Podcasts about homologie

"Kommt homogenisierte Milch von schwulen Kühnen?" Diese und andere absurde Fragen bekommt Comedian, Kabarettist und Theaterpädagoge Malte Anders immer wieder während seiner Auftritte in deutschen Schulen von Schüler:innen gestellt. Mit seinem Programm "Homologie" leistet Malte seit Jahren unterhaltsame und extrem wichtige Aufklärungsarbeit an deutschen Schulen. Wir sprechen mit Malte über die schönen und auch manchmal auch schockierenden Erfahrungen, die er dabei gemacht hat. Wir treffen Malte kurz vor der Premiere zu seinem neuen Programm, dass sich sich mit den 90ern und dem ewigen "Früher war Alles besser" auseinander setzt und erfahren ganz nebenbei, dass er seit Kurzem sogar Vater ist. Ein spannender Mensch in einem umso spannenderen Talk. Dass nicht alle Menschen cool sind haben Maurice und Mitch bei einem Kinobesuch erlebt und teilen ihr Erlebnis mit euch genauso wie die ersten Erfahrungen nach der Hochzeit mit neuem Nachnamen. Außerdem müssen wir in dieser Folge noch einmal über den Kölner Taubenkiller sprechen, denn dieses Thema hat alle Zuhörlinge bewegt und für viele Reaktionen gesorgt. Viel Spaß beim Hören.

Evolution Zusammenfassung: Theorien, Homologie, Artbildung, Selektion, Isolationsmechanismen, Mensch

Der Hass gegenüber queeren Menschen nimmt in Deutschland zu. Deshalb geht Timo Becker als Malte Anders in Schulen und unterrichtet dort das Fach „Homologie“. Dabei gibt er einen humorvollen Einblick in das Thema Homosexualität und die Normalität des Anders-Seins und benennt das Thema Ausgrenzung, Diskriminierung sowie Mobbing. Damit möchte er Verständnis und Toleranz wecken. Über seine Erfahrungen in und außerhalb der Schulen berichtet Timo Becker in diesem erkenntnisreichen, unterhaltsamen und auch lustigen Gespräch.

Kreationisten nehmen die Schöpfungsgeschichte wörtlich, und halten die Synthetische Evolutionstheorie für Quatsch. In diese Folge werden 1.) kreationistische Argumente aufgeführt und 2) wissenschaftliche Forschungsergebnisse beleuchtet. PS: Übrigens ist die Synthetische Evolutionstheorie von der katholischen Kirche anerkannt. Fachbegriffe: Mikroevolution, Makroevolution, Grundtypen, Intelligent Design, Miller-Experiment, Nukleotide, Kohlenhydrate, RNA, DNA, Proteine, genetischer Code, Ribozyme, Atavismen, Rudimente, Homologie, Fossilien, biogenetische Grundregel, Mosaikformen, Endosymbiontentheorie, Prokaryoten, Eukaryoten, aerob, anaerob, Fotosynthese, DNA-Sequenzanalyse, Mythos, Logos... PPS: In der Folge spreche ich von Vitamin D ... es ist Vitamin B12. Macht für den Inhalt aber keinen Unterschied :) Danke für deine Bewertung bei iTunes und schau super gern in das Skript des Podcasts, wo du relevante Inhalte zusammengefasst findest!

Ist ein ähnliches Merkmal - die Stacheln von Igel und Ameisenigel - ein Beleg für die enge Verwandtschaft der zwei Arten? Oder... nicht? Relevante Fachbegriffe: Homologie, Analogie, Kriterium der Lage, Kriterium der spezifischen Qualität, Kriterium der Stetigkeit, homologe Gene, konvergente Entwicklung, Progressionsreihe, Regressionsreihe. Schreibe dein Feedback an biologopodcast@googlemail.com und hinterlasse eine Bewertung bei iTunes. Viel Lernerfolg wünsche ich dir!

durée : 00:58:45 - Les Cours du Collège de France - Qu’est-ce qui se joue dans la distinction entre analogie et homologie et comment la trompe de l’éléphant peut-elle nous aider à y voir clair entre ces deux formes de comparatisme? Philippe Descola revient sur les débats autour des différentes méthodes de comparatismes au XXe siècle. - réalisation : Laure-Hélène Planchet - invités : Philippe Descola Anthropologue, professeur au Collège de France (titulaire de la chaire d’Anthropologie de la nature) et ancien directeur du Laboratoire d’anthropologie sociale (LAS)

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.

Das Paprika Resistenzgen Bs4C aus Capsicum pubescens vermittelt Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)-Stämmen, die den (transcription activator-like) TAL-Effektor AvrBs4 exprimieren. Vorangegangene Arbeiten ließen vermuten, dass AvrBs4 die Expression von Bs4C transkriptionell induziert. In einem “proof of principle”-Experiment, wurde Bs4C unter Verwendung eines RNA-Seq-basierten Ansatzes isoliert. Unter 68 differentiell AvrBs4-induzierten Paprikagenen war jedoch nur eines, das ausschließlich in der resistenten und nicht in der suszeptiblen Akzession induziert war und für das kein Transkript in Abwesenheit von AvrBs4 in der resistenten Akzession nachgewiesen wurde. Kopplungs- und Komplementationsanalysen bestätigten dieses Kandidatengen als das gesuchte Resistenzgen Bs4C. Im Bs4C-Promoter konnte ein Effektorbindeelement (EBE) für AvrBs4 identifiziert werden, das notwendig und ausreichend für die AvrBs4-Bindung an und transkriptionelle Aktivierung von Bs4C ist. Bindungsstudien ließen erkennen, dass zwei Nukleotidpolymorphismen in der korrespondierenden Region der suszeptiblen Akzession eine stark reduzierte Affinität (10fach) gegenüber AvrBs4 bedingen. Außerdem zeigten GUS-Studien, dass der Promoter des suszeptiblen Allels nicht durch AvrBs4 induzierbar ist. Folglich bestimmt ein Substitutionspolymorphismus von zwei Basenpaaren in den Promotoren des resistenten und suszeptiblen Bs4C-Allels über Resistenz oder Suszeptibilität gegenüber AvrBs4-exprimierenden Xanthomonaden. Bs4C kodiert für ein 164-AS großes Protein, das keine Homologie zu Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. In silico Proteinstrukturanalysen sagen vier Transmembranhelices in Bs4C vorher und demzufolge stellt es einen neuen Typ von Exekutorproteinen dar, welcher Resistenz gegen TALE-exprimierende Xanthomonas-Stämme vermittelt. Zudem konnten Sequenzanalysen mindestens ein Homolog in C. pubescens und mindestens sieben Homologe in C. annuum identifizieren. Interessanterweise kodieren die meisten von ihnen aufgrund von Nukleotidaustauschen, Leserahmenverschiebungen und Insertions/Deletionspolymorphismen nicht für Volllängen Bs4C-ähnliche Proteine. Folglich könnten diese homologen Sequenzen duplizierte Gene repräsentieren, die nicht mehr funktional sind.

Prof. Dr. Wolfgang Lück befasst sich am HIM (Hausdorff Research Institute for Mathematics) und dem Mathematisches Institut der Universität Bonn mit der Topologie von Mannigfaltigkeiten und Flächen wie auf einem Torus oder einer Kugel. Speziell für Kugeln und Kreise gibt es die Sphären-Notation , die die Oberflächen des Objekts im beschreiben. Damit ist eine Kreislinie und die Kugeloberfläche.Auch wenn Flächen lokal ähnliche Eigenschaften haben, kann die Situation global ganz anders aussehen: So unterscheidet sich die Vorstellung einer flachen Erde lokal nicht von der Kugelform der Erde, global sieht es aber ganz anders aus. Ebenso kennen wir auch jetzt noch nicht sicher die Topologie des Weltalls. Dazu beschränkt sich unser Vorstellungsraum oft auf drei Dimensionen, obwohl schon die relativistische Physik uns lehrt, unsere Umgebung als Raumzeit in 4 Dimensionen zu verstehen.Bei der Klassifikationen von Flächen auf unterschiedlichen Körpern verwendet man Homöomorphismen um ähnliche Flächen einander zuzuordnen, und letztlich unterscheiden sich die Flächenklassen dann nur noch durch die Anzahl der Löcher bzw. dem Geschlecht, was dann auch die Eigenschaften der Flächen bestimmt. Ein Weg das Geschlecht der Fläche zu bestimmen ist die Triangularisierung, eine andere Möglichkeit bietet die Analyse des Spektrums eines Operators wie dem Laplace-Operators, das auch in der Topologie von Graphen zum Einsatz kommen kann.Ein Beispiel für die Anwendung des Laplace-Operators ist die Wärmeleitungsgleichung, die zwar die lokalen Eigenschaften des Wärmetransports beschreibt, jedoch das Wärmegleichgewicht nach unendlicher Zeit die globalen Zusammenhänge beinhaltet. Ein wichtiger Begriff ist hier der Integralkern, der hilft Lösungen durch Integraloperatoren darzustellen.Ein wichtiger mathematischer Begriff ist dabei der -Funktionenraum, der über die Fourier-Transformation auf bestimmten Gebieten mit dem -Folgenraum identifiziert werden kann, und man dadurch auf Lösungen von partiellen Differentialgleichungen schließen kann.Besonderes Interesse liegt in der Topologie auf Invarianten, wie der Fundamentalgruppe, mit der man auch den Fundamentalsatz der Algebra beweisen kann. Ein weiteres Beispiel für eine Invariante ist die Windungszahl, die gerade in der Funktionentheorie zum Residuensatz und effizienten Integralberechnungsmethoden führt.Dabei entstehen oft nicht kommutative Verknüpfungen, wie man es zum Beispiel von der Matrizenmultiplikation oder den Symmetriegruppen kennen kann.Ein elementarer Einstieg in die Topologie ist auch über die Knotentheorie möglich, wo ebenso Knoten-Invarianten gefunden werden können, und über zum Beispiel Jones-Polynome klassifiziert werden können.Im weiteren Gespräch geht es um Themen wie die unterschiedlichen Bilder der Mathematik in Gesellschaft, Schule und Universität, die Bedeutung der Mathematik für Gesellschaft, die Ausbildung für Industrie und das Lehramt, und über den Stand und Möglichkeiten der Gleichberechtigung und Förderung von Frauen in der Wissenschaft.Literatur und Zusatzinformationen W. Lück: Was und wie zählt man im Alltag und in der modernen Mathematik? Vortrag im Kolloquium zur Didaktik der Mathematik, Karlsruhe, Dezember 2014. W. Lück: Algebraische Topologie, Homologie und Mannnigfaltigkeiten, Vieweg Spektrum, 2005. W. Lück: Transformation Groups and Algebraic K-Theory, Lecture Notes in Mathematics, 1989. Publikationen von Wolgang Lück Wolfgang Lück in der Wikipedia

