Podcasts about liganden

Die Gegenwart von Kohlenhydraten in biologischen Systemen ist von großer Bedeutung für eine Reihe von zellulären Zyklen, so z.B. die Zell-Zell-Erkennung, die Regulation von Proteinaktivitäten oder die Funktion von Kohlenhydraten als Liganden für die Zelladhäsion. Ferner besitzen eine Reihe von mucinartigen O-Glycanen vielfältige Funktionen in immunologischen Prozessen, welche mit unterschiedlichsten Krankheitsbildern, wie z.B. der Karzinogenese sowie Autoimmun- und Infektionskrankheiten einhergehen. Im Besonderen nehmen viele mucinartige Glycane mit funktionellen Oligosaccharidketten, einschließlich Sialinsäure-tragenden Strukturen wie z.B. Glycophorin, Leukosialin (CD 43 oder auch Sialophorin), Sialyl-Lewis x und Sialyl-Lewis a eine entscheidende Rolle als Liganden in Zell-Zell-Erkennungsmechanismen bei inflammatorischen Prozessen, T-Zell-Differenzierung und Krebsmetastasierung ein. Jüngst wurde eine Reihe innovativer Ansätze für die Immuntherapie von Krebs durch ein besseres Verständnis der abweichenden Glycosylierungsmuster von Glycoproteinen und Glycolipiden auf der Oberfläche von Krebszellen entwickelt, wobei ein Schwerpunkt der Arbeiten auf der Herstellung von kohlenhydrat-basierten Krebsvakzinen ruht. Vor diesem Hintergrund beschäftigt sich die folgende Arbeit mit der Synthese von Epitopen des Sialophorin (CD 43), einem bedeutenden O-Glycan-enthaltenden Sialoglycoprotein, welches auf Leukozyten exprimiert vorliegt und mit einer Reihe von Krankheitsbildern, wie rheumatoider Arthritis, Leukämie, dem Wiskott-Aldrich-Syndrom (WAS) und dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS), einhergeht. Der Aufbau komplexer Hexasaccharid-tragender Glycokonjugate konnte hierbei ausgehend von kommerziell erhältlichen Startmaterialien erfolgen. Im Vordergrund stand dabei die Entwicklung eines biomimetischen Synthesewegs, mit dessen Hilfe neben der natürlichen Struktur auch eine Reihe fluorierter Sialophorin-Derivate mit unterschiedlich fluorierten D-Galactose-Bausteinen in den beiden Trisaccharid-Einheiten hergestellt werden können. Dabei sollten sämtliche Glycosylaminosäuren mit einem zur Festphasensynthese kompatiblen Schutzgruppenmuster ausgestattet vorliegen, um einen Einbau in die N-terminale Partialsequenz des Glycoproteins Sialophorin (CD 43) zu erlauben. Beginnend mit der Synthese der unterschiedlich fluorierten D-Galactose-Derivate, der Glucosamin- und der Sialinsäure-Bausteine sollten die regio- und stereoselektiv notwendigen Di- und Trisaccharid-Bausteine chemisch verknüpft werden. Zu diesem Zweck wurden literaturbekannte Königs-Knorr- und Schmidt-Glycosylierungsreaktionen sowie stereoselektive Sialylierungsreaktionen unter Ausnutzung des Nitrileffekts genutzt. Ein weiterer Meilenstein war die regioselektive Glycosylierung der beiden Trisaccharid-Bausteine zu den geschützten Hexasaccharid-Threonin-Konjugaten, die damit für den Einbau in die N-terminale Partialsequenz des Sialoglycoproteins Sialophorin zur Verfügung stehen. Zudem wurden fluorierte sialylierte Trisaccharid-Threonin-Konjugate in die tandem repeat-Sequenz des epithelialen Mucins MUC1 eingebaut, die als potentielle Kandidaten neuer Antitumorvakzine eingesetzt werden können.

Fri, 26 Jun 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18403/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18403/1/Hettstedt_Christina.pdf Hettstedt, Christina ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Gestationsdiabetes mellitus (GDM) ist eine erstmalig in der Schwangerschaft aufgetretene oder diagnostizierte Glukosetoleranzstörung, die 3-8% aller Schwangerschaften betrifft (Metzger et al. 1998). Pathophysiologisch besteht eine große Ähnlichkeit zwischen GDM und Diabetes mellitus Typ 2, die genauen Mechanismen sind aber noch nicht bekannt (Metzger et al. 2007). Die Diagnose eines GDM bringt für Mutter und Kind verschiedene akute und langfristige Komplikationen mit sich. Veränderungen in der Plazenta mit ihren wichtigen metabolischen, endokrinen und immunologischen Funktionen während der Schwangerschaft (Gätje et al. 2011; Gude et al. 2004), könnten dabei eine wichtige Rolle spielen. Ziel dieser Studie war es daher, Expressionsveränderungen verschiedener wichtiger Rezeptoren, darunter nicht-steroidale Kernrezeptoren, wie der Vitamin D-Rezeptor (VDR), Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ) sowie die Estrogen-Rezeptoren α und β (ERα und β)und Human leukocyte antigen-G (HLA-G), in der Plazenta bei GDM zu untersuchen, um dadurch die pathophysiologischen Vorgänge in der Plazenta bei GDM besser verstehen zu können. Für diese Studie wurden die Plazenten von 40 Patientinnen mit GDM und von 40 gesunden Frauen verwendet. Beide Gruppen enthielten jeweils 20 Plazenten von männlichen Feten und 20 von weiblichen. Zunächst wurde die Expression der einzelnen Rezeptoren mittels immunhistochemischen Färbungen untersucht. Signifikante Unterschiede in der Expression einzelner Rezeptoren wurden mit Hilfe weiterer Methoden, wie Doppelimmunfluoreszenz, qRT-PCR, Zellkultur oder rt-MSP bestätigt. In unserer Studie konnten wir zeigen, dass bei GDM eine gesteigerte Expression von VDR vorliegt. Im Gegensatz zum VDR fanden wir eine Inhibition der PPARγ-Expression bei GDM. Mit Hilfe unserer in vitro-Versuche konnten wir zusätzlich die konzentrationsabhängige Regulation der Expression von VDR und PPARγ durch ihre Liganden belegen. Bei GDM lag weiterhin eine erhöhte Expression von ERα vor. Zudem konnten wir zeigen, dass der ERα-Promotor in GDM-Plazenten demethyliert vorliegt. GDM positive Plazenten wiesen zudem eine verminderte Expression von ERβ und HLA-G auf. Abschließend konnten wir für den VDR und ERβ geschlechtsspezifische Unterschiede in der Kontrollgruppe identifizieren: Die Plazenten männlicher Feten exprimierten mehr VDR bzw. ERβ als die der weiblichen. Die besonders ausgeprägten Expressionsveränderungen im EVT an der maternalen-fetalen Grenzzone könnten dafür sprechen, dass diese Teil der Regulation der Immunantwort und der Insulinresistenz in GDM-Plazenten sind. Weiterhin scheinen die Expressionsveränderungen einiger Rezeptoren eine Folge der bei GDM veränderten Konzentrationen bzw. Zusammensetzung der Liganden zu sein. Unsere Studie liefert wichtige Vorkenntnisse, um mit Hilfe klinischer Studien die allgemeinen Empfehlungen zur Nahrungszusammensetzung und Supplementation in der Schwangerschaft zu klären.

Thu, 20 Mar 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16893/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16893/1/Bauer_Helen.pdf Bauer, Helen

Harald Engelhardt beschrijft het ontwerp en de synthese van verschillende liganden voor de histamine H4-receptor. De ontwikkelde verbindingen kunnen helpen te bevestigen dat de histamine H4-receptor een mogelijk aangrijpingspunt is voor ziekten als astma en reuma, waarbij ontstekingen en immuniteit een belangrijke rol spelen. Verder kunnen in de toekomst nieuwe H4-liganden efficiënter worden ontworpen.Spreker: H.A. Engelhardt. Promotor: prof.dr. R. Leurs, prof.dr. E.E.J. Haaksma, dr. I.J.P. de Esch Faculteit: Faculteit der Exacte Wetenschappen. Datum, tijd: 18-12-2013

Harald Engelhardt beschrijft het ontwerp en de synthese van verschillende liganden voor de histamine H4-receptor. De ontwikkelde verbindingen kunnen helpen te bevestigen dat de histamine H4-receptor een mogelijk aangrijpingspunt is voor ziekten als astma en reuma, waarbij ontstekingen en immuniteit een belangrijke rol spelen. Verder kunnen in de toekomst nieuwe H4-liganden efficiënter worden ontworpen.Spreker: H.A. Engelhardt. Promotor: prof.dr. R. Leurs, prof.dr. E.E.J. Haaksma, dr. I.J.P. de Esch Faculteit: Faculteit der Exacte Wetenschappen. Datum, tijd: 18-12-2013

Der humane Mas-related gene X1 (hMrgX1)-Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der selektiv in nozizeptiven Spinalganglienneuronen exprimiert wird. Eine spezifische Aktivierung des Rezeptors durch das Proenkephalin-Spaltprodukt BAM8-22 (bovine adrenal medulla 8-22) wird als schmerzhaft wahrgenommen. Damit stellt der hMrgX1-Rezeptor eine neue molekulare Zielstruktur für eine potentiell nebenwirkungsarme, analgetische Therapie dar. Trotz dieses Potentials sind die pro-algetischen Signalwege des hMrgX1-Rezeptors bislang nicht verstanden. Der MrgX1-Rezeptor entwickelte sich unter hohem positivem Selektionsdruck und kommt nur in Primaten vor. Trotzdem wurden die nicht-homologen MrgC-Rezeptoren der Nagetiere zur Analyse des hMrgX1-Rezeptors verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher zunächst vergleichende Ligandenprofile des hMrgX1- und der MrgC-Rezeptoren aus Maus und Ratte erstellt. Dabei wurden deutliche Unterschiede offensichtlich, da der hMrgX1-Rezeptor exklusiv von BAM8-22 aktiviert wurde, während die MrgC-Rezeptoren durch weitere Liganden, u. a. Spaltprodukte des Proopiomelanocortins, z. T. sogar effizienter aktiviert wurden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die MrgC-vermittelte Ca2+-Mobilisation auf Grund einer β-Arrestin-abhängigen Rezeptorendozytose deutlich desensitisierte, während der hMrgX1-Rezeptor resistent gegenüber dieser Liganden-induzierten Regulation war. Daher können die MrgC-Rezeptoren der Nagetiere nicht als Modellsytem für den hMrgX1-Rezeptor verwendet werden, so dass in dieser Arbeit weiterführend Signalwege des hMrgX1-Rezeptors in Spinalganglienneuronen-ähnlichen F11-Zellen und primären Spinalganglienneuronen untersucht wurden. Dabei zeigte sich eine duale funktionelle Regulation des etablierten pro-algetischen TRPV1 (transient receptor potential cation channel vanilloid 1)-Ionenkanals. Zum einen sensitisierte der hMrgX1-Rezeptor den TRPV1 über einen etablierten, Proteinkinase C-abhängigen Signalweg. Zum anderen zeigte sich eine direkte hMrgX1-mediierte Aktivierung des TRPV1. Dieser Regulationsmechanismus wurde durch eine Phospholipase C (PLC)-β-induzierte Produktion des endogenen TRPV1-Liganden Diacylglycerol und durch die Degradation des tonisch TRPV1-inhibierenden PLC-β-Substrates Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat vermittelt. Neben der TRPV1-Modulation induzierte der hMrgX1-Rezeptor die Expression verschiedener Gene, deren zentrale Bedeutung bei der inflammatorischen und neuropathischen Schmerzchronifizierung etabliert ist. Einerseits wurde eine hMrgX1-induzierte Phosphorylierung der extracellular signal-regulated kinases 1/2 beobachtet, die in einer Aktivierung von serum response factor-abhängigen Reportergenkonstrukten und in der Induktion von c-Fos auf mRNA- und von early growth response protein 1 auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Andererseits zeigte sich die transkriptionelle Ca2+/Calcineurin-abhängige Aktivierung des nuclear factor of activated t cells, die in der Induktion des CCR2 (chemokine receptor 2) auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Somit konnte erstmalig ein physiologischer Induktor des CCR2 in Spinalganglienneuronen beschrieben werden. Weiterhin wurde nach der Etablierung der endogenen Proteinexpression des hMrgX1-Rezeptors in LAD2-Mastzellen eine BAM8-22-induzierte Freisetzung des CCR2-Agonisten chemokine ligand 2 ermittelt, so dass der hMrgX1-Rezeptor die parakrine Stimulation von nozizeptiven Spinalganglienneuronen durch Mastzellen fördern könnte. Diese Dissertation trägt somit zum besseren molekularen Verständnis akuter und chronischer pro-algetischer Funktionen des hMrgX1-Rezeptors bei und könnte damit die Entwicklung neuer analgetischer Wirkstoffe ermöglichen.

Ein bislang nur wenig verstandenes chemo¬sensorisches Zellsystem stellen Spermien dar, die im weib¬lichen Genital¬trakt komplexe Gemische ganz verschiedener Liganden wahr-nehmen müssen, um ihre für eine erfolgreiche Befruchtung essentiellen Aufgaben erfüllen zu können. Dazu gehören u. a. ein sekundärer Reifungsprozess (Kapazitierung), die Weg¬findung zur Eizelle im Eileiter und die Akrosom¬reaktion zur enzymatischen Auflösung der Glyko¬protein¬matrix (Zona pellucida) der Oocyte. Die Sensor¬moleküle auf der Oberfläche des Spermiums, die eine Erkennung bestehender Konzentrations-gradienten von Amino¬säuren, Kohlen¬hydraten, Hormonen, von verschiedensten Ionen und Protonen im luminalen Milieu des weiblichen Genital¬trakts sowie der Kohlenhydrat-reichen Zona pellucida ermöglichen, sind jedoch trotz ihrer Bedeutung für eine erfolgreiche Fertilisation weitgehend unbekannt. Geschmacks¬rezeptoren repräsentieren spezialisierte Erkennungs¬moleküle, die in Sinnes-zellen der Zunge die präzise Detektion eines breiten Spektrums chemisch sehr diverser Geschmacks¬stoffe ermöglichen, welche auffällige Ähnlichkeiten mit den potentiellen Liganden in der wässrigen Umgebung von Spermien im weiblichen Genital¬trakt aufweisen. Interessanterweise werden diese Rezeptorproteine aber nicht nur in Geschmacks¬sinneszellen, sondern auch in chemosensorischen Zellen einer Vielzahl extra-oraler Gewebe exprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb mit Hilfe biochemischer, molekular- und zell-biologischer Techniken sowie mit reproduktions¬biologischen Methoden und unter Verwendung Geschmacks¬rezeptor-defizienter Mäuse der Frage nachgegangen, ob Rezeptor¬moleküle des Geschmacks¬systems als Kandidaten für chemische Sensor-moleküle von Spermien in Betracht kommen. Dabei wurde ein Detektions¬molekül für saure Geschmacksstoffe, der PKD2L1, immun-cyto¬chemisch im Hoden der Maus und in reifen murinen Spermien nach¬gewiesen. Funktionell könnte dieser im Flagellum von Spermien exprimierte Ionenkanal an der Registrierung der verschiedenen Protonen¬konzentrationen im Milieu des weib¬lichen Genital¬trakts beteiligt sein. Weiterhin konnte eine Expression von gustatorischen GPCRs der Tas1r-Familie (süß/umami) und Tas2r-Familie (bitter), in männ¬lichen Reproduktions¬organen und in reifen Spermien gezeigt werden. Zudem wurden Hinweise auf die Expression der gustatorischen G Protein α Untereinheit Gustducin, die in Geschmacks¬sinnes¬zellen an der Signal¬transduktion dieser beiden Rezeptor¬familien beteiligt ist, im männlichen Reproduktions¬system erbracht. Im Einzelnen konnten mit der RT-PCR-Technik Transkripte von 28 der insgesamt 35 Mitglieder der großen Familie der murinen Bitter¬rezeptoren (Tas2rs) aus Hoden-gewebe amplifiziert werden. Die Bedeutung der Expression von Bitter¬rezeptoren für die Reproduktion wurde exemplarisch anhand einer Gen-defizienten Maus für den Tas2r131 unter¬sucht. Bei dieser Knockin-Maus¬linie war die kodierende Rezeptor¬sequenz durch eine GFP-Expressions¬kassette ersetzt worden, so dass das Maus¬modell gleich-zeitig auch eine Bestätigung der Expression des Tas2r131 in späten Keim¬zell¬stadien der Spermato¬genese ermöglichte. Bei der Fertilitätsanalyse Tas2r131-defizienter Tiere waren unter Labor-Zucht¬bedingungen keine Veränderungen in der Anzahl der Nach¬kommen pro Wurf oder der Zeitspanne zwischen den Würfen feststellbar. Allerdings wiesen Tas2r131-defiziente Männ¬chen signifikant mehr epididymale Spermien auf als Wildtyp-Tiere. Darüber hinaus war bei Verpaarungs¬studien mit hetero¬zygoten Männchen eine Genotyp-Verschiebung zugunsten des Tas2r131 [-] Allels zu registrieren. Dieser Phänotyp könnte darauf hindeuten, dass der Tas2r131 eine funktionelle Rolle bei Tas2r-abhängigen Auswahlprozessen verschiedener Spermien¬populationen spielt, bei denen sich z. B. durch eine Regulation der Apoptose im Verlauf der Keimzell¬bildung (Spermatogenese) oder auch durch eine Beeinflussung z. B. der Weg¬findung im weiblichen Genitaltrakt ein Selektions¬vorteil für Tas2r131-defiziente Spermien ergeben könnte. Aus der Familie der Tas1-Rezeptoren, deren drei Mitglieder als Heterodimere für die Erkennung von süßen Stimuli und dem Geschmack von Mononatrium¬glutamat („umami“) verant¬wort¬lich sind, konnten in RT-PCR-Experimenten die beiden Unter-einheiten des Umami-Rezeptors, der Tas1r1 und Tas1r3, aus Hodengewebe der Maus amplifiziert werden. Mit Hilfe Subtyp- und Spezies-spezifischer Antikörper konnte gezeigt werden, dass beide Rezeptor¬proteine im Akrosom und in distinkten Abschnitten des Flagellums von murinen und humanen Spermien exprimiert werden. Die funktionelle Rolle des Umami-Rezeptors wurde mit Hilfe einer Tas1r1-defizienten mCherry Reportermauslinie unter¬sucht, die unter optimalen Zuchtbedingungen ebenfalls keine Fertilitäts¬einschränkungen erkennen ließ. Im Hoden dieser Tas1r1-defizienten Tiere waren jedoch morpho¬logische Veränderungen des Keim¬epithels und eine signifikant erhöhte Apoptose¬rate zu registrieren, die allerdings keine verminderte Anzahl reifer Spermien oder Störungen der Morphologie oder Motilität dieser Zellen zur Folge hatte. Stimulierungsexperimente mit isolierter Zona pellucida, dem physiologischen Auslöser der Akrosomreaktion, haben zudem gezeigt, dass keine Ein¬schränkungen bei Spermien Tas1r1-defizienter Tiere fest¬zustellen waren. Allerdings wiesen Tas1r1-defiziente Spermien eine signifikant höhere Rate an spontaner Akrosom¬reaktion auf, die in unkapazitierten Zellen mit signifikant erhöhten basalen Konzentrationen der second messenger cAMP und Ca2+ einherging. Durch eine Reduzierung der intra¬zellulären Konzentrationen dieser Botenstoffe, die elementare Aufgaben des Spermiums im Verlauf des sequentiellen Prozesses der Fertilisation regulieren, könnten Tas1-Rezeptoren somit durch eine basale Rezeptor-aktivität oder durch eine Liganden-induzierte Rezeptor¬stimulation sicherstellen, dass Spermien im weiblichen Genitaltrakt in einem Ruhezustand erhalten werden, bevor sie in Kontakt mit der Eizelle kommen können. Insgesamt kann dieser Nachweis einer funktionellen Expression von Geschmacks-rezeptoren in Spermien zu einem besseren Verständnis der Regulations¬mechanismen zentraler Spermien¬funktionen beitragen und langfristig möglicherweise auch repro-duktions¬medizinische Perspektiven zur gezielten positiven bzw. negativen Manipulation von Spermien und damit zur Behandlung männlicher Infertilität bzw. zur Entwicklung nicht-hormoneller Verhütungsmittel für den Mann eröffnen.

