Podcasts about die induktion

In meinem hypnotischen Alltag gibt es Worte, die vielen Menschen nicht wirklich etwas sagen, weil sie mit ihnen nicht in Berührung kommen. Induktion, Suggestion, Trigger... Wenn man diese Worte benutzt kommt als Antwort oft nur ein ratloses Stirnrunzeln. Ich glätte diese Runzeln und erzähle dir in den nächsten Podcast Folgen ein wenig über das Fachchinesisch. In dieser Folge geht es um die Hypnoseinduktion. Die geilsten erotischen Hypnosen gibt es auf www.hypnose.sexy Ich bin Anu Morrigan. In meinem Alltag als erotische Hypnosekünstlerin stoße ich häufig auf Fragen zu meiner Arbeit und meinem Leben. In diesem Podcast gebe ich die Antworten. Hol dir deine Belohnungen auf Patreon: https://www.patreon.com/erotischehypnose Folge mir auf Twitter: https://twitter.com/_goddesskali Like mich auf Facebook: https://www.facebook.com/rebecca.muller.50999 bzw. https://www.facebook.com/erotischehypnosen Und verpasse nicht meinen Blog: http://erotik-hypnose.blogspot.co.at

Bei Hund und Katze sowie beim Menschen zählen Epilepsien zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen. Im Hinblick auf eine vollständige Prävention der Epilepsieentstehung (Epileptogenese) haben sich bis heute alle therapeutischen Strategien als klinisch unwirksam erwiesen. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Epileptogenese zugrunde liegen, stellt die Grundvoraussetzung für die Identifizierung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern dar. Differentielle Proteomanalysen könnten wesentlich dazu beitragen die komplexen epileptogenese-assoziierten molekularen Veränderungen zu erforschen. Daher wurde in der vorliegenden Dissertationsstudie eine differentielle Proteomanalyse in einem Tiermodell der Epileptogenese durchgeführt. Die Induktion der Epileptogenese erfolgte in einem elektrischen Post-Status-Epilepticus-(SE)-Modell bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten. Hippocampales (HC) und parahippocampales (PHC) Gehirngewebe von SE- und Kontrolltieren wurde zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten (zwei Tage, zehn Tage und acht Wochen nach SE) entnommen und mittels markierungsfreier Liquid-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Zeitpunkte reflektieren die Post-Insult-Phase, die Latenzphase und die chronische Phase mit spontanen wiederkehrenden Anfällen. Unter Berücksichtigung der besonderen Rolle inflammatorischer Signalwege im Kontext der Epileptogenese, erfolgte neben der unspezifischen Datenanalyse eine fokussierte Auswertung immun- und inflammations-assoziierter Prozesse. Die anschließende immunhistochemische Untersuchung der Gewebe diente sowohl der Validierung der Methodik, als auch der Validierung des differentiellen Expressionsmusters ausgewählter Proteine. Durch die Studie konnte gezeigt werden, dass zu allen untersuchten Zeitpunkten im PHC mehr Proteine reguliert waren als im HC. Des Weiteren ließen sich in beiden Gehirnregionen die umfangreichsten molekularen Veränderungen in der Latenzphase nachweisen. Durch die Pathway-Enrichment-Analyse konnte im HC während der Post-Insult-Phase eine ausgeprägte Neurodegeneration dargestellt werden. Weiterhin zeigte sich in beiden Gehirnregionen eine Regulation Integrin-assoziierter Prozesse während der Latenzphase und der chronischen Phase. Ein signifikantes Enrichment neurodegenerativer und proliferativer Signalwege ließ sich im PHC acht Wochen nach SE darstellen. Im Hinblick auf immun- und inflammations-assoziierte Prozesse konnte eine Überrepräsentation entsprechender Pathways während der Post-Insult-Phase und der Latenzphase nachgewiesen werden. Die regulierten Pathways umfassten unter anderem Toll-like-Rezeptor-(TLR)-vermittelte Signalwege, Synthese und Regulation von Prostaglandinen, leukozytäre transendotheliale Migration und die Signaltransduktion durch transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF beta). Die inflammatorische Antwort während der chronischen Phase zeigte im PHC eine stärkere Regulation als im HC. Im Rahmen der immunhistochemischen Validierung konnte das differentielle Expressionsmuster der Proteine Heat shock 70 kDa protein (Hspa1a), P2Y Purinoceptor 12 (P2ry12) und P2X Purinoceptor 7 (P2rx7) bestätigt werden, die eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Mikroglia spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie liefern neue Erkenntnisse über die komplexen molekularen Veränderungen der Epileptogenese. Darüber hinaus deuten sie auf eine unterschiedliche Veränderung der molekularen Muster von HC und PHC während dem Zeitverlauf der Epileptogenese hin. Die Daten stellen zudem neue Informationen über das differentielle Expressionsmuster zahlreicher Proteine zur Verfügung, die bei wichtigen inflammatorischen Prozessen und Signalwegen eine Rolle spielen. Von besonderer Bedeutung ist hierbei die Regulation TLR-assoziierter Proteine und Purinozeptoren, die zu den essentiellen Modulatoren der inflammatorischen Antwort gezählt werden. Zusammenfassend trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zu unserem Verständnis über die molekularen und im Besonderen die inflammatorischen Mechanismen der Epileptogenese bei. Die Ergebnisse liefern eine umfassende Grundlage für die zukünftige Identifikation und Entwicklung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern für molekulare Bildgebungsverfahren. Die funktionellen Einflüsse einzelner Proteine sollten in zukünftigen Studien (zum Beispiel in Knock-out-Maus-Modellen) bestätigt und genauer untersucht werden.