Vor Beginn dieser Arbeit war ein A. fumigatus-Protein (Chp: CipC homologes Protein) mit unbekannter Funktion und hoher Homologie zum CipC-Protein aus A. nidulans als prominentes hyphenspezifisches Protein identifiziert worden (Schwienbacher, 2005). Weiterhin gab es zu diesem Zeitpunkt Hinweise, dass ein zu CipC homologes Protein in C. neoformans eine wichtige Rolle während der Virulenz spielt (Steen et al., 2003). In dieser Arbeit sollte die biologische Funktion des pilzspezifischen Proteins genauer untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper gegen Chp, mehrere Reporterstämme sowie eine Deletionsmutante hergestellt. Die erhobenen Daten zeigen, dass Chp als Monomer im Cytosol der Hyphen vorliegt. Dabei zeigte sich eine gleichmäßige Verteilung eines GFP-Fusionsproteins innerhalb der Hyphen; nur die Vakuolen schienen ausgespart. Die Identifikation des Proteins auf der Sporenoberfläche von A. fumigatus (Asif et al., 2006) wurde wiederlegt und die differentielle Expression des Proteins bestätigt. Anders als in A. nidulans (Melin et al., 2002) wirkt das Antibiotikum Concanamycin A auf die Bildung von Chp in A. fumigatus nicht induzierend. Da diese Tatsache sowohl für die Na-mensgebung von CipC, als auch für die Namensgebung von Chp verantwortlich war, sollte das A. fumigatus-Protein umbenannt werden. Die Wahl des Namens fiel auf NrpA (Nitrogen regulated protein A), da die Bildung des Proteins von der N-Quelle abhängig ist. Die N-abhängige Regulation war für ein homologes F. fujikuroi Gen auf RNA-Ebene bereits bekannt (Teichert et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte sie in A. fumigatus und erstmals auf Proteinebene bestätigt werden. Desweiteren wurden auch neue N-Quellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass NrpA in Anwesenheit der N-Quellen Glutamat, Nitrat oder Harnstoff nicht gebildet wird, wohin-gegen Komplexmedien sowie die N-Quellen Ammonium, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Valin und Tryptophan zur Bildung des Proteins führen. In Kombination einer induzierenden und einer unterdrückenden N-Quelle dominiert stets die induzierende. In Reporterstämmen (gfp; lacZ) fand diese negative Regulation der Bildung von NrpA nicht statt. Das Protein wurde sowohl in Anwesenheit einer normalerweise unterdrückenden N-Quelle, als auch in den Sporen gebildet. Weiterhin nimmt die gebildete Menge von NrpA sowohl bei längeren Inkubationszeiten, als auch bei Verwendung höherer Animpfdichten zu. Wird der Pilz zunächst mit einer die NrpA-Bildung unterdrückenden N-Quelle angezogen und dann in Medium mit einer induzierenden N-Quelle umgesetzt, dauert es 6 h bis eine Bildung von NrpA verzeichnet werden kann. Diese Zeitspanne blieb auch in einem inversen Experiment gleich. Als nächstes wurde untersucht, ob NrpA in A. fumigatus unter Stressbedingungen von Bedeutung ist. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl osmotischer Stress, als auch oxidativer Stress, der durch Menadion verursacht wird, kei-ne Auswirkung auf die gebildete NrpA-Menge hat. Dagegen führt durch H2O2 verursachter Stress zu einem veränderten Laufverhalten von NrpA in SDS-Gelen. Das Protein scheint unter diesen Umständen ein höheres Molekulargewicht zu haben. Mithilfe eines A. fumigatus-Reporterstammes, der ein NrpA-GFP-Fusionsprotein bildet, konnte gezeigt werden, dass H2O2 auch zu einer veränderten Lokalisation von NrpA führt. Das sonst gleichmäßig in den Hyphen verteilte Protein formierte sich in punktförmigen Strukturen. Auch unter Mangelbedingungen spielt NrpA keine wichtige Rolle, denn weder ein C- noch ein N-Mangel verändert die gebildete Menge des Proteins. Dient die normalerweise die NrpA-Bildung induzierende N-Quelle Glutamin als C- und N-Quelle wird NrpA nicht gebildet. Ebenso wie in F. fujikuroi (Teichert et al., 2002) wird die Bildung des NrpA-Proteins durch MSX, einem Inhibitor der Glutaminsynthetase, fast vollständig inhibiert. Anders als in F. fujikuroi (Teichert et al., 2006) verursachte die Inhibierung der TOR-Kinase durch Rapamycin keinen Effekt auf die Bildung von NrpA. Auch durch eine her-gestellte Deletionsmutante konnte die biologische Funktion von NrpA nicht geklärt werden. In zahlreichen vergleichenden Untersuchungen verhielt sich die Mutante ebenso wie der Wildtyp. Der einzige dokumentierte Unterschied zwischen Mutante und Wildtyp ist eine verstärkte Bil-dung der Katalase 1 in der Deletionsmutante. Anders als angenommen spielt NrpA während der Virulenz von A. fumigatus keine Rolle. In einem Virulenzmodell in embryonierten Hühnereiern verhielten sich Deletionsmutante und Wildtyp gleich. Auch in murinen Makrophagen führten die Deletionsmutante und der Wildtyp etwa zu vergleichbaren Mengen an ausgeschüttetem IL-10 und TNFα. Ein potentieller Nutzen von NrpA bei der Diagnose der allergischen bronchoalveolaren Aspergillose (ABPA) konnte ebenso ausgeschlossen werden. Neben NrpA waren im Vergleich der Proteinmuster der verschiedenen A. fumigatus-Morphotypen auch weitere differentiell exprimierte Proteine aufgefallen. Eines davon war eine MnSOD (Aspf6), die bis dahin auch als mitochondriale MnSOD bezeichnet wurde (Rementeria et al., 2007). Da im Genom von A. fumigatus aber eine weitere MnSOD kodiert ist, die über eine putative Mitochondriensignalsequenz verfügt, sollte in einem zweiten Teil der Arbeit die tat-sächliche Lokalisation dieses Proteins gezeigt werden. Dafür wurden zunächst monoklonale Antikörper gegen das Protein hergestellt. Eine mitochondriale Lokalisation der MnSOD mit puta-tiver Signalsequenz konnte gezeigt werden. Dabei wurden sowohl Western-Blots als auch ein A. fumigatus-GFP-Reporterstamm verwendet. Weiterhin konnte das Protein genauer charakteri-siert werden. Im Gegensatz zu Aspf6, das nur in den Hyphen des Pilzes zu finden ist, wurde die mitochondriale MnSOD sowohl in den Sporen, als auch in den Hyphen nachgewiesen. Die gebil-dete Menge des Proteins verändert sich im Zeitverlauf nicht. Lediglich zu sehr späten Wachs-tumszeitpunkten in der späten stationären Phase war ein leichter Anstieg zu beobachten. Die gebildete Menge des Proteins hing auch nicht von der Animpfdichte der Kultur ab. Anders als Aspf6, das bekannterweise ein Homotetramer bildet (Flückiger et al., 2002), scheint die mitochondriale MnSOD als Dimer vorzuliegen. Auch in Antwort auf oxidativen Stress verhielten sich die beiden MnSODs unterschiedlich. Menadion, das innerhalb der Zelle die Bildung von Su-peroxidanionen bewirkt, führte zu einem leichten Anstieg der Proteinmenge der mitochondrialen MnSOD, während Aspf6 unverändert blieb. Als Folge von oxidativem Stress, der durch H2O2 verursacht wird, zeigte Aspf6 eine leichte Verringerung, während die mitochondriale MnSOD schnell abgebaut wird. In einem dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der Atmung während der Auskeimung von A. fumigatus genauer untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteinbiosynthese für den Auskeimungsprozess unbedingt notwendig ist. Desweiteren wurde mit Hilfe unterschiedli-cher Methoden eine sehr frühe Aktivierung der Atmungskette während des Auskeimungspro-zesses nachgewiesen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Sauerstoff für das Wachstum von A. fumigatus unbedingt erforderlich ist. Im anaeroben Milieu konnten die Konidien weder anschwellen noch auskeimen. Auch bereits vorhandene Hyphen konnten unter Abwesenheit von Sauerstoff nicht weiterwachsen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass A. fu-migatus anders als A. nidulans (Takasaki et al., 2004) nicht über die Fähigkeit verfügt, im Anae-roben durch eine Fermentation von Ammonium zu überleben. In dieser Arbeit wurde ebenso wie in anderen aktuellen Arbeiten (Williger et al., 2008) die Fähigkeit von A. fumigatus, in hypoxischen Umgebungen zu wachsen, nachgewiesen.

