibt es einen Disput darüber, ob regulatorische Sequenzen nahe des exprimierten Gens (cis-Faktoren) und anderswo im Genom kodierte Faktoren (trans-Faktoren) einen qualitativ und quantitativ unterschiedlichen Beitrag zur Variabilität der Genexpression liefern. Hierzu wählte ich ein Gen von D. melanogaster, das nachweislich konsistente Expressionsunterschiede zwischen afrikanischen und nicht-afrikanischen („kosmopolitischen“) Stämmen zeigt, und klonierte die entsprechenden stromaufwärts flankierend gelegenen Teile jeweils in ein bakterielles Reportergenkonstrukt, um – nach erfolgreicher Integration ins Fruchtfliegengenom – direkt die von ihnen gesteuerte Auswirkung auf die Genexpression zu vergleichen. Der beobachtete Effekt war klein, jedoch signifikant, und zeigte sich nur in transgenen Fliegen, die ein X-Chromosom des afrikanischen Ausgangsstammes besaßen. Dies legt den Schluss nahe, dass zusätzlich zu den cis-regulatorischen Faktoren auch noch trans-Faktoren (vor allem auf dem X-Chromosom) zu dem zwischen den Stämmen beobachteten Expressionsunterschied beitragen. Letztendlich untersuche ich in Kapitel 3 das Phänomen des Codon bias durch seinen Zusammenhang mit Genexpression. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes werden viele der proteinogenen Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert. Dies ermöglicht es, synonyme Codons in einer kodierenden Gensequenz auszutauschen, ohne dabei die Aminosäurensequenz des kodierten Polypeptids zu verändern. Ob dies Konsequenzen für die produzierte Proteinmenge hat (Translationseffizienz) ist Gegenstand dieses Kapitels. Ich verglich dabei die von zwei Allelen des Gens Alkoholdehydogenase (Adh) (von D. melanogaster) vermittelte Enzymaktivität direkt miteinander, welche sich in sieben Leucin-Codons unterschieden. Es ergab sich nahezu kein Unterschied in der ADH-Enzymaktivität, obwohl eines der Allele aus gänzlich optimalen Leucin-Codons bestand und das andere sieben suboptimale Leucin-Codons enthielt. Da Letzteres die Wildtypform von Adh war, legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass das Adh-Gen in seiner Leucin-Codonzusammensetzung (und vielleicht auch in seiner Codonzusammensetzung allgemein) bereits ausreichend optimiert ist. Weitere Versuche, die Zahl der optimalen Leucin-Codons zu erhöhen, können sogar einen Negativeffekt hinsichtlich der Enzymproduktion haben; dies möglicherweise aufgrund einer Sättigung des tRNA-Pools und/oder der Konsequenzen veränderter mRNA-Sekundärstrukturen.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07
In der hier durchgeführten Studie „Untersuchungen zur mikrobiellen Besiedlung der Nasenhöhle von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis unter besonderer Berücksichtigung von Staphylococcus aureus und Staphylococcus aureus Small Colony Varianten“ sollte das Keimspektrum der chronischen Rhinosinusitis (CRS) beim Menschen, mit Schwerpunkt auf Staphylococcus aureus (Sa) und seinem Small Colony Variant (SCV) -Phänotyp, untersucht werden. Die chronische Rhinosinusitis (CRS) ist eine häufig vorkommende Erkrankung die bei etwa 5-15 % der Bevölkerung westlicher Industrienationen auftritt. Ihre Ätiologie ist noch unbekannt, allerdings wird als mögliche Ursache eine Infektion mit Bakterien diskutiert. Unter den Bakterien wird dem grampositiven Keim Staphylococcus aureus eine große Bedeutung bei dieser Erkrankung zugeschrieben. In dieser Studie wurden Nasenschleimhautbiopsien und Nasenspülproben von 31 Patienten mit CRS und nasalen Polypen (CRSNP+), 13 Patienten mit CRS ohne nasale Polypen (CRSNP-) und 21 Kontrollpatienten mit verschiedenen mikrobiologischen Methoden untersucht. Die Ergebnisse der hier vorliegenden Studie stellen eine bakteriologische Ursache für die chronische Rhinosinusitis in Frage. Es wird deutlich, dass der normale Phänotyp von Sa keine wesentliche Rolle bei der CRS spielt, da dieser Keim sowohl bei erkrankten als auch bei gesunden Probanden etwa gleich häufig auftrat, bei CRSNP- Patienten sogar in noch geringerer Menge als bei den anderen beiden Gruppen. In keiner der untersuchten Proben konnten SASCV nachgewiesen werden, so dass deren Rolle bei der CRS untergeordnet erscheint. Auf Grund der kleinen Fallzahlen kann von dieser Studie zwar nicht auf die Gesamtbevölkerung geschlossen werden, aber die Ergebnisse geben dennoch Hinweise auf die tatsächliche Situation. Auch bei der Untersuchung der übrigen in den Proben vorkommenden gram-positiven und gram-negativen, aeroben und anaeroben Bakterien konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Beim Vergleich der hier angewandten mikrobiologischen Nachweismethoden, stellte sich heraus, dass die Bakterienkultur im Vergleich zur Real-time PCR und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung die sensitivste Methode war. Die PCR hat allerdings den Vorteil dass auch DNA toter Bakterien nachgewiesen werden kann, und dass sie erheblich schneller durchzuführen ist als die Bakterienkultur. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung an Paraffingewebsschnitten scheint nach den hier vorliegenden Ergebnissen nicht geeignet zu sein, Sa im Gewebe nachzuweisen. Auf diesem Gebiet besteht also noch Bedarf an weiterer Optimierung der Methode an Paraffinschnitten. Neben bakteriologischen Untersuchungen von Patientenproben sollten Auswirkungen des Sa und SASCV- Nachweises auf nasale immunologische Parameter erfasst werden. Hierzu sollte das nasale Zytokinmuster erhoben werden und mögliche Unterschiede der Genexpression bei CRSNP+ Patienten mit Sa- Nachweis untersucht werden. Wie eine Infektion mit Sa bzw. SASCV zelluläre Reaktionen auf Proteinebene beeinflusst und ob Unterschiede zwischen Sa und SASCV in der induzierten Zellantwort bestehen, wurde zusätzlich an humanen monozytären MonoMac-6 Zellen (MM6) und an humanen Atemwegsepithelzellen der Zelllinie BEAS-2B (B2B) untersucht. Eine in vitro Infektion dieser beiden Zelltypen mit verschiedenen Sa- Stämmen führte zu einer unspezifischen Stimulierung der Sekretion aller untersuchten Proteine. Eine Polarisation in Richtung TH1 bzw. TH2, also in Richtung CRSNP- bzw. CRSNP+ konnte nicht festgestellt werden. Auch die Microarrayanalysen von Sa-positiven und Sa-negativen Biopsien von CRSNP+ Patienten zeigen keine vermehrte Expression von Genen für Zytokine die für TH1 oder TH2 polarisieren. Ebenso wurde die Konzentration der in der nasalen Lavage gemessenen Zytokine durch eine Infektion mit Sa nicht beeinflusst und ein TH2 Shift war nicht erkennbar. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass bei der CRS vermutlich zunächst eine Entzündung vorliegt, die dann ggf. die bakterielle Besiedlung fördert, als dass diese Entzündung initial durch eine bakterielle Infektion induziert wird. Es sei aber nochmals darauf hingewiesen, dass hier nur kleine Fallzahlen untersucht wurden. Klarheit könnte eine groß angelegte Studie mit möglichst hohen Patientenzahlen und einer gut charakterisierten Patientenpopulation sowie ggf. die Verwendung molekularer Verfahren zum Nachweis bakterieller Erreger bringen. Diese Studie zeigt, dass eine bakterielle Ursache der CRS unwahrscheinlich ist.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19
Bei der Tumorangiogenese ist die Balance zwischen den pro- und antiangiogenen Faktoren zu Gunsten der proangiogenen Faktoren hin verschoben. Therapeutisch lässt sich die Tumorangiogenese durch eine Hemmung proangiogener Faktoren wie VEGF auch im klinischen Setting wirksam beeinflussen. In präklinischen Modellen ließ sich zeigen, dass auch durch Gabe von physiologisch vorkommenden antiangiogenen Faktoren wie Endostatin und Angiostatin das Wachstum experimenteller Tumoren signifikant gehemmt werden konnte. Angiostatin besteht aus den ersten Kringel-Domänen des Plasminogens und wird bei einer Reihe von physiologischen Prozessen im Körper durch proteolytische Spaltung freigesetzt. Es inhibiert primäres und metastatisches Tumorwachstum durch Hemmung der Tumorneoangiogenese. Da diese löslichen Faktoren eine sehr kurze Halbwertszeit aufweisen, ist eine Gabe als Protein wenig erfolgversprechend und erste klinische Daten zur Applikation von Endostatin als Protein in klinischen Studien waren enttäuschend. Ein effizienter alternativer Applikationsweg für diese Faktoren stellt zweifellos eine gentherapeutisch vermittelte systemische Überexpression dar, wie sie beispielsweise bei Gerinnungsfaktoren bereits in ersten klinischen Studien angewendet worden ist. Sowohl die Leber als auch die Muskulatur können dabei als Orte der Überexpression nach Gentransfer genutzt werden. Der Wahl und Optimierung des Vektorsystems kommt bei einer solchen Strategie ein zentraler Stellenwert zu. In der hier vorgelegten Arbeit wurde ein Vektorsystem basierend auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) für die antiangiogene Gentherapie entwickelt und optimiert. Konventionelle AAV-Vektoren basieren auf einem einzelsträngigen DNA Genom, welches von infizierten Zellen zuerst in ein doppelsträngiges Genom umgewandelt werden muss, um eine Genexpression zu ermöglichen. Dieser Schritt ist limitierend auf dem Weg zur Transgenexpression. In dieser Arbeit wurde ein sogennanter „self compementary“ AAV-Vektor (scAAV) hergestellt und charakterisiert, der in der Zielzelle primär eine doppelsträngige DNA zur Verfügung stellt. Die Strategie beruhte dabei auf Daten der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. J. Samulski, Capel Hill, USA. Es wurde auf dieser Basis ein AAV-Konstrukt zur Expression des Green-Fluorescent Protein (GFP) als Markergen und ein weiteres Konstrukt zur Expression von Angiostatin kloniert und in einem AAV-Serotyp 2 verpackt. Das scAAV-Vektorsystem zeigte in vitro eine um eine log-Stufe stärkere Genexpression (GFP) als konventionelle AAV-Vektoren. Damit wurden die Daten der amerikanischen Arbeitsgruppe bestätigt. In funktionellen in-vitro-Experimenten zeigten sich die scAAV/Angiostatin-Vektoren den konventionellen AAV/Angiostatin-Vektoren signifikant überlegen bei der Hemmung der Proliferation von Endothelzellen. In der Zusammenfassung konnte im Rahmen dieser Arbeit der Grundstein gelegt werden für die Anwendung von scAAV zur Expression von Angiostatin im Rahmen der Gentherapie von Tumoren.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07
Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9299/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9299/1/Panchaud_Philipa.pdf Panchaud, Philipa ddc:590, ddc:500, Tierärztliche Fakultät
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19
Thu, 8 May 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8527/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8527/1/Drechsel_Marei.pdf Drechsel, Marei ddc:600, ddc:610, Medizinische Fakultät
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19
Hintergrund Humane mesenchymale Stammzellen sind ein viel versprechendes Ziel für die ex vivo Gentherapie, und Lentiviren sind exzellente Vehikel für den Gentransfer in hMSCs, da sie hohe Transduktionsfrequenzen mit langfristiger Genexpression erreichen. Dennoch könnte die Seneszenz von hMSCs die therapeutische Anwendung, infolge von zeitaufwendiger Zellselektion und Virus Titration, limitieren. Diese Arbeit beschreibt optimierte Protokolle für hoch effizienten ex vivo lentiviralen Gentransfer in hMSCs und eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu bestimmen. Methoden EGFP wurde als Markergen/-protein verwendet, um verschiedene lentivirale Expressionsvektoren herzustellen. Die Produktion von Lentiviren wurde mit verschiedenen Verpackungssystemen getestet. Der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde durch Polybrene und Blasticidinselektion erhöht. hMSCs von verschiedenen Spendern wurden mittels PCR und Western Blot analysiert. Regulierte Genexpression wurde durch Herstellung eines Tet-On selbstregulierten Expressionsvektors erreicht. Mit einem p24 ELISA-Test wurden übrig gebliebene virale Partikel im Zellkulturüberstand detektiert. Die Effizienz des lentiviralen Gentransfers wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet und mittels qRT-PCR und FACS-Analyse quantifiziert. Die lentiviralen Titer wurden mit qRT-PCR der exprimierten Transgene bestimmt. Die hMSC Differenzierung wurde histologisch untersucht. Ergebnisse Selbstinaktivierende lentivirale Vektoren der dritten Generation zeigten hoch effizienten Gentransfer in hMSCs bei der Verwendung von Polybrene. Die Blasticidinselektion hat den Prozentsatz der transgenen Zellen weiter erhöht unter Selektion von Zellen die mehrere Transgenkopien tragen. Die positiven Effekte von Polybrene und der Blasticidinselektion sind nicht von hMSCs eines speziellen Spenders abhängig. Präzise Regulation der Genexpression wurde durch Herstellung eines selbstregulierten Tet-On-Expressionssystems erreicht. Keine viralen Antigene wurden im Zellkulturüberstand nach aufeinander folgenden Medienwechseln detektiert, was auf die Abwesenheit von infektiösen Partikeln nach einigen Tagen hindeutet. In dieser Arbeit wurde ein starker linearer Zusammenhang zwischen der Virusverdünnung und der Stärke der Transgenexpression mittels qPCR Analysen beobachtet, wodurch die Virustitration durch Quantifizierung der Transgenexpression ermöglicht wird. Abschließend wurde durch Differenzierung in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung gezeigt, dass transduzierte hMSCs ihren Stammzellcharakter beibehalten haben und dass die Transgenexpression durch die Differenzierung nicht beeinflusst wurde. Schlussfolgerungen Die Quantifizierung der Transgen-Kopienanzahl durch qRT-PCR ist eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer nach dem ex vivo Gentransfer in hMSCs zu bestimmen. Die in dieser Arbeit optimierte und charakterisierte Methode für die effiziente lentivirale Transduktion von humanen mesenchymalen Stammzellen, in Verbindung mit regulierbarer Transgenexpression, ist ein sicheres, verlässliches und leistungsstarkes Verfahren und bildet eine aussichtsreiche Grundlage für zukünftige Gentherapie und Tissue Engineering Anwendungen in hMSCs.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19
Polytraumatisierte Patienten entwickeln eine systemische Entzündungsreaktion (systemic inflammatory response syndrome, SIRS), die entscheidend den klinischen Verlauf der Patienten determiniert. Zahlreiche Untersuchungen weisen dem Immunsystem dabei eine zentrale steuernde Funktion zu, wobei die initialen Triggermechanismen der traumabedingten Immunantwort bisher unbekannt ist. Obwohl den Monozyten dabei eine führende Rolle zugesprochen wird, sind die hierfür verantwortlichen intrazellulären Steuerungsmechanismen, insbesondere die Signaltransduktion, die Transkription sowie die Modulation der Translation von inflammatorisch wirksamen Proteinen bislang nur ansatzweise aufgeklärt. Ziele der vorliegenden Untersuchungen waren daher: i) zu überprüfen, ob es überhaupt spezifische, Trauma-responsive mRNA Expressionsmuster in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der frühen posttraumatischen Phase gibt, ii) in einem zweiten Schritt zu untersuchen, ob es darüber hinaus Genexpressionsprofile gibt, die in Abhängigkeit von klinischen Parametern einer signifikant unterschiedlichen Expression unterliegen iii) und schließlich diese identifizierten Faktoren auf ihre biologisch funktionelle Rolle im Organismus zu untersuchen Mittels Affymetrix Oligonukleotid Microarray (22.000 Probe Sets, 14.500 Gene) wurde eine Genom-weite mRNA Expressionsanalyse in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der unmittelbar posttraumatischen Phase (0h-72h) durchgeführt und in einem mehrstufigen biostatistischen Verfahren mit klinischen Einflussfaktoren korreliert. Zur Überprüfung der biologischen Funktion der identifizierter Genexpressionsprofile wurden biologisch-funktionelle Pathway Analysen mittels Ingenuity Pathway Systems durchgeführt. Um das erste Teilziel zu erreichen wurde eine unsupervised-Analyse anhand der ermittelten Microarray Daten durchgeführt. Zentrales Kriterium der unsupervised Analyse ist nun der Variationskoeffizient eines einzelnen Faktors/Gens. Somit lassen sich diejenigen genetischen Expressionsprofile identifizieren, die durch das gemeinsame klinische Ereignis „Trauma“ zu einer gemeinsamen Expressionsänderung angeregt wurden. Dabei fanden sich 318 Probe Sets (280 Gene) signifikant durch das klinische Ereignis „Trauma“ verändert. Somit lässt sich anhand der vorliegenden Studie die Fragestellung i) klar dahingehend beantworten, dass Trauma-sensitive Gene Zeichen der gleichsinnigen Aktivierung bzw. Deaktivierung zeigen können. Um die Teilfragestellung ii) zu beantworten, wurden die Patienten im Anschluss in klinisch relevante Gruppen unterteilt. Führende Zielparameter waren dabei zunächst die Quantifizierung der anatomischen Verletzungsschwere quantifiziert mittels Injury Severity Score (ISS). In den so gruppierten Datensätzen fanden sich interessanterweise 295 Probe Sets (273 Gene), hochsignifikant verschieden exprimiert in Patienten mit einem ISS > 40 im Vergleich zu weniger schwer verletzten Patienten (ISS < 40 Punkte). Eine ähnliche supervised- Analyse wurde anhand des Kriteriums „Massive Substitution von Erythrozytenkonzentraten“ (>10 EKs/24h) berechnet. Dabei fanden sich 224 Probe Sets (205 Gene) differentiell exprimiert. Besonders interessant zeigten sich die Ergebnisse der supervised-Analyse nach Einteilung der Patienten anhand der Ausprägung eines Multiorganversagens. 660 Probe Sets (642 Gene) waren bei Patienten mit Anzeichen eines solchen (MOF Score ≥4 Punkte) hochsignifikant differentiell exprimiert im Vergleich zu Patienten ohne klinische Hinweise auf ein manifestes Multiorganversagen (MOF-Score < 4 Punkte). Schließlich konnten in einer weiteren supervised-Analyse 763 Probe Sets (696 Gene) identifiziert werden, deren Expression je nach dem, ob der Patient das Trauma überlebt hatte, oder im späteren posttraumatischen Verlauf verstorben war, erneut ein hochdifferentiell unterschiedliches Expressionsprofil aufweisen. Somit lässt sich Fragestellung ii) dahingehen beantworten, dass es tatsächlich spezifische Genxpressionsmuster gibt, die durch verschiedene klinische Situationen, wie z.B. die Verletzungsschwere, Massentransfusionen, die Entwicklung eines Multiorganversagens oder das endgültige klinische Outcome induziert werden können. Zur Beantwortung der Fragestellung iii) wurden Pathway Analysen durchgeführt. Dieses Instrumentarium fasst den derzeitigen Stand der wissenschaftlichen Erkenntnisse in einer groß-dimensionierten Software zusammen und zeigt die biologisch-funktionellen Beziehungen der einzelnen Faktoren auf. Dabei fanden sich für die klinische Entität der Verletzungsschwere vor allem Gene, die bei der oxydativen Phosphorylierung von Proteinen eine Rolle spielen, als differentiell exprimiert. Patienten, die einer massiven Bluttransfusion zugeführt werden mussten, zeigen eine signifikant andere Regulation des Ubiquitin-C Pathways als Patienten mit geringerem Transfusionsbedarf. Bei polytraumatisierten Patienten, die im Beobachtungszeitraum Anzeichen eines Multiorganversagens entwickelten, zeigte die Pathway Analyse Software eine unterschiedliche Regulation des Ephrin Rezeptor Pathways. Betrachtet man schließlich das Datenset der Outcome-klassifizierenden Gene, so fällt auf, dass Patienten mit positivem klinischen Outcome eine hochsignifikant andere Expression der PPAR-Signalkaskade aufweisen im Vergleich zu Patienten, die im späteren posttraumatischen Verlauf verstorben waren. Somit lässt sich Fragestellung iii) dahingehend beantworten, dass in der Tat einzelnen, biologisch relevanten, funktionellen Gruppen spezifische, klinische Ereignisse zugeordnet werden können. Die vorliegende Arbeit zeigt somit erstmals, dass es Trauma-responsive, hochspezifische mRNA Expressionsmuster und Signalkaskaden in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der unmittelbaren posttraumatischen Phase gibt, die nicht nur mit dem Ausmaß des Traumas, sondern auch mit dem klinischen Verlauf des Patienten hochsignifikant korrelierbar sind.