Podcasts about tumorprogression

Fragestellung: Das Ovarialkarzinom ist die fünfthäufigste Krebserkrankung bei Frauen. Trotz radikaler chirurgischer Interventionen und nachfolgender Chemotherapie beträgt das Fünfjahresüberleben nur 42%. Die anhaltend schlechte Prognose macht die Suche nach Zielmolekülen im Sinne einer „targeted therapy“ zur Erweiterung des Behandlungsspektrums nötig. Diese Arbeit soll neue Erkenntnisse über die Expression acht verschiedener Rezeptoren der Kernrezeptorsuperfamilie (THRα2, THRα1, THRα1/2, THRβ, THRβ1, RXRα, PPARγ und VitDR) im Ovarialkarzinom bringen und Aussagen zu ihrem prognostischen Stellenwert ermöglichen. Patienten und Methoden: Das untersuchte Kollektiv besteht aus Patientinnen, die an unserer Klinik zwischen 1990 und 2002 aufgrund eines Ovarialkarzinoms operiert wurden. Die Gewebeproben wurden nach den gängigen Methoden der Immunhistochemie bearbeitet, die Färbungen mittels IRS-Score bewertet und mit SPSS statistisch ausgewertet. Ergebnisse: Alle von uns untersuchten Rezeptoren werden im Ovarialkarzinom exprimiert und zeigen zusätzlich zu ihrem nukleären Vorkommen eine Koexpression im Zytoplasma. Speziell PPARγ und THRβ1 kommen überwiegend extranukleär vor. Die Analyse der Rezeptorexpression nach histopathologischen Subtypen ergab eine Spezifität von THRβ1 für klarzellige Ovarialtumore. THRα1/2 ist in allen Subtypen außer dem muzinösen exprimiert. Bei Tumorprogression erlischt die Expression mehrerer Rezeptoren: Mit Verschlechterung des Gradings kommt es zum Verlust von THRα2 in serösen Ovarialkarzinomen und tendenziell auch im Gesamtkollektiv. Beim serösen Ovarialkarzinom wirkt sich dies verkürzend auf das Überleben aus. Auch die Expression des THRβ1 in klarzelligen Tumoren und des VitDR in serösen Karzinomen sinkt signifikant mit der Verschlechterung des Gradings. In fortgeschrittenen FIGO-Tumorstadien verlieren die Karzinome außerdem ihre THRβ1 Rezeptoren, sowie seröse Tumoren tendenziell ihre THRα1/2 Rezeptoren. Zusammenfassung 4 THRβ erfährt als einziger Rezeptor eine Expressionszunahme bei Tumorprogression und ist im Stadium III der FIGO-Klassifikation deutlich überexprimiert. Die zytoplasmatische Expression von THRα2, THRβ und VitDR scheint zudem die Mortalität zu erhöhen. Außerdem zeigt sich eine lange Reihe an Rezeptorkorrelationen. Diskussion: Im Zuge der Entdifferenzierung des Gewebes zeigte sich für mehrere Rezeptoren (THRα2, THRα1/2 und THRβ1) ein intranukleärer Expressionsverlust. Die intranukleäre und zytoplasmatische Expression der von uns untersuchten Rezeptoren korreliert dabei umgekehrt proportional miteinander (Ausnahme VitDR). Eine persistierende intranukleäre THRα2-Expression ermöglich zumindest im serösen Ovarialkarzinom ein längeres Überleben, während die zytoplasmatische Expression von THRα2, THRβ und VitDR im Gesamtkollektiv hochsignifikant das Mortalitätsrisiko steigert. Diese Translokation im Rahmen der Tumorprogression könnte evtl. durch einen Enzündungsprozess oder durch eine Schilddrüsenstörung ausgelöst sein. Weitere Untersuchungen mit Vergleich der Rezeptorexpression im gesunden Ovarialgeweben und simultaner Messung von Schilddrüsenhormonen und Entzündungsparametern sind ausstehend. Die intranukleäre Expression von THRβ hingegen nimmt bei Tumorprogression zu. Sein Stellenwert in der Kanzerogenese des Ovarialkarzinoms ist genau wie seine Bedeutung in der Krebsentstehung anderer Tumore noch nicht geklärt. RXRα, PPARγ und THRα1 scheinen im Ovarialkarzinom eine untergeordnete Rolle zu haben.

Das Mammakarzinom ist weltweit mit über 508.000 Sterbefällen die häufigste krebsbedingte Todesursache. Um dennoch eine Heilung erzielen zu können, existiert ein multimodales Therapiekonzept mit kurativer Absicht. Zu diesem Konzept gehört unter anderem auch die gezielte Krebstherapie, bei welchem sich ein Pharmakon spezifisch gegen Tumorantigene richtet. Da viele Tumorantigene jedoch nicht von allen Mammakarzinomen exprimiert werden, ist die Suche nach weiteren potentiellen Zielen für dieses Konzept sinnvoll. In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Expressionsverhalten einiger relevanter Antigene analysiert. Dabei wurden die Antigene Mucin1, sein Epitop, das Thomsen-Friedenreich Antigen und die Tyrosinkinase Her4, beziehungsweise seine aktivierte, phosphorlierte Form phospho-Her4 untersucht. Mucin1, einem beim Mammakarzinom überexprimierten Transmembranprotein wird dabei eine wichtige Rolle in der Tumorprogression zugeschrieben, indem es sich während der Tumorgenese anreichern und somit die Genexpression beeinflussen kann. Das TF-Antigen wird hauptsächlich von Karzinomen und embryofetalem Gewebe gezeigt. Als Oberflächenepitop wird ihm Einfluss auf Adhäsions- und damit Metastasierungsprozesse zugeschrieben. Die Rolle von Her4 in der Tumorprogression dagegen ist trotz Verwandschaft zum bekannten Onkogen Her2/neu nicht ganz geklärt. Sowohl tumorsupressives, wie auch onkogenes Potential sind beschrieben. In der vorliegenden Studie wurden nun die genannten Antigene zu ihrem Verhältnis zur Zelldifferenzierung und zu ihrer Verteilung bezüglich des histologischen Subtyps, sowie der Herdverteilung untersucht. Des Weiteren wurden die Korrelationen der Antigene untereinander analysiert. Dabei wurde Tumorgewebe von 235 operierten Mammakarzinompatientinnen untersucht. Die in Paraffin eingebetteten Gewebeproben wurde dabei per ABC-Methode immunhistochemisch gefärbt, mittels IRS-Score nach Remmele und Stenger bewertet und danach mit dem Kruskal-Wallis Test, dem Mann-WhitneyTest und der Korrelationsanalyse nach Pearson statistisch ausgewertet. Des Weiteren wurde das Überleben der Patientinnen in Abhängigkeit ihres Mucin1-Expressionsmusters mittels Kaplan Meier Analyse und Cox-Regression untersucht. 6. Zusammenfassung - 69 - Bei der optischen Auswertung von Mucin1 fallen zwei verschiedene Färbereaktionen auf, sodass bei der weiteren Analyse eine membranständige von einer zytoplasmatischen Expression differenziert werden konnten. Auch bei Her4/phospho-Her4 ist die Expression vor allem intrazellulär auszumachen, trotz der Tatsache, dass es sich bei Her4 um ein Transmembranprotein handelt. Eine Erklärung hierfür könnten Veränderungen der Zellstruktur bei Tumoren liefern. Verschiedene Autoren konnten diesbezüglich zeigen, dass in Karzinomen sowohl Mucin1 als auch Her4/phopho-Her4 ihre Lokalisation von der Zellmembran ins Zellinnere verlegen können, um sich dadurch über Beeinflussung der Genexpression am Tumorwachstum zu beteiligen. Das Thomsen-Friedenreich Antigen befindet sich dagegen wie bei einem Oberflächenepitop zu erwarten an der Zellmembran. Die statistische Auswertung beschreibt vor allem bei schlecht differenzierten (G3), duktal-klassifizierten Mammakarzinomen hochsignifikante, positive Korrelationen des zytoplasmatischen Mucin1 mit dem TF-Antigen und mit phosho-Her4. Jenes zytoplasmatische Mucin1 zeigt dabei ein schlechteres Überleben als die membranständige Mucin1-Expression. Diese signifikanten Korrelationen und die Erkenntnis, dass zytoplasmatisch-exprimiertes Mucin1 die Genexpression zu beeinflussen vermag, könnten einen Erklärungsansatz für die TF-Expression bei Karzinomen liefern, deren Regulation noch nicht vollständig geklärt ist. Genauer gesagt, eine Interaktion der beiden Akteure untereinander bei schlecht differenzierten, duktalen Karzinomen ist durchaus denkbar. Die Regulation der proteolytischen Verlagerung von Her4/phospho-Her4 ins Zellinnere, welche Her4 erst ein onkogenes Potential verleiht, ist ebenfalls auf weiten Strecken unerforscht. Auch hier könnte durch die beschriebene Korrelation eine Interaktion mit Mucin1 mitverantwortlich gemacht werden. Wenn eine Zusammenarbeit der beschriebenen Antigene auch auf molekularer Ebene nachgewiesen werden könnten, würden diese ein denkbares, potentes Ziel für die beschriebene „targeted therapy“ darstellen. Denn eine antagonisierende Therapie gegen Proteine, die sich gegenseitig beeinflussen lässt eine Verstärkung der Therpiewirkung, im Sinne eines pharmakodynamischen Synergismus erhoffen. Die intrazelluläre Lage der Antigene könnte dagegen ein pharmakokinetisches Hindernis bei einer monokloalen Antikörpertherapie darstellen.