Um den Wirkmechanismus verschiedener Krebstherapeutika aufzuklären bzw. besser zu verstehen wurden in der vorliegenden Arbeit deren Wirkungen auf Zelllinien untersucht. Hierfür wurde die Wirkung verschiedener kommerziell erhältlicher und einiger Roche-eigener Kinaseinhibitoren auf Leukämiezelllinien untereinander und mit der Wirkung von FLT3-siRNAs verglichen. Die Auswirkungen von Behandlungen mit anti-CD20- und anti-BCR-Antikörper wurden an Lymphomzelllinien analysiert. Für die FLT3-Inhibition konnte gezeigt werden, dass die Vorhersagen zur Spezifität aus der Display-Technologie in vier von fünf Fällen tendenziell richtig waren. In einem mehrstufigen Verfahren wurden verschiedene Eigenschaften der Inhibitoren getestet: Hemmung der Phosphorylierung von rekombinanter FLT3-Kinase, Hemmung der zellulären Phosphorylierung der Wildtyp-FLT3-Kinase, Hemmung der Phosphorylierung von FLT3 mit der ITD-Mutation. So konnte für die Substanzen VX-680, CHIR-265 und RKI-1 eine FLT3-Hemmung als primärer Wirkmechanismus in einer Zelllinie mit FLT3-ITD ausgeschlossen werden. Für die kommerziell erhältlichen Inhibitoren Sorafenib, CFI-2 und CFI-3 sowie die neue Substanz RKI-3 konnte bestätigt bzw. gezeigt werden, dass sie FLT3 / FLT3-ITD in biochemischen und zellulären Testsystemen spezifisch hemmen können. Die Expressionsprofilierung erwies sich für die Klärung dieser Fragestellung nur als bedingt geeignet, da die Expressionsmuster der Behandlungen mit verschiedenen Inhibitoren untereinander trotz unterschiedlicher Wirkungsweisen funktionell stark übereinstimmten. In diesen Profilen zeichnete sich bereits nach vierstündiger Behandlung ein Zellzyklusarrest ab, und im weiteren Verlauf wurden sie von Expressionsänderungen aus dem Umfeld der Apoptose dominiert. Die Inhibitoren konnten jedoch hinsichtlich der FLT3-Hemmung relativ zu einander aufgrund der Übereinstimmung mit dem Muster der Behandlung mit FLT3-siRNAs eingeordnet werden. Aus den bei beiden Behandlungsarten übereinstimmend deregulierten Genen wurden zeitabhängige FLT3-Inhibitionssignaturen abgeleitet.Die Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Typ I anti-CD20-Antikörpern zeigten, dass der Signalweg downstream von CD20 in den getesteten Zelllinien zumindest teilweise mit dem der BCR-Aktivierung identisch ist. Obgleich die Übereinstimmung der BCR-Aktivierungsmuster der verschiedenen Zelllinien verhältnismäßig gering war, konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsmuster der Behandlungen mit anti-CD20- bzw. anti-BCR-Antikörpern untereinander in großen Teilen übereinstimmten. Zwei der besonders schnell und stark induzierten Gene waren CCL3 und CCL4. Die Kinase SYK ist als Signalüberträger downstream des BCR bekannt. Die Induktion der Cytokine CCL3 und CCL4 konnte durch SYK-Hemmung mittels spezifischer Inhibitoren und das siRNA-vermittelte Stilllegen von SYK deutlich vermindert werden. Somit deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass SYK auch im Signalweg von CD20 eine wichtige Rolle spielt. Durch die Behandlung von NHL-Zelllinien mit anti-CD20-Antikörpern wie Rituximab oder LT20 wird demzufolge eine zelluläre Antwort ausgelöst, die einer BCR-Aktivierung ähnelt.

Der humane Thyreotropin-Rezeptor (TSH-R) steuert die zentralen Funktionen der Schilddrüse und ist der wichtigste Regulator für deren Wachstum und Differenzierung. Er gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und kann nach einer Stimulation mit TSH die G-Proteine aller vier Familien (Gs, Gi/o, Gq/11 und G12/13) aktivieren. Dabei werden die meisten zellulären Reaktionen wie die Proliferation der Schilddrüsenepithelzellen und die Bereitstellung der Schilddrüsenhormone einer Aktivierung von Gs zugeordnet. Zu Gs-unabhängigen Signalwegen des TSH-R war dagegen erst wenig bekannt. Da der Gq/11-vermittelte Signalweg durch die Aktivierung der Phospholipase C und Proteinkinase C in maligne Prozesse von Schilddrüsenzellen involviert sein könnte, sollten in der vorliegenden Arbeit Gq/11-abhängige Effektoren des TSH-R in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen identifiziert und näher charakterisiert werden. Als Modellsystem wurden FTC 133 wt TSH-R Zellen verwendet, eine follikuläre Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie, die den humanen TSH-R überexprimiert. In diesen wurde die Aktivierung des Calcium/Calcineurin-abhängigen Transkriptionsfaktors NFAT nach TSH-Stimulation erstmalig beschrieben. Bei einer anschließenden Reihenuntersuchung der NFAT-abhängigen Zielgene Autotaxin, VEGF, c-Myc, Regulator von Calcineurin 1 (RCAN1) und Cyclooxygenase-2 (Cox-2) wurden c-Myc, RCAN1 und Cox-2 als TSH-regulierte Gene identifiziert. Die Induktion von c-Myc war unabhängig von NFAT, dagegen bestätigten Expressionsstudien mit Calcineurin-Inhibitoren und dem spezifischen NFAT-Inhibitor INCA-6, dass RCAN1 und Cox-2 durch eine NFAT-Aktivierung induziert wurden. Diese Aktivierung wurde durch Gq/11-Proteine vermittelt, denn nach spezifischer Herunterregulation der Gq- und G11-α-Untereinheiten mittels siRNA konnten die Zielgene nicht mehr TSH-abhängig induziert werden. Weitere Analysen zum Mechanismus der NFAT-Aktivierung zeigten, dass eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration ([Ca2+]i) allein über intrazelluläre Speicher nicht ausreichend war. Um NFAT zu aktivieren, mussten zusätzlich Calciumionen aus dem Extrazellulärraum einströmen. Untersuchungen mit dem STIM1-Inhibitor SKF-96365 wiesen dabei auf einen Calciumioneneinstrom über Speicher-operierte Ionenkanäle hin. Zusätzlich zur NFAT-regulierten Genexpression wurde in dieser Arbeit die TSH-induzierte Expression des Metallothioneins MT1X in FTC 133 wt TSH-R Zellen und in primären Thyreozyten analysiert. Die mRNA Induktion dieses Cystein-reichen und zytoprotektiven Proteins war ebenfalls abhängig von einer Expression der Gq/11-Proteine. Eine Erhöhung der [Ca2+]i reichte jedoch nicht aus, um MT1X signifikant zu induzieren. Zur gesteigerten Expression war darüber hinaus auch die Aktivierung der Proteinkinase C notwendig. In der vorliegenden Dissertation konnten somit RCAN1, Cox-2 und MT1X als Gq/11-regulierte Zielgene des humanen TSH-R charakterisiert werden. Dabei wurde eine NFAT-regulierte Genexpression nach einer TSH-Stimulation erstmalig gezeigt. Die präsentierten Ergebnisse weisen damit auf eine bisher unbeachtete biologische Rolle von Gq/11-abhängigen Signalwegen des humanen TSH-R in der Schilddrüse hin.