Neben der fehlerfreien Weitergabe der genetischen Information während der Zellteilung durch einen intakten Replikationsapparat, ist auch die Aufrechterhaltung der genetischen Integrität der DNA durch Reparaturenzyme entscheidend für das Überleben der Zellen, sowie für einen gesunden Organismus. Um die genomische Integrität zu wahren, entwickelten sich im Laufe der Evolution verschiedene Mechanismen, u.a. die Exzisionreparatur von geschädigter DNA oder die direkte chemische Reversion der DNA Schäden. Letztere wird durch die Proteinfamilie der Photolyasen katalysiert, welche die einzigartige Fähigkeit besitzen, Pyrimidindimere mit Hilfe von UV-A/B- oder Blaulicht (λ = 320-500 nm) zu spalten. Je nach Art des Substrates lassen sich die Photolyasen in die CPD und die (6-4) Photolyasen unterteilen. Die (6-4) Photolyasen zeigen untereinander, auf die gesamte Sequenzlänge bezogen, eine Homologie von lediglich 25 %. Im Gegensatz zu den CPD Photolyasen existierten von den (6-4) Photolyasen keine genaueren Informationen über die Zusammensetzung der Cofaktoren sowie über den Mechanismus der Photoreaktivierung, der möglicherweise über ein kurzlebiges Oxetanintermediat verläuft. Aufgrund spektroskopischer Messungen von X. laevis (6-4) Photolyase wurde vermutet, dass auch, wie bei den CPD Photolyasen, FAD als einer der beiden möglichen Cofaktoren vertreten ist.(1) Ein zweites, lichtsammelndes Chromophor konnte jedoch bisher nicht identifiziert werden.

Hallo und herzlich Willkommen zur 24ten www.abitour.net Folge! Heute beschäftigen wir uns mit dem riesigen Feld der Homologieforschung. Dabei gehen wir nicht nur auf morphologische Homologien ein (Wirbeltierextremität), sondern natürlich auf auf die molekularen Homologien. Wir diskutieren viele Methoden um Homologie festzustelen, darunter: Immun-Präzipitin Test, DNA-Sequenz Analyse, Aminosäuresequenzanalyse, DNA-Hybridisierung und einige andere. Natürlich besprechen wir auch Analogien und den wichtigen Unterschied zu den Homologien. Viele wichtige und zentrale Aspekte fur Belege für die Evolution werden hier besprochen, in einem 2.500 Wörter langem PDF sogar nochmals intensiviert. In diesem Sinne Viel Spaß Olli und Sven Bitte Spendet uns uns helft uns den traffic zu bezahlen

Die Familie der Sorting Nexine (SNX) umfasst 33 bekannte Mitglieder, jedoch ist der Funktionsmechanismus vieler Sorting Nexine bislang nicht aufgeklärt. Auf der Suche neuer Modulatoren der βAPP-Proteolyse konnte im Rahmen eines Expressionsklonierungs-Screens (Schobel et al., 2006) ein bislang nicht beschriebenes Protein, Sorting Nexin 33 (SNX33), als Aktivator der βAPP-Proteolyse identifiziert werden. SNX33 ist ein phosphoryliertes Protein, das ubiquitär exprimiert wird und zudem eine hohe Homologie zu den Proteinen SNX9 und SNX18 aufweist. SNX33 ist im Zytosol lokalisiert, kann jedoch auch Membran-assoziiert vorliegen. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression von SNX33 zu einer Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose und in Folge dessen zu einer etwa 50% -igen Reduktion der βAPP-Endozytose führt. Die von SNX33 induzierte Endozytosehemmung wird durch die SH3-Domäne des Proteins vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführte Koimmunpräzipitationsstudien zeigten, dass SNX33 mittels seiner SH3-Domäne mit Dynamin interagiert und auf diese Weise möglicherweise dessen Funktion moduliert. In Übereinstimmung mit den durchgeführten Zellkultur-Experimenten führte eine Überexpression von SNX33 im Modellorganismus Caenorhabditis elegans ebenfalls zu einem Dynamin-Funktionsverlust. Da SNX33 Expression zu einer generellen Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose führt, handelt es sich dabei nicht um einen spezifischen βAPP-Modulator. Konsequenz einer reduzierten βAPP-Internalisierung ist eine starke Zunahme der neurotrophen sAPPα-Bildung sowie - je nach verwendeter Zelllinie - ein leichter Anstieg bzw. eine geringe Reduktion der pathogenen sAPPβ-Generierung. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression der homologen Proteine SNX9 und SNX18 ebenfalls zu einer Zunahme der βAPP-Spaltung führt. Es handelt sich also um einen Effekt, der von der ganzen Sorting Nexin-Subgruppe (SNX33/SNX9/SNX18) vermittelt wird. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass diese Funktion innerhalb dieser Subgruppe konserviert ist. Transfektion von SNX1 führte zu keiner Änderung der βAPP-Proteolyse, was bedeutet, dass dieser Effekt nicht von der gesamten Sorting Nexin-Familie vermittelt wird. Interessanterweise ist die Spaltung von βAPP besonders sensitiv bezüglich einer veränderten Endozytose-Rate, da die Proteolyse der Transmembranproteine L-Selektin und des Tumornekrosisfaktor-Rezeptors 2 (TNFR2) unter SNX33 Überexpressionsbedingungen nicht signifikant verändert war. Ein siRNA-vermittelter Knock-Down von SNX33 führte zu keiner generellen Endozytoseinhibition in HEK293 Zellen, es konnte keine veränderte βAPP-Endozytoserate beobachtet werden. Die Bildung von sAPPα- und sAPPβ war in Folge dessen unverändert. Auch ein lst-4/SNX33-Knock-Down in C. elegans führte überraschenderweise zu keiner Inhibition der Dynamin-Funktion, äußerte sich jedoch in einer Fehlfunktion der Insulin-Signaltransduktion. SNX33-Knock-Down in humanen Zellen brachte keine nachweisbare Beeinträchtigung des Insulinsignalweges mit sich, jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Homologen SNX9 und SNX18 einen Verlust von SNX33 kompensieren können. Dabei gilt zu beachten, dass eine Funktionsübernahme durch homologe Proteine in C. elegans nicht möglich ist, da dieser Organismus nur ein einziges homologes Protein der SNX33/SNX9/SNX18-Subgruppe besitzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit präsentierten sowie diskutierten Daten zeigen, dass SNX33 in unterschiedliche zellulärer Prozesse involviert ist. SNX33 ist ein neu identifizierter Modulator der Zelle, der für zentrale Signalwege und Vorgänge, wie zum Beispiel der Insulinrezeptor-Signaltransduktion und Endozytose, von Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Modellorganismus C. elegans kann im humanen Zellkultursystem ein durch siRNA induzierter Funktionsverlust von SNX33 durch die homologen Proteine SNX9 und SNX18 kompensiert werden.