Etwa 25-50% der Frauen im reproduktionsfähigen Alter erleiden in ihrem Leben einen spontanen Abort und 2-3% der Frauen rezidivierende Aborte [1]. Ein Großteil der Aborte bleiben weiterhin ungeklärt [4]. Folglich besteht ein essentieller Forschungsbedarf in der Ursachenerkundung und Prävention von Aborten. Die Rezeptoren Retinoid-X-Rezeptor α (RXRα) und Leptin Rezeptor (ObR) spielen eine Rolle in der plazentaren und fetalen Entwicklung. In vorherigen Studien konnte die Arbeitsgruppe von Toth und Jeschke et al. (2008 und 2009) zeigen, dass die Expression von RXRα und ObR jeweils in villösen- (VT) und extravillösen Trophoblasten (EVT) erhöht ist. In einer weiteren Studie konnte eine vermehrte Anzahl an apoptotischen EVT in Aborten festgestellt werden [191]. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der (patho-) physiologischen Rolle der Rezeptoren RXRα und ObR in Aborten mit speziellem Fokus auf apoptotische Prozesse. Dazu dienten Stimulationsversuche, in denen humane villöse Trophoblasten und Trophoblast-Modellzellen mit Retinsäuren und einem Prostaglandin-Derivat inkubiert wurden und deren Einfluss auf die RXRα und ObR Expression in den Zelllinien untersucht wurde. Des Weiteren wurde die Expression der Rezeptoren zusammen mit einem Marker für Apoptose in Abortplazenten detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Substanzen zu einer Abnahme der RXRα Expression in Trophoblast- und Trophoblastmodellzellen führen. Da Abortplazenten eine erhöhte RXRα Expression aufweisen und mit einer vermehrten Anzahl an apoptotischen EVT assoziiert werden, dient die Liganden-abhängige Reduktion der RXRα Expression durch die Substanzen vermutlich als Schutz vor einem apoptotischen Zustand bzw. vor einem Abort. RXRα stellt einen potentiellen Zielrezeptor in der Prävention von Aborten dar. Die ObR Expression in Trophoblastmodellzellen wurde durch die Retinsäure erhöht. Die Zunahme der ObR Expression kann als eine potentielle Reaktion auf ein vermindertes Leptin Angebot im Abort gedeutet werden. Weiterhin konnte eine Co-Expression des Apoptosemarkers mit RXRα bzw. ObR in EVT von Abortplazenten beobachtet werden. Als Ergebnis sind die vorliegenden Erkenntnisse nicht nur für das Verständnis über die Regulation der Rezeptoren im Abortprozess, sondern auch für den physiologischen Schwangerschaftsverlauf von zentraler Bedeutung.

Urocortine (Ucn) gehören zur Familie des Corticotropin-Releasing-Hormons und sind wichtige Modulatoren der Stressantwort, der Angstkontrolle und der assoziierten Erkrankungen, wie z. B. der Depression. Während Ucn1 mit gleicher Affinität an den CRF1- und CRF2-Rezeptor bindet, sind Ucn2 und Ucn3 spezifische Liganden für den CRF2-Rezeptor. Zusätzlich zum Zentralen Nervensystem sind Urocortine in verschiedenen peripheren Organen exprimiert – so auch in der Nebenniere. Mit Hilfe sechs verschiedener Knock-out Modelle, in denen Urocortine in unterschiedlichen Kombinationen deletiert wurden, wurden potentielle Urocortin-abhängige Effekte auf die Nebenniere der Maus untersucht. Dabei wurde mit Hilfe von HE-Färbungen die Struktur, mit Färbungen gegen PCNA als Proliferationsmarker die Zellteilungen und mit RT-PCR die Expressionslevel wichtiger Schlüsselenzyme der Steroidbiosynthese und der Katecholaminsynthese ermittelt. Während in Single KO Mäusen nur geringe Effekte detektierbar waren, zeigten sich in Double und Triple KO Mäuse im Vergleich zu Wildtyp Mäusen ausgeprägte Änderungen der untersuchten Parameter, so dass eine funktionelle Redundanz innerhalb der Urocortine vermutet werden kann. Um die spezifische Wirkung einer organspezifischen Überexpression von Ucn2 zu untersuchen, wurden Mäuse auf der Basis des Cre-Lox-Systems gezüchtet, die abhängig vom Promotor des Steroidogenic Factor 1-Gens (SF1), d. h. vor allem in der Nebenniere und in den Gonaden, Ucn2 überexprimieren (Ucn2 OE Mäuse mit dem Genotyp R26+/stopUcn2 SF1-Cre+/-). Zusätzlich zu den oben genannten Messungen wurden Hormonkonzentrationen im Plasma unter Basal-Bedingungen, nach einem ACTH-Stimulationstest und nach einem Restraint-Stress-Test bestimmt. Es zeigte sich, dass die Überexpression von Ucn2 mit einer erniedrigten Steroidbiosynthese in der Nebenniere assoziiert ist. Zudem konnten geschlechtsspezifische Unterschiede beobachtet werden – so zeigten weibliche Ucn2 OE Mäuse vor allem Änderungen unter Basal-Bedingungen und nach ACTH-Stimulation, wobei bei männlichen Tieren nur nach Restraint-Stress eine reduzierte Stressantwort im Vergleich zu den Kontrolltieren auftrat. Zusammenfassend kann aus diesen in vivo Studien der Schluss gezogen werden, dass ein intraadrenales Regulationssystem existiert, das durch die Balance aller Urocortine und deren Rezeptoren geschlechtsspezifisch die Struktur und Funktion der Nebenniere beeinflusst.

Thu, 31 Jan 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15657/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15657/1/Summo_Claudia.pdf Summo, Claudia

Thu, 29 Nov 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15100/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15100/1/Hamm_Wolfgang.pdf Hamm, Wolfgang ddc:610, ddc:600, Med

Die Stimulation von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems ist ein etabliertes immunologisches Verfahren zur Tumortherapie, das im Rahmen des von uns untersuchten subkutanen C26 Tumors bei Verwendung von CpG und poly(I:C) zur Tumorreduktion führte. Gleichzeitig konnten wir jedoch im Rahmen der experimentellen Tumortherapie mit CpG und poly(I:C) die Expansion von immunsuppressiv wirksamen myeloischen Suppressorzellen (MDSCs) nachweisen. Der Erfolg einer das Immunsystem aktivierenden Tumortherapie und die Zunahme der definitionsgemäß suppressiv wirkenden MDSCs unter dieser Therapie erschienen als Widerspruch. Im Zentrum der vorliegenden Dissertation stand die nähere Untersuchung dieses Gegensatzes. Es gelang der Nachweis, dass unter Verwendung von CpG und poly(I:C) zur C26-Tumortherapie die immunsuppressive Aktivität der MDSCs negativ beeinflusst wurde. Erstmalig wurde somit nachgewiesen, dass mit dem Effekt dieser Therapie eine negative Beeinflussung der immunsuppressiven MDSC-Funktion einhergeht. Ein besonderes Augenmerk lag darüber hinaus auf der differenzierenden Betrachtung der heterogenen Zellpopulation der MDSCs. Wir konnten im C26-Tumormodell eine unterschiedliche immunsuppressive Potenz der beiden MDSC-Subpopulationen beobachten. Durchgehend wiesen wir für PMN-MDSCs (polymorphonuclear MDSCs) eine stärkere suppressive Aktivität als für MO-MDSCs (Monocyte-like MDSCs) nach. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen dazu bei, ein besseres Verständnis der antitumoralen Immuntherapie zu entwickeln. Dies ist wichtig, da der klinischen Anwendung entsprechender Therapieschemata oft Formen tumoralen Escapes gegenüberstehen. Mit dem Nachweis der Beteiligung von MDSCs an der Wirkung von den Liganden des angeborenen Immunsystems CpG und poly(I:C) wurde ein Mechanismus aufgezeigt, der im Rahmen einer Weiterentwicklung der immunologischen Tumortherapie als Ansatzpunkt dienen kann. Des Weiteren unterstrichen unsere Ergebnisse zum Verhalten der MDSC-Subpopulationen unter immunologischer Therapie des C26-Tumors, dass es zielführend wäre, der Heterogenität der MDSCs durch eine getrennte Betrachtung der beschriebenen Subpopulationen Beachtung zu schenken.

Genregulation gibt der Zelle die Kontrolle über Struktur und Funktion, und ist die Basis für zelluläre Differenzierung, Morphogenese und die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit von jedem Organismus. Um zu begreifen, wie eine Zelle ihre Funktion organisiert und wie sich ganz individuelle Organismen ausbilden, obwohl die gleichen genetischen Informationen vorhanden sind, muss man die Regulation der Genexpression im Detail verstehen. Diese Regulation wirkt an verschiedenen Stellen der Genexpression und besteht aus einer Vielzahl von komplexen Prozessen, die untereinander verbunden sind. Somit ist das Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und ihres Zusammenspiels für Biologie und Biophysik von großer Bedeutung. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von Wechselwirkungen und Wechselwirkungskräften zwischen Biomolekülen, die an der Genregulation und der Epigenetik, auf der Ebene der Transkription beteiligt sind. Insbesondere konnten Protein-DNA-Wechselwirkungen und der Einfluss epigenetischer DNA-Modifikationen quantifiziert werden. Für die Messungen wurde ein molekularer Kraftsensor und als dessen Erweiterung ein molekularer Analog-Digital-Wandler entwickelt. Diese molekularen Sensoren ermöglichen die direkte Messung der Wechsel- wirkungskräfte zwischen DNA und Liganden. Mit dem molekularen Kraftsensor können außerdem hochparallel Messungen durchgeführt werden, wobei durch den symmetrischen, molekularen Aufbau zudem eine sehr hohe Sensitivität erreicht wird. Die Verwendung dieser Methode ermöglichte es, den Einfluss der epigenetisch modifizierten Basen Methylcytosin und Hydroxymethylcytosin („5. und 6. Base der DNA“) auf die mechanische Stabilität der DNA- Doppelhelix zu untersuchen. Es wird gezeigt, dass mit dem aus DNA-Oligomeren aufgebauten molekularen Kraftsensor Protein-DNA-Wechselwirkungen detektiert und deren Dissoziationskonstanten bestimmt werden können. Unter anderem wird die Wechselwirkung der Endonuklease EcoRI mit ihrer DNA- Erkennungssequenz quantifiziert. Hierfür wurden molekulare Kraftsensoren in Zipper- und Scher-Geometrie entworfen. Bei dem neu entwickelten Aufbau des Kraftsensors mit integriertem Förster-Resonanzenergietransfer-Farbstoffpaar genügt schon eine Fläche von 25 !m2, um die Stärke von Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmen zu können. Diese Fläche liegt deutlich unterhalb der Messfleckgröße aktueller DNA-Mikroarrays. Damit erfüllt der molekulare Kraftsensor bezüglich der Messfleckdichte die Voraussetzung für moderne Hochdurchsatz- Methoden. In einem zweiten Schritt wird der molekulare Kraftsensor zu einem „molekularen Analog- Digital-Wandler“ erweitert. In Analogie zum elektronischen Flash-Analog-Digital-Wandler, bei dem mehrere Komparatoren mit unterschiedlichen Referenzschaltungen parallel geschaltet sind, werden beim molekularen Analog-Digital-Wandler parallel räumlich getrennte, molekulare Kraftsensoren mit unterschiedlich stabilen Referenz-Wechselwirkungen zur Bestimmung einer unbekannten molekularen Wechselwirkung verwendet. Durch eine Kompensationsmessung wird dann die Kraft von Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmt. Es werden die Wechsel- wirkungen eines Pyrrol-Imidazol Hairpin-Polyamides, der Endonuklease EcoRI und des Transkriptionsfaktors p53 zur jeweiligen DNA-Erkennungssequenz vermessen. Eine hoch- parallele Version mit Messfleckgrößen mit einem Durchmesser von minimal 15 !m konnte realisiert werden. Abgeleitet vom Bell-Evans-Modell wurde ein analytisches Modell zur Beschreibung des molekularen Analog-Digital-Wandlers entwickelt. Neben den Protein-DNA-Wechselwirkungen werden die epigenetisch modifizierten DNA- Basen Methylcytosin (mC) und Hydroxymethylcytosin (hmC) untersucht. Es wird der Nachweis erbracht, dass sich die mechanische Stabilität der DNA-Doppelhelix bei Separation in zwei Einzelstränge in beiden Fällen signifikant um mehrere Pikonewton ändert. Die Stärke des Effekts ist abhängig von der DNA-Sequenz und der Richtung der angelegten Kraft. Durch Einzelmolekül-Kraftspektroskopie wird eine Reduzierung der Potentialweite durch mC aufgezeigt. Außerdem konnte mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen der Effekt für mC und teilweise auch für hmC auf molekularer Ebene aufgeklärt werden. Es wird ein Modell entwickelt, das erklärt, wie dieser Effekt einen Einfluss auf die Genregulation ausüben kann.

Der TNF-verwandte Apoptose induzierende Ligand TRAIL ist in der Lage, spezifisch Apoptose in Tumorzellen zu induzieren ohne normales Gewebe zu schädigen und gilt deswegen als vielversprechender Kandidat für den Einsatz in der Tumortherapie. Neben der Induktion von Apoptose ist TRAIL allerdings auch in der Lage den Transkriptionsfaktor NF-κB („nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells") zu aktivieren, was wiederum die Induktion von Zelltod durch TRAIL vermindert. Für die Tumortherapie wäre es daher wünschenswert, durch TRAIL selektiv den Apoptosesignalweg und nicht NF-κB zu aktivieren. Dazu ist ein Verständnis beider Signalwege unerlässlich. Im Gegensatz zum Signalweg der TRAIL-induzierten Apoptose ist der Signalweg der TRAIL-induzierten Aktivierung von NF-κB aber bisher wenig erforscht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, das rezeptornahe Adaptorprotein und die ersten, rezeptornahen Signalschritte der NF-κB Aktivierung durch TRAIL zu identifizieren. Die Überexpression konstitutiv aktiver Fusionsproteine der beiden TRAIL-Rezeptoren 1 und 2 war in der Lage, NF-κB zu aktivieren. Fusionsproteine mit verkürztem C-Terminus, der die Apoptose-vermittelnde Todesdomäne enthält, waren dabei nicht im Stande den Signalweg zu aktivieren. Dadurch konnte die entscheidende Funktion der Todesdomäne für TR1 und TR2 bei der Induktion von NF-κB gezeigt werden. Um Untersuchungen des TRAIL-Signalweges mit dem Liganden durchführen zu können, wurde die bakterielle Produktion und Aufreinigung von rekombinantem humanem TRAIL, sowie einem hochaktiven ILZ (Isoleucin Zipper)-TRAIL und einer inaktiven Kontrollvariante etabliert. Die Untersuchung von FADD („fas associated death domain“)-defizienten JURKAT-Zellen, zeigte, dass diese nicht in der Lage waren, NF-κB auf TRAIL zu aktivieren. Die transiente und auch stabile Reexpression von FADD stellte dabei die Aktivierbarkeit von NF-κB durch TRAIL wieder her. Somit konnte FADD als Adaptorprotein für die TRAIL-induzierte Aktivierung von NF-κB identifiziert werden. Die Expression von FADD-Varianten mit je zwei Punktmutationen in der Todeseffektordomäne war hingegen nicht in der Lage, TRAIL-induzierte Aktivierung von NF-κB wiederherzustellen, was auf die Notwendigkeit der Multimerisierung von FADD hinweist. Des Weiteren aktivierten auch JURKAT-Zellen, die defizient für Caspase 8 („cysteinyl-aspartate specific protease 8“) waren, den TRAIL-induzierten NF-κB-Signalweg nicht. Auch die Verminderung der Expression von Caspase 8 in HEK 293T führte zu einer verminderten NF-κB Aktivierung durch die Überexpression des konstitutiv aktiven Fusionsproteins des TRAIL-Rezeptors 2. Im Rahmen dieser Arbeit war es somit gelungen, die Todesdomäne der TRAIL-Rezeptoren 1 und 2, das Adaptorprotein FADD mit seiner Todeseffektordomäne und wahrscheinlich Caspase 8 als rezeptornahe Signalschritte der TRAIL-induzierten Aktivierung von NF-κB zu identifizieren. Folglich sind die Signalwege von Apoptose und Aktivierung von NF-κB durch TRAIL im rezeptornahen Signalweg identisch. Damit ist es nicht möglich, an Hand der gezielten Aktivierung der rezeptornahen Signalschritte TRAIL-induzierte Apoptose selektiv zu aktivieren. Hierzu muss eine Untersuchung weiterer distaler Signalschritte erfolgen.