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Zusammenfassung Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 2 (EBNA-2) ist ein Schlüsselprotein bei der Initiation und der Aufrechterhaltung der B-Zelltransformation nach einer EBV-Infektion. EBNA-2 reguliert die Genexpression von viralen und zellulären Genen und induziert so das physiologische Proliferationsprogramm der B-Zelle. Die DNA-Bindung erfolgt indirekt durch eine Interaktion mit zellulären Adapterproteinen, zu denen das CBF1 (C-promoter binding factor 1) Protein zählt. Mit dieser Arbeit sollte ein Beitrag zum Verständnis der bisher wenig untersuchten molekularen Mechanismen, über die EBNA-2 zelluläre Zielgene transaktiviert, geleistet werden. Die drei zellulären EBNA-2-Zielgene SLAMF1, DNASE1L3 und CCL3 wurden in dieser Arbeit exemplarisch untersucht. Die EBNA-2-Transaktivierung der drei Gene ist CBF1 abhängig. In allen drei Genen konnte erstmals eine EBNA-2-Bindung am Transkriptionsstart nachgewiesen werden. Erstmalig ist auch der Nachweis gelungen, dass EBNA-2 an intronständige CBF1-Bindestellen rekrutiert wird. Eine EBNA-2-Aktivierung führte in allen untersuchten Genen zur Rekrutierung der an Serin 5 phosphorylierten Polymerase II an den Transkriptionsstart, sowie auch zu CBF1-Bindestellen in Regionen, die distal zum Transkriptionsstart lokalisiert sind. Die Aktivierung der Genexpression korreliert in allen Fällen mit einer erhöhten Acetylierung der Histone H3 und H4, die nicht auf den Bereich des Transkriptionsstarts beschränkt war. Eine detaillierte Analyse des CCL3-Gens erwies, dass die DNA-Bindung von CBF1 durch EBNA-2 unterstützt wird. Des Weiteren zeigte sich, dass eine nahe dem Transkriptionsstart gelegene Region entscheidend zur EBNA-2 vermittelten Transaktivierung beiträgt und vermutlich nicht durch CBF1 vermittelt wird. Möglicherweise reguliert EBNA-2 nicht nur über eine Bindung an CBF1 die Transaktivierung eines Genes, sondern noch über einen zweiten Mechanismus, bei dem EBNA-2 direkt oder indirekt an den Transkriptionsstart oder in dessen unmittelbarer Nähe bindet. Zur Identifikation von Proteinen, die direkt an dem molekularen Mechanismus der EBNA-2-Transaktivierung beteiligt sind, wurde die „Tandem Affinity Purification“ (TAP-Reinigung) zur Aufreinigung nativer EBNA-2-Komplexe in B-Zellen etabliert. Durch eine anschließende massenspektrometrische Analyse konnten potentielle EBNA-2-Interaktionspartner identifiziert werden. Für das interessante Kandidatenprotein TFE3, ein Transkriptionsfaktor des Immunglobulinlokus, konnte bereits eine spezifische Anreicherung über EBNA-2 nachgewiesen werden.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Jasmonate sind Phytohormone mit vielfältiger Wirkung in Entwicklung und Stressmanagement der Pflanzen. Über die Perzeption und Transduktion der Jasmonatsignale ist bisher kaum etwas bekannt. Unter Verwendung des synthetischen Jasmonat-Analogons 6-Azido-1-oxoindanoyl(14C)isoleucinmethylester (IndAz(14C)IleMe) als Radioligand wurde eine spezifische Bindestelle in Sojabohne (Glycine max) biochemisch charakterisiert, in der Erwartung, eine Bindestelle für Jasmonate zu beschreiben. Die IndAz(14C)IleMe-Bindung erwies sich als spezifisch, saturierbar und reversibel. Da es sich aber um eine niedrigaffine Bindestelle handelt und die Affinität verschiedener Jasmonate und synthetischer Indanoyl-Isoleucin-Konjugate nicht mit deren biologischer Aktivität in Sojabohne korreliert, dürfte es sich bei der IndAz(14C)IleMe-Bindestelle nicht um einen Jasmonatrezeptor handeln. Sowohl bei Jasmonaten als auch bei Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten wurden Methylester gegenüber den entsprechenden freien Säuren bevorzugt gebunden. Ein Enzym, das den Liganden umsetzt, scheint nicht vorzuliegen, da die IndAz(14C)IleMe-Bindung kein pH-Optimum aufwies und keine Umsetzung des Liganden beobachtet wurde. Mit fortschreitendem Alter der Pflanze nahm die Bindungsaktivität zu. Die IndAz(14C)IleMe-Bindestelle kommt in verschiedenen höheren Pflanzenarten vor, war hauptsächlich in der Wurzel nachweisbar und wurde in der Zellwand lokalisiert. Da die Bindestelle weder mit Salzen noch mit Detergenzien extrahiert werden konnte, gegenüber Proteinase K, DTT, Periodat, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Pectinase und Pectolyase resistent und zu 50 % hitzestabil war, wird vermutet, dass ein in der Zellwand fest verankertes Protein vorliegt. Zu den intrazellulären Signalvermittlern von Pflanzen gehört Calcium, nicht nur im Cytosol, sondern auch im Zellkern. In transgenen Nicotiana tabacum BY-2-Zellen wurden mit Hilfe des Photoproteins Aequorin erstmals jasmonatinduzierte Änderungen der Calciumkonzentration in beiden Kompartimenten gezeigt. Auch ein Vertreter aus der Gruppe der Phytoprostane, Phytoprostan B1 Typ II, löste Calciumantworten in Cytosol und Zellkern aus. JA und OPDA induzierten unterschiedliche Calciumsignaturen, die sich jeweils aus einer cytosolischen Calciumantwort gefolgt von einem Calciumsignal im Zellkern zusammensetzten. Die Unterschiede in Form, Höhe und Kinetik der einzelnen Antworten lassen auf zwei verschiedene Signaltransduktionswege bei JA und OPDA schließen. MeJA war in beiden Kompartimenten inaktiv und demonstriert dadurch, dass MeJA nicht immer, wie häufig angenommen wird, wie JA wirkt. Durch das Isoleucin-Konjugat der JA (JA-Ile) wurde eine dritte Calciumsignatur ausgelöst, die sich von der JA-induzierten Calciumsignatur durch das Fehlen der JA-ähnlichen cytosolischen Calciumantwort unterscheidet. Dieser Befund lässt vermuten, dass die Unterscheidung von JA- und JA-Ile-Signalen möglicherweise auf Ebene des Calciums stattfindet. Eine Struktur-Aktivitätsanalyse mit Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten bestätigte, dass die Konjugation mit Isoleucin zur Veränderung der Calciumsignatur führt. Die unkonjugierte 1-Oxoindan-4-carbonsäure (Ind) verhielt sich wie JA, das Konjugat Ind-Ile wie JA-Ile. Ferner wurde gezeigt, dass für die Induktion der Calciumantworten eine freie, negativ geladene Carboxylgruppe unerlässlich ist. Neben MeJA erwiesen sich JA-IleMe, Ind-IleMe und 3-(Nitro-methyl)-2-((Z)-pent-2-enyl)cyclopentanon als inaktiv. 6-substituierte Indanoyl-Isoleucin-Konjugate zeichnen sich durch verstärkte biologische Aktivität aus. Tatsächlich verlieh der Ethyl-Substituent dem IndEt-IleMe calciuminduzierende Aktivität im Zellkern. Bei den freien Säuren Ind-Ile und IndEt-Ile wurde aber keine Aktivitätssteigerung durch Substitution festgestellt. Die Untersuchung der Expression einiger JA-responsiver Gene zeigte, dass unter den Versuchsbedingungen, die die Induktion von Calciumantworten ermöglichten, keine jasmonatinduzierte Genexpression erfolgte. Sollten die beschriebenen Calciumsignale die Expression bestimmter Gene vermitteln, ist eine ausgewählte Gruppe von Genen zu erwarten, deren Expression eventuell einen besonderen physiologischen Zustand der Zellen erfordert.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Innerhalb des letzten Jahrhunderts intensiver Gedächtnisforschung ist es noch nicht gelungen, ein vollständiges und allgemein gültiges Modell für die Bildung von Langzeitgedächtnis zu entwickeln. Einige neuronale Moleküle, insbesondere Proteinkinasen und Transkriptionsfaktoren, scheinen hierbei in bestimmten Hirnregionen, deren Einbeziehung vom Lerntest abhängig ist, eine essentielle Bedeutung zu haben. Welche Rolle die lerninduzierte Neu-Expression von Genen (Transkription bzw. Translation) einnimmt, die als Teilprozesse der Konsolidierung postuliert werden, ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt. Die Bedeutung dieser Teilprozesse wurde in dieser Arbeit bei Mäusen unter Verwendung von zwei hippokampusabhängigen Lerntests (auditorische trace-Konditionierung und kontextuelle Konditionierung) näher untersucht. Die drei hierbei im Vordergrund stehenden Aspekte waren die pharmakologische Validierung der Lerntests, der regionenspezifische Nachweis neuronaler Aktivierung und Untersuchungen zur Expression lernspezifischer Gene. Die pharmakologische Validierung der beiden Tests zeigte, dass durch lokale Gabe der translationshemmenden Substanz Anisomycin in den dorsalen Hippokampus zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach dem Lernereignis das Gedächtnis beeinträchtigt ist. Die proteinsyntheseabhängige Phase ist bei der kontextuellen Konditionierung spätestens nach einer Stunde abgeschlossen. Demgegenüber hatte die Hemmung der Transkription mit Amanitin auf keinen der beiden Tests Einfluss auf die Gedächtnisbildung. Die neuronale Aktivierung, die anhand der Induktion ausgewählter Immediate early genes (IEGs) im Hippokampus untersucht wurde, sollte indirekt Hinweise auf Genexpression liefern. Die IEGs waren im Gegensatz zur Literatur bei trace-Konditionierung schwach induziert (zif268 mRNA in CA1 und CA3) bzw. bei kontextueller Konditionierung nicht nachweisbar (c-Fos Protein in CA1). Um alternativ dazu die neuronale Aktivierung bezüglich einer erhöhten Proteinbiosyntheserate zu untersuchen, wurde eine Methode etabliert und validiert, die den Einbau der [35S]-markierten Aminosäuren Methionin und Cystein in neu synthetisierte Proteine regionenspezifisch darstellt (funktionelle Proteinbiosynthese). Hierbei zeigte sich in der Subregion CA1 des dorsalen Hippokampus eine erhöhte Proteinbiosyntheseaktivität nach kontextueller Konditionierung. Ein besonderer Vorteil der Methode besteht darin, dass mit Hilfe der Autoradiogramme funktionelle Netzwerke aufgezeigt werden können, indem Korrelationen in der Proteinbiosyntheseaktivität zwischen verschiedenen Hirnregionen auf deren funktionelle Einheit im Zusammenhang mit dem Lerntest verweisen. Unserer Erkenntnis nach ist das einer der ersten Befunde, womit bei Mäusen erfolgreich lernbedingte Veränderungen der Proteinbiosynthese unter Wahrung neuroanatomischer Auflösung dargestellt werden konnten. Die Untersuchungen zur lerninduzierten Expression spezifischer Gene erfolgten auf Ebene der Proteine, da bei der pharmakologischen Validierung der Lerntests nicht gezeigt werden konnte, dass Transkriptionsprozesse für die Gedächtnisbildung essentiell sind. Ausgehend von einem Standardprotokoll der zweidimensionalen Gelelektrophorese wurden unter Verwendung der radioaktiven Markierung von Proteinen mit [35S]-Methionin/Cystein Verbesserungen dieses Verfahrens hinsichtlich Sensitivität und signal-to-noise ratio erzielt. Mit dem verbesserten Verfahren konnte ein Protein gefunden werden, das nach kontextueller Konditionierung im Vergleich zu unbehandelten Tieren eine Veränderung der Nettoladung (Verschiebung des isoelektrischen Punktes) aufweist, was auf einen Unterschied in der posttranslationalen Modifikation schließen lässt. Quantitative Unterschiede wurden nicht gefunden. Dies ließe sich damit erklären, dass die Verfahren zu Proteinextraktion vor allem zytosolische Proteine berücksichtigen, membranständige Proteine jedoch weitgehend vernachlässigen. Zusammengefasst wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Algorithmus etabliert, der sich auf vielfältige Art und Weise für Fragestellungen zur Charakterisierung lern- bzw. stressinduzierter Proteine unter Berücksichtigung neuroanatomischer Aspekte anwenden lässt. Berücksichtigt man, dass Anisomycin neben der Proteinsynthesehemmung auch andere zelluläre Prozesse beeinflusst, so fällt die vorliegende Arbeit kein abschließendes Urteil über die Rolle der Proteinbiosynthese bei hippokampusabhängigen Lernprozessen. Dies kann zu einem erheblichen Teil an der nichttopographischen Anatomie des Hippokampus liegen, so dass zukünftige Studien sich auf eng umrissene Hirnareale konzentrieren sollten.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Erkenntnisse zur funktionalen Zellkernarchitektur wurden bisher überwiegend an fixierten Zellen durch in situ Methoden erlangt. Durch Etablierung eines Lebendzell-Systems sollte überprüft werden, ob es möglich ist, ein einzelnes Transgen auf DNA-Ebene zu visualisieren und es bei seiner transkriptionellen Aktivierung zu beobachten. Das hier entwickelte „Gene Positioning System“ (GePS) nutzt das Lac-Operator/Lac-Repressor-GFP-System („Gene Tag“) als visualisierende Komponente, um das Indikatorgen auf DNA-Ebene sichtbar zu machen. Das Indikatorgen selbst basiert auf der induzierbaren Transkriptionseinheit von HIV-1, die spezifisch durch das virale Protein Tat aktiviert werden kann und die Transkription eines Reportergens (DsRed) kontrolliert. Im transient transfizierten Status konnte das Indikatorgen als Episom durch Bindung des „Gene Tags“ als punktförmiges Signal im Kern detektiert werden. In den etablierten und charakterisierten Zelllinien HeLa-Indi war dies durch Bindung des „Gene Tags“ an 64 Lac-Repressor-Bindungsstellen eines einzelnen Transgens nicht möglich. Die Etablierung der stabilen Zelllinien und die transiente Expression ermöglichten einen direkten Vergleich der Transkription von der integrierten und episomalen HIV-1 LTR. In beiden Fällen konnte eine spezifische Transkriptionsaktivierung durch Tat auf Protein- und RNA-Ebene beobachtet werden. Auch eine Tat-unabhängige Basisaktivität in Form von Volllänge-Transkripten konnte immer nachgewiesen werden, die in verschiedenen Zelllinien und dem episomalen Indikatorgen aber zu keiner nachweisbaren Proteinexpression führte. Die induzierte Expression des Indikatorgens des „GePS“ konnte darüber hinaus in wichtigen HIV-1 Zielzellen (CD4 positive Lymphozyten) gezeigt werden. Des Weiteren konnten Erkenntnisse über die Tat-induzierte, von der HIV-1 LTR ausgehenden Transkription und der Zusammenhang zum Spleißen gewonnen werden. Durch quantitative PCR wurde deutlich, dass sowohl im epsiomalen als auch integrierten Status erst durch die gesteigerte Transkription das Spleißen der Indikatorgen-RNA induziert wird, das Spleißen also co-transkriptionell stattfindet. Tat selbst spielt bei der Rekrutierung von Spleißfaktoren nur eine indirekte Rolle, da durch die transkriptionsdefiziente Mutante Tat(K41A) kein Spleißen initiiert wird. Durch verschiedene methodische Ansätze wurde versucht, die Frage der Chromatinzusammensetzung von nicht replizierenden Episomen in menschlichen Zellen zu beantworten. Weder durch eine Colokalisations-Untersuchung noch eine Chromatin IP konnte jedoch eine spezifische Assoziation des episomalen Indikatorgens mit dem Histon H3 nachgewiesen werden. Eine Bindung von Proteinen an die Episomen konnte am Beispiel von p50, einer Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκB, gezeigt werden. Für die produktive Replikation der Retroviren ist die Integration der proviralen DNA ins Genom der Wirtszelle nötig, jedoch konnte für HIV gezeigt werden, dass nicht integrierte zirkuläre HIV-DNA in sich nicht teilenden Zellen persistiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vermutung, dass nicht integrierte retrovirale DNA transkribiert werden kann und dadurch die exprimierten Proteine Bedeutung für den Lebenszyklus von HIV und durch ihre Persistenz Einfluss auf die Wirtszellen haben können.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Basierend auf der Genomsequenz von H. sal. R1 wurde ein genspezifischer Gesamt-Genom-DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurden für jeden ORF des Genoms ORF-spezifische Oligonukleotide abgeleitet und zur spezifischen Amplifizierung der Genabschnitte mittels PCR eingesetzt. Nach Amplifizierung und Reinigung der Genabschnitte deckten die Produkte über 97% des halobakteriellen Genoms ab. Zur Konstruktion des Gesamt-Genom-DNA-Mikroarrays wurde jede spezifische Gensonde in fünffacher Wiederholung auf den DNA-Array aufgebracht. Auf diese Weise wurde ein DNA-Mikroarray erstellt, der mit einer Gesamtzahl von 13545 genspezifischen Sonden, das bisher dichteste Raster eines archaealen DNA-Mikroarrays aufweist. Durch parallele genomweite Genexpressionsanalyse in H. sal. R1, wurde der Vergleich zwischen aerobem und phototrophem Wachstum in drei umfassenden DNA-Mikroarrayexperimenten gezogen. Die Mikroarrayexperimente wurden mit dem so genannten „common reference“ Experimentdesign durchgeführt, bei dem eine Mischung aller RNA-Proben eines Experiments als Referenz bei den Hybridisierungen dient. Als weitere Vorraussetzung zur späteren statistischen Datenanalyse wurden die Transkriptomexperimente alle vier- bis fünfmal in unabhängigen Experimenten wiederholt. Die Wahl der Referenz und die Anzahl der unabhängigen biologischen Replikate haben die Basis geschaffen, die erhobenen Expressionsdaten mit Hilfe des R/MAANOVA Paktes der flexiblen und leistungsstarken statistischen Programmoberfläche R auszuwerten. Eine leistungsstarke und flexible Programmoberfläche zur Datenanalyse war unerlässlich, denn mit steigender Komplexität eines Transkriptomexperiments, steigt auch die Anzahl der notwendigen Wiederholungen und damit einhergehend die Gesamtzahl der auszuwertenden Datenpunkte. Für ein durchgeführtes Zeitreihenexperiment vom Wechsel aerobes zu phototrophem Wachstum mit sechs Zeitpunkten, fallen ca. 384.000 Datenpunkte an, für deren Vorder- und Hintergrundwerte die statistischen Kennwerte berechnet werden mussten. Ein solcher statistischer Kennwert ist der so genannte p-Wert, der die Signifikanz eines Ergebnisses widerspiegelt. Auf der Basis dieser signifikanten p-Werte ist eine Liste von 242 Kandidatengenen erstellt worden, die als differentiell exprimiert angesehen werden. Ein Anteil von 54.5% dieser differentiell exprimierten Gene weist kein homologes Protein oder Funktion auf. Diese Tatsache, birgt die Chance sowohl die Existenz dieser ORFs, als auch ihre Funktion aufzuklären. In diesem Zusammenhang wurden für die hypothetischen ORFs OE3107F und OE3136F Deletionsmutanten hergestellt und näher charakterisiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Deletionsmutanten R1D3107 und R1D3136 im Vergleich zum WT-Stamm H. sal. R1 deutliche Unterschiede in ihrer Pigmentzusammensetzung aufweisen. Beide Deletionsstämme weisen z.B. einen geringeren Gehalt an Bakteriorhodopsin auf. Somit hat die neu etablierte Methode der DNA-Mikroarray basierten Genexpressionsanalyse dazu beigetragen, zwei bisher unbekannte Kandidaten der Regulation der Expression des Bakteriorhodopsins in H. sal. R1 zu identifizieren. Durch zellfreie in vitro Expression des Gens OE3136F wurde ein möglicher Ansatz zur näheren Charakterisierung und Funktionsaufklärung aufgezeigt. Neben der Herstellung von Deletionsmutanten und deren Charakterisierung, wurde durch die Anwendung einer weiteren Datenanalyse mittels PCA (Hauptkomponentenanalyse) und dem Ansatz die erhobenen Transkriptomdaten auf Stoffwechselwegen abzubilden, zwei weitere denkbare Wege aufgezeigt, aus den ermittelten Expressionsdaten mehr Informationen zu erhalten. Die Ergebnisse aller Transkriptomexperimente für H. sal. R1 stimmen mit den Ergebnissen früherer Arbeiten überein und durch unabhängige Methoden wie RT-PCR, Nothern-Blot-Analysen und Proteomvergleich konnten die Resultate der Expressionsanalysen eindeutig verifiziert werden. Die Konstruktion und Herstellung der H. sal. R1 Gesamtgenom-Mikroarrays und Ausarbeitung eines Standardprotokolls zur Versuchsdurchführung, bilden die Grundlage aller Transkriptomexperimente der Arbeitsgruppe. Daneben ermöglicht die Schaffung einer bioinformatischen Infrastruktur zur statistisch signifikanten Auswertung der DNA-Mikroarray-Hybridisierungsergebnisse die Erstellung einer Transkriptomdatenbank, die durch Anknüpfung an die bereits vorhandene HaloLex-Datenbank jedem Nutzer für weitere Mikroarray-Experimente mit anderer Fragestellung in leichter Form zur Verfügung steht. Abschließend kann gesagt werden, dass die DNA-Mikroarray basierende Transkriptomanalyse von H. sal. R1 dazu beigetragen hat das Wissen über den Prozess der Anpassung an das phototrophe Wachstum zu erweitern. Die in der Arbeit erhobenen Daten bilden die Grundlage einer Datensammlung, die es zu einem späteren Zeitpunkt ermöglichen wird, über viele verschiedene Experimente hinweg neue Co-Regulationen von Genen zu erfassen und damit neue Gene und Verknüpfungen zwischen Stoffwechselwegen schnell und einfach zu detektieren. Die vorliegende Arbeit kann als Ausgangspunkt für genomweite funktionelle Charakterisierung haloarchaealer Genexpression und ihrer Regulation angesehen werden. Dieser Punkt ist im Hinblick auf die wachsende Bedeutung der Systembiologie von entscheidender Wichtigkeit, denn nur auf der Basis von soliden experimentellen Ergebnissen können Modelle aufgestellt und verbessert werden.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/07