Die Existenz eines Zytoskeletts galt lange als charakteristisches Merkmal eukaryotischer Zellen. Obwohl sich mit der Entdeckung der eubakteriellen Zytoskelettproteine MreB, ParM, FtsZ und CreS ein Paradigmenwechsel vollzog, lagen bislang keine Erkenntnisse über das Vorkommen von Zytoskelettproteinen in Archaeae vor. Der erste Teil der Arbeit beschreibt die strukturelle und biochemische Charakterisierung des Aktinhomologen Ta0583 aus dem Archaeon Thermoplasma acidophilum. Die Kristallstruktur von Ta0583 wurde mit der Methode der SAD-Phasierung bei einer Auflösung von 2,1 Å gelöst. Ta0583 gehört zur Aktin/Hsp70 Superfamilie und besteht aus zwei Domänen, die jeweils das Aktin/Hsp70 Kernelement enthalten. Obwohl Aktin und das archaeale Ta0583 kaum Sequenzidentität aufweisen, besteht eine deutliche strukturelle Homologie. Die Struktur von Ta0583 kombiniert strukturelle Eigenheiten sowohl von Aktin, als auch von den eubakteriellen Aktinhomologen MreB und ParM. So konnte beispielsweise die strukturelle Ähnlichkeit der Nukleotidbindungsstellen von Ta0583 und MreB in vitro durch den Effekt des MreB-Inhibitors S-(3,4-Dichlorobenzyl)-isothioharnstoff (A22) nachgewiesen werden, der die ATPase Aktivität von Ta0583 kompetitiv hemmt. Im Kristallgitter sind die Ta0583 Monomere in Filament-ähnlichen Reihen angeordnet, in denen ähnliche longitudinale Gitterabstände wie in den Protofilamenten von MreB, Aktin und ParM vorliegen. In vitro bildet Ta0583 kristalline Schichten, die ähnliche Gitterabstände wie die quasi-Filamente im Kristall aufweisen. Die Bereitwilligkeit von Ta0583 zur Kristallisation und zur Bildung kristalliner Schichten könnte eine intrinsische Neigung des Proteins zur Bildung von filamentartigen Strukturen andeuten. Das Vorkommen eines Aktin-Homologen im Archaeon T. acidophilum gibt erste Hinweise auf das Vorkommen möglicher Zytoskelettstrukturen neben Eukaryoten und Eubakterien auch in der dritten Domäne des Lebens, den Archaeae. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der strukturellen und biochemischen Charakterisierung des in S. cerevisiae essentiellen Stoffwechselenzyms Ugp1p, der UDP-Glukose Pyrophosphorylase (UGPase). Die UGPase katalysiert die Synthese von UDP-Glukose, einem zentralen Glykosyldonor im Stoffwechsel aller Organismen. In S. cerevisiae ist die UGPase ein Oktamer aus identischen Untereinheiten. Obwohl oktamere UGPasen schon in den 1960iger Jahren erstmals charakterisiert wurden, blieb die strukturelle Basis für die Assoziation der Monomere im Komplex bis heute unaufgeklärt. In dieser Arbeit wurde die Struktur von Ugp1p durch Molecular Replacement mit der Struktur einer monomeren UGPase aus A. thaliana bei einer Auflösung von 3,1 Å gelöst. Das Ugp1p Monomer besteht aus drei Domänen, einer N-terminalen Domäne, einer katalytischen SGC-Kerndomäne und einer C-terminalen Oligomerisierungsdomäne mit -Helix Motiv. Anhand der Struktur von Ugp1p konnten mehrere Aminosäurereste identifiziert werden, die die Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten im Oktamer vermitteln. Diese vorwiegend hydrophoben Reste sind in den UGPasen von Tieren und Pilzen konserviert, in den UGPasen der Pflanzen jedoch durch polare und geladene Reste ersetzt. Aufgrund der Konservierung der Reste im Bereich der Oligomerisierungs-Schnittstelle ist davon auszugehen, dass alle UGPasen aus Metazoen und Pilzen Ugp1p-ähnliche Oktamere bilden, pflanzliche UGPasen dagegen anders aufgebaut sind. Während die Aktivität pflanzlicher UGPasen über Assoziation und Dissoziation reguliert zu sein scheint (Martz et al., 2002), sind UGPasen aus Metazoen und Pilzen nicht über Oligomerisierung reguliert. So bildet Ugp1p ausschliesslich stabile Oktamere. In Ugp1p scheint vielmehr das flexible N-terminale Segment, das auch an Ser11 phosphoryliert gefunden wurde (Rutter et al., 2002), die Regulation der Enzymaktivität zu vermitteln. Die Struktur von Ugp1p bildet die Grundlage für gezielte Mutagenesestudien an allen UGPasen aus Metazoen und Pilzen.

In dieser Studie wurde der genetische Defekt der 25-Hydroxyvitamin D3 1α-Hydroxylase (CYP27B1) der PVDR I-Schweine beschrieben. Diese Tiere stellen ein gutes Modell für die Pseudo-Vitamin-D-Mangel-Rachitis Typ I (PVDR I) dar. Die 1α-Hydroxylase ist ein Enzym, dass 25(OH)D3 zu seiner hormonellen Form aktiviert. Wie bei der echten Vitamin-D-Defizienz resultiert die Unfähigkeit Vitamin D3 zu aktivieren in Symptomen der Rachitis. Diese Tiere zeigen niedriege 1,25(OH)2D3-Blutspiegel, hochgradige Hypocalcämie, rachitische Veränderung des Skeletts und erhöhte Parathormon-Blutwerte. Diese Störung trat als spontane Mutation in den 60iger Jahren bei einer Zuchtlinie in Hannover auf. Wir konnten eine Splice-Site-Mutation in der Splice-Donor-Site von Intron 6 (IVS6+1G>A) ausfindig machen. In der cDNA von renalen und nicht-renalen Geweben wurde eine Deletion von Exon 6 gefunden, die in einem Frameshift und in einem verfrühten Stop-Codon resultiert. Zudem analysierten wir die Promotor-Region und die genomische Organisation des porcinen 1α-Hydroxylase-Gens bei dem eine hohe Homologie zum humanen 1α-Hydoxylase-Gen festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde die Expression in der Niere und verschiedenen nicht-renalen Geweben, wie der uterinen Cervix, Haut, Lymphknoten, Nebenniere und dem Colon, ermittelt. Da alle Gewebe dieselbe defekte 1α-Hydroxylase exprimieren, gehen wir davon aus, dass das Enzym in den PVDR I-Schweinen enzymatisch inaktiv ist. Die Information über die Punktmutation wurde für die Entwicklung einer neuen, PCR-basierten Genotypisierungsmethode genutzt. Durch die Mutation wurde eine einmalig vorkommende Restriktionsschnittstelle für Bpu10I ausgelöscht, was die Genotypisierung mittels Restriktions-Längen-Fragment-Polymorphismus (RFLP) erlaubte. Zusätzlich etablierten wir eine Amplifikations-Refraktär-Mutations-System-PCR (ARMS), um die Genotypisierung von homozygoten, heterozygoten und Wildtyp-Genotypen zu vereinfachen. Die Expressionsspiegel der 1α-Hydroxylase wurden in einigen Geweben mittels quantitativer PCR in Wildtyp- und homozygoten Tieren bestimmt. In der Niere war die Expression gegenüber den Wildtyp-Tieren signifikant reduziert, wobei in der Haut keine Unterschiede gefunden wurden. Die Aktivierung von Blut-Makrophagen, mit Hilfe von Interferon γ, bewirkte einen Anstieg der 1α-Hydroxylase-Expression. Die regulatorischen Unterschiede in renalen und nichtrenalen Geweben wurden diskutiert. Diese Ergebnisse erlauben es das PVDR I-Schwein als Tiermodell für die Pseudo-Vitamin-D-Mangel-Rachitis Typ I nutzen zu können, um Studien der Regulation des Vitamin-D-Metabolismus und des Calciumstoffwechsels beim Schwein durchführen zu können.

Proliferation erfordert die Koordination des Zellwachstums mit der Zellzyklusmaschinerie. Daten aus der Hefe belegen eine Funktion des Komplexes aus Nop7p, Ytm1p und Erb1p in der Ribosomenbiogenese, dem energieaufwendigsten Prozeß des Wachstums, und der Replikation. Die Beteiligung an diesen Schlüsselprozessen des Zellzyklus läßt die Vermutung zu, daß dieser Komplex eine Funktion bei der Koordination von Wachstum und Zellzyklusprogression innehat. In Säugern existiert ein trimerer Komplex, der sogenannte PeBoW-Komplex, der sich aus Pes1, WDR12 und Bop1 zusammensetzt, die einen hohen Grad an Homologie mit Nop7p, Ytm1p und Erb1p aufweisen. Der PeBoW-Komplex ist in Säugern an der Ribosomenbiogenese beteiligt, spielt eine Rolle in der Mitose, und dominant-negative Mutanten seiner Komponenten inhibieren die Zellzyklusprogression. Die Koordinatorfunktion des Komplexes scheint von der Hefe bis zum Menschen konserviert zu sein. In dieser Arbeit wurden Deletionsmutanten von Pes1 generiert und auf ihren Effekt auf die Zellzyklusprogression und die pre-rRNS Prozessierung hin untersucht. Die Expression zweier dieser Mutanten, Pes1 M1 mit einer N-terminalen und Pes1 M5 mit einer C-terminalen Deletion, induzierte einen reversiblen Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Beide Mutanten zeigten zudem einen dominant-negativen Effekt auf die Prozessierung der 36S und 32S pre-rRNS. Mutante M5 blockierte zusätzlich die Reifung des 12S Vorläufers. Sowohl Mutante M1 als auch Mutante M5 induzierten eine p53-Akkumulation in proliferierenden, nicht jedoch in serumgehungerten Zellen, was eine Abhängigkeit der p53-Antwort von einer aktiven Ribosomenbiogenese nahelegt. Die p53-Antwort zog eine Akkumulation des Cdk-Inhibitors p21 nach sich, und die Coexpression des E6-Proteins schwächte den von M1 und M5 hervorgerufenen Zellzyklusarrest merklich ab. Die p53 Antwort konnte damit als Ursache des Zellzyklusarrests ausgemacht werden. Über native Gelelektrophorese und Immunpräzipitationen der Pes1-Mutanten konnten die BRCT-Domäne und ein Teil der NPLP-Domäne als essentielle Domänen für die Inkorporation von Pes1 in den PeBoW-Komplex bestimmt definiert werden. Die erhobenen Daten legen Inkorporation in den PeBoW-Komplex als Voraussetzung für die nukleoläre Lokalisation, wie auch für die Ausbildung eines dominant-negativen Phänotyps der Pes1-Mutanten nahe.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