Die bovine neonatale Panzytopenie (BNP) ist ein seit 2006 auftretendes Krankheitsbild mit hoher Mortalität, bei dem neugeborene Kälber an einer hämorrhagischen Diathese aufgrund einer Panmyelophthise erkranken. Vielfältige mikrobiologisch-diagnostische Untersuchungen ergaben, wie bei anderen Arbeitsgruppen auch, keinen Hinweis auf ein infektiöses Geschehen in Zusammenhang mit BNP. IgG wurde, neben anderen Proteinen, aus Kolostrumproben von BNP- und Kontrollmüttern gereinigt, identifiziert und quantifiziert. In anschließenden Versuchen konnte eine signifikant höhere Bindung von IgG aus BNP-Kolostrum (IgGBNP) im Vergleich zu IgG aus Kontrollkolostrum (IgGKontr) an die peripheren Leukozyten genetisch nicht verwandter, junger Kälber nachgewiesen werden. Dabei war eine Bindung sowohl an Granulozyten, als auch an die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) nachweisbar, wobei die Bindung an die PBMC-Population signifikant höher war. Zudem wurde eine signifikante Bindung von IgGBNP an die bovinen Zelllinien MDBK und BK-KL3A nachgewiesen. Eine Bindung an die porzine Zelllinie PK15 war nicht festzustellen. Die mögliche Toxizität von kolostralen Proteinen und von Serumproben, die von durch BNP betroffenen Kälbern und den Mutterkühen gewonnen wurden, wurde in verschiedenen Ansätzen mit oder ohne Komplementzusatz mit peripheren Leukozyten gesunder Kälber getestet. Es war weder ein Einfluss auf die Zellvitalität, noch ein Unterschied zwischen BNP- und Kontrollproben festzustellen. Da ein Zusammenhang von BNP mit dem, mittlerweile vom europäischen Markt genommenen, Impfstoff PregSure-BVD® (Pfizer) gegen die bovine Virusdiarrhö diskutiert wird, wurden Versuche zur Reduktion der Bindung von IgGBNP an die Leukozyten neugeborener Kälber mit Viruszellkulturernten verschiedener Pestiviren und den dazugehörigen Zellüberständen durchgeführt. Eine Vorinkubation von IgGBNP mit Zellkulturernten des, in MDBK-Zellen vermehrten, bovinen Virusdiarrhövirus (BVDV) und des, ebenfalls in MDBK-Zellen vermehrten, Border Disease Virus (BDV) ergab eine signifikante Reduktion der Bindung an die Leukozyten im Vergleich zu den Kontrollen. Interessanterweise war nach Vorinkubation mit Viruszellkulturernte des, in PK15-Zellen vermehrten, verwandten Pestivirus der europäischen Schweinepest (ESPV) keine Reduktion nachweisbar. Sowohl bei den Bindungstests, als auch bei den Reduktionsversuchen war es auffällig, dass dieselben IgGBNP-Proben unter gleichen Bedingungen in unterschiedlich starkem Ausmaß an die Leukozyten verschiedener Spenderkälber gebunden haben. Dies würde die bereits von anderen Arbeitsgruppen vorgeschlagene genetische Prädisposition in Zusammenhang mit der Entwicklung von BNP unterstützen. Erste Versuche zur Charakterisierung der/des Liganden der kolostralen Antikörper durch Versuche zur Reduktion der Bindung durch Vorbehandlung von MDBK-Zellen mit MHC-Klasse I-reaktiven, monoklonalen Antikörpern erbrachten keine eindeutigen Ergebnisse. Die Ergebnisse sprechen für einen oder mehrere wiederkäuerspezifische Zellliganden von IgGBNP, die entweder mit den Pestiviren BVDV und BDV assoziiert sind oder aber, hinsichtlich der Bindung an MDBK- und BK-KL3A-Zellen, auch mit Zellfragmenten aus der Produzentenzelllinie des Impfvirus in Verbindung stehen. Ein Zusammenhang mit dem Einsatz des BVDV-Impfstoffes PregSure-BVD® (Pfizer) erscheint möglich, da Impfstoffkomponenten die Bildung der leukozytenreaktiven IgG-Alloantikörper verursacht haben könnten. Ergänzend könnte eine genetische Prädisposition eine wichtige Rolle in der Entwicklung von BNP spielen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung der Farnesyltransferase-Inhibitoren hinsichtlich der antitumorösen Wirkung auf gastrointestinale Tumore in verschiedenen in vitro Experimenten untersucht. Als Marker für die therapeutische Wirkung wurde die Induktion der Apoptose gewählt. Durchgeführt wurden unsere Versuche mit den Zelllinien HepG2, gewonnen aus einem hepatozellulären Karzinom, sowie HT29, einem kolorektalen Adenokarzinom, unter Verwendung von BMS-214662 und SCH66336 als Vertreter der Farnesyltransferase-Inhibitoren. Diese werden derzeit in klinischen Studien getestet. BMS-214662 befindet sich in Phase II, im Rahmen von SCH66336 sind bereits Phase III Studien abgeschlossen worden. Anhand von Apoptose-Assays waren wir in der Lage einen antitumorösen Effekt durch Induktion der Apoptose aufzuzeigen. Hierbei war die Apoptose-Auslösung dosisabhängig von dem verwendeten Farnesyltransferase-Inhibitor. Im Gegensatz zu SCH66336 induzierte BMS-214662 bereits unter Verwendung von 1µM in 24h die Apoptose, wohingegen eine Konzentration von 25µM SCH66336 notwendig war, eine signifikante Apoptose hervorzurufen. Die Induktion der Apoptose war dabei unabhängig von einer Ras-Mutation. Sowohl in den HT29-Zellen mit Mutation des Ras-Proteins, als auch in den mutationsfreien HepG2-Zellen erfolgte ein Anstieg der Apoptoserate. Zusätzlich zeigten wir einen möglichen synergistischen Effekt für den Antikörper anti-APO in Verbindung mit BMS-214662. Mit Hilfe des Western Blots konnte als ein möglicher Induktionsfaktor eine gesteigerte Rekrutierung der Caspase 8 dargestellt werden. Dies bestätigte sich durch eine messbare Erhöhung der Caspase 3, welche durch Caspase 8 aktiviert wird und den apoptotischen Tod der Zelle hervorruft. Insgesamt läuft der Mechanismus Rezeptor- bzw. Liganden-unabhängig ab, da in der durchgeführten rt-PCR weder vermehrt CD95-Rezeptor bzw. dessen Ligand nachgewiesen werden konnte.

Cetuximab ist ein monoklonaler Antikörper, der zunehmend in der Krebstherapie eingesetzt wird. Die typischste Nebenwirkung ist ein steriles makulo-papulöses Exanthem, das in vielen Studien positiv mit der Prognose korreliert. Auf die Therapie mit Cetuximab spricht jedoch nur ein begrenzter Anteil der Patienten an. Aufgrund der Nebenwirkungen und der nicht unerheblichen Kosten der Therapie wäre es von Interesse im Vorfeld die Patienten einzugrenzen, die am meisten von der Therapie profitieren. Ein Biomarker, der es erlaubt, vor Beginn der Therapie mit Cetuximab die Wirksamkeit der EGF-Rezeptor Inhibition bei einzelnen Patienten vorherzusagen, war bislang nicht bekannt. Das Exanthem, das in vielen Studien mit der Prognose korreliert, tritt erst einige Tage bis Wochen nach Behandlungsbeginn auf und ist daher als Entscheidungshilfe für oder gegen eine Cetuximab-Therapie ungeeignet. Bei dem Exanthem handelt es sich um eine sterile Entzündung und damit um ein immunologisches Geschehen. So entstand der Ansatz, einen immunologischen Marker zu suchen, der vor Therapiebeginn Aufschluss über die Wirksamkeit von Cetuximab bei unterschiedlichen Patienten geben kann. Für die vorliegende Arbeit wurden bei Cetuximab-behandelten Patienten Subpopulationen von Lymphozyten und dendritischen Zellen in Blut und Haut und antimikrobielle Peptide in der Haut durchflusszytometrisch und immunhistochemisch untersucht und mit gesunden Kontrollpersonen und Patienten unter einer Standard-Chemotherapie verglichen. Diese immunbiologischen Parameter wurden außerdem auf einen Zusammenhang mit Exanthemstärke und dem Therapieansprechen untersucht. Im Rahmen unserer Untersuchungen war es uns möglich, das Cetuximab-induzierte Exanthem näher zu charakterisieren. Das Zellinfiltrat wird epidermal durch immigrierte IDEC und regulatorische T-Zellen, dermal durch T-Helferzellen und Memory-Zellen dominiert. Zusätzlich treten plasmazytoide dendritische Zellen auf. Epidermal ist die Expression von humanem β-Defensin 2 erhöht. Der negative Zusammenhang zwischen der Anzahl dermaler zytotoxischer T-Zellen und dem Schweregrad des Exanthems ist ein Hinweis, dass es sich bei der Genese des Cetuximab-induzierten Exanthems nicht um eine Typ IV Immunreaktion handeln könnte. Unsere Untersuchungen im Blut haben keine Ergebnisse erbracht, die allein auf die Therapie mit Cetuximab zurückzuführen wären und als Biomarker für die biologische Wirksamkeit des Cetuximab verwendet werden könnten. Manche Veränderungen, wie die Induktion der CD11c+CD1a+ myeloiden dendritischen Zellen im Blut, korrelieren mit der Exanthemausprägung und sind auf das generalisierte Cetuximab-induzierte Exanthem zurückzuführen. Ergebnisse anderer Studien, die eine Zunahme der regulatorischen T-Zellen bei Tumorpatienten als negativen prognostischen Faktor etabliert haben, wurden durch unsere Untersuchungen bestätigt. In der Mehrzahl der klinischen Studien korreliert das Auftreten des Exanthems positiv mit der Prognose. Die Untersuchungsergebnisse zum Zusammenhang zwischen Exanthemausprägung und der Überlebensdauer sind hingegen zwiespältig. In unsere Studie wurden ausschließlich Patienten mit Cetuximab-induziertem Exanthem eingeschlossen. Die Ausprägung des Exanthems korrelierte in unseren Unter-suchungen nicht mit dem Tumoransprechen. Nach neueren Untersuchungen kann eine fehlende Korrelation zwischen Hautexanthem und Therapieansprechen auf Cetuximab mit Unterschieden im Dimerisationsstatus und im Dimerisationspartner des EGF-Rezeptors in der Haut und im Tumorgewebe zusammenhängen. Auf Keratinozyten übernehmen mehrheitlich EGF-Rezeptor Homodimere die Liganden-vermittelte Signalweiterleitung, während diese im Tumorgewebe von anderen EGFR-Heterodimeren vermittelt wird. Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen zwischen Exanthemausprägung und dem Tumoransprechen in der Literatur stellen jedoch meist keine Korrelation zwischen Exanthemausprägung und dem Therapieansprechen her. Zusätzlich wurden die von uns erhobenen Daten an einem besonderen Patientenkollektiv erhoben. Ein systematischer Fehler aufgrund der Rekrutierungsbedingungen kann nicht ausgeschlossen werden. Ein Zusammenhang zwischen einem Auftreten des Exanthems und dem Therapieansprechen kann daher aufgrund des hier erhobenen Datenmaterials nicht beurteilt werden, da wir nur Patienten mit bestehendem Exanthem in unsere Studie eingeschlossen haben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die von uns untersuchten immunologischen Parameter keinen neuen prädiktiven Wert für das Auftreten des Exanthems oder das Ansprechen auf Cetuximab erbracht haben. In der Literatur ist neben dem negativen K-Ras-Status bisher kein Biomarker beschrieben, der das Ansprechen auf Cetuximab zuverlässig vorhersagen würde.

Fri, 13 Aug 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12105/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12105/1/Wirth_Stefan.pdf Wirth, Stefan ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie un

Fri, 18 Jun 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14678/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14678/1/Zurawski_Alexander.pdf Zurawski, Alexander

Während der Tumorangiogenese werden neue, tumorspezifische Blutgefäße gebildet. Bei diesem Prozess wird unter anderem der Hauptbestandteil der Basalmembran das Kollagen IV durch die Matrix-Metalloproteasen (MMP) 2 und 9 enzymatisch gespalten. Dabei werden bisher verborgene Bereiche der Kollagen IV α-Stränge freigelegt, welche Endothelzellen als Migrationssignale dienen. Diese als kryptische Bindungsstellen bezeichneten Bereiche sind kennzeichnend für angiogene Blutgefäße. Ziel der Untersuchungen war, ein Oligopeptid zu finden, welches spezifisch an diese Bindungsstellen bindet, das möglicherweise als Konjugat für therapeutisch wirksame Radionuklide und Zytostatika in Frage kommt. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes in vivo/in vitro Phage-Display mit einer M13 Phagenbibliothek durchgeführt und ein Phage isoliert, der an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV bindet und die Oligopeptidsequenz TLTYTWS präsentiert. Im Rahmen einer Phagen-Biodistribution mit LLC Tumor-tragenden Mäusen konnte eine spezifische Anreicherung des Phagen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Der Phage weist also die Fähigkeit auf, sich im Tumorgewebe anzureichern. Diese Eigenschaft wird auch als „Tumor-homing“ bezeichnet. Die von dem Phagen präsentierte Peptidsequenz wurde zur chemische Synthese des TLTYTWS-Oligopeptids verwendet. Dieses Oligopeptid ist in der Lage, in vitro die Bindung des Phagen an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV dosisabhängig zu inhibieren. Weiterhin kann durch Koinjektion des TLTYTWS-Phagen und des TLTYTWS-Oligopeptids bei LLC Tumor-tragenden Mäusen die Akkumulation des Phagen im Tumorgewebe inhibiert werden, was die Spezifität des „Tumor-homings“ belegt. Zudem reduziert das TLTYTWS-Oligopeptid dosis-abhängig die Endothelzell-Differenzierung in vitro im Tube-Formation Assay und die Angiogenese in vivo im Matrigel-Plug Assay. Auf Grund dieser Charakteristika eignet sich das Oligopeptid möglicherweise zum Einsatz in der Diagnostik oder Therapie in der Onkologie.

Thu, 21 Jan 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11181/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11181/1/Golic_Michaela.pdf Golić, Michaela ddc:610, ddc:600, Medizinische

Die vorliegende Studie trägt zum besseren Verständnis des breiten klinischen Spektrums und des Fehlens universeller Serum- Marker der infektionsassoziierten Krankheitsaktivität der Lupus- Nephritis und möglicherweise anderer Formen der Immunkomplexnephritis bei. Exogener Kontakt mit TLR 7- Liganden hat die Entwicklung der Lupus- Nephritis bei jungen, gesunden MRL- Wildtyp und MRLlpr/lpr Mäusen nicht getriggert und hatte keinen signifikanten Effekt auf die Krankheitsaktivität bei diesen jungen Mäusen. Bei alten Lupus- Mäusen führte eine ähnliche Exposition jedoch zu einem merklichen Anstieg der Serumspiegel proinflammatorischer Zytokine und von IFNα, sowie zu einer Infiltration der Nierenglomeruli 18 Wochen alter MRLlpr/lpr Mäuse mit Makrophagen und einer (nicht signifikanten) Erhöhung der Autoantikörperspiegel. Diese Daten unterstützen die Theorie, dass dem Toll- like Rezeptor 7 eine Rolle bei den Mechanismen, die das Fortschreiten der autoimmunen Gewebsschädigung in MRLlpr/lpr Mäusen fördern, zukommt. Basierend auf den Ergebnissen der funktionellen Rolle von TLR 7 in Lupus- Mäusen und in Primärzellen, die aus Lupusmäusen isoliert wurden, sahen wir in der TLR 7- Blockade ein mögliches neues Ziel, um die schädlichen Effekte des Signalings über Immunkomplexe und endogene Liganden zu begrenzen. Es zeigte sich, dass die Blockade von TLR 7 und TLR 7 + TLR 9 die Gewebsschäden in Nieren und Lunge signifikant reduzieren konnte. Eine TLR 7 Antagonisierung mit dem Oligodeoxyribonukleotid IRS661 senkte die Menge an Autoantikörpern (insbesondere anti- SM, anti- dsDNA, IgG2a, IgG2b), entzündlichen Zytokine und Chemokinen im Serum, glomerulären Ablagerungen von IgG2a und Komplementfaktor C3c deutlich. Die Hemmung von TLR 7 reduzierte ebenfalls die CC- Chemokin- gesteuerten Makrophagen- und T- Zell- Infiltrate in den Nieren. Dies zeigte sich durch erniedrigte Spiegel von Ccr2, Ccr5, Ccl2 und Ccl5 in den Nieren behandelter Tiere. Diese Ergebnisse unterstützen das Konzept, dass endogene TLR 7- Liganden zur Pathogenese der Autoantikörperproduktion und der autoimmun vermittelten Gewebsschädigung des SLE beitragen. Die TLR 7- Blockade könnte ein neues therapeutisches Konzept beim Lupus erythematodes sein.