Die IGFBP-2-Serumkonzentrationen sind beim menschlichen Kolonkarzinom mit dem Tumorstadium signifikant positiv korreliert und sogar als prognostischer Marker für eine Wiedererkrankung nach Tumorresektion informativ. Dennoch ist die spezifische Rolle von IGFBP-2 für die Entstehung und Progression des Kolonkarzinoms völlig unklar. In vitro wurden für IGFBP-2 sowohl positive als auch negative Effekte auf das Wachstum normaler und maligner Zellen nachgewiesen. Für die zweifelsfreie Zuordnung spezifischer Effekte in vivo wurde in der vorliegenden Arbeit das IGFBP-2-transgene Mausmodell verwendet. In diesem Modell wurde die Kolonkarzinogenese chemisch induziert. Um herauszufinden, in welchem Stadium der mehrstufigen Kolonkarzinogenese IGFBP-2 von Bedeutung ist, wurden die Analysen 10 und 34 Wochen nach Beginn der Behandlung mit dem Karzinogen durchgeführt. Zum früheren Analysezeitpunkt wurde festgestellt, dass IGFBP-2 zunächst die Entstehung von kleinen hyperplastischen aberranten Krypten Foci (ACF) förderte, sich diese ACF aber in der späteren Phase zurückentwickelten und keinen Einfluss auf die Tumorprävalenz hatten. Im Vergleich zum Wildtyp entwickelten die IGFBP-2-transgenen Mäuse jedoch weniger dysplastische ACF. Dysplastische ACF in IGFBP-2-transgenen Mäusen bildeten kleinere Foci und wiesen einen deutlich geringeren Dysplasiegrad auf. Größere ACF des transgenen Genotyps stellten den hyperplastischen ACF-Typ dar. Interessanterweise war die Expression von β-Catenin in den ACF transgener Tiere gegenüber dem Wildtyp deutlich reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IGFBP-2 einen hemmenden Effekt bereits im frühen Stadium der Kolonkarzinogenese ausübt. Zum späteren Untersuchungszeitpunkt unterschied sich die Tumorprävalenz zwischen den beiden Genotypen nicht voneinander. Jedoch war das Volumen der Adenome der IGFBP-2-transgenen Gruppe um das 2,3-fache kleiner als beim Wildtyp, was durch einen geringeren Anteil an proliferierenden Tumorzellen bedingt war und sich bereits bei den ACF der frühen Phase abzeichnete. Zudem wurde, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der früheren Phase, eine deutlich geringere nukleäre Akkumulation von β-Catenin in den Adenomen IGFBP-2-transgener Tiere beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass IGFBP-2 sowohl in der frühen als auch in der späteren Phase der Kolonkarzinogenese einen hemmenden Effekt auf das Wachstum von dsyplastischen ACF und Tumoren hat, indem es die Tumorlast reduziert und die Akkumulation von nukleärem β-Catenin inhibiert. Um Effekte von IGFBP-2 auch auf Ebene der Genexpression zu berücksichtigen, wurde eine Expressionsanalyse von Kandidatengenen, die aus der Literatur im Zusammenhang mit einer Überexpression von IGFBP-2 bekannt waren, durchgeführt. Interessanterweise ergab die Real-Time PCR Analyse eine erhöhte MMP2-, TIMP1- und NFκB-mRNA Expression in Tumoren, nicht aber im normalen Kolongewebe von IGFBP-2-transgenen Mäusen. Aus der konditionalen Überexpression von Invasions- und Migrations-assoziierten Genen im Tumor von IGFBP-2-transgenen Mäusen könnte auf einen möglichen Effekt von IGFBP-2 auf die Metastasierung geschlossen werden. Die Relevanz dieser veränderten Genexpression sollte in einem Metastase-Modell weiterführend untersucht werden.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Die Behandlung zerstörter Gewebe- und Organstrukturen nach akuten Verletzungen oder chronischen Krankheitsverläufen hat sich zu einer enormen Belastung für das heutige Gesundheitswesen entwickelt. Neue Konzepte der Geweberekonstruktion durch Tissue Engineering führten in den letzten Jahren zu einer erheblichen Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung einer genaktivierten Fibrinmatrix zur lokalen Expression des Wachstumsfaktors epidermal growth factor (EGF). Das Konzept beinhaltet die gemeinsame Applikation autologer Keratinozyten und nicht-viraler Genvektoren mit PEI in Form einer injizierbaren Fibrinkleberzubereitung. Durch Variationen von PEI-Struktur, N/P-Ratio und dem Zusatz des abschirmenden Hüllpolymers P6YE5C wurde das Transfektionsverhalten unterschiedlicher Genvektorformulierungen in der Fibrinmatrix untersucht. Durch den Einsatz von fluoreszenzmarkierten Genvektoren wurde der Transfektionsverlauf innerhalb der Matrix visualisiert und dokumentiert. Größere Mengen ungeschützter Genvektoren führten in Fibrin trotz ihres toxischen Potentials zu hohen Genexpressionen. Ein protektiver Effekt durch den Zusatz des schützenden Hüllpolymers P6YE5C schien in Fibrin als nicht zwingend notwendig. Daraufhin wurde ein möglicher Einfluss der Fibrinmatrix auf Genvektorformulierungen untersucht. Erste Vorversuche in Zellkultur zeigten eine Steigerung des Transfektionspotentials nicht-viraler Genvektoren mit PEI nach Vorinkubation mit einer Fibrinogen-Lösung. Aus der Perspektive einer kommerziellen Anwendung heraus wurde ein lagerungsfähiges Lyophilisat aus genaktiviertem Fibrinogen entwickelt, das zum Versuchszeitpunkt als Fibrinklebervorstufe mit Wasser rehydratisiert und gemeinsam mit Thrombin zur Herstellung der genaktivierten Fibrinmatrix eingesetzt werden konnte. Der Einsatz des schützenden Hüllpolymers P6YE5C hatte dabei einen entscheidenden Einfluss auf die unmittelbare Verfügbarkeit der eingesetzten Genvektoren. Für die Regeneration von Knochenbrüchen bleibt dagegen der Einsatz medizinischer Implantate von entscheidender Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wird in einem weiteren Ansatz die Entwicklung und Charakterisierung genaktivierter Polymerfilme aus PDLLA und PLGA zur Beschichtung medizinischer Implantate beschrieben. Die neue Grenzfläche zwischen Implantat und Knochenstruktur soll zur lokalen Transfektion und Expression therapeutischer Gene dienen. Dafür wurden nicht-virale Genvektoren lyophilisiert und als Dispersion in organischen Lösungen der Polymere PDLLA und PLGA auf resistente Oberflächen aufgetragen und getrocknet. Die Besiedelung der verbliebenen Polymerfilme mit Zellen führte über den direkten Kontakt mit genaktivierten Polymerstrukturen zur Expression des eingesetzten Gens. Durch Variation von Polymer- und Genvektormenge wurde anhand der gemessenen Genexpressionen sowie der metabolischen Aktivität transfizierter Zellen das System optimiert. Die Bestimmung der Transfektionseffizienz sowie des Freisetzungsverhaltens formulierter Genvektoren diente zur Charakterisierung der genaktivierten Polymeroberflächen aus PDLLA und PLGA. Trotz struktureller Ähnlichkeiten der eingesetzten Filmbildner zeigte sich das Freisetzungsverhalten aus PDLLA gegenüber PLGA abhängig der eingesetzten Polymer- und Genvektormengen. Das Beschichtungsprinzip konnte ebenfalls für die Aktivierung von Folien aus Aluminiumlegierung eingesetzt werden und führte zur Expression des therapeutischen Gens bone morphogenic protein-2 (BMP-2). Die Verwendung von Poly-[Tyrosincarbonaten] als strukturelle Alternative zu PDLLA bzw. PLGA führte zu keiner Genexpression. Hohe medizinische Anforderungen und individuelle Interaktionen einzelner Matrixkomponenten machen genaktivierter Biomaterialien zu komplexen Applikationsformen der regenerativen Medizin. Kleinste Veränderungen im komplexen Verbund aus Matrixstrukturen, Genvektoren und Zielzellen können drastische Effekte im Gesamtsystem verursachen. Abhängig von Indikation und Materialeigenschaften müssen die Formulierungen individuell angepasst und optimiert werden. Wird dieser Arbeitsaufwand investiert, bietet der Einsatz genaktivierter Biomaterialien gegenüber herkömmlichen Behandlungsformen großes therapeutisches Potential.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Unterschiedliche Stressbedingungen wie Starklicht, Hitze oder Nährstoffmangel können zu einem Abbau photosynthetischer Komplexe wie dem Photosystem I, dem Photosystem II oder Antennenproteinen führen. Dieser Abbau wird durch spezifische Proteasen durchgeführt. Die Proteasen können dabei direkt am Abbau der Strukturproteine beteiligt sein oder aber die Translation oder Transkription von Strukturproteinen oder solchen, die am Schutz photosynthetischer Proteine unter Stressbedingungen beteiligt sind, beeinflussen. Eisenmangel kann z. B. in Pflanzen und in Cyanobakterien zu Chlorose führen. Eisen ist an der Bildung von Chlorophyll beteiligt und kann in Form eines Sauerstoffträgers als Katalysator bei der Atmung agieren. Zudem ist Eisen als Kofaktor von Cytochromen und einigen Enzymen, wie Peroxidase und Katalase, für deren Funktionalität essentiell. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Deg- und SppA-Proteasen aus Synechocystis und Arabidopsis bei der Anpassung an verschiedene Stressbedingungen analysiert. Die plastidären Deg-Peptidasen werden durch vier Mitglieder, drei lumenale Enzyme (DegP1, DegP5 und DegP8) und einem stromalen Enzym (DegP2), vertreten. In Synechocystis besteht die Deg-Familie aus drei Komponenten, HtrA (DegP), HhoA (DegQ) und HhoB (DegS). Die HhoB (DegS)-Protease, die im Synechocystis-Genom durch das sll1427-Gen kodiert wird, ist in die Anpassung an Eisenstress involviert. Die DhhoB-Mutante zeigte sich unter Eisenmangel weniger angepasst und blieb auch nach längerer Stresseinwirkung grün. Die Mutante bildete sehr wohl die zum Schutz vor Eisenmangel benötigten Proteine, jedoch war die Expression von photosynthetischen Genen unter Stressbedingungen nicht wie im Wildtyp herabreguliert. Es wird vermutet, dass HhoB, ähnlich zu der DegS-Protease aus E. coli, an der Regulation der Genexpression beteiligt ist. Jedoch anders als bei E. coli wird bei Abwesenheit des DegS-Proteins die Expression nicht herabreguliert, sondern hochreguliert. Die DegP2- und DegP5-Proteasen aus Arabidopsis sind bei der Anpassung an Lichtstress involviert. Sie sind dabei aber nicht an der Reparatur des PSII oder am Abbau des D1-Proteins beteiligt. Die DdegP2-Mutante zeigte unter Lichtstress eine geringere nicht-photochemische Löschung (NPQ), die DdegP5-Mutante eine höhere NPQ. Die NPQ besteht aus drei Komponenten, der Photoinhibierung qI, der „state transition“ qT und dem „de-excitation quenching“ qE, wobei die ersten beiden nicht betroffen waren. Dass qE betroffen war, wurde anhand des Verhältnisses der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin bestimmt. Zeaxanthin wirkt sich positiv auf die NPQ aus. Die DdegP5-Mutante enthielt mehr Zeaxanthin relativ zu Violaxanthin als die DdegP2-Mutante. Beide Proteasen, DegP5 und DegP2, könnten Regulatoren der lumenalen Violaxanthin-de-epoxidase, welche Violaxanthin zu Zeaxanthin umwandelt, sein. Die DegP2- und die DegP5-Protease agieren als Gegenspieler bei der Löschung überschüssiger Anregungsenergie.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19
Das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM ist in der Tumorentstehung von Plattenepithelkarzinomen über- oder de novo exprimiert. Zudem korreliert die EpCAM-Expression in Tumorzellen positiv mit Proliferation und Entdifferenzierung. Es wurde in Vorarbeiten ein 1100 bp epcam-Promotorfragment kloniert, das spezifisch in EpCAM-positiven Zellen transkriptionell aktiv ist und durch TNFα in der Promotoraktivität reprimiert wird. In meiner Arbeit untersuchte ich, ob das 1100 bp epcam-Promotorfragment zur gezielten heterologen Genexpression geeignet ist. Zu diesem Zweck wurden drei Proteine ausgewählt: Grünes Fluoreszenz Protein (GFP), TNF receptor associated death domain Protein (TRADD) und Herpes Simplex Virus 1 Thymidinkinase (HSV1-TK). GFP diente der Visualisierung der Promotoraktivität im Fluoreszenzmikroskop. TRADD sollte die Apoptose in EpCAM-positiven Tumorzellen induzieren. Mit Hilfe der spezifischen Expression der HSV1-TK in EpCAM-positiven Zellen sollten Tumorzellen für Ganciclovir sensitiviert werden. Eine Therapie mit Ganciclovir sollte das Absterben der Tumorzellen bewirken. Die heterologe Genexpression wurde an einem zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen getestet. Dabei zeigten EpCAM-positive Zellen eine deutliche GFP-Expression, während EpCAM-negative Zellen sporadisch eine minimale Fluoreszenzintensität aufwiesen. Die EpCAM-spezifische Expression von GFP konnte im Immunoblot bestätigt werden. Um den Zusammenhang zwischen EpCAM- und GFP-Expression zu veranschaulichen, wurden die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen der EpCAM-Oberflächenexpression mit der GFP-Fluoreszenz verglichen. Damit konnte im zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen gezeigt werden, dass die epacm-Promotoraktivität zu einer heterologen Genexpression von GFP führt. Das zelluläre Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen wurde auf die Expression weiterer funktioneller Gene untersucht. Für das Funktionsgen TRADD konnte dabei weder eine EpCAM-spezifische heterologe Genexpression in der RT-PCR noch im Immunoblot nachgewiesen werden. In beiden Untersuchungen führten die Positivkontrollen zu einem Nachweis von TRADD. Da TRADD über komplexe Signalwege zur Bildung von TNFα führen kann, findet möglicherweise eine Inaktivierung des epcam-Promotors durch TNFα statt. Die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors konnte im zellulären Modellsystem in der RT-PCR nachgewiesen und auf die EpCAM-positive Tumorzelllinie SKBR3 übertragen werden. Durch die Genexpression von HSV1-TK wurden EpCAM-positive HEK293 Transfektanten sensitiv gegenüber einer Behandlung mit Ganciclovir und zeigten eine deutlich reduzierte metabolische Aktivität im MTT-Ansatz bei Ganciclovirgabe. Dabei gewonnene Erkenntnisse wurden an der EpCAM-positiven Tumorzellinie SKBR3 bestätigt. Zusammengefasst konnte gezeigt werde, dass die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors zu Ganciclovirsensitivität in EpCAM-positiven Zellen führte, jedoch nicht in EpCAM-negativen Zellen. Somit ist es denkbar, das 1100 bp epcam-Promotorfragment für die therapeutische Genexpression letaler Gene zur Elimination EpCAM-positiver Tumorzellen zu verwenden.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19
Das Auftreten einer Metastasierung ist von großer prognotischer Relevanz für Patienten mit einer Tumorerkrankung und hat einen bedeutenden Einfluß auf die Heilungsrate. Bisher gibt es keine Therapie, die die Ausbreitung der Krebserkrankung verhindern oder stoppen kann, unter anderem, weil der Prozess der Metastasierung noch weitgehend unklar ist. Deswegen ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Tumorzelldisseminierung zu verstehen: Gibt es bestimmte Gene, die in disseminierten Zellen unter- oder überexprimiert sind? Hat ihre differentielle Expression einen Einfluss auf die Disseminierung? An welchen Signalwegen sind die dazu gehörigen Proteine beteiligt? Um Antworten auf diese Fragestellungen zu erhalten, ist es von großem Interesse, disseminierte Tumorzellen direkt zu studieren. Die Detektion solcher Zellen ist allerdings schwierig, da die Zellen extrem selten sind und es an spezifischen Markern mangelt. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Marker für die Detektion epithelialer Zellen in mesenchymalem Gewebe zu finden. Dafür wurde die differentielle Genexpression zwischen vier metastatischen Zellen von Brustkrebspatienten (Tester) und Knochenmarkzellen gesunder Patienten (Driver) mit der Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Methode analysiert. Da das Ausgangsmaterial aus global amplifizierter cDNA einzelner Zellen besondere Adaptersequenzen trägt, musste die SSH zuerst daran angepasst werden. Neun der gewonnenen Sequenzen zeigten eine differentielle Expression, die positiv im Tester und negativ im Driver war. Drei der identifizierten Sequenzen (BAF57, IGF1R und LPP) sind für ihre potentielle Beteiligung bei der Tumorentstehung bereits bekannt. Die Expression der neun Sequenzen wurde in elf Tumorzelllinien und Knochenmark geprüft. Drei Sequenzen sind nur in Zelllinien und nicht in Knochenmark nachzuweisen: IGF1R, BAF57 und eine Sequenz von uns #288 genannt, die keinem bereits bekannten Gen entspricht. Sie konnte als Fragment eines von ERV9 Long Terminal Repeat (LTR) gesteuerten Transkriptes identifiziert werden. LTRs von humanen endogenen Retroviren (HERV) enthalten Virale Promotoren, Enhancer und Polyadenylierungssignale und können die Genexpression regulieren. Es wurden bereits verschiedene zelluläre mRNA-Transkripte gefunden, die von ERV9 LTRs gesteuert werden. Die differentielle Expression der Sequenz #288 zwischen Karzinomzelllinien und Knochenmark deutet darauf hin, dass der ERV9 LTR für eine Gewebespezifizität verantwortlich zeichnen könnte. Da in Krebsgewebe auch eine höhere Transkriptionsaktivität für nicht kodierende Transkripte festgestellt wurde, stellt sich die Frage, ob die Sequenz #288 entweder einen neuen Tumormarker darstellen könnte oder an der Regulation anderer Gene beteiligt ist.