Bislang wurde angenommen, dass Shiga Toxin 1 (Stx1) im Gegensatz zu Stx2, von dem zahlreiche Varianten existieren, relativ homogen ist. Es waren nur wenige Stx1-Varianten bekannt und diese wiesen mit einer Ausnahme eine Homologie von 99 % mit dem Prototyp aus Phage 933J auf. Neuere Untersuchungen zeigten jedoch, dass auch von Stx1 mehrere Varianten existieren (Stx1c bzw. Stx1OX3, Stx1d und Stx1v52), die deutlich vom Prototyp abweichen (92-97 % Homologie der Aminosäuresequenzen). In der vorliegenden Arbeit wurde das Vorkommen von Stx1-Varianten bei klinisch unauffälligen Rindern, einem wichtigen Reservoir für STEC, untersucht. Dazu wurden 247 Rinderkotproben aus 38 südbayerischen Betrieben nach einer Anreicherungskultur mit PCR auf das Vorhandensein von stx-Genen untersucht und positive Proben mit spezifischen Primern für die unterschiedlichen stx-Suptypen bzw. stx1-Varianten typisiert. Die Isolierung der Keime erfolgte durch Kolonieblothybridisierung. Von den 247 Fäzesproben waren in 124 (50,2 %) Shigatoxin-Gene nachweisbar. Bei der Feindifferenzierung der positiven Proben wiesen 33 nur stx1, 31 nur stx2 und 60 beide Subtypen auf. Von den 93 stx1-positiven Proben enthielten jeweils 16 die Variante stx1c bzw. stx1d. Von den 35 isolierten STEC wiesen sechs, von welchen fünf zu typischen EHEC-Serogruppen (O26, O103 und O157) gehörten, das eae-Gen auf. Ein stx1-, stx2-, eae- und EHEC-hly-positiver O157:H7 sowie ein Sorbit fermentierender O157:H- wurden isoliert. Bei 23 Isolaten konnte EHEC-hly nachgewiesen werden. Vier Isolate mit drei verschiedenen Serotypen (O76:H19, O113:H4, O163:H12 [n=2]) wiesen die Variante stx1c auf, wobei zwei dieser Isolate zusätzlich ein stx2-Gen und das EHEC-hly besaßen. Bei den sechs stx1d-positiven STEC, die den Serogruppen O11:H48, O141:H19, On.t.:H12, On.t.:H48 und Osp:H48 [n=2] angehörten, konnten keine weiteren Virulenzfaktoren nachgewiesen werden. Die Ergebnisse bestätigen die hohe Prävalenz von STEC beim Rind. Außerdem konnte belegt werden, dass die stx1-Varianten stx1c und stx1d mit einer Häufigkeit von je 6,5 % in einem beachtlichen Anteil der 247 Kotproben vorhanden waren. Das Auftreten von stx1c konnte dabei nicht in direkten Bezug mit dem Kontakt zu Schafen gebracht werden. Da die stx1d-positiven Isolate keine anderen Virulenzfaktoren besaßen, dürfte ihre Pathogenität eher niedrig sein.

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist weltweit der zweithäufigste bösartige Tumor. Fernmetastasen eines CRC treten zumeist in Leber und Lunge auf, sind nur in seltenen Fällen operativ entfernbar und sprechen nicht auf derzeit verfügbare Chemotherapien an. Die Identifizierung von Genen und die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, durch welche sie zur Tumorprogression eines CRC beitragen, liefert eine Grundlage für die Prävention oder Behandlung der zumeist tödlich verlaufenden Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des metastatischen Phänotyps in Kolonkarzinomzellen verantwortlich sind. Hierzu wurden mittels der Genchip-Technologie die Transkriptionsprofile von insgesamt fünf Tumor-Zelllinien erstellt und nach stringenten Auswahlkriterien miteinander verglichen. Zuerst wurde ein CRC-Zellmodell verwendet, das aus einer in der Nacktmaus nicht-metastasierenden humanen Primärtumor-Zelllinie KM12C und zwei davon abgeleiteten, stark zur Leber metastasierenden Zelllinien, KM12SM und KM12L4A bestand. In diesem überwiegend isogenen Zellmodell wurden 145 Gene in beiden metastasierenden Zelllinien als dereguliert im Vergleich zu der nicht-metastasierenden Zelllinie identifiziert. Die Transkriptionsprofile eines weiteren humanen CRC-Zellmodells, bestehend aus einer nicht-metastasierenden Zelllinie HCT116 und einer stark zur Lunge metastasierenden Zelllinie HCT116U5.5 wurden ebenfalls verglichen und 72 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Ein Vergleich der Datensätze aller Transkriptionsprofile ermöglichte die Identifizierung von Vimentin und Trop-2 (TACSTD2, „Tumorassoziierter Vermittler von Kalziumsignalen“) als in allen metastasierenden Zelllinien überexprimiert. Die hohe Homologie des bisher noch weitestgehend unerforschten Trop-2 zu Trop-1 (Ep-CAM), einem regulatorischen Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das überwiegend von aggressiven Tumorarten exprimiert wird und die Proliferation von Tumorzellen stimulieren kann, machten Trop-2 für weiterführende Expressions- und Funktionsstudien zu einem interessanten Zielgen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Expressionsstudien in einer Vielzahl von Tumorbiopsien zeigten deutlich erhöhte mRNA- und Proteinspiegel von Trop-2 in Metastasen aus CRC im Vergleich zu den Primärtumorgeweben. Zusätzlich zu diesem neuen Befund in CRC wurde in dieser Arbeit erstmalig eine erhöhte Expression von Trop-2 in Schild-drüsenkarzinomen und in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben nachgewiesen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Trop-2 für die Metastasierung von Karzinomzellen des Kolons wurden stabile Transfektanten für Trop-2 in der nicht-metastasierenden Zelllinie KM12C generiert. Die konstitutiv Trop-2 exprimierenden Zellklone zeigten erhöhte Cyclin D1-Proteinspiegel bei unveränderter Zellproliferation gegenüber den Vektorkontrollen. Die Induktion von Cyclin D1 könnte mit der Identifizierung eines ebenfalls erhöhten Proteinspiegels von ß-Catenin in den Trop-2 exprimierenden Transfektanten in Zusammenhang stehen. Somit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Einfluss von Trop-2 auf den Tcf/ß-Catenin Signalweg. Zusätzlich demonstrierte ein Migrationstest erhöhte mobile Eigenschaften von Trop-2 exprimierenden Zellen in vitro, während sich die invasive Fähigkeit der Transfektanten, in vitro durch eine Matrigelschicht zu wandern, nicht von den Vektorkontrollen unterschied. Die induzierte Expression von Trop-2 in der Mehrzahl von Metastasen des kolorektalen Karzinoms sowie in Tumoren von Lunge und Schilddrüse war eine neue Beobachtung. Diese Ergebnisse demonstrieren das Potential von Hochdurchsatzmethoden wie die hier verwendete Genchip-Technologie in Kombination mit geeigneten Zellmodellen. In der vorliegenden Arbeit führte sie zur Identifizierung von Trop-2 als einen Marker der Tumorprogression und Metastasierung von verschiedenen humanen Karzinomen.

Das zur Familie der Herpesviridae, Unterfamilie Gammaherpesvirinae, gehörende murine Herpesvirus 68 (MHV-68) besitzt mit 118 kbp wie die zu den Betaherpesvirinae gehörenden murinen und humanen Cytomegalieviren (MCMV und HCMV) mit ca. 230 kbp ein sehr großes Genom. Die Mehrzahl der 80 offenen Leserahmen wurde noch nicht charakterisiert. Zur Untersuchung dieser Gene ist die zufällige Herstellung viraler Mutanten die effiziente Methode, um zu neuen Erkenntnissen bezüglich ihrer Funktion zu gelangen. Aufgrund des großen Anteils nicht oder nur wenig charakterisierter Gene am viralen Genom und der oftmals nur geringen Homologie zu offenen Leserahmen anderer nah verwandter Herpesviren ist für MHV-68 ein Verfahren der „forward genetics“ diejenige Möglichkeit, welche den größten Erfolg verspricht. Dies beinhaltet eine ungezielte Mutagenese des viralen Genoms mit blinder Rekonstitution und nachfolgender Charakterisierung derjenigen Rekombinanten, welche einen interessanten Phänotypen zeigten. Bisher war die Herstellung rekombinanter MHV-68-Klone sehr arbeitsintensiv, da man diese gänzlich mit den Mitteln durchführen musste, welche die Methodik der Zellkultur zur Verfügung stellte. Aufgrund der Klonierung des MHV-68-Genoms als ein künstliches bakterielles Chromosom (BAC), der Etablierung des Verfahrens der Transposonmutagenese und mittels der Möglichkeit der Rekonstitution viraler Rekombinanten durch invasive Bakterien wurde diese Methode der klassischen oder forward genetics möglich. In dieser Arbeit wurde erstmals eine Mutagenese des Genoms von MHV-68 durchgeführt, die resultierenden viralen Rekombinanten rekonstituiert und einer phänotypischen Untersuchung unterzogen. Hierbei wurde das Wachstum der Mutanten auf sechs verschiedenen Zelllinien verglichen. Dies sollte grob augenscheinliche Unterschiede der rekombinanten Viren im Vergleich zu einer Wildtyp-Kontrolle nachweisen, wobei die von Brune et al. bereits etablierte Methodik an die Erfordernisse des MHV-68-Genoms angepasst werden konnte. Bezüglich des viralen Wachstums in Endothelzellen auffällig erscheinende Mutanten zeigten eine Häufung der Tn-Insertionen in der Genregion um ORF 10. Wachstumskurven bestätigten die Rolle von ORF 10 für die Fähigkeit des Virus in Endothelzellen zu replizieren. Dieses ist der erste Hinweis für eine interessante biologische Funktion dieses viralen ORFs, die in weiteren Arbeiten zu sichern und zu analysieren ist.