Thu, 6 Jun 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15830/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15830/1/Hetrodt_Justin.pdf Hetrodt, Justin

Die Induktion eines vaskulären Wachstums und Remodelings stellt einen vielversprechenden neuen Therapieansatz für Patienten mit koronarer Herzerkrankung dar. Stickstoffmonoxid (NO) nimmt in der Regulation des Blutflusses, in der Aufrechterhaltung der vaskulären Homöostase sowie als second messenger für die Induktion einer Arteriogenese und Angiogenese eine zentrale Rolle ein. Dank des Systems der druckregulierten Retroinfusion steht daneben ein komplikations- und nebenwirkungsarmes Verfahren zur Verfügung, das eine selektive, homogene und effektive Applikation von gefäßbildenden Faktoren im Myokard ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurde die retrograde Infusion von eNOS S1177D komplementärer DNA (als konstitutiv aktive Mutante) in die anteriore Koronarvene zur Induktion einer therapeutischen Revaskularisation im chronisch ischämischen, hibernierenden Myokard untersucht. Mittels perkutaner Implantation eines präparierten Koronarstents wurde zunächst eine hochgradige Stenose im proximalen LAD-Segment der linken Koronararterie herbeigeführt. Nach sieben Tagen wurde angiographisch ein Restfluss dokumentiert, um eine langsame aber stetige Abnahme der myokardialen Durchblutung bis zur vollständigen Okklusion zu gewährleisten und die Induktion einer myokardialen Hibernation mit reduzierter kontraktiler Funktion ohne schwerwiegende Infarzierung des Gewebes sicherzustellen. Drei Wochen später wurde den Tieren eNOS S1177D cDNA, eNOS S1177D und L-NAME (unspezifischer NO-Inhibitor) oder eGFP cDNA als Scheintransfektion retrograd in die anteriore Koronarvene infundiert (n,=,6 pro Gruppe). Sowohl am Behandlungstag als auch am Tag,49 der Untersuchung (Versuchsende) wurden Parameter der globalen Herzfunktion bestimmt. Zur Analyse der regionalen myokardialen Perfusion dienten fluoreszierende Mikrosphären; die Bestimmung der regionalen Myokardfunktion als subsegmentale Segmentverkürzung gelang mit Hilfe der Sonomikrometrie. Für das Kollateralenwachstum wurden postmortale Angiographien ausgewertet. Darüber hinaus war zur Ermittlung der Expression von eNOS, des regionalen Blutflusses und der Kapillardichte die Entnahme von Gewebeproben aus dem linken Ventrikel erforderlich. In dieser Untersuchung demonstrieren wir, dass die retrograde Applikation von eNOS S1177D cDNA über die Überexpression von eNOS ein NO vermitteltes Gefäßwachstum induziert, welches mit einer gesteigerten myokardialen Perfusion einhergeht und schließlich zu einer verbesserten kontraktilen Funktion im Zielgebiet führt. Die zum Kontrollareal 2,3-fach gesteigerte Expression von eNOS geht dabei über eine gesteigerte Bildung von NO respektive cGMP (117,1,% der RCx-perfundierten Region) neben einer Proliferation von Kapillaren (Angiogenese) insbesondere mit der Bildung von kollateralisierenden Anastomosen (Arteriogenese) einher. Aus diesem vaskulären Wachstum und Remodeling resultiert im Vergleich zur Kontrollgruppe arealabhängig eine bis zu 2,2-fach gesteigerte myokardiale Perfusion, wodurch sich die regionale Herzfunktion (subsegmentale Segmentverkürzung) bei erhöhtem Sauerstoffbedarf von 7.% auf 41,% (Herzfrequenz von 120 Schägen pro Minute) respektive 33,% (Herzfrequenz von 140 Schlägen pro Minute) des normoxischen Myokards regeneriert.