Sat, 21 Jul 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14758/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14758/1/Seel_Nina.pdf Seel, Nina Nicola

Maligne Zellen wachsen in einem komplexen zellulären und extrazellulären Umfeld, welches die Initiierung und Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps bedeutend beeinflusst. Tumore bestehen zum einen aus den Tumorzellen, zum anderen aus dem unterstützenden Stroma, das Fibroblasten, Endothelien, Perizyten, Lymphgefäße, ein mononukleäres Infiltrat und die Extrazellulärmatrix einschließt. Dieses Tumor-Mikromilieu hat einen großen modulierenden Einfluss auf das Tumorwachstum, die Invasivität und das Metastasierungspotential. Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind pluripotente Vorläuferzellen, die an der Aufrechterhaltung und Wiederherstellung der Gewebeintegrität beteiligt sind. Geschädigtes Gewebe führt zur Mobilisation von MSC und deren Rekrutierung an den Ort der Schädigung. Tumore werden vom Organismus als nicht-heilende Wunden angesehen, so dass MSC in das tumorassoziierte Stroma rekrutiert werden. Dort tragen die Zellen zu verschiedenen Aspekten des Tumorwachstums bei, indem sie als Progenitorzellen für die Tumorgefäße und stromale fibroblastenartige Zellen dienen. Im Rahmen dieses Ausdifferenzierungsprozesses werden gewebespezifische Gensets wie das CC-Chemokin CCL5 in den mesenchymalen Stammzellen aktiviert und zur Expression gebracht. Das Pankreasadenokarzinom ist eines der aggressivsten soliden Malignome des Menschen und ist gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Proliferation des Stromas. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zum einen die Rolle mesenchymaler Stammzellen im Stroma des Pankreaskarzinoms zu evaluieren und zum anderen eine gewebespezifische stammzellbasierte und promoterkontrollierte Suizidgentherapie mit dem Stroma als Angriffspunkt zu etablieren. Mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Knochenmark von C57BL/6 p53-/- Mäusen isoliert und sowohl mit den Reportergenen des rot fluoreszierendem Proteins (RFP) und des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) als auch mit dem Suizidgen der Herpes Simplex I Thymidinkinase (HSV-TK) unter Kontrolle des CCL5-Promoters transfiziert. Die HSV-TK führt zu einer Phosphorylierung und Aktivierung der Prodrug Ganciclovir, welches zytotoxisch auf Thymidinkinase-positive (TK+) Zellen und über den sogenannten „Bystandereffect“ auf umgebende Thymidinkinase-negative (TK-) Zellen wirkt. Diese Stammzellen wurden C57BL/6 Mäusen intravenös injiziert, die orthotope und syngene panc02- Pankreastumore trugen. Die i.v. Applikation von nativen MSC führte zu einer Verdopplung der Tumormasse und einer gesteigerten lokalen Aggressivität im Sinne einer Peritonealkarzinose im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei zeigten sich erhöhte Ccl5-Expressionsniveaus im Tumorgewebe von Tieren, die MSC erhalten hatten. In-vitro konnte gezeigt werden, dass MSC bei adäquater Stimulation zur Ccl5 Expression angeregt werden und somit als Quelle des beobachteten Ccl5-Anstiegs in Frage kommen. Die stromale Aktivierung des CCL5-Promoters in den mesenchymalen Stammzellen konnte durch Verwendung von CCL5-Promoter/Reportergen Stammzellen direkt nachgewiesen werden. Dabei zeigten sich spezifisch im Tumorgewebe Fluoreszenzsignale, die sich in der Immunhistochemie morphologisch genauer darstellen ließen. Eine Reportergenexpression war spezifisch im stromalen Kompartiment der panc02- Tumore nachweisbar, andere untersuchte Organe mit Ausnahme der Milz zeigten keine Reportergenexpression. Der Einsatz der therapeutischen CCL5-Promoter/HSV-TK MSC in Kombination mit der intraperitonealen Gabe von Ganciclovir führte zu einer Tumormassenreduktion um 50%. Darüberhinaus konnte die Therapie die Metastasierungsrate in Milz, Leber und Peritoneum signifikant senken. Es wurden keine systemischen Nebenwirkungen beobachtet. Bei der Untersuchung von humanen Pankreaskarzinomen und korrespondierenden Pankreasnormalgeweben aus den gleichen Patienten zeigte sich bei der Mehrheit eine Hochregulation von CCL5-mRNA. Im immunhistochemischen Nachweis konnte die CCL5 Expression auf Proteinebene im Tumorstroma gezeigt werden, entsprechendes Normalgewebe zeigte bis auf vereinzelte Zellen keine CCL5 Produktion. Das Tumorstroma stellt aufgrund seiner vitalen Bedeutung für die Tumorprogression einen vielversprechenden Ansatzpunkt künftiger therapeutischer Interventionen dar. Mesenchymale Stammzellen eigenen sich hierbei im Rahmen einer Suizidgentherapie als zellbasierte Vehikel. Dank der gezielten Migration und des Einsatzes gewebespezifischer Promoter kann dabei eine hohe Selektivität der Genexpression im Tumorgewebe mit Minimierung der systemischen Nebenwirkungen erreicht werden. Der CCL5-Promoter wird im stromalen Kompartiment des murinen pankreatischen Adenokarzinoms aktiviert und eignet sich daher für die selektive und spezifische Expression von therapeutischen Genen wie der HSV-TK. Dieser Ansatz kann eine mögliche Therapieoption des ansonsten therapieresistenten humanenPankreaskarzinoms darstellen.

Das PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) ist ein induzierbares zytoplasmatisches Protein, das einige Motive, die für die Vermittlung von Protein-Protein Interaktionen bekannt sind, enthält. Die PHLDA1 ist stark in gutartigen melanozytären Läsionen (Naevi) exprimiert und wird während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert. Das PHLDA1 Protein scheint als ein proapoptotisches Molekül zu fungieren. Das Mechanismus ist allerdings noch nicht bekannt. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die 293 PHLDA1 Transfektanten zusätzlich zu einer erhöhten Apoptose Empfindlichkeit auch eine höhere MHC Klasse I Oberflächenexpression im Vergleich zu Neo Kontrollzellen aufweisen. Das konnte mit mehreren monoklonalen Antikörpern, bestätigt werden. Auch mittels IEF, konnte auf der gesamten Proteinebene, bei zwei PHLDA1 Transfektanten eine höhere Expression der Allelprodukte HLA A2 und HLA B7 bestätigt werden. Nach einer 3-stündigen Inkubation mit radioaktivmarkierten Aminosäuren weisen die PHLDA1 Transfektanten 4,5- bis 8,5-fach mehr neu synthetisierte MHC Klasse I Moleküle, im Vergleich zu den Kontrollzellen, auf. Mit Hilfe der Pulse/Chase Methode konnte gezeigt werden, dass PHLDA1 Transfektanten, im Vergleich zu den Neo Kontrollzellen, einen schnelleren MHC Klasse I Transport vom ER zum Golgi Apparat aufweisen. Durch die Immunopräzipitation von MHC Klasse I Molekülen, konnte auch das PHLDA1 Protein mitpräzipitiert werden. Das PHLDA1 Protein war nicht mit ICAM-1 oder MCAM mitpräzipitiert, was eine spezifische Bindung des PHLDA1 Proteins an die MHC Klasse I bestätigt. Es ist denkbar, dass das PHLDA1 Protein als Chaperon fungiert und durch die Bindung an die MHC Klasse I Moleküle diesen eine höhere Stabilität verleiht. Dadurch können die MHC Klasse I Moleküle schneller an die Oberfläche transportiert werden. PHLDA1 Transfektanten wurden von HLA A2 allospezifischen T-Zellen besser als die Neo Kontrollzellen erkannt. So könnte der Verlust des PHLDA1 Proteins bei Melanomen und Mammakarzinomen auch zum Verlust der T-Zellerkennung beitragen.