Das TT-Virus wurde 1997 in Japan bei einem Patienten mit Non A-G-Hepatitis entdeckt. Weitere Arbeiten zeigten eine weite Verbreitung auch in der gesunden Bevölkerung, die sich vor allem durch den fäkal-oralen Übertragungsweg erklären lässt. Zudem konnte eine enorme genetische Variabilität innerhalb der TTV Familie mit bislang 39 beschriebenen Genotypen aufgeklärt werden. Diese ist charakteristisch für die Familie der Circoviren, zu der sich TTV phylogenetisch zuordnen lässt. Bei den schon bekannten tierischen Circoviren konnte festgestellt werden, dass geringe Sequenzunterschiede mit einer erheblich veränderten Pathogenität einhergehen. Bislang konnte trotz intensiver Forschungsarbeit keine Krankheitsassoziation für TTV nachgewiesen werden. Interessant sind jedoch erste Hinweise, dass die zur TTV-Familie gehörenden SENV-Isolate D und H mit Symptomen einer Hepatitis einhergehen. In dieser Arbeit konnten zwei SENV-H Isolate von unterschiedlichen Patienten charakteriert werden. Eine Krankheitsassoziation konnte jedoch bei beiden hier beschriebenen Isolaten nicht nachgewiesen werden. Bislang liegen wenige Arbeiten vor, die sich mit der Etablierung von TTV-genotypen-spezifischen Nachweisverfahren beschäftigen. Für das weitere Verständnis der TTV-Familie ist es jedoch unabdingbar, genotyp-spezifische Nachweisverfahren anzuwenden. In der vorliegenden Arbeit gelang ein solcher typ-spezifischer Nachweis mittels neuentwickelter Restriktions-Fragment-Längenpolymorphismus-Analyse (RFLP) für die TTV-Genotypen SENV-A und KAV. In einer Gruppe von 86 HCV-infizierten Patienten konnte eine Prävalenz von 9,3% für das SEN A Virus eine Prävalenz von 19,7% für KAV bestimmt werden. SENV-A Isolate konnten von vier verschiedenen Patienten sequenziert werden. Die Isolate zeigten dabei eine Homologie von mindestens 95%. Das KAV-Isolat ist dabei Prototyp des in dieser Studie neu entdeckten TTV-Genotyp 28. Es gelang, das Gesamtgenom von KAV zu sequenzieren. Genotyp 28 besitzt mit 3705 Nt das bis dahin kürzeste Genom aller TTV-Genotypen. Dabei fallen besonders zahlreiche Deletionen im Offenen Leserahmen 1 auf. Das KAV-Isolat konnte der zweiten genetischen Gruppe zugeordnet werden und stellt den vierten Genotyp dieser Gruppe dar. Durch Klonierung und anschließende Sequenzierungsanalyse wurden 28 TTV-Isolate gewonnen. Die Analyse dieser Sequenzen zeigte eine enorme genetische Variabilität mit fließenden Übergängen zwischen TTV-Geno- bzw. Subtypen. Einige Wissenschaftler gehen deshalb bei der TTV-Familie inzwischen von einem Virusschwarm aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit können als weitere Hinweis für die Richtigkeit dieser Theorie gewertet werden. Eine Gruppe von 86 HCV-infizierten Patienten wurde im Verlauf einer antiviralen Interferon-Therapie auch dreimal auf TTV untersucht. Dabei zeigte eine TTV-Prävalenz von 79,1% zu Beginn der IFN-Therapie. Nach Therapieende ergab sich ein signifikanter Rückgang auf 47,7%, wohingegen eine im Verlauf durchgeführte Follow-up-Untersuchung wieder einen signifikanten Anstieg der TTV-Prävalenz auf 61,6% ergab. Die hier entwickelte RFLP-Methode erwies sich als geeignet zur Analyse von TTV-Mehrfachinfektionen. Dabei zeigte sich eine Mehrfachinfektionsrate von 88%. Dieses Ergebnis läßt den Schluss zu, dass die Häufigkeit von TTV-Mehrfachinfektionen bislang erheblich unterschätzt wurde. Eine Mehrfachinfektion beeinflusste signifikant das Antwortverhaltens von TTV bezüglich Interferon. Das Vorliegen einer Mehrfachinfektion bei Therapiebeginn war mit einer signifikant schlechteren Virus-Clearance durch Interferon vergesellschaftet. Eine Infektion mit einem TT-Virus führte signifikant häufiger zum Verschwinden von TTV unter der antiviralen Therapie. Unter der IFN-Therapie verringerte sich der Anteil von Trägern von mehr als zwei TT-Viren von 47,7% auf 18,6%. Eine Beeinflussung des Therapieerfolgs bezüglich HCV durch das Vorliegen einer zusätzlichen TTV-Mehrfachinfektion konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In der Klonierungsanalyse der im Blut nachweisbaren Viruspopulation von fünf Patienten mit TTV-Mehrfachinfektion konnte eine außergewöhnliche Dynamik in der TTV-Population während der IFN-Therapie festgestellt werden. Sowohl das Verschwinden von Genotypen als auch das Auftreten neuer Genotypen wurde registriert. Bei einer Patientin waren während eines Jahres sieben TTV-Genotypen nachweisbar, wobei kein TTV-Genotyp zu allen drei Untersuchszeitpunkten nachweisbar war. Auch sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit für das Vorliegen großer Unterschiede in der IFN-Sensibilität einzelner TTV-Genotypen.