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den durch S-Lost-verursachten Symptomen in der Haut, die zunächst durch starke Blasenbildung und später durch eine verzögerte Wund-heilung charakterisiert sind. Bei S-Lost handelt es sich um einen chemischen Kampfstoff, der erstmals im ersten Weltkrieg zum Einsatz kam und bis heute in vielen internationalen Kon-flikten großen Schaden anrichtete, obwohl der Gebrauch schon 1925 durch die Genfer Konvention verboten wurde. Aktuell stellt S-Lost zudem eine Bedrohung durch terroristische Aktivitäten dar. Da für S-Lost-induzierte Verletzungen bislang keine spezifisch wirksamen Behandlungs-methoden verfügbar sind, besteht großes Interesse an der Aufklärung der dem Krankheitsbild zugrunde liegenden molekularen Pathomechanismen, um daraus Rückschlüsse auf besser ge-eignete therapeutische Maßnahmen ziehen zu können. In unseren ersten Experimenten wurden als mögliche Auslöser der Blasenbildung die Expression und Sekretion ausgewählter Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und deren endogenen Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs) in einem 3D-Haut-modell und in verschiedenen Zelltypen der Haut (Keratinozyten, Fibroblasten, mikrovaskuläre Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen, monozytäre Zellen, PMN-Granulozyten) sowohl in Mono- als auch in Mischkultur untersucht. Unter Verwendung von molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden wie qRT-PCR, Zymographie und Western Blot gelang der Nachweis, dass MMPs - insbesondere MMP-9 - nach Exposition der Zellen (v.a. Fibroblasten und monozytäre Zellen) mit S-Lost deutlich hochreguliert wurden. Zu Erhärtung der Annahme, dass MMP-9 durch Degradation der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis zur Blasenbildung beiträgt, konnte als Pathomechanismus nun erstmals eine parakrine Stimulation von Fibroblasten durch S-Lost-behandelte Keratinozyten identifiziert werden, als deren Folge eine vermehrte MMP-9-Sekretion resultierte. Darüber hinaus zeigte sich in weiteren Versuchen unter Verwendung des sog. Scratch-Assays und eines Transwell-basierten Invasionsassays, dass das Migrations- und Invasionsverhalten der Fibroblasten in Gegenwart des konditionierten Mediums der S-Lost-behandelten Keratinozyten positiv beeinflusst wurde. Aus klinischer Sicht sprechen diese Erkenntnisse für neue therapeutische Ansätze, die darauf beruhen sollten, die S-Lost-induzierte, auf proteolytischer Aktivität basierende Blasenbildung der Haut durch Applikation spezifischer MMP-Inhibitoren zu behandeln. In einem weiteren Projekt wurde die verzögerte Wundheilung als spätes Symptom der S-Lost-Vergiftung auf zellulärer Ebene untersucht, bei der eine eingeschränkte Re-Epithelialisierung der betroffenen Hautstellen beobachtet wird. Sowohl für den Prozess der Wundheilung als auch für die stetige Erneuerung der Haut werden epidermale Stammzellen benötigt, die für die Bildung von Keratinozyten verantwortlich sind. Diese unipotenten Progenitorzellen befinden sich in der basalen Schicht der Epidermis und sind in der Lage zu proliferieren und anschließend terminal zu differenzieren. Um eine Beeinflussung dieser Prozesse durch S-Lost zu untersuchen, wurden primäre unreife Keratinozyten (NHEK) verwendet und hinsichtlich ihres Differenzierungspotenzials untersucht. Dabei erwies sich S-Lost als potenter Induktor der Differenzierung von NHEK, was durch Bestimmung der Expression typischer Markerproteine wie Keratin-1, Involucrin und Loricrin gezeigt wurde. Die Induktion des Reifungsprozesses war sowohl von einem Rückgang der Proliferation als auch von einer verminderten Migrationsrate der Zellen begleitet. Die eingehende Analyse von mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signaltransduktionswegen führte zu der Erkenntnis, dass die Aktivitäten von p38 und ERK1/2 gegenteilige Rollen im Differenzierungsprozess einnehmen. Studien mit spezifischen Inhibitoren der MAPK be¬legten, dass p38 für den Reifungsvorgang in NHEK essentiell ist, während ERK1/2 diesem entgegen wirkt. So konnte durch Blockade von p38 die von S-Lost ausgelöste Differenzierung der Zellen verhindert werden. Ebenso war es durch diese Behandlung möglich, die von S-Lost stark beeinträchtige Migrationsfähigkeit der Keratinozyten wiederherzustellen, welche mit einer erhöhten MMP-1-Expression einherging. Davon abgeleitet erscheint es therapeutisch sinnvoll, selektive p38-Inhibitoren für die Behandlung von Wundheilungsstörungen nach Exposition der Haut mit S-Lost einzusetzen. Zusammenfassend erbrachten unsere Studien also den Nachweis, dass der S-Lost-induzierten Blasenbildung (als frühes Symptom) die spezifische Induktion der MMP-9 zugrunde liegt. Darüber hinaus konnte erstmals eine verfrühte Differenzierung in unreifen Keratinozyten der Haut (als mögliche Ursache für die verzögerte Wundheilung) nachgewiesen werden, wobei die MAPK p38 bei der Initiierung des Prozesses von entscheidender Bedeutung ist. Aufgrund dieser Resultate empfiehlt sich eine kombinierte Applikation von Inhibitoren der Aktivitäten von MMP-9 und p38, wobei der Einsatz jedoch zeitlich abgestimmt erfolgen sollte, um pathologische Effekte (Blasenbildung bzw. Differenzierungsinduktion in Keratinozyten) zu blockieren, ohne die positiven Auswirkungen von MMP-9 und p38 auf die Heilung (Migration von Immunzellen und Keratinozyten bzw. Reepithelialisierung) zu hemmen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung der Farnesyltransferase-Inhibitoren hinsichtlich der antitumorösen Wirkung auf gastrointestinale Tumore in verschiedenen in vitro Experimenten untersucht. Als Marker für die therapeutische Wirkung wurde die Induktion der Apoptose gewählt. Durchgeführt wurden unsere Versuche mit den Zelllinien HepG2, gewonnen aus einem hepatozellulären Karzinom, sowie HT29, einem kolorektalen Adenokarzinom, unter Verwendung von BMS-214662 und SCH66336 als Vertreter der Farnesyltransferase-Inhibitoren. Diese werden derzeit in klinischen Studien getestet. BMS-214662 befindet sich in Phase II, im Rahmen von SCH66336 sind bereits Phase III Studien abgeschlossen worden. Anhand von Apoptose-Assays waren wir in der Lage einen antitumorösen Effekt durch Induktion der Apoptose aufzuzeigen. Hierbei war die Apoptose-Auslösung dosisabhängig von dem verwendeten Farnesyltransferase-Inhibitor. Im Gegensatz zu SCH66336 induzierte BMS-214662 bereits unter Verwendung von 1µM in 24h die Apoptose, wohingegen eine Konzentration von 25µM SCH66336 notwendig war, eine signifikante Apoptose hervorzurufen. Die Induktion der Apoptose war dabei unabhängig von einer Ras-Mutation. Sowohl in den HT29-Zellen mit Mutation des Ras-Proteins, als auch in den mutationsfreien HepG2-Zellen erfolgte ein Anstieg der Apoptoserate. Zusätzlich zeigten wir einen möglichen synergistischen Effekt für den Antikörper anti-APO in Verbindung mit BMS-214662. Mit Hilfe des Western Blots konnte als ein möglicher Induktionsfaktor eine gesteigerte Rekrutierung der Caspase 8 dargestellt werden. Dies bestätigte sich durch eine messbare Erhöhung der Caspase 3, welche durch Caspase 8 aktiviert wird und den apoptotischen Tod der Zelle hervorruft. Insgesamt läuft der Mechanismus Rezeptor- bzw. Liganden-unabhängig ab, da in der durchgeführten rt-PCR weder vermehrt CD95-Rezeptor bzw. dessen Ligand nachgewiesen werden konnte.

Thu, 15 Apr 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12108/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12108/1/Heimbeck_Irene.pdf Heimbeck, Irene

Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.