Hintergrund und Ziele der Arbeit: Die Freisetzung von Serotonin aus enterochromaffinen (EC-)Zellen der Darmschleimhaut ist das Schlüsselereignis bei der Regulation der enterischen Motilität und Sekretion. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob nasale olfaktorische Rezeptoren auch in EC-Zellen der menschlichen Darmschleimhaut exprimiert werden, und ob deren Liganden – Duftstoffe und Gewürze – hier eine Serotoninfreisetzung bewirken können. Methoden: Die Expression der olfaktorischen Rezeptoren wurde durch RT-PCR in mittels Laser-assistierter Mikrodissektion gewonnenen humanen EC-Zellen, in humanen Dünndarmbiopsaten sowie in einer von humanen EC-Zellen abstammenden Karzinoidzelllinie (BON) analysiert. Die Aktivierung von EC-Zellen durch Duftstoffe wurde durch digitales Fluoreszenz-Imaging mit dem Ca2+-bindenden Farbstoff Fluo-4 untersucht. Die Serotoninfreisetzung wurde im Zellkulturüberstand durch Serotonin-ELISA sowie mittels Amperometrie unter Verwendung von direkt auf Einzelzellen platzierten Carbonfaser-Mikroelektroden gemessen. Ergebnisse: Es wurden vier olfaktorische Rezeptoren (OR73, hOR17-7/11, OR1G1 und hOR17-210) in mikrodissektierten humanen EC-Zellen, Dünndarmbiopsaten und der Karzinoidzelllinie (BON) exprimiert gefunden. Die hierauf durchgeführten funktionellen Untersuchungen ergaben, dass die Liganden der identifizierten olfaktorischen Rezeptoren einen Ca2+-Einstrom, eine Anhebung des intrazellulären Ca2+-Spiegels und eine nachfolgende Serotoninfreisetzung aus den Zellen bewirken. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass Duftstoffe und Gewürze im luminalen Kompartiment des menschlichen Gastrointestinaltrakts über die Stimulation von olfaktorischen Rezeptoren auch in vivo eine Serotoninfreisetzung aus EC-Zellen bewirken könnten. Da Serotonin als wichtigster Regulator von Darmmotilität und -sekretion fungiert und pathophysiologisch eine wesentliche Rolle u. a. bei Erbrechen, Diarrhoe und dem Reiz-darmsyndrom spielt, könnten die in dieser Arbeit erstmals beschriebenen intestinalen olfaktorischen Rezeptoren mögliche neue Ziele in der Pharmakotherapie von Erkrankungen und Motilitätsstörungen des Gastrointestinaltrakts darstellen.

Atheromatöse Plaques sind vulnerabel, und deren Ruptur kann die Bildung gefäßverschließender plättchen- und fibrinreicher Thromben induzieren, welche akute Myokardinfarkte und ischämische Schlaganfälle verursachen können. Bisher geht man davon aus, dass der Plaque-„tissue factor“ als Aktivator der extrinsischen Blutgerinnung und Stimulator der Thrombin-vermittelten Plättchenaktivierung und Aggregation die bedeutendste prothrombogene Substanz atheromatöser Läsionen darstellt. Zu Beginn dieser Arbeit war nicht geklärt, ob und wie das lipidreiche atherosklerotische Plaquematerial auch direkt mit den Thrombozyten im Blut interagieren und auf diese Weise die Bildung eines gefäßverschließenden Plättchenthrombus induzieren kann. Die atheromatösen Läsionen von mehr als 60 verschiedenen Patienten mit Karotisstenose wurden mittels Endarterektomie isoliert und Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positive, morphologisch äußerst heterogene Strukturen in den Plaques identifiziert, welche direkt die Adhäsion, Sekretion und Aggregation von Plättchen in Puffer, Plasma und Blut stimulierten. Darüber hinaus lösten die Plaques auch die Bildung von Thrombozyten-Monozyten-Aggregaten sowie eine plättchenbeschleunigte Fibrinbildung und Gerinnung aus. Unter arteriellen Flussbedingungen induzierten die kollagenpositiven Komponenten des Plaquematerials die Adhäsion, das Ausbreiten und die Aggregatbildung der Thrombozyten. Die Plaque-stimulierte Plättchenaggregatbildung erfolgte sehr rasch (< 5 min) und wurde in Hirudin-antikoaguliertem Blut beobachtet, was darauf schließen lässt, dass diese direkt und unabhängig von der Plaque-„tissue factor“-vermittelten Koagulation erfolgte und sehr wahrscheinlich für die initiale und schnelle Thrombusbildung nach einer Plaqueruptur in vivo von Bedeutung ist. Sowohl die Ergebnisse mit humanen, als auch mit murinen Blutplättchen wiesen auf eine essentielle Rolle morphologisch diverser Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positiver Plaquestrukturen und des thrombozytären Kollagenrezeptors GPVI bei der durch atheromatöse Läsionen stimulierten Plättchenformveränderung, Adhäsion, Ausbreitung, Sekretion und Aggregation im statischen System und unter arteriellen Flussbedingungen hin. Der zweite bedeutende thrombozytäre Kollagenrezeptor, das Integrin α2β1, schien hingegen nicht an der durch die atheromatösen Läsionen hervorgerufenen Plättchenadhäsion und Aggregation im statischen System und unter Fluss beteiligt zu sein. Diese Beobachtungen führten zur Annahme, dass die Verabreichung von z. B. spezifischen anti-GPVI-Antikörpern oder löslichem GPVI-Protein, welche die Interaktion des thrombozytären GPVI-Rezeptors mit dessen Liganden im Plaquegewebe (Kollagen Typ I/Typ III) inhibieren, viel versprechende neue und effektive antithrombotische Strategien zur frühen Prävention kardio- und cerebrovaskulärer Gefäßverschlüsse darstellen könnten. Der thrombozytäre VWF-Rezeptor GPIbα war weder im gerührten System, noch unter Fluss mit niedrigeren Scherraten von 500 s-1 von Bedeutung für die durch atheromatöse Plaques induzierte Plättchenaggregation im Blut. Unter arteriellen Flussbedingungen mit höheren Scherraten von 1500 s-1 allerdings resultierte die Blockade von GPIbα in einer starken Reduktion (77±5%) der Plaque-stimulierten Thrombozytenadhäsion und Aggregatbildung. Dies lässt darauf schließen, dass unter diesen Strömungebedingungen auch die Interaktion des VWF mit dem Plättchen-GPIbα-Rezeptor eine wichtige Rolle für die Thrombusbildung nach Plaqueruptur spielt. Sowohl die ADP-Rezeptor-Antagonisten MRS2179 (P2Y1-Antagonist) und AR-C69931MX (P2Y12-Antagonist), als auch Aspirin® konnten die Plaque-vermittelte Thrombozytenaggregation in gerührtem PRP und Blut signifikant verringern, wobei die Kombination aller drei Plättchenhemmer am effektivsten wirkte und die Plaque-induzierte Aggregation vollständig inhibierte. Unter arteriellem Fluss (Scherraten: 1500 s-1) wirkten MRS1279, AR-C69931MX sowie deren Kombination allerdings deutlich weniger effizient als im statischen System und reduzierten die Plaque-stimulierte Plättchenaggregatbildung nur um 35±14%, 32±13% und 58±12%. Überraschender Weise führte die Zugabe von Aspirin® unter Fluss zu keiner signifikanten Reduktion der Plaque-induzierten Thrombozytenaggregatbildung. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ADP-Rezeptor-Antagonisten sowie Aspirin® die Bildung eines gefäßverschließenden Thrombus nach Plaqueruptur eher ineffizient hemmen dürften. Die atheromatösen Plaquehomogenate verschiedener Patienten wiesen unterschiedliche thrombozytenaktivierende Eigenschaften auf, welche weder auf deren variierenden Gehalt an löslichem Kollagen, noch auf die unterschiedliche Morphologie der Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positiven Plaquekomponenten zurückgeführt werden konnte. Weiterhin verhielt sich sowohl fibrilläres als auch lösliches Kollagen Typ I und Kollagen Typ III anders als das Plaquematerial bezüglich der Plättchenaggregation im PRP. Die Bindung des thrombozytären GPVI-Rezeptors an das Plaquematerial stellte die Voraussetzung für die Plättchenaktivierung der Plaques dar, wobei jedoch keine eindeutige positive Korrelation zwischen der GPVI-Bindung und der Aktivität der atheromatösen Läsionen verschiedener Patienten hergestellt werden konnte. Der Grund für die unterschiedliche Thrombozytenaktivierung induziert durch das Plaquematerial verschiedener Patienten bleibt letztlich also unklar. Die weitere Erforschung möglicher Ursachen für die unterschiedlichen plättchenaktivierenden Eigenschaften der lipidreichen atheromatösen Läsionen verschiedener Patienten stellt eine interessante und vor allem klinisch relevante zukünftige Fragestellung dar.

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8882/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8882/1/Schwarz_Johannes.pdf Schwarz, Johannes

Atopische Erkrankungen und Asthma bronchiale beeinträchtigen einen Großteil der in den Industriestaaten lebenden Menschen und sind weltweit verbreitet. Es ist zunehmend Konsens, dass die Entstehung von Asthma bronchiale und atopischen Erkrankungen im Kontext einer Interaktion zwischen determinierter, aber modulationsfähiger genetischer Gegebenheit und Umweltbedingungen gesehen werden muss. Dabei wird immer häufiger die Beobachtung gemacht, dass bestimmte Zeitfenster in der immunologischen Reifung eines Individuums Einfluss auf die Entstehung der Erkrankungen haben können. Daher war die Untersuchung einer genetisch weitgehend homogenen, durch politische Umstände jedoch im Kleinkindalter deutlich differenten Umweltbedingungen ausgesetzten Population ein vielversprechender Ansatz zur Klärung der Einflüsse von Genveränderungen im Interleukin-4-Rezeptor-alpha-Gen und seiner unmittelbaren Liganden auf die Entstehung von Allergie-bedingten Erkrankungen. Hierfür wurde die DNS von 1120 Kindern der ISAAC-Studie aus Leipzig und München auf drei vorbeschriebene Single-Nukleotid-Polymorphismen genotypisiert, mit den Daten aus den Fragebogen korreliert und auf ihre Assoziation mit den Erkrankungen Asthma bronchiale, Heuschnupfen, atopische Dermatitis, positiver Haut-Prick-Test und IgE-Spiegel getestet. Keiner der untersuchten SNPs war in dieser Population mit Asthma, Heuschnupfen oder atopischer Dermatitis assoziiert. Der extrazelluläre SNP IL-4Ra_A148G zeigte eine tendenzielle Assoziation mit erhöhtem Gesamt-IgE der Studienkinder. Bei weitgehend gleichen Allelfrequenzen wurden keine deutlichen Unterschiede in der Erkrankungshäufigkeit gesehen, wenn nach den Herkunftsorten stratifiziert wurde. Bei der Haplotypanalyse innerhalb des IL-4Ra beeinflussten die kombinierten SNPs IL-4Ra_A148G und A1652G die IgE-Spiegel der Population, jedoch nicht stabil in allen drei eingesetzten Verfahren der Berechnung. In der Haplotypanalyse mit vorbeschrieben SNPs des Liganden IL-13 konnte ein Risiko-Haplotyp für erhöhtes IgE, IL-4Ra+ IL-13_GAA, identifiziert werden, welcher die additiven und multiplikativen Erwartungen der Einzelassoziationen deutlich übersteigt. Dies macht eine weitere Analyse dieses Haplotyps in funktionellen Studien interessant. Die weiteren untersuchten Haplotypen mit den Genen von IL-4 und dem intrazellulären Signalübermittler STAT6 konnten keine signifikanten Ergebnisse erzielen, welche kritischen Betrachtungen hinsichtlich der klinischen Plausibilität und der Limitationen der Berechnungsmodi standhielten. Daher muss eine entscheidende Rolle der untersuchten SNPs im IL-4Ra-Protein auf die getesteten Phänotypen als unwahrscheinlich angesehen werden, wobei einzelne tendenzielle Effekte auf den Serum-IgE-Spiegel insbesondere in der Haplotypanalyse aufgrund der großen Studienpopulation herausgearbeitet werden konnten. Ein modulierender Einfluss der SNPs und der gebildeten Haplotypen in dieser Signalkaskade auf IgE-vermittelte Erkrankungen kann als wahrscheinlich angesehen werden, konnte jedoch in dieser Assoziationsstudie nicht zweifelsfrei verifiziert werden. Im Rahmen eines „Risikopanels“ für die Entwicklung eines hohen IgEs, beziehungsweise IgE-vermittelter Erkrankungen sind die SNPs IL-4Ra_A148G und A1652G somit weiterhin interessante Kandidaten.

Cathepsine sind lysosomale Cysteinproteasen, die neben der allgemeinen Proteindegradation in Lysosomen auch spezifische Funktionen ausüben, die eine limitierte Proteolyse erfordern. Zudem werden Cathepsine sezerniert, weshalb man sie auch im Extrazellulärraum findet, wo sie ebenfalls an verschiedenen biologischen Vorgängen, wie etwa der Zellmigration/Invasion, teilnehmen. Über Cathepsin X, einen relativ neu entdeckten Vertreter dieser Proteinklasse, war zu Beginn der Promotionsarbeit noch wenig bekannt. Die Struktur und das Aktivitätsprofil konnten zwar bereits gelöst werden, über mögliche (patho-)physiologische Funktionen gab es jedoch noch keine Erkenntnisse. Das Hauptziel meiner Untersuchungen war daher, mittels geeigneter Methoden nähere Aufschlüsse über die Rolle von Cathepsin X oder seiner Proform innerhalb und außerhalb der Zelle zu erlangen. Dies sollte vorwiegend durch die Analyse der Expression und Sekretion dieser Protease, sowie durch das Auffinden von Interaktionspartnern erfolgen. Wie sich in Vorversuchen zeigte, wird Cathepsin X in humanen Leukozyten unterschiedlich stark exprimiert. Da eine hohe Expression insbesondere in Monozyten vorlag, wurde für weitere Analysen das Zellmodell THP-1 eingesetzt, das auch für die Differenzierung zu Makrophagen-ähnlichen Zellen durch Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) oder all-trans Retinsäure (ATRA) verwendet werden kann. Interessanterweise zeigten diese Agenzien unterschiedliche Auswirkungen auf die Expression und Sekretion von Cathepsin X. So wurde mit PMA eine starke intra- und extrazelluläre Erhöhung der Protease verzeichnet, während mit ATRA das Gegenteil der Fall war. Da eine differenzielle Expression von Cathepsin X in Leukozyten auf eine mögliche Funktion in der Entzündungsantwort hindeutet, schien eine Untersuchung der Wirkung von proinflammatorischen Zytokinen und extrazellulären Matrix (EZM)-Proteinen sinnvoll, weil diese Faktoren ebenfalls die Sekretion von Proteasen beeinflussen können. Die untersuchten Zytokine hatten allerdings keinen Effekt auf die Sekretion von Cathepsin X aus THP-1-Zellen, wohingegen mit dem EZM-Protein Vitronektin eine Verdopplung der Cathepsin-X-Konzentration im Medium beobachtet wurde. In diesem Kontext konnte nachgewiesen werden, dass Vitronektin durch die Interaktion mit dem Zelloberflächenrezeptor Integrin avb3 den Sekretionsapparat der Zelle beeinflusst, wobei offensichtlich das Sequenzmotiv Arginin-Glyzin-Aspartat (RGD), welches in Vitronektin enthalten ist, für diesen Vorgang entscheidend ist. Neben Cathepsin X wurde auch für die Cathepsine B und L eine erhöhte Freisetzung nach Inkubation mit Vitronektin gemessen, was zeigt, dass dieser durch das EZM-Protein ausgelöste Mechanismus nicht auf Cathepsin X beschränkt ist. Umgekehrt ließ sich in einem weiteren Zellmodell (HUVEC) durch den Einsatz von „small-interfering RNA“ (siRNA) die Expression von Cathepsin X erniedrigen, was zu einer verminderten Migration der HUVEC in einem Invasionsversuch führte. Dies deutet auf eine Funktion von Cathepsin X in der Zellmotilität hin. Weil Cathepsin X, ähnlich wie Vitronektin, ein exponiertes RGD-Motiv in seiner Proregion aufweist, sollte nun eine mögliche Interaktion mit Integrinen untersucht werden. Tatsächlich ließ sich eine RGD-abhängige Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 zeigen. Somit werden in dieser Arbeit zwei wesentliche neue Aspekte in der Regulation der Sekretion und seiner Beteiligung an Migrationsvorgängen gezeigt, wobei die Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 eine besondere Rolle zu spielen scheint. Ob diese beiden Vorgänge miteinander gekoppelt sind, konnte mit den bisherigen Ergebnissen noch nicht bewiesen werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse jedoch darauf hin, dass extrazelluläres (Pro)Cathepsin X neben seiner Rolle als Protease auch nicht-proteolytische Funktionen, beispielsweise als Ligand bestimmter Zelloberflächenstrukturen ausüben kann. Dieser Aspekt könnte im Hinblick auf eine therapeutische Inhibition von Angiogenese und Metastasierung von Tumorzellen durch Antikörper gegen Cathepsin X und/oder Integrine von großem Nutzen sein.