MIPs (major intrinsic proteins) sind eine Gruppe von Transport-Proteinen, die ubiquitär in Archaea, Pro- und Eukaryoten zu finden sind. Neben spezifischen Wasserkanalproteinen (Aquaporine) sind einige Mitglieder dieser Familie permeabel für andere kleine und ungeladene Moleküle, wie z.B. Glycerin. Als Grundlage zur Funktionsaufklärung der 38 MIP-Mitglieder in A. thaliana wurden ihre transkriptionellen Reaktionen untersucht. Dazu wurde ein DNA-Array mit Sonden aus dem 3´-untranslatierten Bereich dieser Gene entwickelt, der die Unterscheidung der oft hoch homologen Mitglieder auf Transkript-Ebene zuließ, wozu längere cDNA-Sonden nicht geeignet sind. Eine TIP1;2 cDNA-Sonde, die Teile der kodierenden Sequenzen enthielt, zeigte in einem Hybridisierungsexperiment eine 40 %-ige Kreuzhybridisierung mit dem homologen TIP1;1. Die Spezifität der Sonden wurde in Zusammenarbeit mit dem Munich Information Center for Protein Sequences bioinformatisch überprüft. Das stringente Auswahlkriterium dieser Analysen, woraufhin eine Sonde bis zu einer 70 %-igen Homologie über 70 bp nicht kreuzhybridisiert, konnte auch experimentell gestützt werden. Der Vergleich der Signalintensitäten einer 172 bp langen, spezifischen Sonde mit einer 774 bp langen cDNA-Sonde ließ zudem darauf schließen, dass die Spezifität der verwendeten 3´-UTR-Sonden die Sensitivität nicht beeinträchtigte. Eine Organ-spezifische Expressions-Analyse zeigte, dass MIPs in allen untersuchten Organen (Wurzeln, Blätter, Stängeln, Blüten und Schoten) exprimiert werden. Die meisten MIPs (24 von 38) und die höchsten Expressionsniveaus wurden in der Wurzel detektiert. In Blättern konnten hingegen nur 11 von 38 MIP-Mitgliedern nachgewiesen werden. Die geringsten Expressionen zeigten die Mitglieder aus der NIP- und SIP-Subfamilie. Zu den am höchsten und in der Pflanze ubiquitär exprimierten MIPs zählten die PIP-Mitglieder PIP1;1, PIP1;2 und PIP2;1 sowie die TIP-Mitglieder TIP1;1 und TIP2;1, von denen bekannt ist, dass sie als Wasserkanal-Proteine fungieren. Die Möglichkeit, die Wasserpermeabilität von Membranen regulieren zu können, dürfte somit von zentraler Bedeutung in der ganzen Pflanze sein. Neben ubiquitär exprimierten MIPs sind einige nur ausschließlich oder bevorzugt in bestimmten Organen zu finden, z.B. PIP1;4, PIP2;6 und PIP2;7 in der Blüte und NIPs hauptsächlich in der Wurzel. Deren Funktion könnte neben einem Organ- oder Zell-spezifischen Wassertransport auch die Permeation anderer ungeladener Moleküle beinhalten, da die Transporteigenschaften dieser Mitglieder nicht geklärt sind. Das Expressionsprofil der MIP-Genfamilie in verschiedenen Organen sowie die unterschiedliche Reaktion auf Wasserstress (s.u.) lassen auf differenzielle Funktionen der einzelnen MIP-Mitglieder schließen. Lediglich TIP1;1 und TIP1;2 konnten nach diesen Kriterien nicht eindeutig unterschieden werden. Durch Zugabe von 100 mM NaCl und 200 mM Sorbiotol zu hydroponisch angezogenen A. thaliana-Pflanzen wurde über einen Zeitraum von 48 Stunden die transkriptionelle Reaktion der MIP-Familie auf diese Wasserstressbedingungen verfolgt. In Wurzeln wurde festgestellt, dass innerhalb der ersten 24 Stunden bei beiden Stressoren die hoch exprimierten PIP-Aquaporine PIP1;1 und PIP2;2 sowie PIP1;3 reprimiert, TIPAquaporine wie TIP1;1 und TIP2;1 zu diesem Zeitpunkt jedoch unbeeinflusst sind. Die Pflanze verringert demnach bei Wasserstress zuerst die Wasserpermeabilität der Plasmamembran, sofern sich die transkriptionelle Suppression auf Proteinebene widerspiegelt. Interessanterweise zeigte sich im Blatt eine frühe Repression der hoch exprimierten TIPAquaporine TIP1;1 und TIP2;1. Die in der Wurzel reagierenden Aquaporine aus der PIPSubfamilie zeigen im Blatt jedoch keine transkriptionellen Änderungen. Zusammenfassung 95 Diese frühen Repressionen von TIP1;1 und TIP2;1 lassen vermuten, dass es in Blättern wichtig ist, möglichst rasch unter Wasserstress die Wasserpermeabilität des Tonoplasten zu senken. Dies könnte der Stabilisierung des Zell-Turgors dienen und/oder mit einem verringerten Blattwachstum einhergehen. Die ähnlichen Transkriptionsantworten und Kinetiken der MIPs bei NaCl- und Sorbitolstress lassen zudem vermuten, dass MIPs auch unter NaCl-Stress primär auf die osmotische Veränderung in der Nährlösung reagieren bzw. über ähnliche Signalwege reguliert werden. Die parallele Untersuchung transkriptioneller Änderungen von bekannten Stress-Markergenen und Genen des Sekundärmetabolismus unter NaCl- und Sorbitolstress ergab zusätzliche Hinweise auf überlappende und Stressor-spezifische Reaktionen in Wurzeln und Blättern. Eine bekannte Reaktion auf Salz- und osmotischen Stress ist die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies, die sowohl als Signalmoleküle fungieren als auch Schädigungen verursachen können. Die Induktionen der beiden Peroxidasen GPX1 und PRXCB in Blättern und Wurzeln deuten auf eine Beteiligung bei Entgiftungsreaktionen von H2O2 unter Wasserstress hin. Einzelne Mitglieder aus der Familie der UDP-Glycosyltransferasen und Cytochrom P450-Monooxygenasen, wie UGT74F2 und CYP81D1, zeigten bei Salz- und Sorbitolstress überlappende Reaktionen, was darauf hindeutet, dass spezifische Teile des Sekundärstoffmetabolismus ähnlich beeinflusst werden. Daneben zeigten andere Mitglieder aus diesen Gen-Familien spezifische Reaktionen auf die beiden Stressoren. So waren in der Wurzel nach 48 Stunden Sorbitolstress viele CYPs und UGTs reprimiert. Die Pflanze scheint also exklusiv bei Sorbitolstress spezifische, in ihrer genauen Funktion noch unbekannte Teile des Sekundärmetabolismus zu supprimieren. Die unterschiedlichen Reaktionen einer Reihe weiterer Gene auf Salz oder Sorbitol in Blättern und Wurzeln identifizierten zudem differenzielle Stress-Antworten innerhalb der Pflanze. Es wurden zwei Insertionsmutanten in den MIP-Genen PIP2;1 und PIP1;4 isoliert. Transkript-Untersuchungen dieser Mutanten zeigten, dass durch das Ausschalten dieser PIPs alle anderen MIP-Mitglieder, sowohl bei ungestressten als auch unter NaCl-Stress- Bedingungen, keine Änderungen in ihrer Transkriptionsantwort im Vergleich zum Wildtyp zeigen. Möglicherweise besitzen die untersuchten PIP-Mitglieder eine spezifische Funktion, die andere MIPs nicht kompensieren können, oder möglicherweise kommt es in der Pflanze zu veränderten Reaktionen, die anhand der vorliegenden Untersuchungen nicht erkennbar waren.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden mögliche molekulare Wirkmechanismen pharmakologischer und ischämischer Präkonditionierung zur Prävention des Ischämie-Reperfusionsschadens (IRS) am Modell der Rattenleber untersucht. Im Mittelpunkt stand dabei der Einfluss dieser Therapieansätze auf das Eisenregulierende Protein IRP-1 (Iron regulatory protein-1) und das zytoprotektiv wirkende Eisenspeicherprotein Ferritin sowie auf die Aktivität von Matrix Metalloproteinasen, die vor allem an der Ablösung der sinusoidalen Endothelzellen von der sie umgebenden Matrix beteiligt sind. Außerdem wurde die Rolle von Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), einem Schlüsselenzym der Glykolyse, beim IRS genauer betrachtet. Hormonelle Präkonditionierung mit dem Atrialen Natriuretischen Peptid (ANP) verringerte die RNA-Bindungsaktivität von IRP-1. Dieser Effekt wird wahrscheinlich über cGMP vermittelt und ist unabhängig von einer Hämoxygenase-1 Induktion. Die Regulation der RNA-Bindungsaktivität erfolgt nicht über eine Veränderung des Phosphorylierungsstatus von IRP-1, sondern wird vermutlich über ROS vermittelt, die möglicherweise von Kupfferzellen gebildet werden. ANP war außerdem in der Lage, die Ferritinexpression zu induzieren. Dies ist wahrscheinlich eine Folge der verminderten IRP-1 Bindungsaktivität und einer daraus resultierenden Erhöhung der Ferritintranslation. Die Aktivität von Matrix Metalloproteinasen wird durch Präkonditionierung mit ANP nicht beeinflusst. Bei den Untersuchungen zu GAPDH wiesen zwei der verwendeten Methoden zur mRNA-Quantifizierung auf eine Reduktion der GAPDH mRNA-Expression durch ANP hin und lassen eine neuartige Rolle von GAPDH beim IRS vermuten, z.B. eine Beteiligung an der Auslösung von Apoptose. Da die Reduktion der GAPDH mRNA-Menge sich in einer Größenordnung von ca. 40% bewegte und es bisher keine Methode der mRNA-Quantifizierung gibt, die diese relativ geringen Unterschiede zuverlässig und reproduzierbar detektieren kann, konnten wir aufgrund methodischer Grenzen keine eindeutige Aussage bezüglich einer Reduktion der GAPDH mRNA-Expression durch ANP treffen. Die GAPDH Proteinmenge blieb unverändert. Präkonditionierung mit α-Liponsäure führte ebenfalls zu einer Reduktion der IRP-1 Bindungsaktivität. Folglich liegt IRP-1 wahrscheinlich überwiegend als zytosolische Aconitase vor und könnte aufgrund der hohen Homologie zur mitochondrialen Aconitase an einer vermehrten Umsetzung von Citrat im Citratzyklus beteiligt sein. Dies ist vermutlich ein Hinweis darauf, wie α-Liponsäure den ATP-Gehalt in den Zellen erhöhen und so die Energiebereitstellung in der Leber verbessern kann. Auf die Ferritinexpression hatte die Präkonditionierung mit α-Liponsäure keinen Einfluss. Ischämische Präkonditionierung hatte eine deutliche Induktion der Ferritinexpression zur Folge, was zum Schutz vor IRS erheblich beitragen könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen neue Hinweise zum molekularen Wirkmechanismus verschiedener Therapieansätze zum Schutz vor IRS geben. Diese Kenntnisse sind eine wichtige Voraussetzung für deren sinnvolle und rationale Anwendung in der Klinik.

Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands. Vorraussetzung für eine erfolgreiche Infektion sind Fusion zweier kompatibler, haploider Zellen und die folgende Ausbildung eines dikaryotischen Filaments. Diese Prozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der a-Locus kodiert für ein biallelisches Pheromon/Pheromonrezeptor-System, das die Zell/Zell-Erkennung und die Zellfusion reguliert. Die folgende pathogene Entwicklung wird durch den multiallelischen b-Locus kontrolliert, der für zwei Homeodomänenproteine kodiert, bW und bE. Nach der Fusion der haploiden Sporidien können sich bE/bW-Heterodimere ausschließlich aus bW und bE-Proteinen unterschiedlicher Allele bilden. Diese regulieren das filamentöse Wachstum, die Penetration der Pflanzenoberfläche, das Wachstum in der Pflanze und die Tumorinduktion. Das Ziel dieser Arbeit war es, regulatorische Gene aus U.maydis zu identifizieren, die an der Kontrolle der b-abhängigen, pathogenen Entwicklung beteiligt sind. Es wurde versucht, in einem direkten Selektionsprozess haploide, pathogene Stämme zu isolieren, die aus einer REMI-Mutagenese hervorgingen. Um eine möglichst breite Mutagenese zu erreichen, wurde eine neuartige Mutagenesestrategie angewandt, die neben Geninaktivierung ("loss of function") auch eine mögliche Aktivierung der Genexpression der betroffenen Loci ("gain of function") berücksichtigte. In einer weiteren UV-Mutagenese wurden durch Nutzung von egl1 als Reportergen Stämme isoliert, die EG-Aktivität zeigten. Die Expression des b-abhängigen, aber vermutlich nicht direkt durch das bE/bW-Heterodimer regulierten Gens egl1 sollte dabei eine Mutation in einem regulatorischen Gen anzeigen, das wiederum unter der Kontrolle von b stehen könnte. Es wurde angenommen, dass die interessantesten Stämme neben egl1 weitere b-abhängige Gene exprimieren. Eine komplexe Deregulation der Genexpression b-abhängiger Gene in haploiden Zellen sollte die Zentralität des betroffenen Regulators innerhalb der b-Regulationskaskade anzeigen. Die Komplementation des Stammes MR9-1 führte zur Isolierung eines regulatorischen Gens. hda1 kodiert für ein Protein mit signifikanter Homologie zu Histondeacetylasen und ist an der Kontrolle der differentiellen Genexpression in haploiden und dikaryotischen Zellen, und später an der Sporenentwicklung im Tumor entscheidend beteiligt. Hda1 wirkt in haploiden Zellen nicht als genereller Regulator der Genexpression, sondern bestimmt ein spezifisches Set von hda1-abhängigen Genen, das sich vornehmlich aus b-abhängigen Genen und den b-Genen selbst zusammensetzt. Haploide ∆hda1-Stämme vollziehen nicht die pathogene Entwicklung; nur dikaryotische ∆hda1-Zellen führen zur Tumorentwicklung, leiten jedoch nicht die Bildung von Sporen im Tumorgewebe ein. Funktionelle und biochemische Analysen zeigen in haploiden Zellen einen hochmolekularen Hda1-Komplex, der vermutlich den Aufbau einer höher geordneten Chromatinstruktur an regulatorischen Sequenzen bestimmt. Vermutlich kann Hda1 über einen Deacetylierungsmechanismus regulatorischer Sequenzen zur Repression b-abhängiger Gene führen.