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Maligne Tumorzellen besitzen die Fähigkeit, sich vom Primärtumor zu lösen und Metastasen zu bilden. Ein Verlust oder Mutationen im Kalzium-abhängigen, homophilen Zell-Adhäsionsmolekül E-Cadherin korrelieren häufig mit der Metastasierung epithelialer Tumore. Vorarbeiten haben gezeigt, dass in humanen E-Cadherin negativen MDA-MB-435S Zellen die Transfektion von bestimmten mutierten E-Cadherin Genen zu einer reduzierten Adhäsion, erhöhten Motilität und veränderten Zellmorphologie führt. Basierend auf diesen Vorarbeiten war das Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, welchen Einfluß mutierte E-Cadherine und der Zellkontakt auf das Genexpressionsprofil haben. Das Genexpressionsprofil wurde mittels eines im Rahmen dieser Arbeit etablierten 1259 Sonden (~899 Gene) umfassenden cDNA Mikroarrays bestimmt. Es konnten 88 Prozent der mittels des cDNA Mikroarrays gefundenen Genexpressionsunterschiede durch die Validierung mit Northern Blot Analyse und 94 Prozent durch quantitative realtime RT PCR im Bezug auf die Richtung der Genexpressionsveränderung bestätigt werden. Mit Hilfe des cDNA Mikroarrays wurde der Einfluß von E-Cadherin auf den WNT-Signalweg untersucht. Die in dieser Arbeit durchgeführten Gen- und Proteinexpressionsuntersuchungen zeigten, dass der E-Cadherin Status die Expression der im WNT-Signalweg involvierten Gene DKK1, SFRP1, SFRP3, CTNNAL1 und FZD7 so beeinflusst, dass die beta-Catenin Menge in der Zelle stabil gehalten wird. Diese Ergebnisse wurden bereits in Laboratory Investigation (Laux et al., 2004) publiziert. Die Zelllinien, die aufgrund von E-Cadherin Mutationen den Zell-zu-Zellkontakt verloren haben, zeigten eine differentielle Expression von Genen, die in der Angiogenese, Proliferation, Matrix Degradierung und Motilität involviert sind. Viele dieser Gene spielen in der Metastasierung als auch in der Wundheilung eine wichtige Rolle. Die Zelllinie mit WT E-Cadherin Status hat einen engen Zell-zu-Zellkontakt und zeigte eine erhöhte Expression von E-Cadherin Repressoren im Vergleich zu den E-Cadherin negativen oder mutierten Zelllinien. Bei einer hohen Zelldichte konnte ebenfalls eine erhöhte Genexpression der E-Cadherin Repressoren detektiert werden. Die Zelllinien erkennen sensitiv den Zell-zu-Zellkontakt Status und regulieren daraufhin autokrin den E-Cadherin Status über eine veränderte Expression der E-Cadherin Repressoren. Eine Regulation des E-Cadherin Status war bei den hier verwendeten Zelllinien aber aufgrund eines artfremden beta-Aktin Promotors vor den E-Cadherin Konstrukten nicht möglich. Um festzustellen, inwieweit der Zell-zu-Zellkontakt für die E-Cadherin abhängige differentielle Expressionen verantwortlich ist, wurde dessen Einfluß auf das Genexpressionsprofil mittels Zelldichteversuche untersucht. Bei einer geringen Zelldichte, bei der die Zellen wenig Kontakt zueinander haben, korrelieren die Genexpressionsver-änderungen mit denen der Zelllinien, die aufgrund von E-Cadherin Mutationen keinen Zell-zu-Zellkontakt haben. Die vorliegende Arbeit hat zur Identifikation von Genen, welche eine wichtige Rolle in der durch mutiertes E-Cadherin vermittelten Invasion spielen (z.B. MMP1, MMP3, VEGFC, SPARC, ITGA3, CYR61, TIMP3, PRKCD, MXI1, PRLR, PLAUR und LASP1), beigetragen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass der Zellkontakt maßgeblich an der differentiellen Expression deren Gene beteiligt ist. Weiterführende Studien können nun die gefundenen Kandidatengene bezüglich Diagnose und Therapie von malignen Tumoren mit E-Cadherin Mutationen genauer charakterisieren. Die Inhibition einiger dieser Proteine stellt einen viel versprechenden Therapieansatz zur Behandlung dieser Tumoren dar.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Abläufe in der Zelle eines multizellulären Organismus im Rahmen des Zellzyklus oder beim Vorgang der Differenzierung unterliegen strengen Kontrollmechanismen. Ein prominentes Regulationsprotein dieser Mechanismen ist der Retinoblastoma Tumorsuppressor (pRB). Im Zellzyklus liegt die Hauptfunktion pRBs in der Kontrolle des Übergangs von der G1- in die S-Phase. In der aktiven, nichtphosphorylierten Form reprimiert pRB die Expression von S-Phase Genen durch Inaktivierung des Transkriptionsfaktors E2F. Cyclin-abhängige Kinasen überführen pRB in eine mehrfach phosphorylierte, inaktive Form, wodurch die S-Phase eingeleitet wird. Im Gegensatz dazu übt pRB bei Differenzierungsvorgängen aber auch koaktivierende Funktionen aus und wird im Rahmen dieser Prozesse acetyliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass pRB nicht nur phosphoryliert und acetyliert wird, sondern darüber hinaus durch den small ubiquitin-like modifier (SUMO) modifiziert wird. Aktives pRB stellt das bevorzugte Substrat dieser Modifikation dar. Das Akzeptorlysin 720 ist konserviert und liegt in einer für die pRB-Funktion entscheidenden Domäne, der sogenannten pocket B Region. Zusammen mit der pocket A Region bildet sie die pocket Domäne, deren strukturelle Integrität sowohl für die Tumorsuppressorfunktion pRBs als auch für die Modifikation durch SUMO essenziell ist. An die pocket B Region binden neben zellulären Regulationsproteinen des Zellzyklus und der Differenzierung auch virale Onkoproteine, die pRB inaktivieren und dadurch für die Transformation einer Zelle verantwortlich sind. Diese viralen Onkoproteine und bestimmte zelluläre Proteine inhibieren die SUMO-Modifikation pRBs. Umgekehrt steigt die SUMOylierung von pRB an, wenn mutierte pRB-Versionen eingesetzt werden, die keine viralen oder zellulären Proteine mehr über die pocket B Region binden können. Eine Version von pRB, bei der das Lysin 720 zu Arginin ausgetauscht wurde und die somit nicht mehr SUMOyliert werden kann, besitzt ein stärkeres Repressionspotenzial auf die E2F-abhängige Genexpression, wie Reportergenversuche zeigten. Die SUMOylierung vermindert also pRBs Potenzial zur E2F-Reprimierung. Möglicherweise wird durch die SUMO-Modifikation von pRB die Zusammensetzung der Bindungspartner an der wichtigen pocket B Region moduliert.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) gehört zur Gruppe der humanen, vererbbaren Chromosomeninstabilitätssyndromen mit einem pleiotrophen Phänotyp. Betroffene Personen sind homozygot für eine Mutation im NBS1 Gen, die zu einem Ausfall der Bildung eines funktionellen Genproduktes führt. NBS Patienten reagieren u. a. empfindlicher auf ionisierende Bestrahlung, sind immundefizient und entwickeln mit erhöhter Wahrscheinlichkeit maligne Erkrankungen. Durch die vergleichende Analyse von zwei Zellpaaren mit NBS1-/- lymphoblastoiden Zelllinien und ihren entsprechenden NBS1+/- Linien, die aus Zellen von blutsverwandten Personen generiert wurden, wurden mögliche Ursachen für den auf zellulärer Ebene gut charakterisierten Phänotyp der erhöhten Strahlensensitivität der NBS1-/- Linien untersucht. Die Analyse einer möglichen differentiellen Genexpression in diesen Zelllinien mittels DNA Microarraytechnologie ergab nur ein signifikant minderexprimiertes Gen in den NBS1-/- Linien beider Zellpaare: LCK. Dieses Gen ist an der positiven Regulation der strahleninduzierten Apoptose in B- und T-Zellen beteiligt, weshalb die Rolle von NBS1 für die Regulation der strahleninduzierte Apoptose untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass NBS1-/- Zellen verglichen mit den entsprechenden NBS1+/- Zellen eine erhöhte Induktion von Apoptose nach gamma-Bestrahlung aufweisen. Die Analyse des Apoptoseweges demonstrierte die negative Regulation des CD95 vermittelten Weges durch NBS1. Die erhöhte strahleninduzierte Apoptose ist eine gute Erklärungsmöglichkeit für die beschriebene erhöhte Strahlensensitivität von NBS Zellen, da die Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB) von der NBS1 Mutation nicht beeinträchtigt wird und somit keine Erklärung für diesen Phänotyp bietet. Möglicherweise beeinflusst NBS1 aber die Regulation der beiden DSB Reparaturwege homologe Rekombination oder nicht-homologe Endverknüpfung. Um zukünftig das Ausmaß der Verwendung dieser beiden Reparaturwege in NBS1 defizienten Zellen studieren zu können, wurde ein Vektorsystem entwickelt, das die Quantifizierung der Verwendung dieser DSB Reparaturwege durch Analyse von Fluoreszenzmarken nach sequenzspezifischer Induktion von DSB in vivo ermöglicht. Neben der Rolle von LCK in der Regulation der Apoptose ist LCK als T-zellspezifisches Protein insbesondere an der T-Zellaktivierung beteiligt. Deshalb wurde die Rolle von NBS1 für die Regulation der LCK Expression in einer T-Zelllinie untersucht (Jurkat), um so möglicherweise eine weitere Ursache für die Immundefizienz der NBS Patienten beschreiben zu können. Allerdings ist die LCK Expression in diesen Zellen unabhängig von NBS1.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/07
Untersuchungen strahleninduzierter Änderungen der Proliferation und des Zelltodes stellen Schwerpunkte der radiobiologischen Forschung dar. Aus strahlentherapeutischer Sicht interessieren hier im Besonderen die in Tumoren nach Strahlenexposition zu findenden Genexpressionsänderungen, die assoziiert mit strahleninduzierten Änderungen der Proliferation und des Zelltods auftreten. Detaillierte Kenntnisse der diesen biologischen Prozessen zugrundeliegenden Änderungen auf Genexpressionsebene könnten dazu beitragen, die Effizienz der Strahlentherapie humaner und tierischer Tumoren zu verbessern. So ist eine große Anzahl an für Proliferation und Apoptose kodierenden Genen bekannt. Es sind bisher jedoch nicht alle an der Proliferationskontrolle beteiligten Gene gefunden worden. Ebenso wird postuliert, dass auch andere Formen des Zelltodes als Apoptose auf Genexpressionsebene reguliert werden. Deshalb wurde mithilfe eines Mikroarrays mit 11.835 Genen ein Screening nach differentiell exprimierten Genen an strahlenexponierten A549 Zellen (humanen Lungenkarzinomzellen) vorgenommen. Hierzu wurden die Zellen synchronisiert, in der S-Phase mit 5 Gy bestrahlt und an den Zeitpunkten, die der Ausbildung des G2-Blocks und dem Anstieg mikrokernhaltiger und abnormaler Zellen zeitlich vorausgingen, das Screening durchgeführt. Die geeigneten Zeitpunkte wurden zuvor anhand durchflusszytometrischer Zellzyklusuntersuchungen und der Messung des Zelltodes (MAA-Assay) bestimmt. Die hybridisierten Mikroarrays wurden nach dem Digitalisieren unter Zuhilfenahme einer geeigneten Software interaktiv ausgewertet. Es konnten maximal 987 exprimierte Gene gefunden werden, was 12 % aller Gene des Mikroarrays entsprach. Setzte man die Genexpression der mit 5 Gy bestrahlten Zellen ins Verhältnis zu der Kontrolle, konnten 101 Gene als differentiell exprimiert ermittelt werden. Die Anzahl der herunterregulierten differentiell exprimierten Gene übertraf die Anzahl der hochregulierten differentiell exprimierten Gene zu jedem gemessenen Zeitpunkt immer ca. um den Faktor 4. Des Weiteren wurden die differentiellen Genexpressionen relativ zur Kontrolle der unterschiedlichen Zeitpunkte miteinander verglichen, wobei eine auffällige homogene Herunterregulation der Gene festzustellen war. Nach Einteilung der differentiell exprimierten Gene in funktionelle Gruppen konnten viele Gene, die für den Aufbau des Zytoskeletts kodierten, ermittelt werden. Hierbei standen im Vordergrund vor allem Gene für Tubulinproteine und Aktin. Des Weiteren konnten 8 Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, identifiziert werden. Der Anteil bekannter, die Proliferation ("cyclin-dependent kinase inhibitor 1A" (p21, Cip1), "prothymosin, alpha") bzw. die Apoptose ("Caplain" und "TNF receptor-associated factor 1", "Caspase recruitment domain protein 14") regulierender Gene war gering. In Übereinstimmung mit zuvor durchgeführten Untersuchungen in anderen in vitro Modellen konnte eine aktive Herunterregulation bestimmter biologischer Funktionen (z.B. Zytoskelett, Proteinbiosynthese) bei gleichzeitiger Inhibition anderer Funktionen (Proliferation)gezeigt werden ("active silencing"). Da die Aussagen des Mikroarrays nur semiquantitativ sind, müssen die Ergebnisse noch durch ein quantitatives Verfahren (RTQ-PCR) validiert und ergänzt werden. Die vorläufigen Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise darauf, dass neben den bekannten Zellproliferation und Zelltod kodierenden Genen in einem erheblichen Maß auch andere funktionelle Gengruppen wie z.B. Zytoskelett- und ribosomale Proteine kodierende Gene beteiligt sind und die Zelle im Sinne eines "active silencings" durch Abschalten verschiedener Zellfunktionen ihren eigenen Untergang vorbereitet.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19
Thu, 8 Dec 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4720/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4720/1/Kriegl_Lydia.pdf Kriegl, Lydia ddc:6
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Die hypertrophisch obstruktive Kardiomyopathie (HOCM) als Erbkrankheit stellt eine der Haupttodesursachen in der westlichen Welt unter den an Herzkrankheiten plötzlich Verstorbenen dar. Eine intraventrikuläre Obstruktion der Ausflußbahn des linken Ventrikels bedingt eine erhöhte Druckarbeit, was eine Hypertrophie der gesamten Herzmuskulatur des linken Ventrikels nach sich zieht. Klinisch relevant ist die begleitende diastolische Relaxationsstörung. In dieser Arbeit wird untersucht, ob nach erfolgreicher Alkoholablation mit Abnahme der diastolischen Relaxationsstörung Genexpressionsänderungen regulatorischer Proteine der Calciumhomöostase auftreten. Zu diesem Zwecke wurden Herzmuskelbiopsien von Patienten mit HOCM vor und nach Behandlung der Septalastes mit Alkoholablation (TASH) auf den mRNS-Gehalt folgender Gene untersucht: alpha 1c-, beta-, alpha2/delta-Untereinheit, SERCA 2a und das Phospholamban. Die Genexpressionsuntersuchungen wurden quantitativ mit Hilfe der reversen kompetitiven Polymerase Kettenreaktion vorgenommen. Die Ergebnisse zeigen eine prozentuale Abnahme der Genexpression nach Behandlung mit TASH der alpha 1c-Untereinheit um 82,91% (p = 0.05), der alpha2/delta-Untereinheit um 71,64% (p = 0.04) und der beta-Untereinheit um 64,85% (p = 0.03). Die Genexpressionsveränderungen der SERCA 2a und des Phospholambans waren nicht signifikant. Die signifikante Reduktion der Expression der alpha 1c-, alpha2/delta- und beta-Untereinheit nach Alkoholablation der septalen Hypertophie bei Patienten mit HOCM sprechen dafür, dass der L-Typ Calciumkanal eine Rolle im Rahmen der Anpassungsvorgänge bei hypertrophisch obstruktiver Kardiomyopathie spielt. Dies gilt jedoch nicht für die SERCA2a- und die Phospholamban-Genexpression bei den untersuchten Patienten. Eingeschränkt wird die Aussagefähigkeit unserer Untersuchungen durch die geringe Fallzahl. Vorteil der Untersuchung ist jedoch, dass die Genexpressionsänderung der unterschiedlichen Gene jeweils am gleichen Patienten zum Zeitpunkt der Behandlung und sechs Monate danach untersucht wurde. Unsere Untersuchungsergebnisse weisen darauf hin, dass eine Verbesserung der diastolischen Relaxation nach erfolgreicher Intervention mit Genexpressionsänderungen regulatorischer Proteine der Calciumhomöostase einhergeht.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Hintergrund und Fragestellung Eines der schwerwiegenden Probleme der interventionellen Kardiologie stellte bislang die koronare Restenose im Stent dar. Erst durch die Einführung eines Rapamycin- freisetzenden-Stents konnte die Restenoserate erheblich gesenkt werden. Trotz dieses therapeutischen Erfolges sind die transkriptionellen pathophysiologischen Mechanismen der Neointimahyperplasie, die zu über 90% für den Lumenverlust nach koronarer Stentimplantation verantwortlich ist, sowie deren Beeinflussung durch Rapamycin nur teilweise verstanden. Methodik Die vorliegende Arbeit untersuchte deshalb in einem humanen Organkulturmodell auf genregulatorischer Ebene die molekularen Mechanismen, die der Neointimaformation im Menschen zu Grunde liegen, sowie die Beeinflussung dieser Mechanismen durch eine Behandlung mit Rapamycin. Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass (1) die Veränderungen in der Genexpression einem zeitlichen Muster folgen mit maximalen Veränderungen 21 Tage nach Ballondilatation; (2) die inflammatorische Komponente zu den frühen Zeitpunkten eine wichtigere Rolle spielt während Proliferation und Apoptose die späteren Veränderungen in der Genexpression dominieren; (3) die Ballonangioplastie ein Genexpressionsprofil induziert, welches die Rekrutierung und Aktivierung sowohl inflammatorischer als auch hämatopoetischer Vorläuferzellen erleichtert; (4) Rapamycin die Induktion eines solchen pro-adhäsiven, proinflammatorischen Genexpressionsmusters als auch die Induktion von HPC-stimulierenden Genen verhindert. Diskussion Eine zeitlich gestaffelte Genexpressionsanalyse menschlicher Arterien nach Ballonangioplastie ist bisher nicht veröffentlicht worden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass die Veränderungen in der Genexpression einem zeitlichen Muster folgen mit einer maximalen Alteration nach 21 Tagen und nur wenigen ausschließlich nach 56 Tagen regulierten Genen. Somit lässt sich schlussfolgern, dass eine spätere Restenose die Folge einer frühen, gestörten Wundheilung ist. Diese Auffassung wird durch die beeindruckende Verminderung der In-Stent-Restenose durch Rapamycin-freisetzende Stents unterstützt, da diese Stents etwa 80% der totalen Medikamentendosis innerhalb der ersten 30 Tage freisetzen. Während die Proliferation bekanntermassen eine wichtige Rolle für die Neointimaformation spielt, wurde die Bedeutung inflammatorischer Prozesse, welche zur Rekrutierung von Leukozyten und hämatopoetischen Vorläuferzellen führen, erst später vermehrt beschrieben. Die koordinierte Induktion eines in dieser Arbeit nachgewiesenen proinflammatorischen Genexpressionsmusters stellt eine beeindruckende Rationale für eine umfangreiche Rekrutierung von Leukozyten nach Ballondilatation dar. Zytokine wie IL-8, EMAP-II, NAP-2 oder GCP-2 waren nach Angioplastie vermehrt exprimiert und verstärken die Migration von Granulozyten. Die mechanisch induzierte Aktivierung dieses Genexpressionsmusters begünstigt somit die Leukozytenrekrutierung und dadurch auch die Restenose, da die Dichte inflammatorischer Zellen in der Neointima mit dem Ausmass der Restenose korreliert. Als weiterer Mechanismus der Neointimaformation wurde kürzlich die Rekrutierung hämatopoetischer Vorläuferzellen im Tiermodell nachgewiesen. Es war jedoch bisher nicht bekannt, ob sich diese Beobachtungen auf den Menschen übertragen lassen. Im Organkulturmodell zeigte sich nach Angioplastie die vermehrte Expression von einigen mit hämatopoetischen Vorläuferzellen assoziierten Genen. Dies weist daraufhin, dass diese Mechanismen auch im Menschen eine Rolle spielen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des Makrolidantibiotikums Rapamycin auf die transkriptionellen Mechanismen nach Ballonangioplastie untersucht. Zunächst spiegelten sich die bekannten antiproliferativen Effekte von Rapamycin in einer deutlich verminderten Expression von wachstumsassoziierten Genen wie verschiedenen Transkriptionsfaktoren und Kinasen wie JAK1 oder AKT1 wieder. Darüberhinaus führte die Rapamycinbehandlung zu einer koordinierten Hemmung der CXC Chemokine 6-8 (GCP-2, β- Thromboglobulin, IL-8) und von EMAP-II, welche alle eine wichtige Rolle in der Adhäsion, der Migration und der Aktivierung von Neutrophilen und Monozyten spielen. Folglich könnte eine durch Rapamycin veminderte Rekrutierung und Aktivierung dieser Zellen ein wesentlicher Mechanismus in der Reduktion der Neointimaformation sein. Zusätzlich unterstützt diese Arbeit die Hypothese, dass Rapamycin auch direkte Effekte auf hämatopoetische Vorläuferzellen hat. Im Organkulturmodell führte eine Rapamycinbehandlung zur veminderten Expression verschiedener Gene wie des Oncostatin M Rezeptors beta und JAK1, welche das Wachstum immaturer, noch differenzierender Zellen in der Gefässwand fördern. Es lässt sich zusammenfassen, dass Rapamycin neben seiner anti-proliferativen Wirkung nach Ballonangioplastie tiefgreifende hemmende Effekte auf das pro-inflammatorische Genexpressionsmuster und auf Promotoren hämatopoetischer Vorläuferzellen verübt. Somit zeigt diese Arbeit erstmals eine Rationale auf, wie Rapamycin auch im Menschen die Rekrutierung hämatopoetischer Vorläuferzellen in die Gefässwand verhindern könnte. Dies vermag möglicherweise seine hohe Effektivität in der Reduzierung der Restenose erklären.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Die vorliegende Dissertation untersucht mit Hilfe der Microarray-Technologie die Auswirkungen gängiger Zytostatika auf die globale Genexpression humaner Tumor- und Normalzellen und evaluiert deren Gemeinsamkeiten und Unterschiede. Darüber hinaus werden niedermolekulare Inhibitoren, die spezifisch gegen onkologische Targets gerichtet sind, in ähnlicher Weise analysiert und mit einer RNAi-vermittelten Herabregulierung desselben Zielmoleküls verglichen. Der Vergleich der Expressionsmuster lässt darauf schließen, inwieweit die Effekte verschiedener Substanzen übereinstimmen, und ermöglicht aufgrund dessen eine Aussage über ihre Spezifität.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/07