Ziel dieser Arbeit ist es, eine effektive, selektive und homogene Applikation von bekannten Angiogenesefaktoren in eine ischämische Extremität zu etablieren. Die Induktion therapeutischer Angiogenese im ischämischen Hinterlauf ist bereits über den arteriellen Weg wie auch über eine intramuskuläre Applikation gelungen. Als Alternative, das ischämische Gewebe über eine stark stenosierte oder sogar verschlossene Arterie oder aber inhomogen über eine intramuskuläre Injektion zu erreichen, wird in dieser Arbeit das intakte venöse Gefäßsystem unter Verwendung der Retroinfusion genutzt. Hierfür kommt basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) als etablierter Angiogenesefaktor zur Anwendung. Die Retroinfusion wird hierbei mit der intramuskulären Applikation verglichen. Darüber hinaus wird überprüft, ob eine zusätzliche low-dose Ko-Applikation von Vascular Endothelial Derived Growth Factor (VEGF) einen additiven Effekt erzielen kann. Die chronische Ischämie im Hinterlauf des Kaninchens wird am Tag 0 mittels Exzision der Arteria femoralis und Ligatur ihrer Aufzweigungen erreicht. Am Tag 7 wird die Baseline für die Kollateralenanzahl mittels Angiographie und ein Korrelat für die Blutflussgeschwindigkeit in den Kollateralen (Frame Count Score) ermittelt. Anschließend erfolgt die retrograde Applikation von NaCl- Lösung (Kontrollgruppe) oder bFGF (20 μg/kg KG) mit oder ohne VEGF165 (10 μg/kg) über eine Unterschenkelvene. Alternativ wird bFGF (20 μg/kg KG) in die Ober- und Unterschenkelmuskulatur injiziert. Am Tag 35 werden erneut die Kollateralenanzahl wie auch der Frame Count Score ermittelt. Darüber hinaus werden Muskelproben zur Bestimmung des Kappilarwachstums entnommen. Die Ergebnisse zeigen, dass in der Kontrollgruppe das Kapillarwachstum wie auch die Kollateralenanzahl am Tag 35 im Vergleich zum Tag 7 nicht signifikant zunehmen. Die retrograde Applikation von bFGF induziert hingegen eine signifikante Zunahme des Kapillarwachtums und der Kollateralenanzahl, woraus sich eine höhere Blutflussgeschwindigkeit (Frame Count Score) ableiten lässt. Die Ergebnisse entsprechen denjenigen der intramuskulären bFGF Applikation. Die low-dose Ko-Applikation von VEGF165 als Retroinfusion kann keine weitere Verbesserung im Vergleich zur alleinigen bFGF Gabe induzieren. Zusätzlich wurde mit Hilfe szintigraphischer Methoden die venöse retrograde Infusion mit der antegraden arteriellen Applikation verglichen. Hierbei zeigte sich eine effektive, selektive und homogenen Verteilung der infundierten Lösung im Zielgebiet mit einer deutlich verlängerten Verweildauer zu Gunsten der Retroinfusion. Es kann postuliert werden, dass durch eine einmalige venöse Retroinfusion von bFGF Angiogenese und damit ein gesteigerter Blutfluss im Modell des chronischen ischämischen Hinterlaufs des Kaninchens wirkungsvoll induziert werden kann. Zusammenfassend erscheint die venöse retrograde Verabreichung von Wachstumsfaktoren in ein ischämisches Gebiet als eine effektive Methode, Kollateralwachstum und Kapillarsprossung mit folgender Verbesserung des Blutflusses zu induzieren. Da es sich hierbei um ein klinisch anwendbares Applikationsverfahren handelt, könnte dieser Ansatz zu einer Verbesserung der klinischen Effektivität der therapeutischen Angiogenese führen.

Das „Acute Respiratory Distress Syndrome“ (ARDS) ist eine akut auftretende, überwiegend Sepsis-induzierte, inflammatorische Erkrankung der Lunge mit hoher Letalität. Ein komplexes Netzwerk aus proinflammatorischen Zytokinen und Mediatoren initiiert und perpetuiert dabei die pulmonale Entzündungreaktion. Vor diesem Hintergrund steht das Konzept der therapeutischen Suppression dieser Substanzen. Dem Zytokin Interleukin-10 (IL-10) könnte in diesem Zusammenhang aufgrund seines ausgeprägten antiinflammatorischen Wirkspektrums eine Bedeutung zukommen; IL-10 hemmt physiologisch die Synthese und Freisetzung von Entzündungsmediatoren. In tierexperimentellen Untersuchungen bei Sepsis bzw. experimenteller Endotoxinämie konnte die protektive Wirkung von systemisch appliziertem IL-10 auf das Überleben der Versuchstiere sowie die Verminderung der Konzentrationen zirkulierender, proinflammatorischer Mediatoren gezeigt werden. Mit der vorliegenden Studie wurde erstmals untersucht, welche Auswirkungen eine Behandlung mit inhaliertem IL-10 im Hinblick auf die pulmonale und systemische Entzündungsreaktion hat. Da die Tierversuche in der intubierten und kontrolliert beatmeten Ratte durchgeführt werden sollten, musste zunächst ein hierfür geeignetes Verneblersystem entwickelt werden. Die in vitro Evaluation des neu entwickelten Verneblersystems ergab, dass das entwickelte Jetverneblersystem eine für eine alveoläre Deposition geeignete Partikelgröße liefert (d = 2µm). In vivo zeigten die produzierten Aerosolpartikel eine gleichmässige Deposition über die gesamte Lunge. Insgesamt deponierten rund 3.8%(1.3) (Median(IQR)) der vernebelten Ausgangslösung in alveolären Bereichen. Der Vernebelungsprozess beeinflusste weder die Herzfrequenz, den mittleren arteriellen Blutdruck, den arteriellen Sauerstoff- und Kohlendioxidpartialdruck noch die Integrität des Lungenparenchyms und kann daher als sicher angesehen werden. An 24 narkotisierten, kontrolliert beatmeten Ratten wurde die antiinflammatorische Wirkung von IL-10-Aerosol untersucht. Die Induktion des experimentellen Lungenschadens erfolgte durch intravenöse Injektion von Endotoxin (LPS). Die Tiere wurden zufällig einer von drei Versuchsgruppen zugeordnet: Die LPS-Gruppe erhielt eine LPS-Injektion (5mg/kg/KG) ohne therapeutische Intervention. Bei der IL-10-Gruppe erfolgte unmittelbar vor LPS-Injektion eine Behandlung mit IL-10-Aerosol (vernebelte Dosis: ~5μg/Tier; deponierte Dosis: ~0.19 μg/Tier). In einer Kontrollgruppe wurde die Auswirkung von Narkose, chirurgischer Präparation, Beatmung und Aerosolapplikation (Inhalation von PBS als die IL-10-Trägerlösung) evaluiert. Während einer Beobachtungszeit von 6h nach LPS-Injektion wurden kontinuierlich die Hämodynamik und Lungenmechanik sowie stündlich die arteriellen Blutgase und das Butbild bestimmt. Am Ende der Versuche erfolgten eine Bronchoalveoläre Lavage (BAL) sowie die Entnahme von Blut- bzw. Plasmaproben. Wichtigste Zielparameter waren hierbei die pulmonale und systemische Entzündungsreaktion. Durch die Injektion von LPS konnte sowohl systemisch als auch pulmonal eine akute Entzündungsreaktion ausgelöst werden. Zwar führte die experimentelle Endotoxinämie nur zu geringen Verschlechterungen der klinischen Parameter, jedoch zeigte sich sowohl in der BAL als auch im Plasma ein Anstieg der bestimmten proinflammatorischen Mediatoren (TNF-α, IFN-γ, RANTES, IL-1, IL-6). Desweiteren führte LPS zu einer Freisetzung reaktiver Stickstoffradikale aus durch die BAL gewonnenen und ex vivo kultivierten Alveolarmakrophagen. Die Applikation von IL-10-Aerosol senkte die erhöhten Konzentrationen von IFN-γ, RANTES, IL-1 und IL-6 sowohl in der BAL als auch im Plasma. Eine Reduktion der TNF-α-Konzentration war nur in der BAL nachweisbar. Auch die Freisetzung von reaktiven Stickstoffradikalen aus Alveolarmakrophagen wurde durch IL-10-Inhalation suffizient supprimiert. Die Vernebelung von IL-10 vor Induktion einer experimentellen Endotoxinämie zeigte sowohl pulmonal als auch systemisch antiinflammatorische Wirkungen. Basierend auf den hier vorgestellten Befunden können nun weitere Untersuchungen zur Beschreibung der Dosis-Wirkungsbeziehung und zur Bestimmung des Zeitfensters für eine therapeutische Applikation von IL-10-Aerosol nach LPS-Stimulation folgen.