Jasmonate sind Phytohormone mit vielfältiger Wirkung in Entwicklung und Stressmanagement der Pflanzen. Über die Perzeption und Transduktion der Jasmonatsignale ist bisher kaum etwas bekannt. Unter Verwendung des synthetischen Jasmonat-Analogons 6-Azido-1-oxoindanoyl(14C)isoleucinmethylester (IndAz(14C)IleMe) als Radioligand wurde eine spezifische Bindestelle in Sojabohne (Glycine max) biochemisch charakterisiert, in der Erwartung, eine Bindestelle für Jasmonate zu beschreiben. Die IndAz(14C)IleMe-Bindung erwies sich als spezifisch, saturierbar und reversibel. Da es sich aber um eine niedrigaffine Bindestelle handelt und die Affinität verschiedener Jasmonate und synthetischer Indanoyl-Isoleucin-Konjugate nicht mit deren biologischer Aktivität in Sojabohne korreliert, dürfte es sich bei der IndAz(14C)IleMe-Bindestelle nicht um einen Jasmonatrezeptor handeln. Sowohl bei Jasmonaten als auch bei Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten wurden Methylester gegenüber den entsprechenden freien Säuren bevorzugt gebunden. Ein Enzym, das den Liganden umsetzt, scheint nicht vorzuliegen, da die IndAz(14C)IleMe-Bindung kein pH-Optimum aufwies und keine Umsetzung des Liganden beobachtet wurde. Mit fortschreitendem Alter der Pflanze nahm die Bindungsaktivität zu. Die IndAz(14C)IleMe-Bindestelle kommt in verschiedenen höheren Pflanzenarten vor, war hauptsächlich in der Wurzel nachweisbar und wurde in der Zellwand lokalisiert. Da die Bindestelle weder mit Salzen noch mit Detergenzien extrahiert werden konnte, gegenüber Proteinase K, DTT, Periodat, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Pectinase und Pectolyase resistent und zu 50 % hitzestabil war, wird vermutet, dass ein in der Zellwand fest verankertes Protein vorliegt. Zu den intrazellulären Signalvermittlern von Pflanzen gehört Calcium, nicht nur im Cytosol, sondern auch im Zellkern. In transgenen Nicotiana tabacum BY-2-Zellen wurden mit Hilfe des Photoproteins Aequorin erstmals jasmonatinduzierte Änderungen der Calciumkonzentration in beiden Kompartimenten gezeigt. Auch ein Vertreter aus der Gruppe der Phytoprostane, Phytoprostan B1 Typ II, löste Calciumantworten in Cytosol und Zellkern aus. JA und OPDA induzierten unterschiedliche Calciumsignaturen, die sich jeweils aus einer cytosolischen Calciumantwort gefolgt von einem Calciumsignal im Zellkern zusammensetzten. Die Unterschiede in Form, Höhe und Kinetik der einzelnen Antworten lassen auf zwei verschiedene Signaltransduktionswege bei JA und OPDA schließen. MeJA war in beiden Kompartimenten inaktiv und demonstriert dadurch, dass MeJA nicht immer, wie häufig angenommen wird, wie JA wirkt. Durch das Isoleucin-Konjugat der JA (JA-Ile) wurde eine dritte Calciumsignatur ausgelöst, die sich von der JA-induzierten Calciumsignatur durch das Fehlen der JA-ähnlichen cytosolischen Calciumantwort unterscheidet. Dieser Befund lässt vermuten, dass die Unterscheidung von JA- und JA-Ile-Signalen möglicherweise auf Ebene des Calciums stattfindet. Eine Struktur-Aktivitätsanalyse mit Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten bestätigte, dass die Konjugation mit Isoleucin zur Veränderung der Calciumsignatur führt. Die unkonjugierte 1-Oxoindan-4-carbonsäure (Ind) verhielt sich wie JA, das Konjugat Ind-Ile wie JA-Ile. Ferner wurde gezeigt, dass für die Induktion der Calciumantworten eine freie, negativ geladene Carboxylgruppe unerlässlich ist. Neben MeJA erwiesen sich JA-IleMe, Ind-IleMe und 3-(Nitro-methyl)-2-((Z)-pent-2-enyl)cyclopentanon als inaktiv. 6-substituierte Indanoyl-Isoleucin-Konjugate zeichnen sich durch verstärkte biologische Aktivität aus. Tatsächlich verlieh der Ethyl-Substituent dem IndEt-IleMe calciuminduzierende Aktivität im Zellkern. Bei den freien Säuren Ind-Ile und IndEt-Ile wurde aber keine Aktivitätssteigerung durch Substitution festgestellt. Die Untersuchung der Expression einiger JA-responsiver Gene zeigte, dass unter den Versuchsbedingungen, die die Induktion von Calciumantworten ermöglichten, keine jasmonatinduzierte Genexpression erfolgte. Sollten die beschriebenen Calciumsignale die Expression bestimmter Gene vermitteln, ist eine ausgewählte Gruppe von Genen zu erwarten, deren Expression eventuell einen besonderen physiologischen Zustand der Zellen erfordert.

In der vorliegenden Arbeit werden stabile Übergangsmetall-Komplexe der d6-konfigurierten Metalle Rhenium(1), Ruthenium(2), Rhodium(3) und Iridium(3), sowie von Rhodium(1), Iridium(1), Palladium(2) und Platin(2) mit d8-Konfiguration hergestellt. Als Liganden kommen zweizähnige, aromatische N,N'- und N,P-Liganden ohne weitere funktionelle Gruppen zum Einsatz, bei denen die beiden Donor-Atome in einer 1,4-Relation zueinander stehen. Die gebildeten 5-Ring-Metallacyclen weisen entsprechend der beiden unterschiedlichen Donor-Atome zwei verschieden stark gebundene Koordinationsstellen auf. Die aus dieser Konstellation resultierenden Eigenschaften der isolierten Komplexe werden spektroskopisch (IR-, 1H-NMR, 13C-NMR, 31P-NMR) untersucht und die Molekülstrukturen durch Einkristall-Röntgenstrukturanalyse ermittelt. Bei den untersuchten relativ stabilen Systemen kann der Ligandenaustausch so gesteuert werden, dass voll charakterisierbare Spezies erhalten werden. Diese sollen das Verständnis katalytischer Reaktionen in labileren Systemen vertiefen, welche auch durch Modifikation der vorgestellten Liganden zugänglich sind.

In this thesis novel carbohydrate transition metal complexes are presented. As transition metals rhenium(V), copper(II) and palladium(II) are used, and their complexation behaviour towards carbohydrates is investigated. Various carbohydrates, such as tartaric acid, xylaric acid, polyols, hydroxyaldehydes, glyceraldehyde, erythrulose, erythrose, threose and xylose act as ligands in these coordination compounds. The complexes are synthesised and characterised by NMR spectroscopy and single crystal X-ray diffraction. Heteroleptic complexes of copper(II) with xylaric acid and tartaric acid are synthesised and characterised. Different ancillary ligands such as bpma and tpa are used. In these structures the coordination number of copper(II) varies from 4 to 6, and different geometries depending on the ancillary ligand are observed. At last the reactivity of palladium(II) towards highly reducing sugars and aldehydes such as D-erythrose, D-threose, D-erythrulose, D-glyceraldehyde, glyoxal and glycolaldehyde is investigated. Complexes of the hydrated aldehydes can be observed in solution, with the hydrate coordinating up to two metal centers. For the first time complexes of monosaccharides in their open chain form can be identified and characterised in solution. These forms are stabilised and enriched in solution by palladium(II). The crystal structure of a palladium(II)-erythrose complex is presented, which is the first crystal structure of this tetrose as yet.

In dieser Arbeit wurde das Koordinationsverhalten von Sauerstoffdonor-Liganden gegenüber der fac-ReI(CO)3-Einheit untersucht. Als Liganden wurden Diole und Polyole eingesetzt, sowie die Steroidhormone β-Östradiol, Testosteron und Cholesterin. Weiterhin wurden die Koordinationseigenschaften von Oxacalix[3]arenen gegenüber der fac-ReI(CO)3-Einheit untersucht. Dabei bilden die Diole (1S,2S)-trans-Cyclopentandiol (1S,2S)-Cptd und (1R,2R)-trans-Cyclohexandiol (1R,2R)-Chxd die zweikernige Komplexe [Re2(CO)6{µ-(1S,2S)-CptdH-1}3]- und [Re2(CO)6{µ-(1R,2R)-ChxdH-1}3]- mit der fac-ReI(CO)3-Einheit aus, in denen der Ligand jeweils einfach deprotoniert vorliegt und das Sauerstoffatom jeweils zwei Rheniumatome verbrückt. Dieses Strukturmotiv wird auch mit den Steroidhormonen gebildet. Es bilden sich zwei flächenverknüpfte Oktaeder aus, in welchen die drei Brückenpositionen jeweils von einem Sauerstoff-Atom eines Liganden eingenommen werden, so dass drei Liganden die drei Brückenpositionen besetzen. Mit 1,2,3-Triolen wie Glycerin (Glyc) oder Methyl-β-D-Ribopyranosid (Me-β-D-Ribp) bilden sich die dreikernige Komplexe [Re3(CO)9(µ3-O)(µ3-GlycH-3)]- und [Re3(CO)9(µ3-OMe)(µ3-1C4-Me-β-D-Ribp2,3,4H-3)]-, in denen der Ligand dreifach deprotoniert vorliegt und die drei Sauerstoff-Atome jeweils zwei Rhenium-Atome verbrücken. Die µ3-Koordinationsstelle kann von einem Oxido-, Hydroxido-, Alkoxido-, oder einem Thiolato-Liganden eingenommen werden. Das Pentitol D-Arabitol (D-Arab) und die Hexitole D-Sorbitol (D-Sorb) und Dulcitol (Dulc) können sechskernige Komplexe mit der fac-ReI(CO)3-Einheit aufbauen, indem zwei Polyolmoleküle jeweils fünffach deprotoniert vorliegen [Re6(CO)18(D-ArabH-5)2]4-, [Re6(CO)18(D-SorbH-5)2]4- und [Re6(CO)18(DulcH-5)2]4-. An ihnen können sich die sechs fac-ReI(CO)3-Einheiten so anordnen, dass jede von ihnen oktaedrisch koordiniert wird. Das Tetrol L-Threitol ist auf Grund seines speziellen Hydroxygruppenmusters in der Lage, den zweikernigen Komplex [Re2(CO)6(L-ThreH-3)]- auszubilden, in welchem jedes Sauerstoffatom des Liganden koordiniert ist. Dieser Komplex erweist sich als so stabil, dass er sogar in Wasser herstellbar ist. In der Kristallstruktur liegt die bisher kürzeste Wasserstoffbrückenbindung in Alkoxido-Komplexen vor (O•••O-Abstand: 2.36 Å). Die Oxacalix[3]arene bilden mit der fac-ReI(CO)3-Einheit einkernige Komplexe aus, in denen nur zwei der drei Phenoxidosauerstoff-Atome an das Rhenium-Atom koordinieren. Die dritte freie Koordinationsstelle wird von einem etherischen Sauerstoffatom eingenommen. Diese Komplexe fragmentieren wenn die Base DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en) vorhanden ist, wobei eine Etherspaltung einsetzt und die DBU-Einheit in der resultierenden Verbindung an der Position eines früheren etherischen Sauerstoff-Atoms gebunden ist.

Mit den Mitteln der Infrarotspektroskopie wurde der Einfluss der organischen Hülle auf Struktur und Dynamik von CdSe Nanopartikeln untersucht. Zunächst wurde ein Verfahren entwickelt, das es ermöglicht, aus dem statischen Infrarotspektrum Informationen über die Qualität der organischen Hülle und das Bindungsverhalten der Liganden zu gewinnen. An qualitativ hochwertigen und gut charakterisierten Proben wurde anschließend die Dynamik des niederenergetischsten Elektronenniveaus 1S nach optischer Anregung im Sichtbaren zeitaufgelöst gemessen. Als Referenz diente CdSe TOPO, das durch Proben mit den Liganden Octanthiol, Octansäure, Octylamin, Naphthoquinon, Benzoquinon und Pyridin ergänzt wurde. Die untersuchten Nanopartikel hatten einen Durchmesser von 4.86 nm. Mit Hilfe des Anreg-Abtast- oder Pump-Probe-Verfahrens wurden zunächst Messungen im Pikosekundenbereich durchgeführt. Die Anregungswellenlängen wurden dabei spektral eingeschränkt und so gewählt, dass selektiv die Übergänge 1S-1S und 1P-1P, nicht aber der dazwischenliegende 2S-1S-Übergang, angeregt wurden. Die Anregungsintensitäten wurden bewusst so niedrig gehalten, dass die Anregung mehrerer Exzitonen in einem Kristall vermieden werden konnte. Die Abtastwellenlänge im Infraroten entsprach der Energiedifferenz zwischen den Elektronenniveaus 1S und 1P. Die Transienten im Pikosekundenbereich zeichnen sich durch einen steilen Anstieg des Signals aus, auf den ein multiexponentieller Zerfall folgt. Der Anstieg, der die Bevölkerung des angeregten Zustands widerspiegelt, ist unabhängig von der Wahl der Liganden. Der Einfluss der organischen Hülle wird erst in den unterschiedlichen Zerfallszeiten der angeregten Elektronenniveaus sichtbar. Der Zerfall des Messsignals von CdSe TOPO lässt sich näherungsweise mit drei Zeitkonstanten beschreiben: eine Zerfallszeit im frühen Pikosekundenbereich, eine Zeitkonstante um die hundert Pikosekunden und eine Zeitkonstante bei einigen Nanosekunden. Bei ansteigender Abtastwellenlänge werden die Zerfallszeiten länger. Durch gezielte Anregung des 1S-1S und des 1P-1P-Übergangs konnte der Zerfall des 1P-Zustands in den energetisch günstigeren 1S-Zustand beoachtet werden, der im verzögerten Anstieg des Messsignals bei Anregung des 1P-1P-Übergangs sichtbar wird. Dem Übergang zwischen den Elektronenniveaus 1P und 1S konnte eine Zeitkonstante von ca. 190 fs zugewiesen werden, die nicht von der Wahl der organischen Hülle beeinflusst wird. Nanopartikel mit den Liganden TOPO, Pyridin und Octanthiol zeigen auch nach 3 ns noch ein gut sichtbares Messsignal. An diesen Proben wurden Messungen im Nanosekundenbereich durchgeführt. Auch hier ist der Einfluss der organischen Hülle auf die Dynamik der Nanopartikelprobe deutlich zu erkennen. Mit der Kombination beider Messreihen konnte erstmals ein Zeitbereich abgedeckt werden, der sich von einigen hundert Femtosekunden bis in den Mikrosekundenbereich hinein erstreckt.

Atherosklerose wird heute als entzündliche Gefäßerkrankung verstanden, an deren Beginn ein Funktionsverlust des Endothels steht. Genablationsversuche zeigen, dass der Protease-aktivierte Rezeptor 2 (PAR-2) eine Rolle bei der Vermittlung inflammatorischer Reaktionen des Endothels spielt. PAR-2 gehört zur Familie der heptahelikalen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und wird durch proteolytische Spaltung seines N-Terminus aktiviert. Zusätzlich zu bekannten PAR-2-Liganden wie Trypsin und Gerinnungsfaktoren Xa und Tissue Factor/VIIa wurde mittels positional scanning synthetic combinatorial library die Typ II transmembrane Serinprotease Matriptase/MT-SP1 als PAR-2-aktivierende Protease identifiziert. MT-SP1/Matriptase wird bislang ausschließlich eine Rolle bei Tumorinvasion und Metastasierung zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde eine entzündungsfördernde Wirkung der katalytischen Domäne von MT-SP1/Matriptase in primären Gefäßendothelzellen und der daran beteiligte Rezeptormechanismus untersucht. MT-SP1/Matriptase induzierte die de novo-Synthese der proinflammatorischen Mediatoren Interleukin-8 (IL-8), IL-6 und Monocyte Chemoattractant Protein (MCP)-1 abhängig von der katalytischen Aktivität und über die Aktivierung von PAR-2. Die MT-SP1/Matriptase-induzierten Signalwege beinhalteten die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB in Abhängigkeit von der Aktivität der MAPK p38 und p42/44. Die IL-8-Induktion durch MT-SP1/Matriptase erforderte dabei lediglich die Aktivität von p38. Zusätzlich wurde ein zweiter, PKCalpha-abhängiger Signalweg zur MT-SP1/Matriptase-induzierten IL-8-Expression nachgewiesen, der unabhängig von p38, p42/44 und NF-kB war. Die endotheliale Dysfunktion in der Atherosklerose kennzeichnet sich nicht nur durch Inflammation, sondern auch durch prothrombotische Veränderungen. MT-SP1/Matriptase induzierte zusätzlich zu inflammatorischen Zytokinen die Neusynthese des Gerinnungsfaktors Tissue Factor und könnte dadurch proatherogen wirken. Tissue Factor selbst induzierte wiederum IL-8 unabhängig von seinem Liganden FVIIa, aber abhängig von den Serinresten 253 und 258 in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors. Expressionsstudien zeigten die erhöhte Expression von MT-SP1/Matriptase in der endothelialen Innenwand atherosklerotischer Gefäße im Vergleich zu gesundem Gefäß. Auch am Endothel adhärierte Blutzellen wiesen MT-SP1/Matriptase-Expression auf. Die Basalexpression von MT-SP1/Matriptase war nicht in Endothelzellen, aber in Monozyten nachweisbar, die im atherosklerotischen Prozess mit dem Endothel interagieren können. MT-SP1/Matriptase könnte daher eine Rolle bei der PAR-2-vermittelten Entzündungsreaktion in der atherosklerotischen Gefäßwand spielen.