Der Eileiter spielt eine bedeutende Rolle im Reproduktionsgeschehen und ist dabei in viele wichtige Prozesse involviert. Er unterstützt durch das Milieu, das er bereit stellt, die Kapazitation der Spermien, die Reifung und die Befruchtung der Eizelle, und er fördert durch sezernierte Faktoren die frühe Embryonalentwicklung. Während des Zyklus durchläuft er deutliche morphologische und histologische Veränderungen, um seinen verschiedenen Aufgaben gerecht zu werden. Da viele Veränderungen in einem Gewebe mit einer Veränderung des Transkriptoms einhergehen, haben wir bovines Eileiterepithel als Ausgangsmaterial für Untersuchungen auf der Ebene der mRNA ausgewählt. Um ein homogenes und definiertes Probenmaterial erhalten zu können, musste die Schlachtung der Tiere zur Probengewinnung zu einem möglichst genau definierten Zykluszeitpunkt stattfinden. Hierfür wurde ein Protokoll zur Tiervorbereitung erarbeitet, mit dessen Hilfe alle Tiere für die Versuche einheitlich ausgewählt und zyklussynchronisiert wurden. Weiterhin wurde ein Entnahmeprotokoll für die Eileiterepithelproben entwickelt, das Schwankungen in der Probenqualität unabhängig von der durchführenden Person minimiert. Zur Untersuchung von Veränderungen des Transkriptoms wurde in einem ersten Ansatz eine Kombination aus subtraktiven cDNA-Banken und radioaktiver cDNA-Array-Hybridisierung verwendet. Zuerst wurde Eileiterepithel (Ampulle und Isthmus gemeinsam) von drei Tieren im Östrus und drei Tieren im Diöstrus untersucht. Insgesamt wurde die Expression von 3072 cDNA-Klonen (1536 cDNAs pro subraktiver Bank, eine Bank pro Zykluszeitpunkt) im Östrus versus Diöstrus verglichen. Dabei konnten 77 verschiedene cDNAs mit signifikanten Konzentrationsunterschieden zwischen den beiden Zykluszeitpunkten identifiziert werden. Davon waren 37 im Östrus und 40 im Diöstrus stärker exprimiert. Die identifizierten Gene wurden in Funktionsklassen eingeordnet. Dadurch konnten vereinfachte „Gene Ontologies“ gebildet werden, die einen Überblick geben, welche biologischen Prozesse und molekularen Funktionen zwischen Östrus und Diöstrus reguliert werden. So sind Gene, die für die Synthese und Sekretion von Proteinen wichtig sind, im Östrus hochreguliert, wohingegen Gene, die Aufgaben in der Regulation der körpereigenen Immunantwort und der Transkription haben, im Diöstrus hochreguliert sind. In einem zweiten Ansatz wurden die gewonnenen Einblicke in die Genexpressions-veränderungen während des Zyklus weiter vertieft. Dazu wurde ein Ovidukt-Array hergestellt, das auf vorangegangene Arbeiten zur Genexpression im Eileiterepithel aufbaute und durch alle cDNAs, die im Vergleich von Eileiterepithel im Östrus zu Diöstrus als differenziell exprimiert auffielen sowie durch einige Kandidatengene, erweitert wurde. Zusätzlich enthielt es, als interne Kontrolle, 94 cDNAs, von denen keine Veränderung der Genexpression im Zyklusverlauf zu erwarten waren. Auf dem Ovidukt-Array befanden sich insgesamt 549 cDNAs von 432 Genen. Mit diesem Array wurden Hybridisierungs-experimente mit bovinen Eileiterproben aus vier verschiedenen Zyklusstadien durchgeführt, jeweils drei Tiere an Tag 0, Tag 3,5, Tag 12 und Tag 18 des Sexualzyklus. Dabei wurden Proben aus Ampulle und Isthmus getrennt voneinander untersucht. Die Auswertung der Hybridisierungsergebnisse ergab 196 differenziell exprimierte Gene. Die mit den Ovidukt-Array erhaltenen Daten konnten die beim Östrus-Diöstrus-Vergleich erhaltenen Ergebnisse sehr gut bestätigen, weiter vertiefen und spezifizieren. Zusätzlich wurden Veränderungen der mRNA-Spiegel ausgewählter Gene durch quantitative Real-time RT-PCR genauer quantifiziert und Lokalisationsstudien im Eileiterepithel mittels in situ Hybridisierung durchgeführt. Weiterhin wurde damit begonnen, Veränderungen auf Proteinebene in den Eileiterepithelzellen im Zyklusverlauf für einzelne Kandidatengene zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit ergab grundlegende Erkenntnisse zur Veränderung der mRNA-Zusammensetzung während des Sexualzyklus im bovinen Eileiterepithel aus der Ampulle und dem Isthmus. Damit wurden histologische Veränderungen des Epithels während des Zyklus auf molekularer Ebene charakterisiert. Auf dieser Grundlage können auch spezifische Reaktionen, die von anwesenden Spermien, befruchteten Eizellen oder Embryonen ausgelöst werden, untersucht werden.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Monoklonale Antikörper sind unverzichtbare Hilfsmittel, um Proteinkomplexe aus Zellen zu isolieren oder Proteine in Gewebeschnitten zu lokalisieren. Sie dienen auch dazu, Entwicklungsvorgänge aufzuklären. Dabei wird als Modellorganismus für Vertebraten oft der Zebrafisch gewählt, da er sich asaisonal vermehrt, eine zahlreiche Nachkommenschaft hat und sowohl die Befruchtung als auch die Entwicklung außerhalb des Mutterleibs erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper generiert, die spezifisch mit neuronalen Geweben und Organen des Zebrafisches reagieren. Zur Immunisierung wurde Gehirngewebe des Zebrafisches verwendet. Immunisiert wurden Ratten. Antikörperbildende B-Zellen aus der Ratte wurden mit einer Mausmyelom-Zelllinie fusioniert. Proteine von Interesse wurden mit Hilfe der Antikörper aus Zelllysaten des Zebrafisch-Gehirns immunpräzipitiert und durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die durch Antikörper detektierbaren Banden wurden ausgeschnitten und die enthaltenen Proteine mit massenspektrometrischen Techniken identifiziert. In einem weiteren Ansatz diente eine in λ-Phagen einklonierte Genbank der Expression der Proteine. Die Proteine wurden ebenfalls mit monoklonalen Antikörpern identifiziert. Die Phagen, die diese Proteine produzierten, wurden vermehrt und die für das Protein kodierende DNA sequenziert. Wir haben unsere Anstrengungen vor allem auf Proteine neuronalen Ursprungs konzentriert, weil diese Strukturen in den Fischen besonders deutlich markiert wurden. Histologische Untersuchungen an anderen Spezies ergaben, dass die Antikörper mit neuronalen Strukturen vieler Spezies reagierten, was auf eine hohe Konservierung der Proteine in der Phylogenese schließen lässt. Aus drei Fusionen mit Milzzellen von immunisierten Ratten wurden 2400 Zellüberstände erzeugt, die auf ihre Immunglobulin-Subklasse getestet wurden. IgG-positive Überstände wurden auf histologischen Schnitten untersucht. Schließlich wurden 17 Klone etabliert, die mit Nervengewebe des Zebrafisches reagierten, und weitere 9 Klone, die sowohl mit neuronalen Zellen des Zebrafisches als auch mit neuronalem Gewebe anderer Spezies reagierten. Die von den einzelnen Antikörpern erkannten Proteine wurden entweder massenspektrometrisch oder mittels einer Expressionsgenbank, die aus drei Tage alten Zebrafischlarven hergestellt wurde, identifiziert. Es wurden Antikörper gegen folgende Proteine gefunden: 1. Tenascin R 2. Plasticin 3. TOPAP 4. VAT-1 Es wurden 16 monoklonale Antikörper, die gegen fünf verschiedene humane Antigene hergestellt worden waren, auf Kreuzreaktivität mit Zebrafischgehirn getestet. Die Antikörper reagierten sowohl mit dem Hirn des Zebrafisches als auch mit dem Hirn acht verschiedener Säugerspezies. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Versuch unternommen, gezielt gegen ein Fusionskonstrukt, das Teile des humanen Parkins enthielt, monoklonale Antikörper herzustellen. Aus vier Fusionen wurden nur drei spezifisch mit dem Antigen reagierende Antikörper selektiert, die auch im Western-Blot mit Parkin reagierten. In vivo wurde das Antigen in histologischen Schnitten jedoch nicht erkannt.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluss des potentiellen Tumorsuppressors Pdcd4 auf das invasionsassoziierte Urokinase-Rezeptorgen(uPAR), sowie auf den Invasionsvorgang selbst, untersucht. In verschiedenen gastrointestinalen Karzinomzelllinien wurde eine gegenläufige Expression von uPAR und Pdcd4-mRNA und -Protein nachgewiesen. In Reportergen-Assays unter Verwendung von Wildtyp- und mutiertem uPAR-Promotor zeigte sich nach gleichzeitiger Transfektion von Pdcd4 eine dosisabhängige Suppression der uPARPromotoraktivität. Ferner wurden verschiedene cis-Elemente innerhalb des Promotors als potentielle Mediatoren dieser Regulation identifiziert. Bei diesen handelt es sich potentiell um die Region -402/-350bp mit mutmaßlichen Bindestellen für Sp-1, GATA-1, NF-1 und einem PEA3/ets Element an Position -245 bp. Zusätzlich konnte durch eine Mutation der kombinierten Bindungstelle für Sp-1 und Sp-3 an Position -152/-135bp, die über Pdcd4 ermittelte Suppression der Promotoraktivität aufgehoben werden. In Gelshiftanalysen zeigte sich neben einer verminderten Bindung von Transkriptionsfaktoren der GATA- und Sp-Familie innerhalb der Region -402/-350bp insbesondere eine Erhöhung der Bindung von Sp-3 an Promotorregion - 152/-135bp. Dies impliziert neben den oben genannten Mediatoren, dass Pdcd4 durch Induktion der Bindung von Sp-3 an dieses Element den uPAR-Promotor supprimiert. Darüber hinaus konnte durch die Expression von Pdcd4 die Invasionsfähigkeit der Kolonkarzinomzellinie HCT-116 in vivo reduziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pdcd4 die Promotoraktivität von uPAR über verschiedene cis-aktive Elemente des Promotors supprimiert und belegen erstmals die Regulation eines invasionsassoziierten Gens durch den potentiellen Tumorsuppressor Pdcd4. Ferner wird erstmals Sp-3 als Mediator der Pdcd4 vermittelten Genexpression vorgeschlagen. Daneben postulieren die Invasionsdaten auch eine Funktion von Pdcd4 als potentiellen Suppressor von Teilschritten der Metastasierungskaskade. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit ein neues quantitatives CAM-Modell etabliert werden, das die Invasion und Intravasation von Tumorzellen in vivo spezifisch im Hühnerei-Modell untersucht. Das Protokoll unterscheidet sich von den bisher publizierten Arbeiten durch die Verwendung einer spezifischen TaqMan®-Probe in Zusammenfassung 116 Kombination mit Primern, die spezifisch humane Alu-Sequenzen der YB8-Unterfamilie nachweisen. Durch diese Modifikationen wurde eine höhere Sensitivität der quantitativen Alu-PCR erreicht. Zusätzlich eröffnet die Spezifität der hier entwickelten Primer über den CAM-Assay hinaus die Möglichkeit, humane Zellen und Mikrometastasen auch in murinen in vivo Modellen wie SCID- oder Nacktmäusen nachzuweisen.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Thu, 21 Apr 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3560/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3560/1/Greetfeld_Martin.pdf Greetfeld, Martin
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Genexpression von a(1,3)-Fucosyltransferasen, Präsentation fucosylierter Zelloberflächen-Glykane und Bindung an E-Selektin durch diverse Magenkarzinom-Zelllinien
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/19
In der Pathogenese, Progression und den akuten Ereignissen der Atherosklerose haben die Wachstumsfaktoren VEGF und PDGF und das Chemokin MCP-1 große Bedeutung. Durch Veränderung der Ausbildung dieser Proteine könnte der Lauf der durch Atherosklerose bedingten Erkrankungen positiv beeinflusst werden. Untersuchungen von Medikamenten oder Nahrungsbestandteilen die einen Einfluss auf die Genexpression dieser Proteine haben sind somit von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von diätetisch zugeführten, niedrig dosierten w-3 Fettsäuren auf die Serumspiegel von VEGF, PDGF-AB und MCP-1 und die Expression und Proteinbildung von MCP-1 und PDGF unter dem Einfluss von alleiniger Adhärenzstimulation oder Zugabe von verschiedenen gängigen Stimulanzien in mononukleären Zellen untersucht. In der Atherogenese spielen mononukleäre Zellen eine zentrale Rolle. Da w-3 Fettsäuren einen positiven Effekt in den durch Atherosklerose bedingten Krankheiten haben und vorausgegangene Studien sehr hohe, in der Praxis nicht mögliche Dosierungen gewählt wurden, ist eine Studie zu deren Einfluss, in niedriger, jedoch wirksamer Dosierung, auf die Expression von VEGF, PDGF-AB und MCP-1 von großer Bedeutung. Dafür wurde ein randomisierte, doppelblinde, Placebo kontrollierte Interventionsstudie an 14 männlichen gesunden Freiwilligen durchgeführt. Die Probanden der Verumgruppe erhielten zusätzlich zu ihrer normalen Ernährung für sechs Wochen täglich 3g und dann für weitere sechs Wochen 1,5g w-3 Fettsäuren. Die anfängliche hohe Dosierung wurde gewählt um eine Aufsättigung mit w-3 Fettsäuren zu erreichen. Die Probanden der Placebogruppe erhielten entsprechend Placebokapseln die in ihrem Fettsäurenprofil der westlichen Ernährung angepasst waren. Die Expressionsänderungen der genannten Proteine wurden in den Zellstimulationen auf der Genomebene mittels der etablierten 3n-rT-PCR als auch auf der Proteinebene mittels ELISA gemessen. Aufgrund von o.g. methodischen Problemen waren diese Ergebnisse jedoch angesichts der großen Mühen leider nicht verwertbar. Die Konzentrationen von VEGF, PDGF-AB und MCP-1 im Serum der Probanden wurden mittels ELISA gemessen. Hier zeigten sich deutliche interindividuelle Schwankungen. Die Konzentration von VEGF im Serum der Probanden der Verumgruppe senkte sich nach 3 Monaten durchschnittlich um 54±18% gegenüber den Ausgangswerten. Die Konzentration von VEGF im Serum der Placebogruppe änderte sich im Durchschnitt nicht, jedoch schwankten die Werte. Die Konzentration von PDGF-AB senkte sich im Serum der Verumgruppe nach 3 Monaten durchschnittlich um 57±20%. Die Konzentration von PDGF-AB veränderte sich in der Placebogruppe über den Untersuchungszeitraum nicht relevant. In der Verumgruppe senkte sich die Konzentration von MCP-1 im Serum der Probanden nach 3 Monaten im Durchschnitt um 43±17%. In der Placebogruppe war keine nennenswerte Veränderung vorhanden. Diese Ergebnisse waren statistisch relevant. Bei gesunden Probanden beeinflussen niedrig dosierte w-3 Fettsäuren die Regulation von VEGF, PDGF-AB und MCP-1. Somit wird die antiatherosklerotische Wirkung von w-3 Fettsäuren über die Beeinflussung der Genexpression und Proteinbildung proatherogener Faktoren auch in niedrigen Dosierungen bestätigt. Ein Einfluss von w-3 Fettsäuren auf VEGF wurde hier erstmals beim Menschen beschrieben.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
HIV-1-infizierte Patienten leiden häufig unter krankhaften Veränderungen des Endothels, die zu funktionellen Störungen des Gefäßsystems, koronaren Herzerkrankungen und zu Tumoren führen können. Bemerkenswert ist, dass auch Kinder HIV-1-infizierter Frauen eine signifikant schlechtere Herzfunktion und somit ein erhöhtes Risiko für koronare Herzerkrankungen aufweisen, selbst wenn diese Kinder nicht mit dem Virus infiziert sind. Ziel diese Arbeit war zu untersuchen, ob die Ursache für diese Auffälligkeit eine Störung der Endothelzellen ist. Dazu wurden differenzierte Endothelzellen und zirkulierende endotheliale Vorläufer-Zellen aus der Stammzellfraktion des Nabelschnurblutes von nicht-infizierten Kindern HIV-1-infizierter und nicht-infizierter Mütter untersucht. Dabei konnten keine Unterschiede hinsichtlich der Proliferation, der Fähigkeit zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen in Matrigel und der Expression charakteristischer Endothelzellmarker beobachtet werden. Allerdings zeigte der molekularbiologische Vergleich der Genexpression, dass in Endothelzellen von Kindern HIV-1-infizierter Mütter die Expression von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) unter der Nachweisgrenze liegt oder signifikant reduziert ist. Dies konnte auf RNA- und Proteinebene sowie mittels Gelatine-Zymografie bestätigt werden.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
In dieser Arbeit wurden mit Hilfe einer neuartigen Screening-Methode im Hochdurchsatz-Maßstab Gene identifiziert, welche einen Schutz vor dem bei Morbus Alzheimer assoziierten oxidativen Nervenzelltod vermitteln können. Dazu wurde jeder Klon einer cDNA Kollektion einzeln in klonale hippokampale Mausneuronen der Zelllinie HT-22 transient transfiziert und die Zellen anschließend mit einer toxischen Konzentration Wasserstoffperoxid stimuliert. Nach Inkubation wurde der Anteil lebender Zellen als Grad für den durch das transfizierte Gen vermittelten Schutz bestimmt. Auf diese Weise konnten sechs Gene identifiziert werden, welche HT-22 Zellen signifikant vor toxischen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid schützten. Vier der sechs Gene: Glutathion Peroxidase-1, Peroxiredoxin-1, Peroxiredoxin-5 und Katalase, kodieren direkt antioxidativ wirkende Genprodukte, deren Identifikation die Funktionalität des Screening-Systems bestätigte. Neben Genen, deren Proteintranskripte direkt antioxidativ wirken, konnte des Weiteren der Transkriptionsfaktor Nrf2 und das Enzym Glutamin: Fruktose-6-phosphat Amidotransferase-2 (Gfat-2) detektiert werden. Nrf2 aktiviert die Transkription sog. „antioxidant response element (ARE)“-regulierter Antioxidanzien und detoxifizierender Enzyme, und wirkt somit indirekt schützend. Für Gfat-2 war bisher noch kein direkter Zusammenhang für die Protektion vor oxidativem Stress beschrieben. Mit der Charakterisierung dieses Effektes wurde begonnen. Parallel zu diesem Screening-Ansatz wurden Zelllinien generiert, die gegen oxidativen Zelltod resistent sind. Als Modell dienten Mausneuronen der Zelllinie HT-22. Von dieser Zelllinie wurden Klone isoliert, die resistent gegenüber den oxidativen Substanzen Glutamat und Wasserstoffperoxid sind. Untersucht wurde dabei die Genexpression der resistenten Klone mit der der sensitiven parentalen Zellen. Der Grad der Genexpression wurde dabei mit Hilfe von Affymetrix-Chips untersucht. Getestet wurde inwieweit die Überexpression derjenigen Gene, die in beiden resistenten Zelllinien eine verstärkte Expression aufwiesen, einen Schutz in den sensitiven Zellen gegenüber einem oxidativem Stress vermitteln konnte. Eine Stichprobe von 25 Genen bestätigte dabei keinen Zusammenhang zwischen starker Expression und funktioneller Protektion. Zusätzlich wurde überprüft, ob die verminderte Sensitivität H2O2- und Glutamat resistenter Zelllinien auf einen oxidativen Stress eine verminderte Regulation Apoptose induzierender Gene mit sich bringt. Ein Datenbankabgleich identifizierte neun Gene, die in beiden resistenten Zelllinien vermindert exprimierten und deren Überexpression in HEK 293 Zellen Apoptose induzierte. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass der in dieser Arbeit beschriebene funktionelle Screening-Ansatz im Vergleich zu genomweiten Expressionsanalysen deutliche Vorteile bei der Identifizierung von Gen-Funktionen besitzt, ohne dabei Einschränkungen in der untersuchten Probenzahl hinnehmen zu müssen. Die in beiden Ansätzen identifizierten Gene, könnten als Ansatzpunkte für neuroprotektive Wirkstoffe genutzt werden.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19