Die einzige Möglichkeit, Patienten mit Pankreaskarzinom zu heilen, besteht in einer möglichst frühzeitigen Diagnose und Operation. Nach einer kurativen Resektion versterben dennoch über 95% aller Patienten innerhalb der folgenden fünf Jahre an einem Rezidiv, was belegt, dass nach der Operation disseminierte Tumorzellen (DTZ) im Körper des Patienten verbleiben und deren Progression zu einem Rezidiv der Krebserkrankung führt. Beim Pankreaskarzinom wurde gezeigt, dass der Nachweis von DTZ mit dem Antikörper A45-B/B3 gegen Zytokeratin im Knochenmark und mit dem Antikörper Ber-EP4 gegen EpCAM im Lymphknoten mit einer schlechteren Prognose korreliert. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Einblicke in die Biologie von hämatogener und lymphogener Disseminierung beim Pankreaskarzinom zu erarbeiten. Zunächst wurde die Prävalenz von DTZ durch immunzytochemische Färbungen gegen die oben genannten epithelialen Marker bestimmt. Anschließend wurden die Zellen isoliert, ihre DNA amplifiziert und mit der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) auf numerische Aberrationen hin untersucht, welche mit den chromosomalen Veränderungen des Primärtumorkollektivs verglichen wurden. Diese Gegenüberstellung sollte ergründen, ob Ähnlichkeiten zwischen hämatogen disseminierten (H-DTZ), lymphogen disseminierten Tumorzellen (L-DTZ) sowie Primärtumoren (PT) bestehen und ob charakteristische Veränderungen für H-DTZ und L-DTZ existieren, welche möglicherweise im Rahmen der Disseminierung selektiert wurden. Die Prävalenz von DTZ bei Patienten mit nicht metastasiertem Pankreaskarzinom lag im Knochenmark bei 23,0% und im Lymphknoten bei 38,1%. Dieser Unterschied war nicht signifikant. Die genomische Analyse von DTZ und PT deckte auf, dass Primärtumore die höchste Anzahl an numerischen Aberrationen aufwiesen (Mittelwert: 12,8), gefolgt von den L-DTZ (Mittelwert: 9) und den H-DTZ (Mittelwert: 4,7). Zum anderen zeigten EpCAM-positive Zellen aus den Lymphknoten häufiger abnorme Karyotypen (78,3%) als Zytokeratin-positive Zellen aus dem Knochenmark (68,8%), während alle PT numerische Aberrationen aufwiesen. Die Häufigkeit von chromosomalen Gewinnen und Verlusten war unterschiedlich in den verschieden Gruppen und betrug bei H-DTZ 3,6 DNA-Gewinne und 1,1 DNA-Verluste, bei L-DTZ 4,5 DNA-Gewinne und 4,5 DNA-Verluste und bei PT 5,6 DNA-Gewinne und 7,2 DNA-Verluste pro analysierter Probe. Die Ähnlichkeitsanalyse numerischer Aberrationen der drei Kollektive zeigte, dass PT und insbesondere DTZ untereinander sehr heterogen sind. Charakteristische Veränderungen, die möglicherweise selektiert worden waren, wurden in erster Linie in PT gefunden, in geringerem Ausmaß auch in Tumorzellen aus Lymphknoten. Es handelte sich dabei in erster Linie um DNA-Verluste, wie zum Beispiel auf Chromosom 17 und 18, welche PT und L-DTZ gemeinsam waren und eine größere Ähnlichkeit zwischen diesen beiden Gruppen im Vergleich zu PT und H-DTZ nahelegen. Andererseits konnten auch Aberrationen identifiziert werden, die charakteristisch für die jeweilige Gruppe waren. Insbesondere handelte es sich dabei bei H-DTZ um DNA-Gewinne von 5p und 15q und bei L-DTZ um DNA-Gewinne von 4p oder 19 beziehungsweise DNA-Verluste von 11q oder 12p. Häufige DNA-Gewinne und -Verluste auf den Chromosomen 1, 3 oder 22 waren kennzeichnend für die Gruppe der Primärtumore. In der Analyse gepaarter Proben desselben Patienten waren gemeinsame Aberrationen zwischen PT und H-DTZ nur in der Hälfte (3/6), zwischen PT und L-DTZ dagegen in allen der untersuchten Fälle (2/2) anzutreffen. Auch die Anzahl dieser gemeinsamen Veränderungen war bei letzteren größer (Anteil gemeinsamer Veränderungen zwischen a) PT und H-DTZ: 5,9%, 5,9%, 4,8% und b) PT und L-DTZ: 16,3%, 8,9%). Der Vergleich solcher Aberrationen zwischen den verschiedenen Patienten mit gepaarten Proben dagegen führte nicht zur eindeutigen Identifikation typischer Veränderungen, welche im Zusammenhang mit einer hämatogenen oder lymphogenen Disseminierung gesehen werden können. Eine Zunahme numerischer Aberrationen mit fortschreitender Tumorprogression im Primärtumor wurde für die meisten soliden Tumoren nachgewiesen. Auch bei der Progression der pankreatischen intraepithelialen Neoplasie zum Pankreaskarzinom ist die Akkumulation von genetischen Veränderungen zu beobachten. Vor diesem Hintergrund deuten die vorliegenden Ergebnisse daraufhin, dass die Disseminierung ein frühes Ereignis im Rahmen der Progression des Pankreaskarzinoms ist. In sehr frühen Tumorstadien, welche möglicherweise von den Genomprofilen der DTZ im Knochenmark repräsentiert werden, sind in erster Linie DNA-Gewinne anzutreffen. Interessanterweise scheinen diese DTZ im Milieu des Knochenmarks keine Deletionen zu akkumulieren. Mit fortschreitender Tumorprogression kommt dagegen DNA-Verlusten eine zunehmend bedeutende Rolle zu, was in DTZ aus Lymphknoten sowie im Primärtumor zu beobachten ist. Diese Beobachtungen bilden die Grundlage für eine Vielzahl weiterführender Fragestellungen, wie zum Beispiel die Identifikation der genetischen Veränderungen, die am Anfang der genetischen Progression stehen. Gerade diese Veränderungen könnten von allen Tumorzellen geteilt werden und somit ideale Zielstrukturen für neue Therapieansätze darstellen.

Die Rekrutierung von Zellen ist ein komplexer, in mehreren Schritten ablaufender Mechanismus, der eine zentrale Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie z.B. Entzündung, Transplantatabstoßung, Tumormetastasierung und Stammzell¬migration hat. Die Migration von Zellen aus dem Blutstrom oder einem Reservoir in ein Zielgewebe bzw. Zielorgan und umgekehrt wird durch zahlreiche spezifische und unspezifische Reize ausgelöst und orchestriert. Dies erfolgt zu einem großen Teil durch von Chemokinen regulierte Mechanismen. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, welche an spezifische auf der Zelloberfläche exprimierte Chemokinrezeptoren (CCR) binden. Zellen mit entsprechenden Chemokinrezeptoren wandern entlang eines Chemokingradienten zum jeweiligen Ziel, z.B. einem Entzündungsherd oder einem Zielorgan. Erstes Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Chemokinrezeptorexpression im kutanen T-Zell Lymphom (CTCL), einem Non-Hogkin-Lymphom mit primärer kutaner Manifestation. Der Nachweis von Chemokinrezeptoren erfolgte in vitro mit der Polymerasekettenreaktion (PCR), der Durchflusszytometrie und mit Migrations-versuchen. Der Chemokinrezeptornachweis auf Hautschnitten von CTCL-Patienten erfolgte mit der Immunhistochemie. Erstmals konnte der hautassoziierte Chemokinrezeptor CCR10 im Rahmen des CTCL nachgewiesen werden. Außerdem gelang der Nachweis der Chemokinrezeptoren CCR4, CCR7 und CXCR3 in Hautschnitten und Lymphknotenbiopsien. CXCR3 wurde erstmals im Sezary Syndrom, einer fortgeschrittenen und aggressiven CTCL-Unterform, beschrieben. In der Immunhistochemie wurde die stärkste CCR10-Expression in Sezary Syndrom-Hautschnitten festgestellt. In Biopsien von befallenen Lymphknoten zeigte sich ein auffälliges CCR10-Verteilungsmuster: CCR10-positive Zellen wurden im Lymphsinus nachgewiesen, drangen aber nur vereinzelt in den Lymphknoten ein. In peripheren, nicht-kutanen Lymphomen wurde CCR10 nicht nachgewiesen und ist somit vermutlich exklusiv auf dem primär kutanen CTCL exprimiert. Es ist davon auszugehen, dass CCR10 den Epidermotropismus vor allem in aggressiveren Stadien reguliert. Die Bedeutung von CCR10 für die lymphatische Metastasierung des CTCL ist noch nicht geklärt. CCR10 könnte in der Zukunft als Faktor für die klinische Einstufung des CTCL oder als Ziel für eine gezielte Tumortherapie dienen. Die gezielte Tumortherapie ist u.a. mit Chemokinantagonisten möglich. Sie erlauben die gezielte Beeinflussung der chemokingesteuerten Rekrutierung von Leukozyten, Stammzellen oder Tumorzellen. Deshalb wurde ein membranbindender Antagonist des Chemokins CCL5, als potentielles Agens für die lokale Therapie von Tumoren oder von Transplantatabstoßungen, generiert. Das Chemokin CCL5 und seine Rezeptoren spielen in der akuten Transplantatabstoßung und in der Tumorprogression, z.B. im Mammakarzinom, eine zentrale Rolle. Der CCL5-Antagonist Met-RANTES inhibiert in Transplantatabstoßungsmodellen die Rekrutierung von Leukozyten. Der akute Entzündungsprozess und der daraus resultierende chronische Gefäßschäden werden so vermindert. Auch in einem Tumormodell ist ein Effekt auf die lokale Tumorprogression wahrscheinlich. Der in dieser Arbeit hergestellte CCL5-Antagonist Met-RANTES(Dimer)-GPI soll eine lokale Therapie ohne systemische Nebenwirkungen ermöglichen. Durch die erstmals beschriebene Bindung eines Chemokins oder Chemokinderivats an einen Glykosylinositolphosphatidyl (GPI)-Anker soll der Antagonist effektiv in die Zellmembranen von Endothelzellen inkorporiert werden, länger auf dem Endothel verbleiben und die benötigte Proteinmenge vermindern. Zunächst wurde durch die Erweiterung des signalgebenden N-Terminus von CCL5 der CCL5-Antagonist Met-RANTES generiert. Ein Aminosäureaustausch erzeugte ein dimerisierendes Molekül, welches einfacher als die zur Polymerisierung neigende Wildform zu isolieren war. Das Protein wurde mit der PCR mit einem GPI-Anker fusioniert und in Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen subkloniert. Met-RANTES(Dimer)-GPI wurde erfolgreich aus den CHO-Zellen isoliert und mit der Säulenchromatographie gereinigt. In in vitro-Versuchen wurde Met-RANTES(Dimer)-GPI effektiv in die Oberfläche von humanen Endothelzellen reinkorporiert und hemmte die transendotheliale Migration von Monozyten, welche bei der Transplantat¬abstoßung und bei der Tumorprogression eine wichtige Rolle spielen. Mit Met-RANTES(Dimer)-GPI präperfundierte Transplantate zeigen möglicherweise einen geringeren vaskulären Schaden bei der akuten Transplantatabstoßungsreaktion. Im Tumormodell soll eine Hemmung der Tumorinfiltration durch Monozyten, welche eine beschleunigte Tumorprogression verursachen, erreicht werden. Im Vergleich zu nicht GPI-gebundenen CCL5-Antagonisten würde eine lokale fokussierte Therapie ermöglicht und eine eventuell geringere zu applizierende Proteinmenge bei längerer Verweildauer erzielt. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben zunächst einen genaueren Einblick in die Pathogenese des CTCL. Der Chemokinrezeptor CCR7 wird vor allem von fortgeschrittenen Formen mit lymphatischer Infiltration exprimiert. CCR10 wird erstmals im Zusammenhang mit dem CTCL beschrieben und vor allem von fortgeschrittenen Unterformen exprimiert. Desweiteren wurde ein membranbindender Chemokinantagonist hergestellt. Erstmals wird die Kombination eines Chemokins oder Chemokinderivats mit einem GPI-Anker beschrieben. Der Antagonist erlaubt eine hohe lokale Applikation ohne systemische Zirkulation des Agens. Mögliche Einsatzgebiete sind die gezielte Tumortherapie oder die Behandlung der Transplantatabstoßung.