Die Familie der Geruchsrezeptoren ist zwar ein zentrales Forschungsgebiet, dennoch ist wenig über sie bekannt. Im Folgenden wird dargestellt, worin die beiden Hauptursachen für die Problematik der Analyse von Geruchsrezeptoren bestehen und welche Strategien in dieser Arbeit gewählt wurden, um einen experimentellen Ansatz zur Untersuchung von Geruchsrezeptoren zu finden: 1. Erst wenigen Geruchsrezeptoren konnten Liganden zugeordnet werden . Da noch keine Struktur eines Geruchsrezeptors bekannt ist, können bislang Modellvorstellungen nur über Sequenzhomologien innerhalb der Rezeptorgruppe oder anhand verwandter Rezeptoren, z. B. dem Rinderopsin, erstellt werden. Offensichtlich reichen diese Modelle jedoch nicht aus, um effektiv Liganden zuzuordnen oder Struktur-Funktion-Zusammenhänge zu erkennen. Das HEK-293-Zellsystem erwies sich zwar als das bisher effektivste heterologe Expressionssystem für diese Art von Rezeptoren, doch auch hier ist die Zahl beschriebener, funktionell exprimierter ORs begrenzt . Es gibt also nur wenige Möglichkeiten, Geruchsrezeptoren funktionell zu exprimieren, und daher besteht ein Bedarf an weiteren Expressionssystemen, um diese Rezeptoren in vivo untersuchen zu können. 2. Neben der Problematik einer funktionellen Expression gibt es bislang kein Expressionssystem, welches die Herstellung geeigneter Mengen für eine Strukturaufklärung dieser Rezeptoren ermöglicht. Die Menge der synthetisierten Rezeptoren ist in der Regel zu gering oder die Zielproteinspezies liegt in Einschlusskörpern vor. Zu 1) Die funktionelle Expression mit korrekter Translokation des Membranproteins sollte in Kombination mit einer Semliki Forest Virus-basierten Infektion in Säugetier P19-Zellen durchgeführt werden. Ausgewählt wurde diese Zelllinie aufgrund folgender Tatsachen: es handelt sich bei der P19-Zelllinie um Teratokarzinom-Zellen, welche ursprünglich aus embryonalen Stammzellen, implantiert in Hodengewebe, generiert wurden. Einem Gewebe also, in dem in vivo eine Geruchsrezeptor-Expression nachgewiesen wurde . Ein weiterer vielversprechender Umstand war die Differenzierbarkeit dieser Fibroblasten-ähnlichen Zellen in neuronale Zellen, dem Zelltyp, der auch in vivo für olfaktorische Neuronen vorliegt. Dementsprechend lautet die Annahme, dass es sich um eine optimale Zelllinie für die Expression rekombinanter ORs handeln kann, die zur zeitgerechten Expression aller für die olfaktorische Signalkaskade notwendigen Bestandteile befähigt ist. Die Zelllinie sollte bezüglich ihrer Eignung als Expressionsplattform für Geruchsrezeptoren charakterisiert und Expressionsstudien am Beispiel des Rezeptors OR5 durchgeführt werden. Zu 2) Die Überexpression des Membranproteins zur quantitativen Isolierung erfolgte in Hefe. Gegenüber E. coli ist der Hefeorganismus zur Durchführung posttranslationaler Modifikationen fähig. Ein Vorteil im Vergleich zu Säugerzellen sind die hohen erreichbaren Zelldichten. Primärgewebe kam für diese Fragestellung nicht in Frage: eine Isolierung wäre mit sehr geringen Ausbeuten verbunden, eine Problematik, die durch die Verwendung von heterologen Expressionssystemen umgangen werden kann. Es wurde eine „unfolded protein response“ (UPR)-kontrollierte Expression in Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, um zu gewährleisten, dass überwiegend korrekt gefaltetes Rezeptorprotein gebildet wird. Mit dieser Arbeit sollten erstmals durch eine optimierte Expression, Produktion und Isolierung ausreichende Proteinmengen des Geruchsrezeptors OR5 (aus R. norvegicus) mit einer Homogenität von >90% zur Verfügung gestellt werden, um biochemische und strukturelle Charakterisierungen durchzuführen. Zusätzlich sollten monoklonale OR5-Antikörper generiert werden, um eine spezifische Detektion und Immunopräzipitation des Geruchsrezeptors OR5 zu ermöglichen. Zusammengefasst tragen die etablierten Systeme dazu bei, die genaue Rolle der ORs in der Geruchswahrnehmung in Zukunft entschlüsseln zu können. Mit Hilfe der P19-Zelllinie wird die OR-Charakterisierung in einem heterologen System ermöglicht, und durch den Gebrauch des Hefeexpressionsystem und die optimierte Isolierungs-Strategie kann das Material für eine Strukturaufklärung bereitgestellt werden.

Zelllinienentscheidungen in der Hämatopoese werden eingeleitet und sind abhängig von der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren. Es ist allerdings bisher nicht geklärt, ob die initiale Aktivierung früher hämatopoetischer Transkriptionsfaktoren durch bisher unbekannte extrinsische Signale oder durch ein zellinternes autonomes Programm erfolgt. Notch Rezeptoren sind evolutionär hoch konservierte Transmembranrezeptoren, die an der Regulation von Zelllinienentscheidungen, Differenzierung und Proliferation in verschiedenen embryonalen und adulten Geweben beteiligt sind. Die Expression von Notch Rezeptoren auf hämatopoetischen Zellen und der dazugehörigen Liganden wie Jagged1 auf Knochenmarksstromazellen deutet auf eine Bedeutung von Notch in der Regulation der Hämatopoese. Vor Kurzem konnte die Induktion der myeloischen Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Notch nachgewiesen werden. Die molekularen Mechanismen dieses Prozesses sind dabei noch völlig unklar. Darin Einblick zu gewinnen wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit durch die Suche nach Zielgenen von Notch in der Myelopoese versucht. Dazu wurden die multipotente myeloische Stammzelllinie FDCP-mix und die granulozytäre Vorläuferzelllinie 32D mit einem durch Tamoxifen aktivierbarem Notch als Zellsysteme gewählt. In dieser Arbeit durchgeführte zytokingesteuerte Differenzierungskinetiken konnten bestätigen, dass die verwendeten FDCP-mix Zellen während ihrer Differenzierung in reife Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten auf RNA-Ebene charakteristische Regulationen von wichtigen myeloischen Transkriptionsfaktoren, Zytokinrezeptoren sowie differenzierungsabhängigen Funktionsproteinen durchlaufen. Sie stellen somit ein optimales Zellsystem zur Analyse von Notch-Zielgenen in der Myelopoese dar. Mit dem Tamoxifen induzierbaren System der Notchaktivierung wurden zuerst bekannte, zentrale Regulationsfaktoren der Myelopoese auf eine Induktion durch Notch im Northern Blot untersucht. Dabei stellte sich als entscheidendes Ergebnis sowohl in 32D als auch FDCP-mix Zellen die direkte, spezifische Induktion des frühen myeloischen Transkriptionsfaktors PU.1 heraus, von dem bekannt ist, dass er myeloische Differenzierung initiiert. Außerdem kam es zu einer indirekten Hochregulation des M-CSF-Rezeptors, der als wichtiges Zielgen von PU.1 bekannt ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein extrinsisches Signal, im Organismus durch den Jagged / Notch Signalweg vermittelt, zu einer Aktivierung eines frühen hämatopoetischen Transkriptionsfaktors führt, welcher Zelllinienentscheidungen in der Hämatopoese bestimmt. In Zusammenschau mit den biologischen Wirkungen von Notch in der Hämatopoese weist dies darauf hin, dass extrinsische Mechanismen eine wichtige Rolle in der Regulation der Hämatopoese spielen dürften. Durch ein neu zu etablierendes cDNA-Filter (cDNA-Microarray) Screening-Verfahren konnten dann als weitere wichtige Zielgene von Notch in der Hämatopoese u.a. der Interferon Regulatory Factor-1 (IRF-1), der Interleukin1-Rezeptor-Antagonist (IL1RA), der Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2), sowie c-myc und myb identifiziert werden.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden die Eigenschaften, insbesondere die Oligomerisierung, von Organometallphosphaniden der Gruppe 13 untersucht und neue Liganden entwickelt, die einen niedrigen Oligomerisierungsgrad ermöglichen können. Die Synthese von Trialkylsilylphosphanylgallanen, –alanen und -indanen führt in Abhängigkeit der Größe der organischen Reste an den Metallen zu monomeren und dimeren Verbindungen, deren Eigenschaften durch quantenmechanische Rechnungen (DFT) untersucht wurden. Anders als allein durch sterische Effekte zur kinetischen Stabilisierung monomerer Spezies wird das freie Elektronenpaar in den neuen Phosphanid-Liganden durch Koordination einer Wolframpentacarbonyl-Einheit an das Phosphoratom abgesättigt. Damit steht es nicht mehr für eine Oligomerisierungsreaktion zur Verfügung. Eine neue, einstufige Synthese der Monowolframpentacarbonyl-Verbindung Li[W(CO)5PH2] und der Biswolframpentacarbonyl-Verbindung Li[(W(CO)5)2PH2] wurde entwickelt, wobei das Syntheseprodukt über die Wahl der Stöchiometrie gesteuert wird. Ausgehend von diesen Lithiumphosphaniden und Kalium-trialkylsilylphosphaniden konnten die Mono- und Biswolframpentacarbonyl-Liganden des Typs [W(CO)5P(H)SiR3]- und [(W(CO)5)2P(H)SiR3]- hergestellt werden. Zusammenfassend liefert die vorliegende Arbeit neue Erkenntnisse über Oligomerisierungsprozesse sowie deren Beeinflussung und Steuerbarkeit und stellt neue Liganden für die Organometallchemie zur Verfügung.

Myokardiale Blockade des CD40-Liganden durch adenoviralen Gentransfer von CD40-Fc zur Steigerung der kardialen Kontraktionskraft und Verminderung des Remodeling im insuffizienten Kaninchenherz.

Durch den Transfer tumorspezifischer T-Zellen können solide Tumore nicht nur in Tieren, sondern auch im Menschen erfolgreich behandelt werden. Dudley et al. konnten kürzlich nach dem autologen Transfer stimulierter tumorinfiltrierender Lymphozyten (TIL) nach vorheriger non-myeloablativer Konditionierung in zwei von zwölf Patienten mit Melanomen eine Tumorregression erreichen (Dudley et al. 2002). Änliche Erfolge konnten Chang et al. bei der Behandlung von fortgeschrittenen Nierenkarzinomzellen erzielen (Chang et al. 2003). Sie vakzinierten Patienten mit Calmette-Guérin Bacillus versetzten Tumorzellen und ernteten anschließend die T-Zellen aus den angrenzenden Lymphknoten der Vakzinierungsregion. Nach autologem Transfer der vorwiegend CD8+ T-Zellen, welche in vitro mit anti-CD3 stimuliert wurden, sprach die Therapie bei neun von 34 Patienten an. Die Mechanismen der T-zellvermittelten Tumorregression sind aber bis heute noch unklar. Gegenstand dieser Arbeit war es daher Faktoren zu untersuchen, welche eine Rolle bei der Regression von D5-Melanomlungenmetastasen durch den adoptiven Transfer CD4+/CD8+ T-Zellen aus Tumorvakzin drainierenden Lymphknoten (TVDLN) nach Vakzinierung mit D5G6 (einem GM-CSF transduzieren D5-Subklon) spielen. Hierzu wurden D5-Zellen in vitro mit Zytokinen, welche von Effektor T-Zellen (TE) produziert werden, stimuliert. Wir konnten zeigen, dass D5-Tumorzellen die als proapoptotisch geltenden Rezeptoren TNF-R I sowie Fas nach IFN-g-Stimulation exprimieren. Die Inkubation mit den Liganden dieser Rezeptoren TNF-a, LT-a und FasAb bewirkt keine Apoptoseinduktion. Gleichzeitige Inkubation dieser Liganden führt nur zu einer Apoptoserate von 25% in D5. Mögliche Gründe der relativen Apoptoseresistenz von D5 könnten die intrazellulären Apoptoseinhibitionsproteine c-IAP I, c-IAP II und Survivin sein, welche wir in D5 nachweisen konnten. Da nach adoptivem Transfer tumorspezifischer TE Makrophagen die pulmonalen Tumormetastasen infiltrieren, untersuchten wir, ob TE Chemokine exprimieren. Unsere Untersuchungen ergaben, dass TE die Chemokine MIP-1a, MIP-1b und RANTES tumorspezifisch exprimieren. Nach Stimulation von D5-Tumorzellen mit den Zytokinen TNF-a und IFN-g, welche von TE tumorspezifisch exprimiert werden, wird die Chemokin-mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig in D5 exprimiert. Auch die Koinkubation von D5 mit TE induziert die Expression der mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig. Deutlich erhöhte KC und MCP-1 Proteinkonzentrationen wurden im Überstand von D5-Tumorzellen mittels ELISA nach TNF-a Stimulation gegenüber unstimulierten und IFN-g stimulierten D5-Zellen festgestellt. Um zu prüfen, ob die von D5 gebildeten Substanzen auch tatsächlich chemotaktisch auf Makrophagen wirken, führten wir einen chemotaktischen Assay durch. Wir konnten zeigen, dass es zu einer signifikanten Steigerung der Anzahl migrierter Makrophagen in Richtung D5- Tumorzellen nach deren Stimulation mit IFN-g und TNF-a kommt. Da wir in TE die Expression von TNF-a-mRNA und die Sekretion von IFN-g tumorspezifisch nachweisen konnten, besteht Grund zur Annahme, dass in vivo TE in der Lage sind Tumorzellen zur Chemokinbildung anzuregen, was zu einer Invasion von Makrophagen in die Tumorregionen führt. Dass Makrophagen möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Tumorregression spielen, deckt sich auch mit der Beobachtung von Feinmesser et. al., welche mit einer peritumorösen Injektion von Multikinen (Zytokin-/Chemokinmischung) Kopf und Halstumore behandelten (Feinmesser et al. 2003). Nach dieser Therapie zeigte sich in den Tumorregionen der erfolgreich behandelten Patienten im Gegensatz zu Non-Respondern eine hohe Anzahl migrierter und aktivierter Makrophagen. Wir fanden mit den Ergebnissen unserer Studie erstmals Hinweise darauf, dass im murinen Melanommodell B16BL6-D5 nicht ausschließlich die direkte T-zellabhängige Zytotoxizität zur Tumorregression führt, sondern dabei weitere Zellarten wie Makrophagen/Monozyten involviert sind, welche mittels tumorspezifischer Chemokine rekrutiert werden. Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zur Erforschung der Mechanismen T-zellvermittelter Tumorregression. Die Kenntnisse dieser Mechanismen haben entscheidende Bedeutung bei der Entwicklung neuer, effektiver Behandlungskonzepte gegen solide Tumore.

Ein Ziel dieser Arbeit ist die Darstellung toxikologisch unbedenklicher M2+-salen-Komplexe (M: Ca, Mg) die als Starter für die Ringöffnungspolymerisation von Lactiden zur Herstellung biologisch abbaubarer Polylactide eingesetzt werden können. In Zusammenarbeit mit Feijen et al. an der Universität Twente (Niederlande) wird das Calciumsalen auf seine Eigenschaften als Initiator für die Ringöffnungspolymerisation (ROP) von Lactiden (LA) untersucht. Es zeigt sich, dass in Gegenwart von iso-Propanol eine schnelle, kontrollierte Polymerisation über ein aktiviertes Monomer von LA unter sehr milden Bedingungen (RT) stattfindet, wobei praktisch keine Nebenreaktionen wie Racemisierung oder Transveresterung auftreten. Es werden Polymere mit hohen mittleren Molmassen Mn erhalten. Stereoselektive Polymerisationen eines rac-LA wird durch das Calciumsalen trotz der Verwendung des enantiomerenreinen Jakobsen-Liganden bei der Synthese nicht initiiert. Eine neue Perspektive für stereoselektive Polymerisationen über aktivierte Monomere stellt die Magnesiumsalen-Verbindung dar, da hier der sterische Einfluss des chiralen Liganden für eine Koordination an das Metallzentrum größer ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit werden die Parameter der oxidativen C-C-Kupplungsreaktion von (Trialkylsilyl)(2-pyridylmethyl)aminen mit metallorganischen Reagenzien untersucht. Ersetzt man den Trialkylsilyl-Substituenten durch einen weiteren 2-Pyridylmethyl-Substituenten, so kann die Reaktion schrittweise untersucht werden. Hierbei sind die Reaktionsfaktoren Stöchiometrie, Zeit und Temeratur maßgeblich für die Bildung der Produkte. Unter anderem gelingt so die Synthese von reaktiven vicinalen Dianionen die sich durch Delokalisierung der negativen Ladung über den benachbarten Pyridyl-Substituenten stabilisieren. Ebenso sind Azaallylverbindungen des Zinks und des Zinns durch Wasserstoff-Eliminierung zugänglich. Erstmals geling auch die strukturelle Aufklärung eines zweifach zinkierten primären Amins und der bisher unbekannten cis-bent Struktur des Zinns.

Die Dissertation handelt von Umsetzungen von Organometall(I)-Verbindungen (Bsp. Mn(CO)5X, Re(CO)5X (X = Cl, Br, I) mit Aziridinen sowie C-Nitroso-Verbindungen. Alle synthetisierten Verbindungen wurden mit Methoden wie NMR, IR, UV-Vis Spektroskopie sowie mit Elementaranalysen charakterisiert. Außerdem wurde für ein Großteil der Verbindungen Röntgenstrukturanaylsen durchgeführt.

PPAR gamma ist in mehreren Zellen des atherosklerotischen Plaques hochexprimiert und beeinflusst zahlreiche Mechanismen der Atherogenese. Ziel dieser Arbeit war es, an einem Makrophagenmodell, der MM6 sr Zelle, die Wirkung einer Stimulation des Transkriptionsfaktors PPAR gamma auf die Expression atherogener Scavengerrezeptoren und die funktionellen Auswirkungen des veränderten Rezeptorstatus auf die oxLDL- Aufnahme zu untersuchen sowie die daran beteiligten Regulationsmechanismen zu klären. Insbesondere sollte auch die Expression des Cholesterintransporters ABCA 1, der den reversen Cholesterintransport initiiert, untersucht werden. Dabei wurden verschiedene PPAR gamma- Liganden verwendet: An synthetischen Liganden wurde aus der Gruppe der NSAR Indomethacin ausgewählt und als Maßstab wurde 15-deoxy-12,14-Prostaglandin J2, der präsumtive physiologische Ligand, eingesetzt. Als pharmakologisch bedeutsamer Ligand wurde Rosiglitazon verwendet. Damit sollte dessen Wirkung auf Mechanismen der Atherogenese abgeschätzt werden. Weiteres Ziel dieser Arbeit war es, Interaktionen des PPAR gamma-Transduktionsweges mit anderen, für die Atherogenese potentiell relevanten Signalwegen zu charakterisieren. Da die Hyperinsulinämie im Rahmen des metabolischen Syndroms eine wichtige Rolle für arteriosklerotische Gefäßwandveränderungen spielt, und Thiazolidindione an peripheren Zellen als Insulinsensitizer wirken, sollte die Interaktion der PPAR gamma- und Insulin- Signalwege auf die Expression von Scavengerrezeptoren auf Makrophagen untersucht werden.

Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Bedeutung der Expression von Liganden wie Vaskular Endothelial Growth Factor (VEGF) und Stem Cell Factor (SCF), sowie deren Rezeptortyrosinkinasen VEGFR-1, VEGFR-2 und Stem Cell Factor Receptor KIT für die Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) genauer zu untersuchen. In neun von zehn der untersuchten leukämischen Zelllinien konnte eine starke VEGF Expression gezeigt werden, wohingegen die VEGFR-1 und VEGFR-2 Expression auf sechs bzw. zwei Zelllinien beschränkt blieb. Um der Überexpression von Rezeptortyrosinkinasen in den untersuchten Leukämiezelllinien eine pathogenetische Relevanz zuweisen zu können, wurde mit Hilfe der spezifischen Proteintyrosinkinaseinhibitoren SU5614, STI571 und SU1498 versucht, das Wachstum dieser leukämischen Zelllinien zu hemmen. Dabei zeigte sich, dass nicht die Expression von VEGFR-2 sondern nur die Überexpression und Stimulation von KIT eine proliferative Wirkung auf die untersuchten AML Zelllinien hat. Zur Bestätigung dieser Ergebnisse wurden zusätzlich verschiedene Apoptoseassays durchgeführt, die zeigen konnten, dass durch den Einsatz des PTK-Inhibitors SU5614 darüber hinaus Apoptose induziert werden kann. Auch die biochemischen Phosphorylierungsuntersuchungen des KIT Rezeptors in Kasumi-1 und KIT Rezeptor transfizierten HEK-293 Zellen belegten eindeutig eine Hemmung der Tyrosinphosphorylierung des KIT Rezeptors durch SU5614 Inkubation und bestätigen die Bedeutung des SCF/KIT Signalweges für das Zellwachstum von KIT positiven AML Zellen.