Als eine der wichtigsten Augenerkrankungen des Pferdes wird der equinen rezidivierenden Uveitis seit der Antike eine große Bedeutung beigemessen. Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist die Ätiologie und Pathogenese dieser Erkrankung jedoch nicht ganz erforscht. Viele vorausgegangene Untersuchungen weisen auf ein autoimmun-mediiertes Geschehen hin. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des potenziellen Autoantigens cellular retinaldehyde-binding protein (cRALBP) anhand der Kriterien der drei Postulate von Witebsky. Dem ersten Postulat folgend muss das Autoantigen bekannt sein. cRALBP wurde bereits in einer früheren Arbeit als potenzielles Autoantigen in der ERU beschrieben (Pompetzki 2003). Dem zweiten Postulat Witebskys folgend, müssen Autoantikörper und/oder autoreaktive Zellen gegen das potentielle Autoantigen nachgewiesen werden. Dazu wurden die Serumproben von 289 und die Glaskörperspülproben von 326 ERU-Patienten im ELISA getestet. 29,1% der Serumproben und 19% der Glaskörperproben wiesen positive ODs gegen cRALBP auf. Die Untersuchungen zur T-Zellantwort zeigten, dass 6 von 20 ERU-Patienten nach Kontakt mit cRALBP in den Proliferationsassays positive Stimulationsindizes aufzeigen. Das gleichzeitige Auftreten positiver ODs gegen cRALBP und andere, bereits bekannte retinale Autoantigene im ELISA lässt auf eine Beteiligung von cRALBP am Mechanismus des Epitop Spreading schließen. Auch in der T-Zellantwort konnte dies nachgewiesen werden. Die Induktion der Erkrankung durch Immunisierung gilt als indirekter Beweis einer autoimmun-mediierten Erkrankung und beschreibt das dritte Postulat von Witebsky. Sowohl im Lewisratten- als auch im Pferdemodell konnte durch subcutane Immunisierung mit cRALBP in FCA eine Uveitis ausgelöst werden. Diese konnte sowohl klinisch als auch histopathologisch gezeigt werden. Somit wurden alle zur Charakterisierung eines potenziellen Autoantigens notwendigen Postulate von Witebsky erfüllt und cRALBP muss, neben S-Antigen und Interphotorezeptor-Retinoid-bindendem-Protein, als neues Autoantigen in der ERU bezeichnet werden.