Thu, 27 May 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2245/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Das Nierenzellkarzinom ist die häufigste neoplastische Erkrankung der Niere und stellt das siebthäufigste Malignom beim Mann dar, an der in Deutschland jedes Jahr mehr als 11 000 Menschen erkranken. Bei Erstdiagnose sind etwa 13 % der Karzinome bereits metastasiert. Die 1-Jahres-Überlebensrate dieser Patienten beträgt bei rein operativer Behandlung lediglich 15 %. Da das Nierenzellkarzinom keine Strahlensensitivität zeigt und gegenüber gängigen Chemotherapeutika refraktär ist, wird seit langem nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten gesucht. Hierbei wird berücksichtigt, dass das Karzinom zu der relativ kleinen Gruppe immunogener Tumoren gezählt wird, da es möglich ist in vitro eine Immunantwort gegen den Tumor zu induzieren. Zudem zeigen einige Patienten Remissionen von Primärtumoren oder Metastasen nach systemischer Gabe von IL-2, so dass scheinbar auch in vivo eine Immunantwort gegen den Tumor ausgelöst werden kann. Die Tumorgewebe weisen in den meisten Fällen außerdem eine sehr starke Infiltration von Lymphozyten auf, unter denen beispielsweise bereits Tumor-spezifische T-Zellen identifiziert werden konnten. Die Lymphozyten scheinen im Tumorgewebe allerdings inaktiv zu sein, da sie das Wachstum des Tumors in vivo nicht verhindern können. Die Erkennung und Bekämpfung der Ursachen für diese funktionelle Inaktivität der Lymphozyten könnte zu einer Entwicklung neuer immuntherapeutischer Ansätze führen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die NK-Zellen innerhalb der infiltrierenden Lymphozyten tatsächlich in einem funktionell inaktivierten Zustand vorliegen. Sie sind nicht in der Lage Zellen zu lysieren, selbst wenn diese keine MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren und deshalb von allen NK-Zellen erkannt werden sollten. Durch die direkte ex vivo-Isolierung der Lymphozyten konnte allerdings gezeigt werden, dass die infiltrierenden NK-Zellen durchaus eine maßgebliche Effektorpopulation bei der Eliminierung der Tumorzellen darstellen können. Ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen konnte bereits über eine Kurzzeitkultivierung der Zellen mit IL-2 induziert werden. Die infiltrierenden NK-Zellen waren in der Vergangenheit wenig untersucht worden, da viele Eigenschaften dieser Zellpopulation erst in den letzten Jahren charakterisiert wurden und sowohl Techniken als auch Reagenzien für ihre Beschreibung fehlten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine NK-Zell-Subpopulation, die durch die Expression des inhibitorischen Rezeptorkomplexes CD94/NKG2A charakterisiert ist, verglichen mit autologen peripheren Lymphozyten im Tumorgewebe überrepräsentiert ist. Die Charakterisierung weiterer phänotypischer und funktioneller Merkmale der infiltrierenden NK-Zellen ließ vermuten, dass sie sowohl durch das Expressionsmuster der inhibitorischen Rezeptoren, als auch durch die Expression bestimmter Zytokine wie IL-10 sowie durch ihre geringe zytotoxische Aktivität in situ eine Herabregulierung der Immunantwort im Tumorgewebe verursachen. Dass die NK-Zellen jedoch bereits über eine Kurzzeitstimulierung mit IL-2 aktivierbar waren, könnte erklären, warum die Immuntherapie an Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom über IL-2 auch in vivo Wirkung gegen die Tumoren zeigen kann. Die Aktivität der NK-Zellen nach dieser Stimulierung konnte allerdings nur dann festgestellt werden, wenn der Anteil der NK-Zellen innerhalb der TIL hoch lag. Somit konnte ein Zusammenhang zwischen der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen und ihrer Anzahl im Tumor festgestellt werden. Allerdings lag keine Korrelation mit der Größe und Ausbreitung des Primärtumors vor. Dies scheint nicht verwunderlich, da die NK-Zellen im Tumor funktionell inaktiv sind und den primären Tumor somit nicht bekämpfen können. Es wäre allerdings möglich, dass die Anzahl der NK-Zellen nicht nur mit ihrer Aktivierbarkeit im Tumor selbst in Zusammenhang steht, sondern bei diesen Patienten gleichzeitig eine generell bessere Aktivierbarkeit des Immunsystems gegen den Tumor wiederspiegelt. Bei verschiedenen anderen Tumortypen konnte bereits gezeigt werden, dass sowohl die Anzahl als auch die Aktivität der NK-Zellen für die klinische Prognose der Patienten entscheidend sein kann. Somit wäre möglich, dass ein hoher Anteil an NK-Zellen im Tumor einen prognostischen Faktor für das Ansprechen der Patienten auf die systemische Immuntherapie mit IL-2 darstellt und könnte helfen solche Patienten zu selektieren, die somit für diese Therapie mit den zum Teil schwerwiegenden Nebenwirkungen in Frage kommen. Eine Untersuchung dieses Zusammenhangs ist nun retrospektiv auf einfache Weise möglich, da in dieser Arbeit eine Methode dargestellt werden konnte, die es erlaubt die NK-Zellen erstmals über eine einfarbige immunhistochemische Färbung in asservierten Gewebeproben bereits vor längerer Zeit operierter Patienten spezifisch zu identifizieren und die Korrelation mit deren klinischem Krankheitsverlauf zu untersuchen. Bisher ist nicht geklärt, warum verschiedene Tumoren unterschiedliche Anteile infiltrierender NK-Zellen aufweisen. Neben einer verstärkten Einwanderung von NK-Zellen wäre es möglich, dass NK-Zellen in verschiedenen Tumoren unterschiedlich stark proliferieren können. Diese Tumoren weisen dann möglicherweise eine verminderte Fähigkeit auf, das Immunsystem zu unterdrücken und könnten auch aus diesem Grund eine bessere klinische Prognose für die Patienten darstellen. Die Ursachen für die unterschiedliche Aktivierbarkeit der NK-Zellpopulationen konnten bisher ebenso nicht geklärt werden. Hierfür würde sich anbieten, Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen NK-Zellpopulationen zu suchen, was beispielsweise mithilfe der Array-Technolgie bewerkstelligt werden könnte. Ein Zusammenhang zwischen der Anzahl der NK-Zellen im Tumor und der Prognose für die Tumorpatienten könnte bestätigen, dass die Population der NK-Zellen in vivo eine ausschlaggebende Effektorpopulation bei der Bekämpfung der Tumoren darstellen. Weiterhin wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen an infiltrierenden T-Zellen durchgeführt, die vermuten lassen, dass sowohl aktivierte T-Zell-Populationen als auch regulatorische T-Zellen im Tumorgewebe vorhanden sind. Dies konnte durch die Expression verschiedener Oberflächenmarker und Proteine wie beispielsweise Foxp3, das spezifisch von regulatorischen T-Zellen exprimiert wird, gezeigt werden. Die Anwesenheit verschiedener regulatorischer Zellen könnte einen entscheidenden Beitrag zu einer funktionellen Inaktivierung der Lymphozyten im Tumor und der damit verbundenen Toleranz gegenüber Tumorzellen leisten, da bereits gezeigt wurde, dass regulatorische Zellen beispielsweise die Immunantwort gegen Selbst-Antigene, die auch von Tumorzellen exprimiert werden, unterdrücken können. Erkenntnisse über die Eigenschaften infiltrierender Lymphozyten tragen entscheidend zu einem besseren Verständnis der immunologischen Vorgänge im Nierenzellkarzinom bei. Die in dieser Arbeit aufgezeigten Charakteristika der TIL und die Etablierung einer Methode für die spezifische Identifizierung der NK-Zellen im Gewebe könnten in Zukunft eine Grundlage für die Entwicklung neuer Immuntherapien darstellen, die eine gezielte Aktivierung des Immunsystems gegen den Tumor bewirken könnten.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Es wurde ein Assay-System auf Basis von Reporter-Konstrukten entwickelt, dass eine Detektion der HIV1- Tat und Rev-Funktion auf Einzelzell-Ebene ermöglichte. Dieses fluoreszenzbasierte System wurde hinsichtlich seiner Eigenschaften untersucht und charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass es sich dazu eignet sowohl die Tat- als auch die Rev-Funktion konzentrationsabhängig darzustellen. Des Weiteren konnten bereits beschriebene Inhibitoren der Rev-Funktion durch den Assay bestätigt werden, was die Zuverlässigkeit des Testsystems belegt. Außerdem ermöglichte dieses System in durchgeführten Versuchen eine Quantifizierung der RNA-destabilisierenden Aktivität von INS-Elementen des HIV-Genoms. Durch die Herstellung einer stabilen Zelllinie mit einem entwickelten Reporter-Konstrukt und die Etablierung einer Fluoreszenzmikroskopie- und FACS-basierten Auswertung der Daten wurde die Grundlage für eine umfangreiche Suche nach Inhibitoren der HIV-1 Genexpression gelegt. Im Laufe erster „Screenings“ nach zellulären Inhibitoren der HIV-Genregulation wurden in einer cDNA-Bank aus fötalem Hirn mehrere inhibitorisch wirksame Kandidaten-cDNAs identifiziert. Damit konnte gezeigt werden, dass zelluläre Faktoren potentiell dazu in der Lage sind regulierend bzw. inhibierend in die HIV-1 Genexpression einzugreifen.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/07
Gene expression in the tooth development of mice (Mus musculus) The development of teeth and jaw bones are lead by mechanisms that determine cells to become, teeth, bones or cartilages. The ectomesenchymal cells of the lower jaw receives signals from overlying epithelium to differentiate into odontoblasts, osteoblasts and chondrocytes. Cells from the neural crest are influenced by ectodermal signals. An early signal (Fgf8) comes from the oral epithelium and induces the development of the lower jaw. Molar morphogenesis in the maxillary starts from the mesenchyme, influenced by genes like Barx1, Dlx2 and Dlx2. At the same time the absence of genes like Msx1 and genes from the Alx-family is necessary for a normal development (McCollum and Sharpe, 2001). The expression of Msx1 and Alx-genes causes the development of incisors. Mice with null mutation of Dlx1 and Dlx2 fail to develop maxillary molars. Also additional abnormalities appear in the upper jaw. All other teeth are regularly developed (Qiu et al., 1997; Thomas et al., 1997). Dlx5 and Dlx6 are believed to be involved in the development of the lower molar teeth. Ectopic expression of Barx1 in the distal mandibular mesenchym, accompanied by loss of Msx1, results in a transformation of incisors into molars (Tucker et al., 1998). Msx1 mutant mice have defects in the distal jaw skeletal tissue. In conclusion, genes that determine the expression of molar teeth also control the development of the proximal jaw and genes that regulate incisor morphogenesis also regulate distal jaw development (McCollum and Sharpe, 2001). Generation of canine and premolar teeth is caused by overlapping domains of homeobox genes like Msx1, Dlx1 and Dlx2. In mice, the development of teeth in the maxilla seems to be different compared to the mandibula. Activin ßA null mutant mice shows no incisor and molar teeth in the lower jaw. Growth of teeth stops at bud stage in the mandibula while tooth development in the upper jaw in unaffected (Matzuk et al., 1995b). Most of the basic genetic mechanisms during the development of the teeth in the upper and lower jaw are identical. Only some of them lead into a different developmental pattern. This could be due to the different origin of mesenchymal cells (McCollum and Sharpe, 2001). The lower jaw is formed by ectomesenchymal cells originating from the neural crest from the cranial rostral hindbrain and the caudal middlebrain while neural crest cells from the caudal forebrain and middlebrain contribute to the fronto-nasal region (Osumi-Yamashita et al., 1994).
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/07
Knorpeldefekte lassen sich nicht zufriedenstellend therapieren, da bis heute ein kontrollierter regenerativer Gewebeaufbau unmöglich war. Eine neue Strategie wäre eine Kombination von Chondrozytentransplantation mit gentherapeutischen Methoden, z. B. die stabile Ex-vivo-Transduktion von primären Chondrozyten mit retroviralen Vektoren, die gewebeaufbauende Zytokine exprimieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb Etablierung und Optimierung des retoviralen Gentransfers in primäre Kaninchenchondrozyten und die Beobachtung von Verbleib, Vitalität und Genexpression der Zelltransplantate in vivo. Transduzierte Zellen sollten ohne weitere Selektionsverfahren für eine spätere Transplantation verwendet werden können. Da regulierbare Genexpression in einem solchen Modell von Vorteil ist, war ein weiteres Ziel die Entwicklung retroviraler Tet-On-Vektoren. Es wurden konstitutiv exprimierende retrovirale Vektoren und Tet-On-Vektoren kloniert und Retroviren mit unterschiedlichen Infektionsspektren generiert. Effizienz und Stabilität des Gentransfers wurden ohne weitere Selektionsverfahren mit Hilfe konstitutiv nlslacZ-exprimierender retroviraler Vektoren in vitro und in vivo beurteilt. Zusätzlich wurde stellvertretend für ein therapeutisches Gen der Wachstumsfaktor hbmp-2 transferiert. Retrovirale Ein-Vektor-Systeme, die den reversen Transaktivator rtTA2s-M2 und den Tet-responsive Promotor enthielten, wurden in vitro durch die Expression der Reportergene nlslacZ oder egfp in verschiedenen Zelllinien getestet. Mit VSV.G-pseudotypisierten Retroviren konnte eine Transduktionseffizienz von bis zu 99 % erzielt werden, amphotrope Viren waren deutlich weniger effizient. Transduzierte Chondrozyten zeigten in vitro über mindestens 12 Wochen eine stabile Transgenexpression, die auch in 3D-Kultur auf Kollagenschwämmen fortbestand. In vivo war für mindestens drei Wochen Transgenexpression nachweisbar. hbmp-2 transduzierte Zellen exprimierten zudem dieses Transgen in vitro. Die neu entwickelten Tetrazyklin-induzierbaren Retroviren zeigten eine starke Basalexpression bei nur geringer Steigerung nach Induktion mit Doxyzyklin. Die Transduktionseffizienz dieser Retroviren war wesentlich geringer als bei der Verwendung konstitutiv exprimierender Vektoren. VSV.G-pseudotypisierte Retroviren sind eine optimale Methode für den retroviralen Gentransfer in primäre Kaninchenchondrozyten ohne weitere Selektionsverfahren. Neben dem Transfer von Markergenen ist dies die Grundlage für den Transfer von therapeutischen Genen, um deren Effekt in vitro und in vivo zu untersuchen. Zudem wurde ein neuartiger universal einsetzbarer Vektor entwickelt, der die Klonierung in die retroviralen U3 Region und somit die Konstruktion retroviraler Double-copy-Vektoren erlaubt. Die Entwicklung zuverlässiger retroviraler Tet-On-Vektoren bleibt weiterhin eine Herausforderung für die Zukunft.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Bei Patienten, die mit dem humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) infiziert sind, kommt es häufig zu krankhaften Veränderungen des Endothels, die zu einer Fehlfunktion des Gefäßsystems führen. Klinischer Ausdruck dieser als acquired immune deficiency syndrome (AIDS)-assoziierten Vaskulopathie bezeichneten Veränderungen sind Schädigungen des Aortenendothels, die mit einer erhöhten Adhäsion mononukleärer Zellen an das Endothel einhergehen, Defekte der Blut-Hirn-Schranke, die zur Entstehung von Demenz beitragen, sowie das Kaposi-Sarkom (KS), das durch eine sehr starke Extravasation von T-Zellen und Monozyten gekennzeichnet ist. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass das regulatorische HIV-1-Tat-Protein und das inflammatorische Zytokin TNF-a synergistisch die Adhäsion der promonozytären Zelllinie U937 und von PBMZ an humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVEZ) erhöht. Die adhäsionsfördernde Wirkung wurde selektiv bei HIV-1-Tat beobachtet, andere virale Proteine des HIV-1, wie Negativfaktor (Nef) und das Glykoprotein gp41, hatten keinen Einfluss auf die Adhäsion. Anhand zellspezifischer Marker wurde gezeigt, dass HIV-1-Tat in periphere mononukleäre Blutzellen (PBMZ) spezifisch die Adhäsion von Monozyten und T-Zellen erhöhte, jedoch nicht von B-Zellen. Intravital-mikroskopische Untersuchungen an der Maus bestätigten in vivo, dass HIV-1-Tat und TNF-a synergistisch die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel erhöhten. HIV-1-Tat reguliert die Expression einer großen Anzahl zellulärer Gene. Diese Fehlregulation durch HIV-1-Tat könnte an der Enstehung der AIDS-assoziierten Vaskulopathie beteiligt sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die parakrine Wirkung von HIV-1-Tat auf die Genexpression in Monozyten mittels der suppressed subtractive hybridization (SSH)-Methode untersucht. Hierbei wurde O-linked N-Acetylglucosamine-transferase (OGT) als Gen identifiziert, dessen Expression durch HIV-1-Tat unterdrückt wird. Bisher ist bekannt, dass OGT ein Repressor der basalen Transkription und der SP-1-regulierten Transkription ist. Die Expression von OGT wurde sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Protein-Ebene durch HIV-1-Tat und VEGF121 gehemmt, wobei die Regulierung über den VEGF-Rezeptor Flt-1 vermittelt wurde. Weitere Faktoren wie inflammatorische Zytokine (TNF-a, IL-1b, IFN-g und IL-2), angiogene Wachstumsfaktoren (bFGF und VEGF165) und Chemokine (IL-8, MIP-1a, IP-10, MCP-1 und SDF-1a) hatten keine hemmende Wirkung auf die OGT-Expression. Die schnelle Abnahme von intrazellulärem OGT-Protein wurde weder durch lysosomale Proteasen noch durch Proteasen des Proteasoms verursacht. Expressionsstudien an PBMZ von fünf verschiedenen Probanden zeigten, dass bei zwei Probanden die OGT-Konzentration durch HIV-1-Tat zunahm, bei zweien nahm sie ab und bei einer Person gab es keine Veränderung. Diese Ergebnisse belegen, dass HIV-1-Tat entscheidend an der Entstehung der AIDS-assoziierten Vaskulopathie, insbesondere von KS, beteiligt sein könnte. Die Repression von OGT durch HIV-1-Tat könnte die weitreichende Wirkung des HIV-1-Tat-Proteins auf zelluläre und virale Gene erklären.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19
Mon, 28 Jul 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1194/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1194/1/Besch_Robert.pdf Besch, Robert ddc:610, ddc:600, Medizinische Fakultä