[NiFe]-Hydrogenasen besitzen in ihrem aktiven Zentrum neben den namengebenden Metallen Nickel und Eisen die Nicht-Protein-Liganden CO und CN. Die Synthese und der Einbau dieses NiFe(CN)2CO Zentrums ist ein komplexer Prozess mit neuartigen bioanorganischen Fragestellungen, an dem eine Reihe von Hilfsproteinen beteiligt sind. Im Fall von Escherichia coli handelt es sich hierbei um die sieben Reifungsenzyme HypA, HypB, HypC, HypD, HypE und HypF. Zusätzlich bedarf es einer spezifischen Endopeptidase sowie ATP, GTP und Carbamoylphosphat als niedermolekulare Substrate. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Ablauf der Hydrogenasereifung und der Charakterisierung der am Metalleinbau beteiligten, akzessorischen Proteinen. Im Einzelnen wurden folgende Resultate erzielt: 1. Die Funktion von HypA/HybF in vivo wurde als die eines Metallochaperons bestimmt, was einhergeht mit der Forderung nach Nickelbindung. Diese konnte experimentell nachgewiesen werden. Das Auffinden von stöchiometrischen Mengen an Zink sowie ein konserviertes Cysteinmotiv deuten auf einen “Zinkfinger“ hin, der von struktureller Bedeutung für das HybF-Protein ist. Ein Reifungsnetzwerk zwischen den drei Hydrogenasen von E. coli wurde erstellt, welches eine Regulation epistatisch zur Expression der Gene darstellt. 2. Die Charakterisierung des HypD Proteins durch Mössbauer-Spektroskopie ergab, dass es ein EPR-stilles [4Fe-4S]2+ Cluster enthält, welches ihm die gelbliche Farbe und das typische UV-VIS Spektrum verleiht. Die Bestimmung der Eisen- und Schwefelmenge im Wildtyp-Protein und in HypD-Varianten verstärkten diesen Befund. Austausche der konservierten Aminosäuren von HypD ergaben, dass ein C-terminales Cysteinmotiv zur Stabilität des Proteins beiträgt, weshalb die Cysteinreste als Liganden des FeS-Clusters vorgeschlagen wurden. 3. Da Carbamoylphosphat (CP) für die Synthese der Cyanidliganden notwendig ist, wurde ein CP-negativer E. coli Stamm näher untersucht. Dabei wurde ein Proteinkomplex aus zwei Hilfsproteinen (HypC und HypD) entdeckt, der ein Reifungsintermediat darstellt. 4. Die am HypE-Protein synthetisierte Cyanidgruppe wird auf den HypC-HypD Komplex übertragen. Dieser in vitro Befund führte zur Aufstellung eines neues Reifungsmodels als Zusammenfassung dieser Arbeit, wobei ein Gerüstkomplex zur Ligandensynthese postuliert wird.

GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) und NTN (Neurturin), die zwei zuerst beschriebenen Liganden der GDNF-Familie, fungieren als Überlebens- und Entwicklungsfaktoren für definierte Populationen von zentralen und peripheren Neuronen. GDNF ist darüber hinaus für die Nierenentwicklung erforderlich. Für die Vermittlung ihrer biologischen Wirkung benutzten GDNF und NTN einen Rezeptor, der aus zwei Ketten besteht: Die Signal-transduzierende Komponente RET wird sowohl von GDNF als auch von NTN benutzt. RET wird von 21 Exonen kodiert und kommt in multiplen Spleiß-Varianten vor. Für die Liganden-Spezifität ist eine zweite Rezeptorkomponente verantwortlich, ein Mitglied der GFR-Familie. GFRa-1 bindet präferentiell GDNF, während GFRa-2 NTN stärker als GDNF bindet. Ziel dieser Arbeit war es, mögliche wechselseitige Interaktionen zwischen dem Nerven- und Immunsystem durch die GDNF-Familie zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Expression von GDNF, NTN und ihrer Rezeptoren in gereinigten Immunzell-Subtypen untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Prototyp dieser Liganden-Familie, GDNF, von keiner der untersuchten Immunzellen exprimiert wurde. Hingegen wurde das verwandte NTN von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten exprimiert wie mit RT-PCR, Western Blot und Immunzytochemie gesehen wurde. Transkripte für das zu NTN und GDNF verwandte Persephin (PSP) wurden in Monozyten und mononukleären Zellen des peripheren Blutes gefunden. Der Transmembran-Rezeptor RET wurde von allen untersuchten Immunzell-Subtypen exprimiert. B-Zellen und T-Zellen exprimierten unterschiedliche Isoformen von RET, sowohl im extrazellulären Liganden-bindenden als auch im intrazellulären Signal-transduzierenden Teil. Die Expression der Isoformen von RET wurde zudem in T-Zellen und B-Zellen noch stark durch Aktivierung reguliert. In CD8+ T-Zellen wurde auch eine bislang noch nicht beschriebene Spleiß-Variante am 5` Ende beobachtet. Im Gegensatz zu T-Zellen und B-Zellen exprimierten Monozyten nur die volle Länge von RET. Auch die Liganden-bindenden Ketten GFRa-1 und GFRa-2 wurden von Immunzellen exprimiert wie mit RT-PCR und FACS gesehen wurde. GFRa-2 war deutlich abundanter als GFRa-1. Von GFRa-2 wurden verschiedene Isoformen in Immunzellen gefunden. In der in T-Zellen und B-Zellen am stärksten exprimierten Isoform ist Exon 2 und 3 nicht enthalten. Dem resultierenden Protein fehlen die N-terminale Cystein-reiche Domäne und eine N-Glykosylierungsstelle, eine Region, die allerdings für die Bindung von NTN und die Interaktion mit RET entbehrlich ist. Mögliche Effekte von GDNF und NTN auf Immunzellen wurden untersucht. Dabei zeigte sich, dass GDNF und NTN an der Regulation von TNF-alpha beteiligt sind. Wenn GDNF oder NTN nach 5 oder 6 Tagen zu LPS+IFN-g stimulierten Blutzellen oder zu ConA aktivierten T-Zellen gegeben wurde, dann war nach weiteren 24 h der TNF-a-Gehalt im Überstand reduziert. Weitere Experimente wiesen daraufhin, dass diese Reduktion des TNF-a-Gehalts auf eine verstärkte Aufnahme oder Verbrauch zurückzuführen ist. Proliferation, Expression von Aktivierungsmarkern (HLA-DR, CD38, CD40, CD69, CD86) oder Produktion von IFN-g und IL-4 wurden durch GDNF und NTN nicht beeinflusst. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Immunzellen den neurotrophen Faktor NTN produzieren und Rezeptoren für GDNF und NTN besitzen. Multiple Isoformen der Signal-transduzierenden Kette RET wurden exprimiert und durch Aktivierung reguliert. NTN und GDNF regulierten in aktivierten T-Zellen und Monozyten die Aufnahme oder den Verbrauch von TNF-a. Diese Befunde weisen daraufhin, dass Immunzellen miteinander und auch mit dem Nervensystem mit Hilfe der GDNF-Familie interagieren können.

Wed, 31 Mar 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2228/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2228/1/Mueller_Andreas.pdf Müller, Andreas ddc:540, ddc

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Expression und Bedeutung des Toll-like Rezeptors 4 (Tlr4) in normalen und adenomatösen epithelialen Hypophysenzellen untersucht. Tlr4 ist der Rezeptor für bakterielle Lipopolysaccharide und ist daher an der Induktion der angeborenen Immunantwort bei Infektions- oder Entzündungsprozessen beteiligt, die durch gram-negative Bakterien verursacht werden. Zusätzlich könnte der Tlr4 eine Rolle bei der Tumorgenese spielen, da Tumor-assoziierte Komponenten der extrazellulären Matrix oder Heat-Shock Proteine ebenfalls aktivierende Liganden des Tlr4 repräsentieren. In vorhergehenden Arbeiten wurde gezeigt, dass in der normalen Hypophyse der Tlr4 vorwiegend in follikulostellaren (FS) Zellen exprimiert wird und für immun-endokrine Interaktionen von Bedeutung ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde eine sporadische Expression des Tlr4 auch in allen endokrinen Vorderlappenzellen nachgewiesen. Außerdem wurde eine heterogene Expression des Tlr 4 auch in 26 von 67 untersuchten Adenomen gezeigt. In den meisten Fällen wurde in Tlr4-positiven Adenomen eine verstreute Expression in weniger als 5% aller Adenomzellen beobachtet. Die Tlr4 Expression korrelierte nicht mit einem speziellen Adenomtyp (hormonaktiv oder –inaktiv) oder Phänotyp (Mikro- oder Makroadenom). Der adenomatöse Tlr4 war funktionell aktiv, da LPS in Tlr4-positiven, IL-6-sezernierenden Adenomen die IL-6 Sekretion dosisabhängig stark stimulierte. Das synthetische Glukokortikoid Dexamethason und der p38α MAP Kinase Inhibitor SB 203580 waren potente Inhibitoren der LPS-induzierten IL-6 Sekretion. Eine heterogen Tlr4 Expresion wurde auch in endokrinen Hypophysenzelllinien gefunden, von denen manche Tlr4-positiv waren (kortikotrope AtT20 und inaktive humane HP75 Zellen), während laktosomatotrope GH3 und gonadotrope αT3-1 Zellen keinen Tlr4 exprimierten. LPS hatte in AtT20 und GH3 Zellen keinen Einfluß auf die Hormonsekretion. Im Gegensatz dazu supprimiert LPS das Wachstum von AtT20 Zellen, nicht aber von GH3 Zellen, was darauf hinweist, daß LPS direkt das Wachstum von Tlr4-positiven Zellen inhibiert. Zusammengefasst weisen diese Egebnisse darauf hin, daß während transienter oder chronischer infektiöser bzw. inflammatorischer Prozesse, die durch gram-negative Bakterien induziert worden sind, LPS da Wachstum von Hypophysentumoren beeinflussen könnte. Ob LPS in vivo die Hypophysentumor-Entwicklung inhibiert oder stimuliert, hängt von der Co-Expression und Stimulation von IL-6 (ein Progressionsfaktor für Hypophysentumoren) durch LPS in Tlr4-positiven Adenomen ab und vom Einsetzen und dem Ausmaß des Anstiegs von anti-inflammatorisch wirksamen Glukokortikoiden. Nicht nur LPS, sondern auch das bei Krebserkrankungen eingesetzte Chemotherapeutikum Taxol, von dem man annimmt, dass es durch Tlr4 wirksam ist, inhibierte das Wachstum von AtT20 Zellen. Das läßt vermuten, dass in Tlr4-positiven Adenomen auch noch weitere Liganden des Tlr4 wie z.B. andere bakterielle oder virale Bestandteile, Pharmaka oder intratumorale Fragmente der extrazellulären Matrix die Entwicklung von Hypophysentumoren beeinflussen. Dies muss in zukünftigen Studien noch geklärt werden, ebenso wie die Frage, ob der Tlr4 allgemein eine Rolle für die Tumorgenese in anderen Tlr4-positiven epithelialen Tumoren spielt.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die durchgeführten Experimente zur Charakterisierung der molekularen Assoziation der Rezeptor-Tyrosinkinase c-Kit mit dem Onkoprotein Bcr-Abl. Es wird in der zeitlichen Abfolge der chronisch myeloischen Leukämie (CML) besonders für die chronische Phase eine Beteiligung des Stammzellfaktors (SCF), dem natürlichen Liganden von c-Kit, an der Proliferation des malignen Zellklons vermutet. Ob hierbei eine Stimulierung durch SCF wesentlich ist, oder ob der Rezeptor von intrazellulärer Seite durch Bcr-Abl stimuliert wird ist eine wichtige Frage für das Verständnis der Progression der CML. Um diese Frage zu beantworten, wurden Expressionssysteme in Säugetierzellen und Insektenzellen optimiert, um eine hohe Produktion von c-Kit zu gewährleisten. Es wurde eine Koexpression von c-Kit und Bcr-Abl hergestellt um gute Bedingungen in den nachfolgenden Immunpräzipitationen (IP) zu schaffen. In diesen Studien konnte eine Kopräzipitation von c-Kit und Bcr-Abl erstmals nachgewiesen werden. Die Bindungspartner waren jeweils im Western-Blot der IP nachweisbar, sowohl nach Präzipitation von Bcr-Abl, als auch von c-Kit. Im Western-Blots konnte der Status der Tyrosinphosphorylierung von c-Kit detektiert werden. Eindeutige Hinweise auf die Aktivierung von c-Kit durch Bcr-Abl konnten durch diese Experimente zum ersten Mal nachgewiesen werden. Punktmutationen an funktionell relevanten Positionen in Bcr-Abl änderten nichts an der gezeigten Interaktion, bis auf eine Kinase-inaktive Mutante, die keine Phosphorylierung von c-Kit mehr bewirkte. Um eine Bindungsstelle in c-Kit zu charakterisieren, wurden dann Trunkationsmutanten von c-Kit hergestellt. Dabei wurde der extrazelluläre Rezeptoranteil entfernt und immer kürzere Mutanten, durch Entfernung einzelner struktureller Domänen von N-terminal, hergestellt. Diese wurden in IPs mit Bcr-Abl eingesetzt. Es konnte für sämtliche Mutanten eine Kopräzipitation gezeigt werden, so dass eine Assoziationsstelle von c-Kit nicht klar ermittelt werden konnte.