Mon, 26 May 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8668/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8668/1/Huesemann_Yves.pdf Hüsemann, Yves ddc:500, ddc:

Maligne Lymphomerkrankungen stellen lebensgefährliche Krankheitsbilder dar. Auch wenn mit der ersten Therapie nach Diagnosestellung bis zu 50 % der Patienten geheilt werden können. Patienten mit Rezidiverkrankungen haben eine deutlich niedrigere Überlebensrate. Daher kommen bei diesen Patienten, auch in der Ära der monoklonalen Antikörper, intensivere Therapieformen wie die PBSCT zum Einsatz, um die Überlebensraten zu erhöhen. Seit den ersten Transplantationen von PBPC bei Menschen in den Jahren 1985 und 1986, und damit dem Beweis der Durchführbarkeit dieser Therapieform, haben sich die Forschungsziele rasch geändert (Körbling et al., 1985); (Kessinger et al., 1986); (Juttner et al., 1985). Wenn auch keine Verbesserung der Überlebenszeiten im Vergleich zur ABMT nach¬gewiesen werden konnte, waren die klinischen und finanziellen Vorteile der PBSCT für die weitere Verbreitung Ausschlag gebend. Somit rückten die Einflüsse auf die Mobilisation, die Apherese und die Transplantation selbst in den Mittelpunkt des Interesses. In dieser Arbeit wurde vor allem die Auswirkung der zytostatischen Vortherapie auf die Mobilisation der PBPC untersucht. Aber es wurden auch andere, zumeist patientenunabhängige Parameter bezüglich ihres Einflusses auf die PBPC sowie die Beurteilung des Mobilisierungsschemas hinsichtlich Verträglichkeit und Ausschwemmung von BPC, analysiert. Die Untersuchung des Salvageschemas IEV mit Ifosfamid, Etoposid und Epirubicin ergab sehr gute Ergebnisse hinsichtlich der Mobilisierung von PBPC und der Aktivität gegenüber den Tumorzellen. Es wurden 37 Patienten evaluiert. Vier Patienten hatten ein T-Zell-Lymphom, acht ein centroblastisches NHL, vier Patienten hatten ein centroblastisches NHL nach Transformation aus einem centroblastisch/centrocytischem NHL, zwölf Patienten hatten centroblastisch/centrocytische NHL, vier Patienten hatten ein centrocytisches NHL, ein Patient hatte ein lymphocytisches NHL, zwei Patienten ein Plasmozytom und zwei waren am M. Hodgkin erkrankt. 14 Prozent der Patienten, d.h. fünf Patienten erreichten nach dem IEV-Schema eine komplette und 68 Prozent, d.h. 25 von 37 Patienten, eine partielle Remission.. Dies bedeutet eine Ansprechrate von 82 Prozent was 30 Patienten entspricht. Bei 7 Patienten, d.h. 18 Prozent wurde eine Progression festgestellt. Nur ein Patient verfehlte die vorgegebene Mindestanzahl an PBPC nach Mobilisierung mit IEV. Trotzdem konnte dieser Patient erfolgreich transplantiert werden und überlebte mindestens 51 Monate. In 29 % der Fälle mußte die IEV-Dosis reduziert werden, was die hämatologische Toxizität von 77% verdeutlicht. Von den fünf Todesfällen, was 12 Prozent der Patienten entspricht, verstarben vier der Patienten an den Folgen der Tumorprogression und ein Patient an einer Sepsis. Aufgrund der hohen Rate an Todesfällen sollte eine Dosisreduktion des IEV-Schemas vor allem bei Patienten über 60 Jahren erfolgen. Der signifikante Zusammenhang zwischen Überlebenszeit nach der Transplantation und der Anzahl der PBPC belegt die Wichtigkeit der Einflußfaktoren auf die Stammzellmobilisierung . Statistisch signifikante Zusammenhänge konnten wir in Bezug auf den zeitlichen Abstand zur Erstdiagnose sowie zur letzten Chemotherapie vor Salvagetherapie beobachten. Je größer die zeitlichen Abstände waren, umso höher war die Anzahl der PBPC. In Bezug auf die Vortherapie zeigten sich für Vincristin, Cyclophosphamid und Ifosfamid signifikante Korrelationen. Cyclophosphamid und eventuell auch Vincristin als Vortherapie verminderten die Stammzell¬ausbeute. Patienten, mit Ifosfamidgabe in der Anamnese, erzielten, sogar dosisbezogen, signifikant mehr PBPC als Patienten ohne diese Vortherapie. Tendenzielle Zusammenhänge konnten wir bei dem Geschlecht, Knochenmarksbefall, Stadium der Erkrankung, der Diagnose sowie vorheriger Bestrahlung und Gabe von Methotrexat erkennen. Männer erzielten eine doppelt so hohe Mobilisierung von CFU-GM als die Frauen unserer Studie. Auch Patienten mit Knochenmarksbefall wiesen tendenziell niedrigere Ergebnisse an PBPC auf als die ohne Knochenmarksbefall. Bei Erkrankten mit niedrigem Ann Arbor Stadium (A im Rezidiv bis B) konnten wir ebenfalls mehr als doppelt so hohe periphere BPC feststellen als bei Erkrankten mit fortgeschrittenem Tumorleiden (VA und B). Patienten mit niedrigmalignen Non-Hodgkin-Lymphomen erzielten weniger PBPC als jene mit M.Hodgkin, Plasmozytom oder hochmalignen NHL. Auch die Patienten, die eine Bestrahlung in der Vortherapie erhalten hatten, erreichten im Vergleich mit Patienten, die keine Bestrahlung erhalten hatten, weniger als die Hälfte an PBPC. Patienten nach Methotrexatgabe wiesen von der Tendenz her mehr PBPC auf als jene ohne anamnestische Methotrexatgabe. In Bezug auf das Alter, Überleben, Anzahl der Rezidive und Höhe der Laktatdehydrogenase des Patienten konnten wir keine Beziehungen zwischen der Anzahl der PBPC und den untersuchten Parametern erkennen. Auch die, vor der Salvagetherapie verabreichten Anzahl der Chemotherapieschemata oder der Chemotherapiezyklen sowie die Gabe und Dosis an Adriamycin, Procarbazin, Mitoxantron, Melphalan, Chlorambucil, Bleomycin und Etoposid hatten keinen Einfluß.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des kürzlich identifizierten Polymorphismus im Gen der Rezeptortyrosinkinase FGFR4 (fibroblast growth factor receptor 4) im besonderen Hinblick auf seine Zusammenhänge mit der humanen Tumorpathogenese näher untersucht. Es handelt sich dabei um eine Keimbahnmutation, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 (Arg388) und somit zu einer veränderten Proteinstruktur in der Transmembrandomäne des Rezeptors führt. Zuvor publizierte Studien, die Tumore verschiedener Organsysteme mit Fokus auf den FGFR4 Polymorphismus untersuchten, postulieren einen Zusammenhang zwischen der Rezeptormutation und seinem Einfluss auf die Tumorprogression und das Metastasierungspotential. Um diesen Einfluss der Mutation in unserem Tumorkollektiv zu untersuchen, führten wir bei Tumorproben von 301 Patienten, die an einem Plattenepithelkarzinom aus dem Bereich des Oropharynx litten, eine Genotypisierung mittels RFLP-PCR sowie immunhistochemische Untersuchungen durch, um die Expressionsstärke des FGFR4 feststellen zu können. Dabei zeigte sich, dass der FGFR4 in 34% der Fälle in heterozygoter oder homozygoter mutierter Form im Kollektiv vorliegt. Das entspricht einer Allelfrequenz für das Arg388 von 0.2. Die Verteilung der Rezeptorexpression im Kollektiv war weitgehend gleichmäβig verteilt. Um die Auswirkungen der durch die Untersuchungen gewonnenen Parameter auf die Tumorpathogenese festzustellen, wurden sie mit einem umfassenden Datensatz, der aus den Patientenakten gewonnen wurde, korreliert. Statistische Untersuchungen wiesen keine signifikanten Zusammenhänge zwischen dem FGFR4 Genotyp und der Tumorprogression oder einem gesteigertem Metastasierungspotential nach. Auch die in anderen Organsystemen zuvor festgestellte verringerte rezidivfreie Überlebenszeit bei Vorliegen des Arg388 Allels konnte in dem Kollektiv dieser Studie nicht reproduziert werden. Bezüglich der Rezeptorexpression ergaben unsere Untersuchungen Hinweise auf einen Überlebensvorteil bei starker FGFR4 Expression. Signifikante Zusammenhänge zwischen Rezeptorexpression und Tumorgröβe oder Tumorprogression konnten jedoch nicht nachgewiesen werden und decken sich mit den Ergebnissen von Streit et al. Somit können wir die bereits mehrfach postulierte Perspektive nicht stärken, den FGFR4 als Prädiktor oder prognostischen Parameter bei Krebserkrankungen zu deklarieren.