In dieser Arbeit wurden vier Gene aus T. versicolor isoliert und charakterisiert, die an der Kupferversorgung des Trans-Golgi-Netzwerks, in dem Laccase mit Kupfer beladen wird,beteiligt sind. Die zwei Kupferpermease-Gene cupA und cupB (copper uptake permease) konnten durch Komplementation der S. cerevisiae Deletionsmutanten ∆ctr1 bzw. ∆cup5 mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert werden. Die aus den beiden Genen abgeleiteten Proteinsequenzen zeigen strukturelle Homologien zu den Proteinen aus der Ctr-Familie und weisen ein in dieser Familie konserviertes MxxxM-Motiv auf. Die Expression beider Gene wird in T. versicolor durch Kupfermangel induziert und durch Kupfergabe reprimiert. Das Gen für das cytosolische Kupferchaperon TahA (Trametes ATX1 homolog) wurde mittels PCR mit degenerierten Primern isoliert. TahA zeigt deutliche Homologie zu Atx1 aus S. cerevisiae, HAH1 aus dem Menschen und CCH aus A. thaliana. TahA kann in Hefe Atx1 funktionell ersetzen: sowohl als Kupfertransportprotein zur im Golgi lokalisierten Kupfer-ATPase Ccc2, als auch bei der Entgiftung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Der Promotor des tahA-Gens enthält Motive, die im Promotor der durch Kupfer regulierten Gene Metallothionein (CUP1) und Cu/Zn-Superoxiddismutase (SOD1) aus S. cerevisiae konserviert sind. Das tahA-Gen wird unter erhöhten Kupferkonzentrationen (>0,25 µM) exprimiert und unter Kupfermangel reprimiert. Es unterscheidet sich somit in der Regulation deutlich vom ATX1-Gen, das unter Eisenmangel und oxidativem Stress induziert wird. Das Gen für die im Golgi-Netzwerk lokalisierte Kupfer-P-Typ-ATPase, ctaA (copper transport ATPase), wurde durch die funktionelle Komplementation einer Hefe ∆ccc2-Mutante mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert. Dadurch wurde zugleich die physiologische Funktion des Proteins bei der Kupferversorgung des Golgi-Netzwerks gezeigt. CtaA weist deutliche Homologien zu den bekannten Kupfer-P-Typ-ATPasen aus dem Menschen (MNKP und WNDP), aus A. thaliana (RAN1) und S. cerevisiae (Ccc2) auf. CtaA enthält alle wichtigen Motive, die für die Kupfertransport- und ATPase-Funktionen in allen anderen Kupfer-P-Typ-ATPasen konserviert sind. Durch die deregulierte Koexpression von tahA und ctaA in S. cerevisiae sowie in T. versicolor konnte eine im Vergleich zum Wildtypstamm bis zu achtfach höhere Laccase-Expression erreicht werden. Dies zeigt, dass die Überexpression von Genen, die an der Versorgung des sekretorischen Systems mit Kupfer beteiligt sind, ein Mittel darstellt, um die Expression von sekretierten, kupferabhängigen Enzymen zu steigern. Durch Anzucht von T. versicolor unter Kupfermangel wurde eine Apo-Form der Laccase hergestellt und gereinigt, die kein für blaue Oxidasen typisches Absorptionsmaximum bei 600 nm besaß und die kaum Aktivität aufwies. AAS-Untersuchungen zeigten, dass weniger als ein Kupferion pro Laccase-Molekül in dieser Proteinpräparation vorhanden war. Durch die in vitro Beladung dieser Apo-Laccase mit Kupfer konnte die Enzymaktivität wiederhergestellt werden. Die Bedingungen hierfür waren ein niedriger pH-Wert,reduzierende Bedingungen und das Vorhandensein von NaCl. Eine spontane Beladung der Laccase im Golgi scheint daher ohne Mitwirkung eines weiteren Faktors möglich zu sein.

Sensillen sind „Kleinsinnesorgane“ der Arthropoda, die die Wahrnehmung einer Vielzahl unterschiedlicher Reize ermöglichen. Trotz großen Interesses an diesen Sinnesorganen ist die Frage nach den Homologieverhältnissen und der Evolution von Sensillen weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit werden daher die antennalen Sensillen von Larven aller größeren monophyletischen Gruppen der Diptera, sowie einiger mit den Diptera verwandter Holometabola raster- und transmissionselektronenmikroskopisch untersucht und vergleichend beschrieben. Die larvalen Antennen der Holometabola sind vor allem wegen der verhältnismäßig kleinen Anzahl von Sensillen besonders geeignete Modellobjekte, da dies die ultrastrukturelle Analyse des jeweils gesamten Sensilleninventars der Antennen ermöglicht. Obwohl die REM-Untersuchung der larvalen Antennen eine enorme äußere Vielfalt an Sensillenformen offenbart, zeigt die Analyse der inneren Ultrastruktur, daß die antennalen Sensillen von insgesamt 32 Dipterenarten und vier holometabolen Außengruppenvertretern nach strukturellen Kriterien nur zehn unterschiedlichen Sensillentypen zugeordnet werden können. Darüber hinaus lassen „modalitätsspezifische Strukturen“ Rückschlüsse auf die Funktionen der Sensillen zu. So deuten die Befunde darauf hin, daß es sich bei den Sensillentypen um olfaktorische, kontaktchemosensitive, gustatorische, thermo-, hygro- bzw. thermo-/hygrosensitive Sensillen, sowie um mechanosensitive Extero- und Propriorezeptoren handelt. Die Ergebnisse zeigen also, daß die larvalen Antennen, obwohl sie bei den Diptera durchschnittlich nur mit etwa zehn Sensillen ausgestattet sind, über ein ähnlich breites Spektrum der Reizwahrnehmung verfügen wie die imaginalen Antennen, die einige hundert oder gar tausend Sensillen besitzen. Rasterelektronenmikroskopisch konnten vor allem äußerliche Anpassungen der Antennen und Sensillen z.B. an Habitat und Lebensweise der Larve nachgewiesen werden; so sind lange Antennen, und mit ihnen meist auch überwiegend langgestreckte Sensillen, in aquatischen Lebensräumen eindeutig begünstigt, während terrestrisch lebende Larven, besonders in festen Substraten, wie z.B. Holz, eher kurze oder sogar plattenförmig reduzierte Antennen besitzen. Die vergleichende TEM-Untersuchung zeigt jedoch auch, daß Sensillen des gleichen Typs bei den jeweiligen Tieren sowohl in ihrer Position auf den Antennen, als auch in ihren strukturellen Merkmalen übereinstimmen. Nach dem Lagekriterium und dem Kriterium der spezifischen Qualität konnte so die Homologie einzelner antennaler Sensillen der Dipterenlarven für die gesamte Ordnung und teilweise sogar für die Holometabola wahrscheinlich gemacht werden. Über diesen homologen Sensillensatz hinaus konnte gezeigt werden, daß individuelle Sensillen - also kleinste Sinnesorgane - evolutiven Veränderungen unterliegen, die es erlauben ihr Schicksal im Verlauf der Phylogenese zu verfolgen. So belegen die Ergebnisse beispielsweise, daß der antennale Kontaktchemorezeptor „Peg“, bei den cyclorrhaphen Fliegen im Zusammenhang mit der Evolution des Antennen-Maxillar-Komplexes zum Maxillarpalpus verlagert wurde. Bei der vergleichenden Analyse aller antennalen Sensillen waren evolutive Tendenzen feststellbar, die in vielen Punkten mit den etablierten Stammbäumen der Diptera übereinstimmen, aber auch interessante Anregungen für derzeit noch ungeklärte Verwandtschaftsbeziehungen liefern. Für die meisten monophyletischen Gruppen der Diptera fanden sich charakteristische Merkmalskombinationen, die teilweise sogar als Synapomorphien gedeutet werden können. Bezogen auf offene Fragen der Dipterensystematik legen die Sensillenmerkmale beispielsweise ein Schwestergruppenverhältnis zwischen den Anisopodidae (Fenstermücken) und den „orthorrhaphen Fliegen“ nahe, wobei eine enge Verwandtschaftsbeziehung vor allem mit den Tabanomorpha (ohne die Vermileonidae) wahrscheinlich ist. Darüber hinaus führte ein Außengruppenvergleich zwischen den Diptera und einigen anderen Holometabola zu dem Ergebnis, daß der „Cone“ als Komplexchemosensillum ebenso zu den Grundplanmerkmalen holometaboler Insektenlarven gehört, wie zwei Thermo-/Hygrorezeptoren (lS3-Sensillen). Das bedeutet, daß diese individuellen Sensillen über fast 300 Mio. Jahre Evolution bis ins frühe Perm zurückverfolgt werden können.