In dieser Arbeit werden neue Koordinationsverbindungen von deprotonierten Zuckersäuren (Aldaraten) mit den Metallen Kupfer(ii), Palladium(ii), Aluminium(iii), Gallium(iii)und Indium(iii) beschrieben. Die Komplexe von Aldaraten mit dem Zentralmetall Kupfer(ii) 1–10 wurden mit Hilfe von Einkristall-Röntgenstrukturanalyse charakterisiert, und daraus Kenntnisse zur Strukturchemie von Aldarato-cupraten gewonnen. Bei diesen Versuchen kristallisierte mit [Cu(NH3)4(H2O)2](Gal1,6A21,6H−2) (11) auch das Galactarat des erstaunlicherweise zum ersten Mal röntgenstrukturanalytisch charakterisierten Tetrammindiaqua- kupfer(ii)-komplexes aus. Bei der Umsetzung von Tartronsäure mit Kupfer(ii) und o-Phenantrolin (1:1) wurde der heteroleptische, über zwei Carboxylatgruppen des Tartronats koordinierte, Komplex [Cu(phen)(C3H2O5)(H2O)] · H2O (1) kristallisiert. Sämtliche weitere Umsetzungen von Kupfer(ii)-Salzen mit Aldaraten erfolgten ohne Zugabe von Hilfsliganden. Es konnten Alkalimetall- und Ammonium-Salze von Aldaratocupraten isoliert, und die Einkristallstrukturen bestimmt werden. Die über die Carboxylatgruppe koordinierten Ditartronato-cuprate Li2[Cu(C3H2O5)2(H2O)2] · 2H2O (2), Na2[Cu(C3H2O5)2(H2O)2] · 6H2O (3) und (NH4)2[Cu(C3H2O5)2(H2O)2] (4) ließen sich aus schwach sauren Lösungen, die Tartronsäure, Kupfer(ii) und Basen enthielten, kristallisieren. Es zeigte sich, dass sich die Kationen bestimmend auf die Kristallstruktur auswirken. Bei neutralen Bedingungen (pH = 7) wurden die Tritartronatocuprate (NH4)4[Cu3(C3HO5)3Cl] · 3H2O (5), K3[Cu3(C3HO5)3(H2O)] · 3,785H2O (6), Rb3[Cu3(C3HO5)3(H2O)] · 4H2O (7) und Cs3[Cu3(C3HO5)3(H2O)3] · H2O (8) kristallisiert. Die Tartrato-Liganden liegen vollständig deprotoniert vor und koordinieren jeweils zwei Kupfer-Atome über zwei Chelatfünfringe, die von den α-Alkoxo-Carboxylat-Einheiten ausgebildet werden, so dass die deprotonierte Hydroxy-Funktion verbrückend wirkt. Interessante Unterschiede zeigen die Komplex-Anionen bei der weiteren Koordination der Kupfer-Atome im zentralen Cu3O3-Sechsring an Aqua- oder Chloro-Liganden. Auch in der Kationenkoordination an die Sauerstoff-Atome im Cu3O3-Ring zeigen sich Unterschiede. Mit Xylarat als Ligand gelang es, einen der bislang größten [47] homoleptischen Cupratkomplexe, K9[Cu13(Xyl1,5A21,2,4,5H−4)5(Xyl1,5A2H−5)3]· 90H2O (9), aus einer schwach sauren Lösung zu kristallisieren. Bereits bei diesem niedrigen pH-Wert weist der Komplex drei vollständig und fünf vierfach deprotonierte Xylarato-Liganden auf. In der Struktur des Komplex-Anions vereinigen sich sämtliche bei Aldarato-Komplexen beobachtete Koordinationsmuster der Liganden, außer der nur bei Tartronat möglichen Koordination durch zwei Carboxylatgruppen zu einem Chelatsechsring. Auch alle bislang bei Oxo-cupraten beobachteten Kupfer-Sauerstoff-Baueinheiten (Cu2O2-Vierringe, Cu4O4-W¨urfel, Cu3O3-Sechsringe) sind hier in einer Verbindung kombiniert. Das polymere Cuprat Na4[Cu(Gal1,6A2H−6)] · 12H2O (10) lässt sich aus alkalischen Natriumhydroxid-haltigen Lösungen mit Galactarat als Ligand kristallisieren. Galactarsäure besitzt wie der homologe Zuckeralkohol Dulcit eine Erythrit-Teilstruktur und bildet mit dieser das Cuprat aus, wie es auch bei polymeren Erythritolato- und Dulcitolato-cupraten beobachtet wurde [38]. Die in Aldarat/Pd-en-Lösung vorhandenen Komplexspezies bei unterschiedlichen Stöchiometrien und bei Zugabe verschiedener Basen wurden mittels 13C-NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Von den nachgewiesenen Spezies konnten einige kristallisiert und ihre Struktur aufgeklärt werden (12–16). Tartronat-haltige Pd-en-Lösungen zeigen in 13C-NMR-Spektren neben unkoordiniertem Tartronat nur das über das doppelt deprotonierte α-Hydroxy-Carbonsäure-Fragment koordinierte Ethylendiamin-tartron-1,2,3-ato-O1,2-palladat(ii). Aus diesen Lösungen kristallisiert dennoch das neutrale über beide Carboxylatgruppen koordinierte [Pd(C3H2O5)(en)] · H2O (12). Durch Variation der Mengen von l- und meso-Weins¨aure in Pd-en-Lösungen und bei Zugabe verschiedener Alkalilaugen lassen sich alle drei möglichen, über Chelatfünfringe koordinierte Komplexspezies in Lösung durch 13C-NMR-Spektren nachweisen. Die Zugabe von Lithiumhydroxid zu den Lösungen bewirkt die Verdrängung des PdII(en)-Fragments von der Koordination durch eine Carboxylatgruppe zur Diolat-Einheit. Mit dem zweikernigen Komplex [(Pd(en))2(l-Thr1,4A2H−4)] · 5,42(3)H2O (13) und dem einkernigen Palladat [Pd(en)2][(en)Pd(Ery1,4A21,2,4H−3)]2 · 10H2O (14) konnten zwei der in Lösung nachgewiesenen Spezies kristallisiert werden. Auch in NMR-Spektren von Xylarat-haltigen Pd-en-Lösungen lässt sich beobachten, dass nach Zugabe von Lithiumhydroxid keine Koordination mehr durch eine Carboxylatgruppe vorliegt. Diese anionische Komplex-Spezies ließ sich kristallisieren und als Li2[(en)Pd(Xyl1,5A21,2,3,5H−4)] · 6,5H2O (15) charakterisieren. Galactarat zeigt das Verhalten gegenüber Lithiumhydroxid nicht, so dass sich aus Lithiumhydroxid-haltigen Lösungen von Galactarsäure in Pd-en der zweikernige Neutralkomplex [(Pd(en))2(Gal1,6A21,2,5,6H−4)] · 5H2O (16) kristallisieren lässt, der über die beiden α-Alkoxo-Carboxylat-Einheiten des Liganden koordiniert wird. Im dritten Teil der Arbeit wurden neue Aldarato-metallate mit den Metallen der dritten Hauptgruppe Aluminium, Gallium und Indium (17–27) synthetisiert und strukturell aufgeklärt. Desweiteren konnte durch 27Al-MAS-NMR-Spektroskopie an Kristallen im Vergleich mit 27Al-NMR-Spektren von Reaktionslösungen nachgewiesen werden, dass die kristallisierten Aldarato-aluminate auch in Lösung die Hauptspezies darstellen. Durch Umsetzung von Tartronsäure mit Aluminium(iii)- bzw. Gallium(iii)-Salzen und Alkalihydroxiden lassen sich aus den sauren Lösungen Kristalle der isotypen Natriumsalze Na6[M3(C3H2O5)3(C3HO5)3] · 15,6H2O (17: M = Al, 19: M = Ga) bzw. isotypen Kaliumsalze K6[M3(C3H2O5)3(C3HO5)3] · 8H2O (18): M = Al, 20: M = Ga) isolieren, deren drei cyclisch über Ecken verknüpfte MO6-Oktaeder ein neues Baumotiv in der Al- bzw. Ga-Koordinations-Chemie außerhalb der Strukturchemie der Oxide und Hydroxide darstellen. Durch Simulation der 27Al-MAS-NMR-Spektren mit Hilfe der drei Spin-Funktionen der kristallographisch unabhängigen Aluminium-Kerne in 17 lassen sich die isotropen chemischen Verschiebungen berechnen (δCSiso = 14,4; 17,0 und 19,3), deren Mittel sehr gut mit dem in Lösungen von Kristallen und Reaktionslösungen zu beobachtenden breiten Hauptsignal bei 16,8 ppm übereinstimmt. Aus vergleichbaren Reaktionslösungen mit Indium(iii)-nitrat lässt sich das neuartige vierkernige Indat Na6[In4(C3HO5)6(H2O)2] · 8H2O (21) gewinnen, in dem jedes Indium- Atom siebenfach von Sauerstoff koordiniert wird. Viele Arbeitsgruppen versuchten bislang vergeblich die Kristallisation einer Aluminium-tartrat-Verbindung. In dieser Arbeit konnte erstmals die Kristallstruktur eines Tartarto-aluminats (Cs2[Al6(H2O)6((l-Thr1,4A2)7H−20)] · 19H2O (22)) vorgestellt werden. Im sechskernigen Komplex liegen sieben l-Tartrato-Liganden unterschiedlichen Protonierungsgrads vor. Alle funktionellen Gruppen der Liganden sind an der oktaedrischen Koordination der Aluminium-Atome beteiligt, und die sechs offenen Koordinationstellen werden durch Aqua-Liganden abgesättigt. Aus sauren Lösungen lassen sich die zweikernigen, isotypen Cäsiumsalze der Xylarato-metallate Cs[M2(Xyl1,5A21,2,5H−3)(Xyl1,5A21,2,4,5H−4)(H2O)4] · 3H2O (23: M = Al, 25: M = Ga) kristallisieren. Diese zeichnen sich wie eine zweite Modifikation des Aluminats Cs[Al2(Xyl1,5A21,2,5H−3)(Xyl1,5A21,2,4,5H−4)(H2O)4] · 6H2O (24) durch eine starke intramolekulareWasserstoffbrückenbindung zwischen den beiden Liganden aus, bei der sich die beiden Sauerstoff-Atome bis etwa 242pm nahe kommen. Zur Koordination der beiden isolierten MO6-Oktaeder werden trotz vorhandener freier Hydroxygruppen der Liganden zusätzlich je zwei Aqua-Liganden herangezogen. Wiederum lässt sich zeigen, dass das kristallisierte Aluminat (δCSiso = 21,9; 23,4) auch die Hauptspezies (δ = 22,5) in Lösung darstellt. Seine Sonderstellung in der Kohlenhydrat-Polyolat-Chemie unterstreicht Aluminium bei den Galactarato-aluminaten Na6[Al6(Gal1,6A21,2,5,6H−4)4(OH)8] · 21H2O (26) und K6[Al6(Gal1,6A21,2,5,6H−4)4(OH)8] · 23H2O (27), die aus alkalischen Lösungen kristallisiert werden konnten. Die Strukturanalyse zeigt ein Cyclohexaaluminat, in dem pro Al vier Baseäquivalente gebunden sind. Diese 24 Baseäquivalente liegen nicht ausschließlich in Form von deprotonierten Gruppen am Galactarat vor, sondern acht µ-Hydroxo-Liganden stellen zusammen mit vier tetraanionischen Galactarato-Liganden die Sauerstoff-Ligator-Atome für den Ring aus sechs kantenverknüpften AlO6-Oktaedern bereit. Die anhand der Simulation des 27Al-MAS-NMR-Spektrums ermittelten Verschiebungen (¯δCSiso = 20,1) stimmen mit dem sehr breiten Hauptsignal in den Lösungsspektren der Reaktionslösungen bei etwa 20 ppm überein. Daneben befindet sich ein nicht unbeträchtlicher Anteil von [Al(OH)4]− in Lösung. d-Mannaro-1,4-3,6-dilacton wirkt in alkalischen Lösungen reduzierend und zersetzt sich leicht. Im letzten Teil der Arbeit gelang es in HPLC-unterstützten Untersuchungen einen Weg zu finden, ausgehend vom Dilacton über den Umweg der Umsetzung zum d-Mannarsäurediamid und der anschließenden Verseifung zu stabilen, reinen d-Mannarat-Lösungen zu gelangen, die sich zur weiteren Umsetzung mit Metallsalzen eignen. Die bevorzugte Koordination von Metallen durch Aldarate erfolgt durch die Ausbildungvon Chelatfünfringen mit der doppelt deprotonierten α-Hydroxy-Carbonsäure-Einheit. Desweiteren wurden die Koordinationen durch 1,2-ständige Diolate (Chelatfünfringe), 1,3-ständige Diolate (Chelatsechsringe, nur bei 9), eine 1,2,3-Triolat-Einheit (facial durch einen Xylarato-Liganden in 9) und durch 1,3-ständige Carboxylatgruppen bei Tartronaten (1–4 mit Cu(ii) und 12 mit Pd(ii)) beobachtet. Während Carboxylatgruppen ausschließlich endständig an Metalle koordinieren, finden sich deprotonierte Hydroxygruppen sowohl in endständigen als auch in µ2- und µ3-verbrückenden Positionen. Es ließ sich zeigen, dass sich aufgrund der leichten Deprotonierbarkeit der Carbonsäure-Funktion und der erhöhten Acidität der α-ständigen Hydroxygruppe die Darstellung von Aldarato-Komplexen bei sehr milden Bedingungen auch im Bereich des physiologischen pH-Werts bewerkstelligen lassen. Die Aldarsäuren eignen sich desweiteren hervorragend zum Aufbau neuartiger oherkerniger Metall-Sauerstoff-Cluster.

In dieser Arbeit werden die ersten Kohlenhydratverbindungen von Rhenium(V) und Rhenium(VI) beschrieben, die durch ein- und zweidimensionale NMR-Spektroskopie in Lösung und durch Einkristall-Röntgenstrukturanalyse untersucht wurden. Es werden zwei Synthesewege für die Darstellung von Rhenium(VI)-Kohlenhydrat-Ver-bindungen vorgestellt (Schema 2.1). Durch Reduktion von ReVII2O7 mit PPh3 konnte der Komplex [{ReVIO(AnErytH−2)}2(µ-O)2(µ-MeOH)] (4) dargestellt werden. Die beiden Komplexe [{(µ-O){ReVIO(MeO)(Me-α-D-Lyxf 2,3H−2)}}2{(µ-O){ReVIO(Me-α-D-Lyxf 2,3H−2)}2}] (5) und [(µ-O){ReVIOCl(AnErytH−2) · MeOH}2] (6) entstanden bei der Oxidation von [ReVOCl4]− mit Sauerstoff. Dabei zeigt sich die starke Oxophilie des stark Lewis-sauren ReVI. Die Metallatome sind über Oxobrücken verknüpft und kommen sich so nahe, dass wie bei 4 Metall-Metall-Wechselwirkungen entstehen können. Der Komplex ist aus zwei [ReVIO2(AnErytH−2)]-Einheiten aufgebaut. Dieser Aufbau ähnelt 6, bei der zwei [ReVIOCl(AnErytH−2)]+-Einheiten über einen O2−-Liganden verbunden sind. Das gleiche Verknüpfungsmuster besitzt die tetranukleare Verbindung 5. Hier sind vier [ReVIO(Me-α-D-Lyxf2,3H−2)]2+-Fragmente mit O2−-Liganden verbunden, wobei an den terminalen Ein-heiten Methanolat koordiniert. Diese Verbindungsklasse ist in erster Linie von wissenschaftlichem Interesse. Ihre hohe Oxidationsempfindlichkeit und hydrolytische Instabilität erlauben keine Verwendung in der Nuklearmedizin. Die Komplexe konnten alle ohne einen Hilfsliganden stabilisiert wer-den. Dies gelang auch bei dem ReV-oxalat-Komplex [(ReVOCl3)2(Ox)]2− (1) und der ReV-kojinat-Verbindung [ReVOCl3(KojiH−1)]− (2). Dabei koordinieren Oxalat und Kojisäure trans zum apicalen Sauerstoff und substituieren ein Chloratom des Eduktes [ReVOCl4]−. Eine formale Re-Re-Doppelbindung besitzt der binukleare Komplex [{ReV(MeO)2Cl2}2 (µ-O)(µ-MeO)]− (3), wobei sich die Metallatome bis auf 2.46 Å nahe kommen. Eingehender wurden die ReV-Komplexe untersucht, bei denen ein Hilfsligand das Kohlen-hydrat-[ReVO]3+-Fragment stabilisiert. Die drei Strukturmuster sind in Abbildung 4.1 aufgeführt. Zusammenfassung 69 OReOONNNNNNBReOOONNN+_IReOOOClNN Abbildung 4.1: Die drei Strukturmuster der heteroleptischen ReV-Komplexe 8–20 (außer 18) mit den Hilfsliganden phen, tpb und dien. Mit phen als Hilfsligand konnten die Komplexe [ReVOCl(phen)(cis-1,2-CptdH−2)] (8), [ReVOCl(phen)(AnErytH−2)] (9), [ReVOCl(phen)(trans-1,2-ChxdH−2)] (10) und [ReVOCl(phen)(Xylt2,3H−2)] (11) röntgenkristallographisch untersucht werden. Die orangen Verbindungen sind gut zugänglich; [ReVOCl4]− wurde in Methanol unter Zugabe von phen und dem Kohlenhydrat umgesetzt. Die entstandenen Komplexe waren bei zu langer Sauerstoffexposition instabil, was auf die Substitutionsstelle des Chlorids zurück-zuführen ist. Durch eine formale Substitution von Chlorid und phen mit dem dreizähnigen tpb-Liganden verbesserte sich die Stabilität der tpb-Komplexe [ReVO(tpb)(AnErytH−2)] (13), [ReVO(tpb)(Me-β-D-Galp3,4H−2)] (14), [ReVO(tpb)(D-Thre2,3H−2)] (15) und [ReVO(tpb)(Eryt1,2H−2)] (16) im Vergleich zu den phen-Komplexen. Ein weiterer Grund für die Oxidationsstabilität der neutralen Verbindungen ist der Chelateffekt. Nachteilig ist ihre schlechte Wasserlöslichkeit. Zur Synthese dieser blauen Substanzen wurde eine me-thanolische Suspension aus [ReVO(tpb)Cl2], dem Kohlenhydrat und der Base Triethylamin zwei Stunden lang unter Rückfluß bei 80 °C gerührt. Auffällig bei 14 ist der niedrige Tor-sionswinkel der chelatisierenden Diol-Einheit mit 32.5 °. Daraus ergibt sich eine Abwei-chung von 23.7 ° im Vergleich zum C3–O3–O4–C4-Torsionswinkel des freien Galactopy-ranosids. Dies ist bisher die größte beobachtete Erniedrigung eines Torsionswinkels einer komplexierenden Diol-Einheit in Pyranosiden. Die Synthese der Rhenium(V)-dien-Kohlenhydrat-Verbindungen ähnelt der Darstellung der phen-Komplexe. Eine methanolische Suspension aus [ReVO2I(PPh3)2], dem Kohlenhydrat-Liganden und dien musste eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt werden. Es entstanden rosa Kristalle mit der Summenformel [ReVO(dien)(AnErytH−2)]I (17), [ReVO(dien)(Me-α-D-Manp2,3H−2)]I (19) und [ReVO(dien)(Me-β-D-Galp3,4H−2)]I (20). Weiterhin wurde ein Adenosin-Komplex mit der postulierten Zusammensetzung [ReVO(dien)(AdoH−2)]I (21) synthetisiert. Die Verbindungen zeichnen sich durch ihre 70 Zusammenfassung Wasserlöslichkeit, ihre Oxidations- und Hydrolysestabilität (bei Raumtemperatur bis zu einer Woche) und durch ihre schnelle Präparation aus. Es gelang, die Mannopyranosid-Verbindung 19 und den Adenosin-Komplex 21 mit Hilfe der HPLC zu charakterisieren. Damit wurde die analytische Basis für die Synthese von radioaktiven Rhenium(V)-Kohlen-hydrat-Verbindungen gelegt. Auf der Grundlage der Darstellungsvorschriften der dien-Verbindungen wurden, ausgehend von 188ReVIIO4−, die radioaktiven Ionen [188ReVO(dien)(Me-α-D-Manp2,3H−2)]+ von (22) und [188ReVO(dien)(AdoH−2)]+ von (23) synthetisiert. Ihre Existenz konnte mit der HPLC-Chromatographie nachgewiesen werden. Nuklearmedizinische Anwendungen dieser radioaktiven Verbindungen werden zurzeit untersucht. Bei den Reaktionen von polyfunktionellen Kohlenhydraten mit Rhenium(V)-Verbindungen sind viele isomere Formen von Oxorhenium(V)-Komplexen möglich. Bei den in dieser Arbeit vorgestellten Verbindungen werden die anti/syn-Isomere beschrieben, in denen der Ligand um 180° um die äquatoriale Ebene gedreht ist. Während die phen-Komplexe empfindlich gegenüber Sauerstoff reagierten, zeichneten sich die Rhenium-Komplexe mit tpb und dien durch ihre kinetische Inertheit aus. Unter dem Aspekt der Synthese stabiler Rhenium(V)-Kohlenhydrat-Verbindungen hat sich das „3 + 2“- dem „2 + 2“-Konzept als überlegen erwiesen. Aufgrund ihrer Stabilität in Lösung können aussagekräftige NMR-Spektren der Oxo-rhenium(V)-Komplexen erhalten werden. Die Resonanzen der Kohlenstoffatome, die an die koordinierenden Sauerstoffe gebunden sind, verschieben sich durch die Komplexierung um bis zu 31.4 ins Tieffeld. Die dem Rhenium(V) nahen Wasserstoffe (H–C–O–Re) erfahren eine Tieffeldverschiebung von bis zu 1.9. Die Zuordnung der Resonanzen zu ein-zelnen Atomen erfolgte mit Hilfe der 2D-NMR-Spektroskopie. Der Erkenntnisgewinn aus der Verzahnung von struktureller Aufklärung und den Reso-nanzverschiebungen in den 1H- und 13C-Spektren führt dazu, dass schon auf Basis von NMR-Verschiebungen zuverlässige Aussagen über die Koordination des Kohlenhydrates an Rhenium(V) getroffen werden können.