Von Juni 1997 bis April 2001 wurden 97 Patienten, die an einem unilateralen uvealen Melanom litten, mit dem Gamma-Knife radiochirurgisch behandelt. Die Melanome aller 97 Patienten waren aufgrund der Lokalisation oder der Größe für eine Therapie mit Ruthenium-Applikatoren nicht geeignet. Alle 97 Patienten, die sich der Therapie mit dem Gamma-Knife unterzogen, wurden in eine engmaschige Nachsorge aufgenommen. Bei der Nachsorge wurden in regelmäßigen Abständen klinische, echographische und neuroradiologische Untersuchungen durchgeführt. Die Daten der Patienten beziehen sich auf einen Zeitraum von median drei Jahren nach erstmalig erfolgter Bestrahlung mit dem Gamma-Knife. Bei 73 der 97 Patienten lagen Daten mit einem Jahr Nachbeobachtungszeit (median 12 Monate (Konfidenzintervall: 9-15 Monate)) nach erfolgter Bestrahlung vor. Alle 73 Patienten konnten bulbuserhaltend therapiert werden. Von einer lokalen Tumorkontrolle konnte bei 72 Patienten der 73 Patienten gesprochen werden. Die lokale Tumorkontrolle wurde als Stoppen der Tumorprogression oder als Tumorregression definiert. So war bei einem der 73 Patienten keine lokale Tumorkontrolle möglich. Im Echogramm konnte nun die maximale apikale Tumorhöhe im standardisierten A- Bild gemessen und mit den Ausgangswerten bei primärer Diagnosestellung verglichen werden. Bei primärer Diagnosestellung ließ sich ein Wert von median 8,0 mm festhalten. Bei einjähriger Nachbeobachtungszeit nach Bestrahlung mit dem Gamma-Knife war die maximale apikale Tumorhöhe auf den medianen Wert von 5,7 mm abgesunken. Bei 7 Patienten musste innerhalb des folgenden Jahres nach Behandlung mit dem Gamma-Knife eine Enukleation durchgeführt werden. Bei 33 Patienten lagen Daten mit zwei Jahren Nachbeobachtungszeit nach erfolgter Bestrahlung vor. Eine lokale Tumorkontrolle war bei allen 33 Patienten möglich. Auch im Echogramm konnte nun median ein deutlich Rückgang der maximalen apikalen Tumorhöhe verzeichnet werden. So war nun nach Ablauf der zweijährigen Nachbeobachtungszeit nach Bestrahlung mit dem Gamma-Knife die maximale apikale Tumorhöhe auf den medianen Wert von 4,3 mm abgesunken. Der Unterschied war statistisch hochsignifikant. Bei 1 Patienten musste innerhalb des folgenden Jahres eine Enukleation durchgeführt werden. Bei 15 Patienten lagen Daten mit drei Jahren Nachbeobachtungszeit nach erfolgter Bestrahlung vor. Eine lokale Tumorkontrolle war bei allen 15 Patienten möglich. Hier war ebenfalls ein deutlicher Rückgang der maximalen apikalen Tumorhöhe im Echogramm zu verzeichnen. So war die maximale apikale Tumorhöhe auf den medianen Wert von 4,6 mm abgesunken. Innerhalb des folgenden Jahres musste nun bei keinem der 15 Patienten eine Enukleation durchgeführt werden. Die klinischen Ergebnisse der 97 Patienten haben gezeigt, dass mittels einer stereotaktischen Präzisionsbestrahlung mit dem Gamma-Knife Patienten mit großen oder ungünstig gelegenen uvealen Melanomen, die nur durch eine Enukleation hätten behandelt werden können, in hohem Prozentsatz erfolgsversprechend bulbuserhaltend therapiert werden konnten. Die Wahrscheinlichkeit einer Enukleation war im ersten Jahr nach erfolgter Bestrahlung mit dem Gamma-Knife am größten und nahm in der Behandlungsserie in den folgenden Jahren rapide ab.

Das Karzinoembryonale Antigen Zelladhäsionsmolekül CEACAM-1 ist an interzellulären Adhäsionen beteiligt und begünstigt die Tumorangiogenese. In dieser Studie wurde die Expression von CEACAM-1 bei operablen nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen und ihr prognostischer Einfluss untersucht. Primärtumoren von 145 Patienten mit operablen nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen wurden mittels eines monoklonalen anti-CEACAM-1 Antikörpers immunhistochemisch untersucht. Die CEACAM-1 Expression wurde in 3 Kategorien eingeteilt: niedrig: £33% gefärbte Tumorzellen, intermediär: >33% und