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist weltweit der zweithäufigste bösartige Tumor. Fernmetastasen eines CRC treten zumeist in Leber und Lunge auf, sind nur in seltenen Fällen operativ entfernbar und sprechen nicht auf derzeit verfügbare Chemotherapien an. Die Identifizierung von Genen und die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, durch welche sie zur Tumorprogression eines CRC beitragen, liefert eine Grundlage für die Prävention oder Behandlung der zumeist tödlich verlaufenden Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des metastatischen Phänotyps in Kolonkarzinomzellen verantwortlich sind. Hierzu wurden mittels der Genchip-Technologie die Transkriptionsprofile von insgesamt fünf Tumor-Zelllinien erstellt und nach stringenten Auswahlkriterien miteinander verglichen. Zuerst wurde ein CRC-Zellmodell verwendet, das aus einer in der Nacktmaus nicht-metastasierenden humanen Primärtumor-Zelllinie KM12C und zwei davon abgeleiteten, stark zur Leber metastasierenden Zelllinien, KM12SM und KM12L4A bestand. In diesem überwiegend isogenen Zellmodell wurden 145 Gene in beiden metastasierenden Zelllinien als dereguliert im Vergleich zu der nicht-metastasierenden Zelllinie identifiziert. Die Transkriptionsprofile eines weiteren humanen CRC-Zellmodells, bestehend aus einer nicht-metastasierenden Zelllinie HCT116 und einer stark zur Lunge metastasierenden Zelllinie HCT116U5.5 wurden ebenfalls verglichen und 72 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Ein Vergleich der Datensätze aller Transkriptionsprofile ermöglichte die Identifizierung von Vimentin und Trop-2 (TACSTD2, „Tumorassoziierter Vermittler von Kalziumsignalen“) als in allen metastasierenden Zelllinien überexprimiert. Die hohe Homologie des bisher noch weitestgehend unerforschten Trop-2 zu Trop-1 (Ep-CAM), einem regulatorischen Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das überwiegend von aggressiven Tumorarten exprimiert wird und die Proliferation von Tumorzellen stimulieren kann, machten Trop-2 für weiterführende Expressions- und Funktionsstudien zu einem interessanten Zielgen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Expressionsstudien in einer Vielzahl von Tumorbiopsien zeigten deutlich erhöhte mRNA- und Proteinspiegel von Trop-2 in Metastasen aus CRC im Vergleich zu den Primärtumorgeweben. Zusätzlich zu diesem neuen Befund in CRC wurde in dieser Arbeit erstmalig eine erhöhte Expression von Trop-2 in Schild-drüsenkarzinomen und in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben nachgewiesen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Trop-2 für die Metastasierung von Karzinomzellen des Kolons wurden stabile Transfektanten für Trop-2 in der nicht-metastasierenden Zelllinie KM12C generiert. Die konstitutiv Trop-2 exprimierenden Zellklone zeigten erhöhte Cyclin D1-Proteinspiegel bei unveränderter Zellproliferation gegenüber den Vektorkontrollen. Die Induktion von Cyclin D1 könnte mit der Identifizierung eines ebenfalls erhöhten Proteinspiegels von ß-Catenin in den Trop-2 exprimierenden Transfektanten in Zusammenhang stehen. Somit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Einfluss von Trop-2 auf den Tcf/ß-Catenin Signalweg. Zusätzlich demonstrierte ein Migrationstest erhöhte mobile Eigenschaften von Trop-2 exprimierenden Zellen in vitro, während sich die invasive Fähigkeit der Transfektanten, in vitro durch eine Matrigelschicht zu wandern, nicht von den Vektorkontrollen unterschied. Die induzierte Expression von Trop-2 in der Mehrzahl von Metastasen des kolorektalen Karzinoms sowie in Tumoren von Lunge und Schilddrüse war eine neue Beobachtung. Diese Ergebnisse demonstrieren das Potential von Hochdurchsatzmethoden wie die hier verwendete Genchip-Technologie in Kombination mit geeigneten Zellmodellen. In der vorliegenden Arbeit führte sie zur Identifizierung von Trop-2 als einen Marker der Tumorprogression und Metastasierung von verschiedenen humanen Karzinomen.

Bislang ist die Pathogenese paraneoplastischer neurologischer Erkrankungen des zentralen Nervensystems nicht vollständig geklärt. Insgesamt mehreren sich jedoch die Hinweise auf einen zu Grunde liegenden Autoimmmunprozess. Nicht zuletzt die Entdeckung onkoneuronaler Antikörper in Blut und Liquor betroffener Patienten lässt vermuten, dass diese Autoantigene im Rahmen des Krankheitsprozesses angegriffen werden. Bislang gibt es jedoch keinen Beweis für die vielfach favourisierte Autoimmunhypothese, nicht zuletzt ist es bisher wiederholt nicht gelungen die Erkrankung im Tiermodell zu reproduzieren. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der adoptive Transfer spezifisch gegen die onkoneuronalen Proteine Pnma1 und rYo gerichteten CD4+ Th1 T-Zellen in der Lage ist, in der DA-Ratte eine Enzephalomyelitis zu induzieren. Dazu wurden zunächst die korrespondierenden, bis dahin noch nicht bekannten Ratten-Antigene rPnma1 und rYo kloniert. Verglichen mit ihrem humanen Korrelat zeigte sich auf Aminosäureebene eine Übereinstimmung von .93,8% für das PNMA1 und 85,7% für das Yo Protein. Nach Immunisierung weiblicher Ratten mit dem entsprechenden Antigen wurden aus den drainierenden Lymphknoten ex vivo in vitro spezifische CD4+ TH1 T-Zelllinien gegen diese Proteine generiert. Es konnte schließlich gezeigt werden, dass der Transfer dieser Zellen in naiven Empfängertieren eine Enzephalitis induzieren kann, die nach histopathologischen und lokalisatorischen Kriterien der humanen Erkrankung sehr ähnlich ist. Diese bestand insbesondere aus perivaskulär, teilweise auch parenchymal lokalisierten T-Zellen und Makrophagen und war assoziiert mit Pnma1 vor allem im Mes- und Dienzephalon, assoziiert mit rYo vor allem im Kleinhirn lokalisiert. Ebenso wie es bei der mit anti- Ma oder anti-Yo assoziierten humanen Erkrankung keine Geschlechtsbevorzugung gibt, liess sich die Pnma1-assoziierte Enzephalitis in männlichen und weibliche DA-Ratten induzieren. Die alleinige Immunisierung mit Protein resultierte zwar in hohen Antikörper-Spiegeln, jedoch lediglich mit minimalen histopathologischen Veränderungen assoziiert. Die Induktion entzündlicher ZNS-Veränderung nach Transfer rPnma1- bzw. rYo-spezifischer T-Zellen konnte erstmals zeigen, dass eine Autoimmunreaktion gegen ein neuronales Antigen pathogen sein kann und sützt damit die Autoimmun- und T-Zell-Hypothese bei der Pathogenese dieser Erkrankungen.