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Aufgrund der Zunahme an Organ- und Knochenmarkstransplantationen und der damit verbundenen Immunsuppression bzw. immunsuppressiven Therapie sowie der zunehmenden Zahl an AIDS-Patienten ist das Zytomegalovirus (CMV) als Pathogen in den letzten zwanzig Jahren trotz der Einführung wirksamer antiviraler Medikamente bis heute von großer klinischer Bedeutung. Während bei immunkompetenten Personen eine primäre CMV-Infektion durch das Immunsystem kontrolliert werden kann, führt eine Primärinfektion oder eine Reaktivierung einer latenten CMV-Infektion in immunsupprimierten Patienten zu lebensbedrohlichen Komplikationen. Die Pathogenese einer CMV-Infektion wird entscheidend von der Qualität der antiviralen Immunantwort des Wirtes beeinflusst und Kenntnisse über die Interaktion von CMV mit dem Immunsystem sind für die Prophylaxe und Behandlung einer CMV-Infektion von großer Bedeutung. Dendritische Zellen (DCs) sind die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems und spielen bei der Initiierung einer antiviralen Immunantwort eine zentrale Rolle. Die Stimulation von naiven T-Zellen durch DCs und die Auslösung einer zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort trägt entscheidend zur Eliminierung von viral-infizierten Zellen bei. Die Interaktion des Zytomegalovirus mit dendritischen Zellen gibt dem Virus eine Möglichkeit, seine Eliminierung durch das Immunsystem des Wirtes entscheidend zu beeinflussen. Zur Identifikation von Zielzellen für latente und lytische Infektionen durch MCMV und zur Untersuchung der Auswirkungen einer MCMV-Infektion auf den Phänotyp und die Funktion der Zellen wurde die murine hämatopoetische Stammzelllinie FDCP-Mix als Modellsystem verwendet. Definierte Differenzierungsstadien der Zellen entlang der dendritischen Reihe wurden hierzu mit einer GFP-exprimierenden MCMV-Mutante infiziert. Während undifferenzierte FDCP-Mix-Zellen und von FDCP-Mix-Zellen abgeleitete reife DCs nicht produktiv infizierbar waren, setzten unreife DCs infektiöse Virusnachkommen frei. In reifen DCs wurden nur virale Proteine der sehr frühen und frühen Phase der viralen Genexpression synthetisiert, während späte Genprodukte nicht nachgewiesen werden konnten. Die Infektion unreifer und reifer DCs resultierte anfänglich in deren Aktivierung, erkennbar an der vorübergehend verstärkten Expression der Oberflächenmoleküle CD80, CD86, CD40, MHC-Klasse-I und Klasse-II. Die verstärkte Expression der MHC- und ko-stimulatorischen Moleküle auf reifen DCs einige Stunden nach Infektion spiegelte sich in einer gesteigerten Stimulation naiver autologer T-Zellen durch infizierte DCs wider. In der späten Phase der Infektion war die Aktivierung von autologen T-Zellen beeinträchtigt. Dies korrelierte mit der reduzierten Oberflächenexpression der MHC- und ko-stimulatorischen Moleküle auf infizierten reifen DCs. Allogene T-Zellen konnten durch MCMV-infizierte DCs weder in der frühen noch in der späten Phase der Infektion stimuliert werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass DCs im Laufe einer MCMV-Infektion mehrere Rollen spielen: (1) unreife DCs produzieren MCMV-Nachkommen und können so zur Verbreitung des Virus im Wirt beitragen; (2) in einem frühen Stadium der Infektion aktivieren DCs naive T-Zellen und initiieren damit eine antivirale Immunantwort, die einer Ausbreitung der viralen Infektion entgegenwirkt. (3) Zu einem späteren Zeitpunkt der Infektion ist die Stimulation der T-Zell-Proliferation durch MCMV-infizierte DCs beeinträchtigt. Dies ist einer der Mechanismen, welche die Persistenz des Virus in seinem Wirt ermöglichen. Unabhängig vom Zeitpunkt der Infektion ist bei der allogenen Transplantation die Induktion der T-Zell-Antwort immer beeinträchtigt. Die Unfähigkeit der CMV-infizierten DCs, naive allogene T-Zellen zu stimulieren, trägt so zu einer reduzierten antiviralen Kontrolle bei, was CMV-verbundene Krankheiten nach allogenen Knochenmarkstransplantationen begünstigt und gravierende gesundheitliche Probleme zur Folge hat.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands. Vorraussetzung für eine erfolgreiche Infektion sind Fusion zweier kompatibler, haploider Zellen und die folgende Ausbildung eines dikaryotischen Filaments. Diese Prozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der a-Locus kodiert für ein biallelisches Pheromon/Pheromonrezeptor-System, das die Zell/Zell-Erkennung und die Zellfusion reguliert. Die folgende pathogene Entwicklung wird durch den multiallelischen b-Locus kontrolliert, der für zwei Homeodomänenproteine kodiert, bW und bE. Nach der Fusion der haploiden Sporidien können sich bE/bW-Heterodimere ausschließlich aus bW und bE-Proteinen unterschiedlicher Allele bilden. Diese regulieren das filamentöse Wachstum, die Penetration der Pflanzenoberfläche, das Wachstum in der Pflanze und die Tumorinduktion. Das Ziel dieser Arbeit war es, regulatorische Gene aus U.maydis zu identifizieren, die an der Kontrolle der b-abhängigen, pathogenen Entwicklung beteiligt sind. Es wurde versucht, in einem direkten Selektionsprozess haploide, pathogene Stämme zu isolieren, die aus einer REMI-Mutagenese hervorgingen. Um eine möglichst breite Mutagenese zu erreichen, wurde eine neuartige Mutagenesestrategie angewandt, die neben Geninaktivierung ("loss of function") auch eine mögliche Aktivierung der Genexpression der betroffenen Loci ("gain of function") berücksichtigte. In einer weiteren UV-Mutagenese wurden durch Nutzung von egl1 als Reportergen Stämme isoliert, die EG-Aktivität zeigten. Die Expression des b-abhängigen, aber vermutlich nicht direkt durch das bE/bW-Heterodimer regulierten Gens egl1 sollte dabei eine Mutation in einem regulatorischen Gen anzeigen, das wiederum unter der Kontrolle von b stehen könnte. Es wurde angenommen, dass die interessantesten Stämme neben egl1 weitere b-abhängige Gene exprimieren. Eine komplexe Deregulation der Genexpression b-abhängiger Gene in haploiden Zellen sollte die Zentralität des betroffenen Regulators innerhalb der b-Regulationskaskade anzeigen. Die Komplementation des Stammes MR9-1 führte zur Isolierung eines regulatorischen Gens. hda1 kodiert für ein Protein mit signifikanter Homologie zu Histondeacetylasen und ist an der Kontrolle der differentiellen Genexpression in haploiden und dikaryotischen Zellen, und später an der Sporenentwicklung im Tumor entscheidend beteiligt. Hda1 wirkt in haploiden Zellen nicht als genereller Regulator der Genexpression, sondern bestimmt ein spezifisches Set von hda1-abhängigen Genen, das sich vornehmlich aus b-abhängigen Genen und den b-Genen selbst zusammensetzt. Haploide ∆hda1-Stämme vollziehen nicht die pathogene Entwicklung; nur dikaryotische ∆hda1-Zellen führen zur Tumorentwicklung, leiten jedoch nicht die Bildung von Sporen im Tumorgewebe ein. Funktionelle und biochemische Analysen zeigen in haploiden Zellen einen hochmolekularen Hda1-Komplex, der vermutlich den Aufbau einer höher geordneten Chromatinstruktur an regulatorischen Sequenzen bestimmt. Vermutlich kann Hda1 über einen Deacetylierungsmechanismus regulatorischer Sequenzen zur Repression b-abhängiger Gene führen.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Die kotranslationelle Dekodierung des Kodons UGA als Selenocystein erfolgt durch eine spezifische tRNA (tRNASec), die von Seryl-tRNA Synthetase mit Serin beladen und anschließend von Selenocystein Synthase (SelA) zu Selenocysteyl- tRNASec umgesetzt wird. Selenophosphat, das als Selendonor für diese Reaktion dient, wird von Selenophosphat Synthetase (SelD) aus Selenid und ATP generiert. Der anschließende Transfer der beladenen tRNA zum Ribosom erfolgt durch den spezialisierten Elongationsfaktor SelB, dessen N-terminale Region Homologie zu EF-Tu zeigt und wie dieses Guanosin-Nukleotide und tRNA bindet. Der C-terminale Teil interagiert zusätzlich mit einer als SECIS-Element bezeichneten mRNA- Sekundärstruktur, die in Bakterien unmittelbar auf das für Selenocystein kodierende UGA-Triplett folgt und für dessen Rekodierung als Sinnkodon verantwortlich ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Mechanismen, die der Interaktion von SelB mit seinen Liganden sowie der Regulation der Selenocystein- Biosynthese durch SelB zu Grunde liegen. Im Einzelnen wurden dabei folgende Resultate erhalten: 1) Die strikte Diskriminierung zwischen Seryl- und Selenocysteyl-tRNASec durch SelB ist essentiell für das Funktionieren des Selenocystein inkorporierenden Systems. Eine gerichtete Mutatagenese der Aminoacyl-Bindetasche von SelB zeigte, dass die Selektivität der tRNA-Bindung vermutlich nicht auf einer spezifischen Erkennung des Aminoacyl-Rests beruht. Nach Zufallsmutagenese konnten vier SelB-Varianten isoliert werden, die in vivo eine erhöhte Aktivität mit Seryl-tRNASec besitzen. Zwei der Mutationen waren in der G-Domäne von SelB lokalisiert, die anderen beiden in Domäne 4a. Die biochemische Charakterisierung der mutierten Proteine ergab noch keinen Hinweis auf eine erhöhte Affinität der SelB-Varianten für Seryl-tRNASec, so dass andere Mechanismen für die Erweiterung der Aminosäure-Spezifität verantwortlich sein müssen. 2) Die Interaktion von SelB mit seinen Liganden wurde mit Hilfe von biochemischen und biophysikalischen Methoden analysiert. Der Elongationsfaktor zeigt im Gegensatz zu vielen anderen G-Proteinen eine höhere Affinität für GTP (KD = 0,74 µM) als für GDP (KD = 13,4 µM),was zusammen mit der hohen Dissoziationsrate von GDP (kdis = 15 s-1) darauf hinweist, dass der Nukleotidaustausch ohne Katalyse durch einen Austauschfaktor erfolgt. Die Kinetiken der Interaktion mit Guanosin-Nukleotiden werden durch die Gegenwart eines SECIS-Elements nicht beeinflusst. Die Affinität von SelB zu einem fluoresceinmarkierten SECIS-Transkript liegt im nanomolaren Bereich (KD = 1,23 nM), wobei die Assoziations- und Dissoziationskinetiken sehr schnell sind und durch die Gegenwart von Guanosin-Nukleotiden nicht verändert werden. In Gegenwart von Selenocysteyl-tRNASec wurde jedoch eine signifikante Verringerung der Dissoziationsgeschwindigkeit beobachtet, die zu einer Stabilisierung der Bindung führt und eine Interaktion zwischen der SECIS- und tRNA-Bindetasche nahelegt. Diese intramolekulare Wechselwirkung wurde durch Charakterisierung der isolierten mRNA-Bindedomäne von SelB bestätigt. Die Gleichgewichtslage der einzelnen Reaktionen führt zu einer gerichteten Bildung eines Komplexes aus SelB, GTP, Selenocysteyl-tRNASec und dem SECIS-Element, der durch seine hohe Stabilität auf der mRNA fixiert wird und gleichzeitig eine Konformation annimmt, die seine Interaktion mit dem Ribosom zulässt. 3) In der 5´-untranslatierten Region der selAB-mRNA wurde eine Sekundärstruktur identifiziert, die Ähnlichkeit mit dem SECIS-Element aufweist und mit der SelB spezifisch und mit hoher Affinität interagiert. Die Stabilität des Komplexes zwischen SelB und dem SECIS-ähnlichen Element erhöht sich in Gegenwart von Selenocysteyl-tRNASec. Eine Analyse der sel-Genexpression ergab, dass die Synthese von SelA und in geringerem Ausmaß SelB in genetischen Hintergründen, die eine Assemblierung des quaternären Komplexes aus SelB, GTP, Selenocysteyl- tRNASec und dem SECIS-ähnlichen Element erlauben, reprimiert ist. Mutationen in sel- Genen führen dagegen zu einer erhöhten intrazellulären Konzentration dieser Proteine. Mit Hilfe von Reportergen-Fusionen wurde gezeigt, dass die Repression der selA-Expression direkt von der Bildung eines quaternären Komplexes am SECIS-ähnlichen Element abhängig ist. Da diese keinen Einfluss auf die Transkription hat und nur zu einer schwachen Verringerung der mRNA-Menge führt, wurde gefolgert, dass das SECIS-ähnliche Element eine Regulation der Translationsinitiation am selA-Gen in Abhängigkeit vom Selenstatus der Zelle ermöglicht.
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Diese Arbeit befasst sich mit der Embryonalentwicklung des Vorderhirns bei der Maus. Es werden die zellulären und molekularen Mechanismen untersucht, die eine distinkte Entwicklung von zwei benachbarten Regionen im Telencephalon, dem zerebralen Cortex und dem Striatum, ermöglichen. Es wird gezeigt, dass Zellen, die im Cortex entstehen, innerhalb des Cortex wandern, aber nicht über die Grenze in den Striatum hinein wandern können. Auf der anderen Seite können Zellen aus dem Striatum in den Cortex hinein wandern. Die Untersuchung dieser Zellwanderung in Mausmutanten zeigt, dass die Transkriptionsfaktoren Ngn2 und Pax6, die nur von den corticalen und Grenz-Zellen exprimiert werden, notwendig sind für die Restriktion der Zellen innerhalb des Cortex. Pax6 muss auch anwesend sein, um auch die Wanderung der striatalen Zellen gering zu halten. Weiterhin wird gezeigt, dass die interzelluläre Kommunikation via Gap-Junctions an der Grenzregion zwischen Cortex und Striatum unterbrochen wird. Somit weist die cortico-striatale Grenze die gleichen Merkmale wie andere Grenzen in der Embryonalentwicklung von Vertebraten oder auch von Insekten: Eine distinkte Genexpression, die Restriktion der Zellwanderung, und die Unterbrechung der interzellulären Kommunikation.
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Die vorliegende Promotionsarbeit beschäftigt sich vorwiegend mit der Untersuchung von Patienten mit partieller Monosomie 10p. Der Phänotyp dieser Patienten ähnelt häufig dem des DiGeorge-Syndroms. Neben fazialen Dysmorphien und weiteren Nebensymptomen ist die Symptomentrias Herzfehler, T-Zelldefekt und Hypoparathyreoidismus das typische Merkmal dieses Entwicklungsdefektes. Viele Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p zeigen diese Symptome, was für einen DiGeorge-Syndrom-Locus auf Chromosom 10p spricht. Der Hauptlocus für das DiGeorge-Syndrom liegt jedoch auf Chromosom 22q11. Mehr als 90 % der DiGeorge-Syndrom-Patienten haben eine Mikrodeletion 22q11. Diese Mikrodeletion zählt mit einer Frequenz von etwa 1/4000 zu den häufigsten Deletionen beim Menschen überhaupt und ist deshalb schon seit langem das Ziel intensiver Forschungstätigkeit. Dennoch ist es erst in der jüngsten Zeit gelungen, zumindest ein Gen aus der Mikrodeletionsregion 22q11 (TBX-1) zu isolieren, welches für den beobachteten Herzfehler verantwortlich sein könnte. Ansonsten sind die molekularen Ursachen dieses Entwicklunsdefektes noch immer weitgehend unbekannt. Die Deletionen auf Chromosom 10p sind sehr selten. Sie sind aber von wissenschaftlichem Interesse, da die molekulare Aufklärung dieser Region zu einem tieferen Verständnis der Pathogenese des DiGeorge-Syndroms und isolierter Fehlbildungen insgesamt beitragen kann. Im ersten Teil der Arbeit wurden 16 Patienten mit partieller Monosomie 10p zytogenetisch und molekulargenetisch untersucht. Elf dieser Patienten zeigten einen DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp, fünf Patienten wurden nicht in das DiGeorge-Syndrom-Krankheitsbild eingeordnet. Die Patienten besaßen terminale und interstitielle Deletionen im Größenbereich von 13-48 cM. Mit Hilfe von FISH mit genomischen YAC-, PAC- und BAC-Sonden wurden die Bruchpunktregionen in den Patienten bestimmt. Bei einigen Patienten, bei denen DNA der Eltern vorlag, konnte auch eine Genotypisierung mit polymorphen Markern aus der Region vorgenommen werden. Mittels zweier Patienten konnte eine Haploinsuffizienzregion (DGCR2) kartiert werden, die für den Herzfehler und den T-Zelldefekt verantwortlich sein sollte. Die Region DGCR2 ist um den Marker D10S585 lokalisiert und besitzt eine minimale Ausdehnung von etwa 300 kb. Eine genaue Genotyp-Phänotyp-Analyse unter Einbeziehung von Patienten aus der Literatur zeigte jedoch, daß der gesamte Phänotyp der partiellen Monosomie 10p nicht mit der Haploinsuffizienz nur einer Region erklärt werden konnte, sondern daß zumindest noch ein zweiter Locus (HDR1) deletiert sein mußte. Dieser Locus war mit dem typischen DiGeorge-Syndrom-Symptom des Hypoparathyreoidismus assoziiert. Zusätzlich kartierten in diesen Locus noch eine sensorineurale Taubheit und Nierendefekte. Patienten mit diesen drei Symptomen leiden an einem HDR-Syndrom. Dieser zweite Haploinsuffizienzlocus HDR1 kartiert etwa 3 Mb distal zur Region DGCR2. Im zweiten Teil der Arbeit wurde sowohl über die Region DGCR2 als auch über die HDR1-Region ein PAC/BAC-Contig etabliert. Ausgewählte Klone aus den Contigs wurden im Rahmen des Humangenomprojekts vom Sanger Centre sequenziert. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der molekulargenetischen Untersuchung der beiden Haploinsuffizienzregionen DGCR2 und HDR1. Es konnten 12 EST-Klone in die Region DGCR2 kartiert werden. Bei allen Klonen handelte es sich um Transkripte, die nicht zu funktionellen Proteinen translatiert wurden. Nachdem die genomische Sequenz zugänglich war, konnte eine In-silico-Analyse dieser Region durchgeführt werden. Es handelt sich um eine sehr genarme Region. In die minimale Region DGCR2 kartiert nur das Gen NAPOR, das für ein RNA bindendes Protein kodiert. Es wurde als Kandidatengen für den mit dieser Region assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt näher charakterisiert. Eine Northern-Blot-Hybridisierung zeigte eine Expression in allen aufgetragenen Herzgeweben. Es wurden mindestens sechs verschiedene Transkripte identifiziert, was für die Existenz mehrerer Isoformen des Gens spricht. RNA-in-situ-Hybridisierungen auf Schnitte humaner Embryos und Foeten ergaben eine Genexpression in verschiedenen Geweben beginnend von Embryos des Carnegie-Stadiums C12 bis zu 18 Wochen alten Foeten. Es wurde eine Expression im Thymus vom Carnegie-Stadium C16 an und eine Expression im Herzen bei einem Foetus der 9. Woche beobachtet. Das Expressionsmuster machte NAPOR zu einem guten Kandidatengen für den mit der Haploinsuffizienzregion DGCR2 assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt. Mutationsanalysen in mehr als 100 Patienten ergaben keine Mutationen im NAPOR-Gen. Die meisten untersuchten Patienten besaßen einen DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp waren aber zytogenetisch normal. Besonderer Wert wurde auf die Anwesenheit eines Herzfehlers gelegt. Nur bei etwa 10 % der untersuchten Patienten lag auch eine Thymus-Hypoplasie vor. Ein direkter Beweis für die Beteiligung des NAPOR-Gens am Herzfehler und/oder T-Zelldefekt bei Patienten mit partieller Monosomie 10p steht noch aus. Die HDR1-Region konnte mit Hilfe zweier Mikrodeletionspatienten auf etwa 200 kb eingegrenzt werden. In diese Region kartiert das Gen GATA-3. Mutationsanalysen in zytogenetisch normalen HDR-Patienten zeigten in drei Patienten Mutationen, die zu einem funktionslosen GATA-3-Protein führen. Damit wurde der Beweis erbracht, daß das HDR-Syndrom eine Einzelgenerkrankung ist und daß die Symptome Hypoparathyreoidismus,sensorineurale Taubheit und Nierendefekte bei Patienten mit partieller Monosomie 10p auf eine Haploinsuffizienz des GATA-3-Gens zurückzuführen sind. Zusätzlich zu Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p wurden auch zwei Patienten näher charakterisiert, die eine interstitielle Deletion auf dem Chromosom 14q11-q13 aufwiesen. Diese Region war von Interesse, da das Gen PAX-9 dorthin kartiert und homozygote Pax9 -/- Knockout-Mäuse unter anderem eine Thymus-Hypoplasie und einen Hypoparathyreoidismus zeigen. Die Mäuse haben zwei der drei Leitsymptome des DiGeorge-Syndroms und stellen eine Beziehung zum Phänotyp der partiellen Monosomie 10p her. Die Deletionsbruchpunktregionen der beiden Patienten wurden über eine Genotypisierung mit polymorphen Markern identifiziert. Mit Hilfe eines Dosis-Blots und einer FISH-Analyse konnte gezeigt werden, daß beide Patienten für PAX-9 hemizygot waren. Beide Patienten zeigen keine Symptome des DiGeorge-Syndroms, was daraufhin weist, daß beim Menschen eine PAX-9-Haploinsuffizienz nicht zu einem DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp führt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen an Patienten mit partieller Monosomie 10p und an Patienten mit einer interstitiellen Deletion 14q11-q13 lieferten einen Beitrag zur molekulargenetischen Charakterisierung des DiGeorge-Syndroms. Der DiGeorge-Syndrom ähnliche Phänotyp bei vielen Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p ist das Resultat eines Contiguous Gene Syndroms, bei dem mindestens zwei unabhängige Regionen (DGCR2 und HDR1) auf Chromosom 10p hemizygot vorliegen müssen. Es wurde gezeigt, daß eine GATA-3-Haploinsuffizienz u.a. zu einem Hypoparathyreoidismus führt, einem der drei Leitsymptome des DiGeorge-Syndroms. Für den mit dem Syndrom assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt wurde mit NAPOR ein gutes Kandidatengen aus der Haploinsuffizienzregion DGCR2 identifiziert und charakterisiert. Eine Haploinsuffizienz des PAX-9-Gens auf Chromosom 14q12 führt zu keinem DiGeorge-Syndrom beim Menschen.