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist weltweit der zweithäufigste bösartige Tumor. Fernmetastasen eines CRC treten zumeist in Leber und Lunge auf, sind nur in seltenen Fällen operativ entfernbar und sprechen nicht auf derzeit verfügbare Chemotherapien an. Die Identifizierung von Genen und die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, durch welche sie zur Tumorprogression eines CRC beitragen, liefert eine Grundlage für die Prävention oder Behandlung der zumeist tödlich verlaufenden Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des metastatischen Phänotyps in Kolonkarzinomzellen verantwortlich sind. Hierzu wurden mittels der Genchip-Technologie die Transkriptionsprofile von insgesamt fünf Tumor-Zelllinien erstellt und nach stringenten Auswahlkriterien miteinander verglichen. Zuerst wurde ein CRC-Zellmodell verwendet, das aus einer in der Nacktmaus nicht-metastasierenden humanen Primärtumor-Zelllinie KM12C und zwei davon abgeleiteten, stark zur Leber metastasierenden Zelllinien, KM12SM und KM12L4A bestand. In diesem überwiegend isogenen Zellmodell wurden 145 Gene in beiden metastasierenden Zelllinien als dereguliert im Vergleich zu der nicht-metastasierenden Zelllinie identifiziert. Die Transkriptionsprofile eines weiteren humanen CRC-Zellmodells, bestehend aus einer nicht-metastasierenden Zelllinie HCT116 und einer stark zur Lunge metastasierenden Zelllinie HCT116U5.5 wurden ebenfalls verglichen und 72 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Ein Vergleich der Datensätze aller Transkriptionsprofile ermöglichte die Identifizierung von Vimentin und Trop-2 (TACSTD2, „Tumorassoziierter Vermittler von Kalziumsignalen“) als in allen metastasierenden Zelllinien überexprimiert. Die hohe Homologie des bisher noch weitestgehend unerforschten Trop-2 zu Trop-1 (Ep-CAM), einem regulatorischen Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das überwiegend von aggressiven Tumorarten exprimiert wird und die Proliferation von Tumorzellen stimulieren kann, machten Trop-2 für weiterführende Expressions- und Funktionsstudien zu einem interessanten Zielgen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Expressionsstudien in einer Vielzahl von Tumorbiopsien zeigten deutlich erhöhte mRNA- und Proteinspiegel von Trop-2 in Metastasen aus CRC im Vergleich zu den Primärtumorgeweben. Zusätzlich zu diesem neuen Befund in CRC wurde in dieser Arbeit erstmalig eine erhöhte Expression von Trop-2 in Schild-drüsenkarzinomen und in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben nachgewiesen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Trop-2 für die Metastasierung von Karzinomzellen des Kolons wurden stabile Transfektanten für Trop-2 in der nicht-metastasierenden Zelllinie KM12C generiert. Die konstitutiv Trop-2 exprimierenden Zellklone zeigten erhöhte Cyclin D1-Proteinspiegel bei unveränderter Zellproliferation gegenüber den Vektorkontrollen. Die Induktion von Cyclin D1 könnte mit der Identifizierung eines ebenfalls erhöhten Proteinspiegels von ß-Catenin in den Trop-2 exprimierenden Transfektanten in Zusammenhang stehen. Somit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Einfluss von Trop-2 auf den Tcf/ß-Catenin Signalweg. Zusätzlich demonstrierte ein Migrationstest erhöhte mobile Eigenschaften von Trop-2 exprimierenden Zellen in vitro, während sich die invasive Fähigkeit der Transfektanten, in vitro durch eine Matrigelschicht zu wandern, nicht von den Vektorkontrollen unterschied. Die induzierte Expression von Trop-2 in der Mehrzahl von Metastasen des kolorektalen Karzinoms sowie in Tumoren von Lunge und Schilddrüse war eine neue Beobachtung. Diese Ergebnisse demonstrieren das Potential von Hochdurchsatzmethoden wie die hier verwendete Genchip-Technologie in Kombination mit geeigneten Zellmodellen. In der vorliegenden Arbeit führte sie zur Identifizierung von Trop-2 als einen Marker der Tumorprogression und Metastasierung von verschiedenen humanen Karzinomen.

Das nicht polymorphe HLA-Klasse-I-Antigen HLA-G wird hauptsächlich in der Plazenta exprimiert, wo es vermutlich den semiallogenen Fötus vor Angriff des mütterlichen Immunsystems schützt. Eine Besonderheit von HLA-G ist das Auftreten von mehreren verkürzten Isoformen, die von alternativ gespleißten Transkripten translatiert werden. Neben dem kompletten membranständigen HLA-G1 mit den extrazellulären Domänen a1, a2 und a3 existieren die verkürzten Isoformen HLA-G2 (∆a2), HLA-G3 (∆a2, ∆a3) und HLA-G4 (∆a3). Außerdem wurden die löslichen Isoformen HLA-G5 (HLA-G1s), HLA-G6 (HLA-G2s, ∆a2) und HLA-G7 (HLA-G3s, ∆a2, ∆a3) beschrieben. Um die Expression und Funktion einzelner Isoformen getrennt voneinander und ohne Beeinflussung durch andere MHC-Klasse-I-Moleküle untersuchen zu können, wurden Transfektanten für die Isoformen HLA-G1, HLA-G2, HLA-G4 und HLA-G5 in der HLA-Klasse-I-negativen humanen Zellinie K-562 generiert. HLA-G kann mit inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren auf NK- und T-Zellen in Wechselwirkung treten und so Effektorfunktionen beeinflussen. Die Expression von HLA-G kann außerdem indirekt über HLA-E auf die Zytotoxizität von NK-Zellen und T-Zellen einwirken. Die HLA-E-Expression ist abhängig von Peptiden aus den Signalsequenzen von HLA-Klasse-I-schweren Ketten. Zum Ausschluß der Koexpression des HLA-Klasse-I-Antigens HLA-E auf der Zelloberfläche wurden HLA-G1mut- und HLA-G4mut-cDNA-Vektoren eingesetzt, deren Exon 1 so verändert ist, daß kein Ligand für HLA-E zur Verfügung gestellt wird. Während in der Zellinie K-562 HLA-G1 und HLA-G5 auf der Zelloberfläche exprimiert bzw. sezerniert werden, waren die verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 mittels FACS-Analyse mit einer Reihe HLA-Klasse-I- und HLA-G-spezifischer Ak nicht auf der Zelloberfläche nachweisbar. Diese Ergebnisse korrelieren mit der Sensitivität dieser verkürzten Isoformen gegenüber Endo H. Aus der fehlenden Resistenz der HLA-G2- und HLA-G4-Polypeptide gegenüber Endo H ergibt sich kein Hinweis auf ihren Transport zur Zelloberfläche. Diese fehlende Oberflächenexpression von HLA-G2 und HLA-G4 könnte auf einer gestörten Assoziation mit b2m oder Bestandteilen der MHC-Klasse-I-Prozessierungsmaschinerie beruhen. Kopräzipitationsexperimente ergaben, daß nur die HLA-G1-schwere Kette mit b2m und TAP assoziiert ist. HLA-G2 ließ sich zwar mit TAP, jedoch nicht mit b2m kopräzipitieren und HLA-G4 ließ sich weder in Assoziation mit b2m noch mit TAP nachweisen, so daß diesen Isoformen ein wichtiger Bestandteil der vollständigen HLA-I-Komplexe fehlt und bei HLA-G4 außerdem die Beladung mit Peptiden gestört ist. Diese Daten sprechen gegen eine Zelloberflächenexpression der verkürzten HLA-G-Isoformen. Im Unterschied zu HLA-G1 war HLA-G5 nicht in Kopräzipitaten mit TAP zu finden. Daher scheint für diese Isoform eine stabile Assoziation mit TAP für die Peptidbeladung nicht essentiell zu sein. Zum funktionellen Nachweis von HLA-G wurden Zytotoxizitätstests mit der Zellinie NKL sowie mit PBL, NK-Zellen und LAK-Zellen aus dem peripheren Blut mehrerer Donoren durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die Expression der verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 die Zytotoxizität der verschiedenen Effektorzellen nicht beeinflußte. HLA-G1 inhibierte die Lyse von K-562 in Abhängigkeit von der HLA-G1-Expressionsstärke und wirkte sich weniger deutlich als eine entsprechende HLA-E-Expression auf die Zytotoxizität aus. Neben der Plazenta wird HLA-G auch in zahlreichen anderen Geweben exprimiert und kann in Tumoren induziert oder hochreguliert werden. Da bei verschiedenen Tumoren die MHC-Klasse-I-Expression aufgrund von Mutationen im b2m-Gen gestört ist, wurden HLA-G1-Transfektanten in der b2m-negativen humanen Zellinie Daudi etabliert. Daudi HLA-G1-Transfektanten weisen gegenüber K-562 HLA-G1-Transfektanten eine reduzierte HLA-G-Proteinmenge auf. In Abwesenheit von b2m ist HLA-G1 außerdem nicht resistent gegenüber Endo H und kann auch nach Inkubation der Zellen bei niedrigen Temperaturen und Zugabe von b2m oder Ligand nicht auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Da von HLA-B27 bekannt war, daß b2m-freie Homodimere auf der Zelloberfläche exprimiert werden können und eine Dimerisierung von HLA-G über ungepaarte Cysteinreste möglich ist, wurden die Daudi HLA-G1-Transfektanten auf Anwesenheit von HLA-G1-Dimeren untersucht. In Abwesenheit von b2m waren jedoch keine Dimere nachweisbar. Auch in funktionellen Experimenten mit LAK oder gd T-Zellen hatte die HLA-G-Expression in Daudi HLA?G1-Transfektanten keine Auswirkung auf die Zytotoxizität oder Proliferation der Effektorzellen. Die HLA-G1-Expression in b2m-negativen Tumoren trägt daher nicht zur Tumorprogression bei. Eine Analyse der Unterschiede in der Expression und der Auswirkungen der HLA-G-Isoformen in verschiedenen Zellinien könnte Hinweise auf die Regulation und die Funktion der HLA-G-Expression liefern.