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Im Unterschied zu den HLA-Klasse-Ia-Molekülen ist das nicht-polymorphe Klasse-Ib-Molekül HLA-G v.a. in der Plazenta exprimiert. Es wird postuliert, daß HLA-G die Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegen den „semiallogenen“ Fetus mitreguliert. In allen anderen Zellen und Geweben, in denen es gefunden wurde, ist die Menge im Vergleich zu klassischen Klasse-I-Molekülen um Größenordnungen geringer. Auch in der Genexpression unterscheidet sich HLA-G drastisch von allen übrigen Klasse-I-Molekülen. Am auffallendsten ist dabei das Auftreten verschiedener alternativer Spleißformen. Neben dem Volle-Länge-Transkript G1m gibt es eine Reihe verkürzter Isoformen: G2 (G2m, Da2-Domäne), G3 (Da2/Da3-Domäne), G4 (Da3-Domäne) sowie zwei Formen, die für lösliche Proteine kodieren, da die nicht-entfernte Intron-4-Sequenz zu einem vorzeitigen Translationsstop führt, G5 (G1s), G6 (G2s, Da2-Domäne, + In4). Die schwache Expression von HLA-G bestätigte sich auch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Haut- und Muskelbiopsien sowie Gehirnproben. Transkripte für HLA-G und die verkürzten Isoformen waren in fast allen Proben nachweisbar, wobei das Volle-Länge-Transkript die dominante Form war. Bei den nach Krankheitsgruppen eingeteilten Hautbiopsien und den Muskelbiopsien mit definierten Diagnosen konnte keine Korrelation eines bestimmten Expressionsmusters mit einer bestimmten Krankheitsgruppe bzw. Diagnose festgestellt werden. Diese Heterogenität des Expressionsmusters sowie die selektive Hochregulation der Volle-Länge-Isoform G1m auf Transkriptions- und Proteinebene in Glioblastomzellinien und Myoblasten, die nur eine äußerst schwache konstitutive Expression von HLA-G aufweisen, nach Behandlung mit IFNg deutet auf eine differentielle Regulation hin. Um die einzelnen Isoformen getrennt voneinander untersuchen zu können, wurden Transfektanten für jede Form in der Klasse-I-negativen B-Zellinie 721.221 etabliert. Nur die Volle-Länge-Isoform G1m sowie deren lösliche Variante G1s konnten auf der Zelloberfläche bzw. im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Von den übrigen Isoformen konnten nur EndoH-sensitive Polypeptide gefunden werden, und auch Immunofluoreszenzfärbung mit einer Reihe von Klasse-I-Ak zeigte keine Zelloberflächenexpression. Es muß daraus geschlossen werden, daß die verkürzten Isoformen in der Zelle zurückgehalten werden. HLA-G kann auf zwei Wegen die Aktivität von Immuneffektorzellen regulieren: direkt über ILT2 und indirekt über HLA-E. Das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-E wird durch Bindung eines Nonamers (P3-11) aus dem Signalpeptid verschiedener Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen stabilisiert. Aus der Interaktion dieses funktionellen HLA-E/Peptid-Komplexes mit dem inhibitorischen Rezeptorkomplex CD94/NKG2A auf NK-Zellen resultiert ein Schutz dieser Zellen vor der NK-Lyse. Auch das entsprechende Peptid aus der Signalsequenz von HLA-G ist ein Ligand für HLA-E. Allerdings wurde gezeigt, daß die Stabilisierung von HLA-E auf der Zelloberfläche durch das Peptid G311 schwächer als mit anderen Klasse-I-Peptiden und auch weniger stabil ist. Effektive Inhibition der Lyse der NK-Zellinie NKL über diese Interaktion von HLA-E mit CD94/NKG2A findet man nur bei HLA-G1m-Transfektanten. Diese werden auch durch die direkte Interaktion von HLA-G1m mit einem weiteren inhibitorischen Rezeptor auf NKL - ILT2 - geschützt. In den 721.221-Transfektanten der verkürzten HLA-G-Isoformen war eine unphysiologisch hohe Konzentrationen an HLA-G-Polypetid notwendig, um die kritische Menge an HLA-E-Ligand für den Schutz dieser Zellen vor der Lyse durch NK-Zellen liefern zu können. Das war nur für eine äußerst stark exprimierende G3-Transfektante der Fall. Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in einer ineffizienteren Prozessierung des Signalpeptids von HLA-G und einer im Vergleich mit anderen HLA-E-Liganden geringeren Bindungsaffinität des Peptids G3-11 für HLA-E. Eine Funktion der verkürzten HLA-G-Isoformen durch die direkte Interaktion mit Rezeptoren auf NK-Zellen konnte nicht nachgewiesen werden und ist wegen ihrer intrazellulären Expression auch unwahrscheinlich. Vielmehr deuten erste Daten, die zeigen, daß die Isoformen, direkt oder indirekt, mit dem TAP-Komplex assoziiert sind, auf eine mögliche Funktion im Rahmen der Antigenpräsentation hin. Worin diese besteht, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Daher ist anzunehmen, daß HLA-G in vivo hauptsächlich über HLA-G-bindende KIR immunregulatorische Funktionen wahrnimmt und durch indirekte Wirkung über HLA-E-CD94/NKG2A modulierend eingreift.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19
Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa. Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten. Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis, Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y. enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y. enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion (durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y. enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-, GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3- Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort: schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y. enterocolitica-Infektion initiiert.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Durch die genetische Fusion mit dem Grün Fluoreszierenden Protein können seit 1994 Proteine oder Genexpression in vivo visualisiert werden, ein bedeutender Fortschritt für die Lebenswissenschaften. Die Nutzungsmöglichkeiten können z. B. mit der gleichzeitigen Verwendung von fluoreszenzspektroskopisch unterscheidbaren GFP-Varianten (multispektrale Detektion) erweitert werden. Eine Veränderung der spektralen Eigenschaften des Proteins unter Beibehaltung seiner Funktionalität in vivo kann nur durch Mutagenese erfolgen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, einen Beitrag zur grundlegenden Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen dem Chromophor und der umgebenden Proteinmatrix zu leisten. Durch die Substitution von T203 in wt-GFP kann gezeigt werden, dass die B-Spezies gegenüber der A- und der I-Spezies durch eine Wasserstoff-Brücke von T203 zum Chromophor gekennzeichnet ist. Diese bewirkt gegenüber der I-Spezies ein Blauverschiebung der Absorption um ca. 23 nm. Die I-Spezies kann durch Doppelmutationen stabilisiert werden und stellt unter den GFP-Varianten einen neuen spektralen Phänotyp dar. Die Tendenz zur Dimerisierung ermöglicht die absorptionsspektroskopische Darstellung einer Population der I-Spezies in wt-GFP. Gleichzeitig wird das Dimerisierungsmodell experimentell bestätigt und mit einer relativ schwachen Dimerisierungskonstante von ca. 3 mM-1 ergänzt. Die spektroskopischen Eigenschaften wichtiger GFP-Varianten lassen sich nun mit einem molekularen Modell erklären. So wird bewiesen, dass die Absorptionsrotverschiebung um 33 nm durch die Mutation T203Y (YFP-Varianten) nur zu ca. 1/3 auf spezifisch aromatischen Wechselwirkungen beruht. Zusammen mit den EGFP-Varianten eignet sich die T203V-Variante für eine neue Art der multispektralen Detektion auf der Grundlage der sehr gut separierten Anregungsspektren. Die Kenntnisse über die Vorgänge bei der Dimerisierung von wt-GFP bzw. GFPuv lassen sich prinzipiell für die intrazelluläre und lokale in vivo-Messung effektiver Proteinkonzentrationen bzw. von Protein-Protein-Wechselwirkungen nutzen. Durch kombinatorische Mutagenese wurde deutlich, dass der schnelle Protonentransfer (ESPT) nach Anregung der A-Spezies das negativ geladene E222 als Akzeptor benötigt. Ansonsten wird der Prozess deutlich verlangsamt, was mit einer entsprechenden Abnahme der Quantenausbeute für die grüne Emission einhergeht. In der Variante S65G/T203V/E222Q wird zusätzlich der strahlunglose Verlust der Anregungsenergie von A* stark verringert. Dadurch dominiert die blaue A*-Emission das Emissionsspektrum. Dieser neue spektrale GFP-Phänotyp ist für multispektrale Anwendungen geeignet. Von den GFP-homologen Proteinen, die erst seit Ende 1999 entdeckt werden, hat das stark rot emittierende aus Discosoma (DsRed) die langwelligste Emission und ist deshalb für in vivo Applikationen am interessantesten. Es wird bewiesen, dass der Chromophor des Proteins über die langsame kovalente Modifikation des intermediär entstehenden GFP-Chromophors gebildet wird. Mit der Entfaltung des Proteins wird dieser Prozess teilweise revertiert. Aus einer Proteinbibliothek konnten Varianten identifiziert werden, in denen räumlich gruppierte Einzelmutationen diesen finalen Maturierungsschritt in verschiedenem Ausmaß unterdrücken. Die Emission des intermediären GFP-Chromophors kann von dem finalen DsRed-Chromophor absorbiert werden (FRET), was auf eine starke Oligomerisierung hindeutet.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Muc18/MCAM/CD146, ein Zelloberflächenglykoprotein von 113 kD, wurde ursprünglich als Melanom-Antigen identifiziert, dessen Expression mit Tumorprogression und der Fähigkeit zur Metastasierung assoziiert ist. Es ist ein Mitglied der Immunglobulinsuperfamilie und vermittelt homotypische und heterophile Adhäsion. Aus diesem Grund wurde vermutet, dass Muc18, wie auch andere Zelladhäsionsmoleküle, der Beginn einer Signalkette ist. Da der zugehörige Ligand immer noch unbekannt ist, wurden zur Untersuchung dieser Vermutung monoklonale α-Muc18-Antikörper verwendet, um die Bindung des Liganden zu imitieren. Nach Kreuzvernetzung von Muc18 in Muc18-Transfektanden und in natürlich Muc18- exprimierenden Melanomzellen mit verschiedenen α-Muc18-Antikörpern konnte kein Calcium-Einstrom festgestellt werden, aber eine Reihe von neu Tyrosin-phosphorylierten Proteinen wurden mittels Western Blot detektiert. Diese lagen bei etwa 50, 70 – 90, 128 und 146 kD. Zwei dieser neu phosphorylierten Proteine wurden als das Adapterprotein p130Cas (crk-associated substrate) und sein Ligand p105CasL identifiziert. Eine Muc18-assoziierte Phosphorylierung von fak („focal adhesion kinase“) und fyn (eine Proteintyrosinkinase der src-Familie) wurde nicht beobachtet. P130Cas und p105CasL, sowie nck, ein weiteres Adapterprotein, wurden mit Muc18, unabhängig von Muc18-Aktivierung, kopräzipitiert. Fak, fyn und Paxillin konnten nicht kopräzipitiert werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der Muc18-Signalweg ähnlich, aber nicht identisch mit dem β1-Integrin-Signalweg ist. Zusätzlich zu diesen zytosolischen Interaktionspartnern konnten noch weitere, im Zellkern wirksame Signalpartner von Muc18 identifiziert werden. Bei transienter Transfektion von Melanomzellen mit Luziferase-Reporterkonstrukten, die jeweils verschiedene Transkriptionsfaktor- responsive Elemente enthielten, führte Kreuzvernetzung von Muc18 zur Aktivierung von CRE (cAMP responsive element) und der NF-κB-responsiven Elemente aus dem ICAM- 1-Promotor. Damit sind wahrscheinlich auch CRE-bindende Proteine und NF-κB am Muc18- Signalweg beteiligt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Bindung von Muc18 an seinen Liganden nicht nur zur Muc18-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion führt, sondern auch zu Veränderungen in der Genexpression und vielleicht zu verstärkter Expression von anderen Zelladhäsionsmolekülen. Somit konnte in dieser Arbeit die Frage, ob Muc18 ein Signalweg-Initiator ist, bejaht, und die ausgelöste Signalkette punktuell aufgeklärt werden.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Ziel dieser Arbeit war es, Veränderungen innerhalb weniger Stunden nach UV-B-Exposition auf Protein- und Transkriptionsebene bei 10-wöchigen Buchensämlingen Fagus sylvatica L. zu analysieren. Dazu wurden Buchensamen unter standardisierten Bedingungen angezogen und von dem Zeitpunkt der Keimung an unter einem UV-B/PAR-Verhältnis exponiert, das den natürlichen Umweltbedingungen sehr ähnlich ist. Die UV-B-Exposition der 10-wöchigen Buchensämlinge erfolgte in einer UV-B-Pflanzenkammer, die das Lichtspektrum des Sonnenlichts simulierte. Die in einer Zeitkinetik geernteten Primärblätter dienten als Ausgangsmaterial für die Daten in der vorliegenden Arbeit. Die 2D-PAGE der löslichen Gesamtproteine und in vitro translatierten Proteine wurde stets zweifach durchgeführt und jeweils die Gele mit der besten Auflösung als Einzelbestimmung ausgewertet. Die Untersuchungen auf Ebene des löslichen Gesamtproteins der Buche Fagus sylvatica L. erfolgten mittels einer Zeitkinetik über 1 Woche, wobei täglich 1 mal geerntet wurde. Die 2DPAGE Analyse ergab über die gesamte Zeitkinetik betrachtet 1 UV-B-induziertes Protein gegenüber der Starklicht-Kontrolle: Protein 28 (17 kDa; pI 6,8). Die 2D-Analysen auf löslicher Gesamtproteinebene stimmten mit den Daten auf in vitro Translationsebene überein, wobei die Effekte auf Transkriptionsebene wesentlich stärker waren. Insbesondere nach 3 und 6 h UV-B-Exposition konnten auf Transkriptebene eine 60%-ige und 90%-ige Reprimierung gezeigt werden. Diese Reprimierung war transient und auf Proteinebene in geringerem Ausmaß zeitlich verzögert nachzuweisen. Diese Daten gaben Hinweise dafür, daß bei der Buche Fagus sylvatica L. infolge UV-B-Exposition eine Regulation auf Transkriptionsebene stattgefunden hat und die drastische Reprimierung der Transkripte verschiedener Gene nur transient war. Da diese Effekte auf Proteinebene wesentlich schwächer waren, deutete das darauf hin, daß sich die Buchensämlinge innerhalb weniger Stunden an die UV-B-Exposition adaptierten. Auf in vitro Translationsebene gab es bei der Buche Fagus sylvatica L. 18 mRNAs, die unter Berücksichtigung der UV-B- und Starklicht-Tagesgänge direkt dem UV-B-Effekt zugeordnet werden konnten. Es wurde belegt, daß infolge erhöhter UV-B-Exposition 10 Transkripte neu vorhanden waren und die Transkripte von 8 Proteinen nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Diesen charakteristischen Veränderungen unterlagen überwiegend saure und basische Proteine. Die Effekte waren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kinetik zu sehen (7 h, 10 h, 18 h, 28 h und 31 h nach Versuchsbeginn). Die DDRT-PCR wurde eingesetzt, um UV-B-vermittelte Antworten auf Genebene in Buchenblättern zu identifizieren. Bei den isolierten cDNAs wurden geringe Homologien verschiedener Buchenklone in der TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank gefunden: UV-Breprimierte Buchenklone zeigten Ähnlichkeiten zur Peroxidase, zur „DNA directed RNA-Polymerase alpha chain“ und zu einem „ara-3, ras-related GTP-binding protein“. Durch UV-B-Exposition induzierte Buchenklone wiesen Homologien zu dem „ABI-3“, zu dem „phytochrome regulated gene“ und zur Squalen-Synthase auf. Die Sequenzen dieser Buchenklone wurden zum ersten Mal beschrieben. Erstmals wurde ein ribosomaler Klon L37 bei der Buche beschrieben. Die L37 mRNA wurde aufgrund erhöhter UV-B-Exposition transient induziert. Bei erhöhter Ozon-Behandlung erreichte das Transkript dieses Klons zwei zeitlich voneinander getrennte Maxima; das zweite Maximum (am 3. Tag der Behandlung, 1,6-fache Induktion) ging mit sichtbaren Ozon- Schäden an den jungen Seitentrieben der Buche einher. Die Funktion dieses Proteins ist bisher noch unbekannt. Für eine direkte Zuordnung der isolierten Klone zu den Proteinspots auf der 2D-PAGE müßte eine Sequenzierung der Proteinspots erfolgen. Die Menge der Proteinspots für eine Proteinsequenzierung war jedoch nicht ausreichend. Über die TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank wurde erstmalig ein nach UV-BExposition induzierter Buchenklon isoliert, der hohe Homologien zum „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ aufwies. Dieses Transkript wurde bereits nach 3 h UV-BExposition transient induziert. Der durch Ozon-Exposition reprimierende Effekt wurde durch die kombinierte UV-B/Ozon-Exposition aufgehoben. Die UV-B-vermittelte Induktion dieser zwei Buchenklone unterstützten die auf der 2D-PAGE Analyse resultierende Hypothese, daß die Regulation nach UV-B-Exposition vor allem auf Transkriptionsebene stattzufinden scheint. Die Daten der vorliegenden Arbeit ergaben folgende Schlußfolgerungen: Das Differentielle Display wurde eingesetzt, um infolge UV-B-Exposition differentielle cDNAs in Buchenblättern zu klonieren. Mittels der durchgeführten Northern-Blots wurde gezeigt, daß die Veränderungen auf Transkriptebene durch erhöhte UV-B-Exposition bedingt waren. Die vorliegenden Daten belegten, daß 6 verschiedene Transkripte infolge UV-B-Exposition transient induziert wurden. Diese überwiegenden transienten Veränderungen wurden ebenso durch die Untersuchungen mittels 2D-PAGE auf löslicher Gesamtprotein- und Transkriptebene bestätigt. Das bedeutet, daß innerhalb kurzer Zeit eine Anpassung der Buche an die veränderten Umweltbedingungen erfolgte. Möglicherweise kann dies durch die Anzucht der Buchensämlinge unter UV-B und Schwachlicht begründet werden. Diese Bedingungen sind jedoch umweltrelevant, da die Pflanze in jungen Jahren unter schattigen Lichtbedingungen heranwächst. In der vorliegenden Arbeit wurden infolge abiotischer Streßbehandlung (erhöhtes UV-B) erstmals 2 eindeutig transient induzierte differentielle Buchenklone isoliert: der ribosomale Klon L37 und der „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ Klon. Die durchgeführten Northern-Blot Analysen zeigten, daß sich diese 2 Klone als Kandidaten für Molekulare Marker zum Nachweis frühzeitiger UV-B-vermittelter Änderungen auf Transkriptebene bei Fagus sylvatica L. eignen.