Lebensqualität zu erhalten ohne die Chance auf Überleben zu kompromittieren ist ein Hauptziel in der Krebstherapie. Dies ist eine große Herausforderung für das Rhabdomyosarkom im Blasen-Prostata-Bereich im Kindesalter. Etwa 0.5-0.7 Fälle pro einer Million Kinder unter 15 Jahren erkranken an einem Rhabdomyosarkom, zwölf Prozent davon entstehen im Bereich der Blase und Prostata. Zur Therapieoptimierung werden in Deutschland alle Patienten in einem zentralen Studienregister der Cooperativen Weichteilsarkomstudie (CWS) erfaßt. Ziel dieser Arbeit war es, den Stand der deutschen Chirurgie in der Behandlung des Rhabdomyosarkomes im Bereich Blase/Prostata im Kindesalter zu erheben, das Überleben in Abhängigkeit des chirurgischen Vorgehens zu ermitteln sowie Langzeitauswirkungen der Therapie zu erfassen. Die Patienten wurden aus dem Datenpool der CWS von 1981 bis 1995 rekrutiert, wobei es sich um Patienten im Alter von 0-18 Jahren handelte. Im ersten Teil der Arbeit wurde das Datenmaterial retrospektiv aus den Studienakten und der Studiendatei erhoben und jeweils fehlende Daten einzeln nachgefordert, um eine möglichst umfassende Erhebung zu gewähren. Zunächst wurden die verschiedenen Risikofaktoren, welche das Überleben beeinflussen, aufgearbeitet. Das Patientengut wurde dann in Abhängigkeit des chirurgischen Vorgehens in drei Behandlungsgruppen unterteilt (rein konservatives Vorgehen, Blasenerhalt und Zystektomie) und deren Verteilung bezüglich der Risikofaktoren dargestellt. Daraufhin wurde das Gesamt- und ereignisfreie Überleben berechnet und in Abhängigkeit des chirurgischen Vorgehens betrachtet. Diese Ergebnisse wurden im Anschluß mittels Einzelfallbesprechungen näher beleuchtet. Im Rahmen einer Fall-Kontroll-Studie wurden im zweiten Teil dieser Arbeit Langzeitauswir-kungen der Therapie mit Hilfe eines offenen Patientenfragebogens ermittelt. Insgesamt konnten 58 Patienten in die Auswertung aufgenommen werden, welche sich zu etwa gleichen Teilen aus den einzelnen Studienlaufzeiten der CWS-81, CWS-86 und CWS-91 rekrutierten. Die Mehrzahl der Patienten war männlich mit einem Anteil von 85% (49/58). Die Altersbreite erstreckte sich von 10 Monaten bis 18 Jahre, wobei die Mehrzahl der Patienten im unteren Altersbereich zwischen 1-3 Jahren liegt, mit einem Altersmedian von 2 Jahren. Histologisch lag bei 55 Patienten ein embryonales Rhabdomyosarkom vor, nur zwei hatten ein alveoläres und in einem Falle war das Gewebe nicht näher differenzierbar. Die Tumorgröße bei Diagnose war bei fast der Hälfte aller Patienten (n=27) zwischen 5-10 cm, 20 Patienten hatten einen Tumor von weniger als 5 cm, wobei in nur fünf Fällen der Tumor kleiner als 3cm war. In zehn Fällen fand sich eine Tumormasse von über 10cm. Insofern eine Responsebestimmung erfolgen konnte (primär nicht entfernte Tumormasse und ausreichende Bildgebung) zeigte das Rhabdomyosarkom im Bereich der Blase/Prostata trotz überwiegend embryonaler Histologie nur eine moderate Response. Nur bei zwei Patienten fand sich eine komplette Response, etwa ein Drittel zeigte ein gutes Ansprechen auf die Therapie, 14 Patienten hatten eine schlechte Response und bei vier Patienten zeigte der Tumor kein wesent-liches Ansprechen auf die konservative Therapie, wobei in weiteren vier Fällen die Daten zur Responsebestimmung nicht vorlagen. Da nach Aufteilung in Gruppen nach operativem Management die Fallzahl zu gering war konnte eine statistische Auswertung bezüglich Unterschiede in den Risikofaktoren nicht erfolgen. In graphischer Darstellung zeigten sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Gruppen bezüglich Geschlecht, Alter und Histologie. In Bezug auf die Tumorgröße fand sich in der Gruppe mit blasenerhaltender Operation erwartungsgemäß ein relativ höherer Anteil mit Tumoren unter 3cm Größe, jedoch überraschenderweise auch ein größerer Anteil an Tumoren über 10cm Ausdehnung. Trotz multimodalem Therapiekonzept erfolgte bei annähernd der Hälfte der Patienten (n=26) eine Primärresektion, wobei in zwei Fällen primär eine Zystektomie durchgeführt wurde, während in den restlichen 24 Fällen eine blasenerhaltende Operation erfolgte. Bei sieben dieser Patienten konnte jedoch bei einer darauffolgenden Sekundäroperation die Blase nicht mehr er-halten werden, so daß am Ende nur bei 17 der 24 primär blasenerhaltend operierten Patienten dies auch dauerhaft war. Sekundär wurden 16 Zystektomien durchgeführt und 13 blasenerhaltende Operationen. Von den 26 Primäreingriffen konnte nur in vier Fällen ein Stadium I erreicht werden. Bei weite-ren vier Fällen war nach makroskopisch kompletter Entfernung der Resektionsrand tumor-infiltriert (Stad II) und bei 11 Operationen konnte der Tumor auch makroskopisch nicht komplett entfernt werden (Stadium III) . Die Sekundäroperation führte in 15 Fällen zu einer R0-Resektion. 13 weitere Sekundäroperationen führten zur makroskopisch kompletten Tumorentfernung, wobei in drei Fällen die Tumorfreihet des Resektionsrandes unklar blieb, in den übrigen zehn Fällen der Tu-mor eindeutig den Resektionsrand infiltrierte. In einem Falle verblieben auch bei der Sekundäroperation weitere Tumorreste in situ. Insgesamt wurden letztendlich 18 Patienten Zystektomiert wohingegen 30 Patienten blasenerhaltend operiert werden konnten. 10 Patienten erhielten ausschießlich konservative Therapie. Unter den blasenerhaltend operierten Tumoren war der Tumorursprung zu je etwa einem Drittel vom Blasendach, Blasenboden und der Prostata. In der Gruppe der Zystektomien ging der Tumor in der Hälfte (n=11) vom Blasenboden aus. Sieben Tumore hatten ihren Ursprung von der Prostata und in zwei Fällen war der Ursprung des Tumors nicht differenzierbar. Sämtliche Tumoren mit Ursprung im Blasendachbereich (ca. 15%) konnten blasenerhaltend reseziert wer-den. Bezüglich des Überlebens hatte die Gruppe mit Blasenerhalt mit einer absoluten 5-Jahres-Überlebensrate von 93% und einer ereignisfreien 5-Jahres-Überlebensrate von 80% die besten Ergebnisse, gefolgt von der konservativ behandelten Gruppe mit absoluten und ereignisfreiem 5-Jahresüberleben von ebenfalls 80%. Nach Zystektomie ergab sich nur eine absolute 5-Jahres-überlebensrate von 67%, wobei nur 50% fünf Jahre ereignisfrei überlebten. Es wurde somit trotz radikaler chirurgischer Therapie ein relativ schlechtes Ergebnis erzielt. Nach Betrachtung der Einzelfälle zeigte sich, daß die Zystektomie, die in vielen Fällen eher spät und wohl auch im Sinne einer ultima ratio durchgeführt wurde, oftmals das Leben des betroffenen Patienten dann auch nicht mehr erhalten konnte. Es kam in der Gruppe der zystektomierten Patienten relativ häufiger zu Ereignissen (6 von 18) mit überwiegend metastatischen Geschehen, nur in einem Falle kam es ausschließlich zum Lokalrezidiv. Wohingegen nur sechs von 30 Patienten mit Blasenerhalt ein Ereignis hatten und nur in einem dieser Fälle Metastasen auftraten. Jedoch kam es hier eher noch zu späteren Todesfällen mit einem Abfall der Absoluten Überlebensrate nach 10 Jahren auf 86%. Nach konservativer Therapie kam es bei einem von 10 Patienten zum Lokalrezidiv, bei einem weiteren Patienten lag eine Tumorprogression von. Bei Erfassung der Langzeitprobleme gaben drei der zehn konservativ behandelten Patienten Probleme im Bereich des Harntraktes an, wobei in einem Falle nur geringe Kontinenzprobleme vorlagen, in den beiden anderen jedoch weiterreichende Probleme einer Strahlenblase auftraten, was in einem Falle zu Folgeoperationen mit letztendlich kontinenter Harnableitung nach Blasenaugmentation führte. 11 der 30 Patienten mit blasenerhaltender Tumorresektion gaben Beschwerden im Bereich des Harntraktes an, welche jedoch bei fast allen von geringerer Problematik waren, im Sinne von milden Kontinenzproblemen, Blasenentleerungsstörungen, Pollakisurie und Hämaturie. Lediglich ein Patient benötigte weitere Operationen zur vorrübergehenden äußeren Harnableitung, welche jedoch nach fünf Jahren ohne weitere Konsequenz zurückverlagert werden konnte. Vier Patien-ten in der Gruppe mit Blasenerhalt verstarben an einem Tumorrezidiv, hatten bis dato jedoch keine Harntraktsymptomatik. Die übrigen 15 Patienten blieben beschwerdefrei. Nach Zystektomie hatten sechs Patienten ein kontinentes Stoma, 12 Patienten eine inkontinente Form der Harnableitung. Bei sieben Patienten kam es zu eher charakteristischen, Pouch- oder Stoma bedingten Komplikationen, welche in vier Fällen Folgeoperationen nach sich zogen. Sechs der Patienten mit inkontinenter Harnableitung verstarben innerhalb der ersten drei Jahre nach Erstdiagnose. Abschließend zeigt sich das Rhabdomyosarkom im Bereich Blase/Prostata als Region mit geringer R0-Chance, umso mehr bei Primärresektion. Dennoch ergibt sich eine akzeptable Prognose auch nach mikroskopischen Tumorresten bei Therapieintensivierung. Es zeigte sich auch, dass nach kompletter oder guter Chemotherapieresponse eine Tumorresektion nicht zwingend ist. Die 5-Jahres Überlebensrate nach blasenerhaltender Operation ist exzellent (93%), jedoch kommt es in einer nicht unerheblichen Anzahl zu Rezidiven, die zu späteren Todesfällen führen und somit die Langzeitüberlebensrate nach 10 Jahren auf nur noch 86% reduziert. Hier stellt sich für die Zukunft die Frage, ob dieser Verlust durch eine Optimierung der Lokaltherapie, unter anderem mit dem Einsatz neuerer Therapieverfahren reduziert werden kann. Die Zystektomie als lebenserhaltende Maßnahme bedarf einer kritischen Selektion, um unnötige Zystektomien zu verringern. Zur chirurgischen Therapieoptimierung ist primär die Grundlage einer besseren, chirurgiegerechten Dokumentation zur Auswertung chirurgischer Maßnahmen zu fordern. Die Selektion und Durchführung der optimalen chirurgischen Therapie erfordert sehr viel Erfahrung und sollte entsprechend in wenigen spezialiserten Kliniken zentralisiert werden.

Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen. Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter Wichtigkeit. PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs- assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen Melanom beschrieben. Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht. Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden: In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien, die aus Melanommetastasen etabliert wurden. In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1- spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1- Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert wird. Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1- Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere Kontaktinhibition. Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1- Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten. Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1 im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47- Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations- initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig geklärt. Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1- Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK) FGFR4 (Fibroblast Growth Factor Rezeptor 4) in der Tumorentwicklung untersucht. Der FGFR4 besteht aus einer extrazellulären ligandenbindenen Domäne, einer einspännigen Transmembrandomäne und einem intrazellulären Bereich, der neben zwei Kinasedomänen auch eine Reihe von Bindungsmotiven für Adapterproteine mit und ohne enzymatische Aktivität enthält. Die Tyrosinkinase Funktion des FGFR4 wird durch lösliche Liganden, die FGFs, stimuliert. Die häufig starke Aktivität des FGFR4 Gens in Tumorgeweben lässt eine Funktion des FGFR4 in der Tumorentwicklung vermuten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine Mutation in der Transmembrandomäne des FGFR4 nachgewiesen, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 führt (Gly388Arg). Diese Mutation ist homolog zu der seltenen GlycinIn der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK) FGFR4 (Fibroblast Growth Factor Rezeptor 4) in der Tumorentwicklung untersucht. Der FGFR4 besteht aus einer extrazellulären ligandenbindenen Domäne, einer einspännigen Transmembrandomäne und einem intrazellulären Bereich, der neben zwei Kinasedomänen auch eine Reihe von Bindungsmotiven für Adapterproteine mit und ohne enzymatische Aktivität enthält. Die Tyrosinkinase Funktion des FGFR4 wird durch lösliche Liganden, die FGFs, stimuliert. Die häufig starke Aktivität des FGFR4 Gens in Tumorgeweben lässt eine Funktion des FGFR4 in der Tumorentwicklung vermuten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine Mutation in der Transmembrandomäne des FGFR4 nachgewiesen, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 führt (Gly388Arg). Diese Mutation ist homolog zu der seltenen Glycin dem Wildtyprezeptor (Gly388) und der Rezeptormutante. Die in vitro Kinase Assays der MAP-Kinase ERK2, die nach FGFR4 Stimulierung in L6 Myoblasten aktiviert wird, bestätigen diese Ergebnisse. In der Fähigkeit zu migrieren, unterschieden sich Brustkrebszellen, die stabil den mutierten FGFR4 exprimierten, dagegen deutlich von vergleichbaren Zellen, die den Wildtyprezeptor exprimierten. Daneben ergab die cDNA Array Analyse in den oben genannten Brustkrebszelllininen unterschiedliche Expressionsstärken für eine Reihe von Genen, die in der Tumorentwicklung eine bedeutende Rolle spielen. Des weiteren gelang es mit einem Fusionsprotein zwischen der extrazellulären FGFR4 Domäne und dem Glutathion-S-Transferase (GST) Protein eine ungewöhnliche Funktion des FGFR4 in der Zelladhäsion nachzuweisen. Nur wenige RTKs waren bis dahin als Vermittler von Zelladhäsion bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass verschiedene Zelltypen exklusiv auf Zellkulturplatten, die mit dem FGFR4-GST Fusionsprotein beschichtet sind, adherieren können. Im Gegensatz zu früheren Befunden ist dieser Prozess abhängig von zweiwertigen Kationen und kann nicht durch einen Überschuss von löslichen Heparin blockiert werden. Weiterhin konnten die spezifische Bindung von zwei Proteinen, deren Identität noch unbekannt ist, an das FGFR4-GST Fusionsprotein nachgewiesen werden, so dass von einer direkten Wechselwirkung zwischen der extrazellulären Domäne des FGFR4 mit weiteren Molekülen ausgegangen werden kann. Die Untersuchungen ergaben außerdem Hinweise auf eine Intgrin-vermittelte Signalkette, die während der Adhesion an FGFR4-GST induziert wird. Es wurde sowohl die Zunahme der Tyrosinphosphorylierung der “Focal Adhesion Kinase” (FAK) als auch die Aktivierung der MAP-Kinasen ERK2 und JNK gezeigt. Die hier erarbeiteten Daten ermöglichen also, eine Funktion des FGFR4 als morpho-regulatorisches Protein zu diskutieren. Darüberhinaus erlauben die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse erstmals eine Diskussion über die Funktion von Sequenzvarianten im FGFR4 in der humanen Pathogenese und insbesondere in der Tumorprogression. Sie zeigen, dass das vererbte FGFR4 Arg388 Allel mit einer schlechten klinischen Prognose in Brust- und Darmkrebs assoziiert ist und weisen auf einen Mechanismus hin, in dem der klinische Verlauf von Tumorerkrankungen durch vererbliche Parameter moduliert wird.

Muc18/MCAM/CD146, ein Zelloberflächenglykoprotein von 113 kD, wurde ursprünglich als Melanom-Antigen identifiziert, dessen Expression mit Tumorprogression und der Fähigkeit zur Metastasierung assoziiert ist. Es ist ein Mitglied der Immunglobulinsuperfamilie und vermittelt homotypische und heterophile Adhäsion. Aus diesem Grund wurde vermutet, dass Muc18, wie auch andere Zelladhäsionsmoleküle, der Beginn einer Signalkette ist. Da der zugehörige Ligand immer noch unbekannt ist, wurden zur Untersuchung dieser Vermutung monoklonale α-Muc18-Antikörper verwendet, um die Bindung des Liganden zu imitieren. Nach Kreuzvernetzung von Muc18 in Muc18-Transfektanden und in natürlich Muc18- exprimierenden Melanomzellen mit verschiedenen α-Muc18-Antikörpern konnte kein Calcium-Einstrom festgestellt werden, aber eine Reihe von neu Tyrosin-phosphorylierten Proteinen wurden mittels Western Blot detektiert. Diese lagen bei etwa 50, 70 – 90, 128 und 146 kD. Zwei dieser neu phosphorylierten Proteine wurden als das Adapterprotein p130Cas (crk-associated substrate) und sein Ligand p105CasL identifiziert. Eine Muc18-assoziierte Phosphorylierung von fak („focal adhesion kinase“) und fyn (eine Proteintyrosinkinase der src-Familie) wurde nicht beobachtet. P130Cas und p105CasL, sowie nck, ein weiteres Adapterprotein, wurden mit Muc18, unabhängig von Muc18-Aktivierung, kopräzipitiert. Fak, fyn und Paxillin konnten nicht kopräzipitiert werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der Muc18-Signalweg ähnlich, aber nicht identisch mit dem β1-Integrin-Signalweg ist. Zusätzlich zu diesen zytosolischen Interaktionspartnern konnten noch weitere, im Zellkern wirksame Signalpartner von Muc18 identifiziert werden. Bei transienter Transfektion von Melanomzellen mit Luziferase-Reporterkonstrukten, die jeweils verschiedene Transkriptionsfaktor- responsive Elemente enthielten, führte Kreuzvernetzung von Muc18 zur Aktivierung von CRE (cAMP responsive element) und der NF-κB-responsiven Elemente aus dem ICAM- 1-Promotor. Damit sind wahrscheinlich auch CRE-bindende Proteine und NF-κB am Muc18- Signalweg beteiligt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Bindung von Muc18 an seinen Liganden nicht nur zur Muc18-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion führt, sondern auch zu Veränderungen in der Genexpression und vielleicht zu verstärkter Expression von anderen Zelladhäsionsmolekülen. Somit konnte in dieser Arbeit die Frage, ob Muc18 ein Signalweg-Initiator ist, bejaht, und die ausgelöste Signalkette punktuell aufgeklärt werden.