In der vorliegenden Arbeit wurden Effekte von IL-10 auf monocytäre Lipidrezeptoren und -Transporter untersucht, die zusätzlich zu den anti-inflammatorischen Wirkungen von IL-10 für dessen anti-atherosklerotische Wirkung von Bedeutung sein könnten. Es konnte gezeigt werden, dass IL-10 die Expression des quantitativ wichtigsten Scavenger Rezeptors, CD36, in Monocyten/Makrophagen sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene hemmt. Diese Hemmung ging einher mit einer verringerten zellulären Aufnahme von oxidiertem LDL. Durch PPARgamma-FACS und -Western Blot in Cytosol-Kern-Fraktionen sowie Koinkubationen mit IL-10 und den PPARgamma-Agonisten 15d-PGJ2 (15-deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2) und Indomethacin konnte gezeigt werden, dass die IL-10 Hemmung von CD36 über die Hemmung des Transkriptionsfaktors PPARgamma vermittelt wird. Im Gegensatz dazu stimulierte IL-10 den Cholesterinexporter ABCA1 und dessen wichtigsten Transkriptionsfaktor LXRalpha auf RNA- und Proteinebene. Die Induktion von ABCA1 hatte funktionell einen verstärkten zellulären Cholesterinefflux zur Folge, welcher die Monocyten und Makrophagen vor Lipidakkumulationen schützte und das vermehrte Einschleusen von Cholesterin in den reversen Cholesterintransport ermöglicht. IL-10 stimulierte ABCA1 dabei trotz der Hemmung des Transkriptionsfaktor PPARgamma. Die IL-10 Stimulation von ABCA1 war durch Piceatannol, einem Inhibitor der proximalen, STAT3-vermittelten Signalübertragung des IL-10 Rezeptors, hemmbar. Mittels LXRalpha "knock down" Zellen konnte weiter gezeigt werden, dass für die IL-10-stimulierte ABCA1 Expression ein intakter LXRalpha-Signaltransduktionsweg nötig ist. Koinkubationen mit Fenofibrat, 9-cis RA (9-cis retinoic acid) und 22-OHC (22-Hydroxycholesterol) ergaben, dass IL-10 auch die Induktion von ABCA1 durch die beiden Transkriptionsfaktoren, PPARalpha und LXRalpha, verstärkte. Durch Hemmung der Proteinkinase A (PKA) und Messung der zellulären cAMP-Spiegel konnte des Weiteren ein distaler cross-talk des IL-10-Signalweges mit dem cAMP/PKA-Weg für die ABCA1 Stimulation nachgewiesen werden. Dagegen hatte IL-10 keinen anhaltenden Einfluss auf die Transkription von SR-BI. Der Scavenger Rezeptor BI (SR-BI) kann je nach Konzentrationsgradient sowohl die zelluläre Cholesterinaufnahme wie die Cholesterinabgabe vermitteln. Des Weiteren reduzierte IL-10 die LPS-induzierte ICAM-1 Expression, was auf die Attenuierung der NFkappaB- und PPARgamma-vermittelten ICAM-1 Expression zurückgeführt werden konnte. Insgesamt befördert IL-10 somit den ABCA1-initiierten peripheren Cholesterinabtransport aus Monocyten/Makrophagen durch HDL. Die gezeigten Effekte von IL-10 erklären tierexperimentelle Befunde eines deutlich reduzierten Lipidgehalts in atherosklerotischen Plaques unter IL-10 Behandlung. Sie erklären auch die niedrigen HDL-Spiegel bei IL-10 knock out (IL-10-/-) Mäusen, die durch exogene IL-10 Substitution korrigiert werden können. Demnach sollte IL-10 nicht nur durch seine anti-inflammatorischen Mechanismen, sondern auch durch seine Effekte auf das Cholesterinhandling von Monocyten/Makrophagen in der Gefäßwand die Entstehung und Progression atherosklerotischer Plaques reduzieren.

Die Immunantwort auf ein Verbrennungstrauma beginnt im Moment der Verletzung und resultiert in einer Monozytenaktivierung, die mit einer vermehrten Synthese und Ausschüttung von inflammatorischen Mediatoren einhergeht. Unter physiologischen Bedingungen dient ein ausgewogenes Zusammenspiel von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen der Homöostase, wohingegen das Immunsystem nach massivem Trauma mit einer oft exzessiven Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren reagiert. Patienten mit schwerer Verbrennungsverletzung sind daher hochgradig gefährdet ein ausgedehntes „systemic inflammatory response syndrome, (SIRS)“, d. h. eine maligne Ganzkörperinflammation, eine Sepsis oder eine Multiorgandysfunktion, assoziiert mit einer hohen Letalität, zu entwickeln. Eine überwiegend antiinflammatorische Immunantwort dagegen manifestiert sich als systemische Immundefizienz und Anergie mit einer signifikant erhöhten Infektionsanfälligkeit. Es besteht eine eindeutige Ursache-Effekt-Beziehung zwischen Trauma und Zytokinsystem. Mechanischer Stress führt zu schweren Störungen der Interaktion von Monozyten und T-Zellen mit der Folge einer schwerwiegenden Immundysfunktion, wobei PGE2 als einer der Hauptmediatoren der traumainduzierten Immundepression angesehen wird. Erhöhte PGE2-Spiegel sind mit einer reduzierten T-Zellmitogenese, IL-2-Produktion und IL-2-Rezeptorexpression korreliert und für eine Verschiebung der T-Helfer-Aktivität in Richtung eines dominierenden TH2 Phänotyps mit erhöhter Synthese der immunsuppressiven Zytokine IL-4 und IL-10 verantwortlich. Zytokine sind für die Kommunikation im Immunsystem, vor allem bei der Koordination einer Immunantwort durch T-Lymphozyten, von entscheidender Bedeutung. Als sezernierte Proteine waren sie bis vor kurzem der durchflusszytometrischen Analyse nur begrenzt zugänglich. Wir konnten sie wie in vorliegender Arbeit beschrieben in fixierten Zellen intrazellulär nachweisen, d. h. vor der Sekretion. Dieses Verfahren erlaubte es uns, die Expression der Zytokingene quantitativ, kinetisch, korreliert mit Oberflächenproteinen und auf die Einzelzelle bezogen analytisch zu erfassen, zumindest bis zur posttranslationalen Ebene. In peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 10 Patienten mit schwerer Verbrennungsverletzung (KOF >30%) und 15 gesunden Kontrollpersonen wurde die Zytokinsynthese mit Ionomycin und PMA polyklonal induziert und die Zellen anschließend mit fluorochromkonjugierten monoklonalen Antikörpern gegen IL-2, IL 4 und IFN-g, sowie gegen CD4-, CD8-, CD45RA- und CD45RO-Zelloberflächenantigene in unterschiedlichen Kombinationen gefärbt. Massives Verbrennungstrauma führte nach polyklonaler Stimulation der T Lymphozyten zu teils signifikanten systemischen Veränderungen der Zytokinexpression in den Kulturüberständen. Verglichen mit einer exzessiven IL-4 Freisetzung und stark erhöhter IL-10 Sekretion zeigten die IFN-g- und die IL-2 Synthese eine nur mäßige Steigerung gegenüber den gesunden Kontrollen. Wir sahen somit eine traumatisch induzierte Veränderung des Zytokinprofils in Richtung eines überwiegend TH2-artigen, immunsuppressiven Phänotyps. Diese Verschiebung von einer eher zytotoxischen (TH1) zu einer weitgehend humoralen und daher abgeschwächten Immunantwort ist mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit verbunden. Mit der durchflusszytometrischen Einzelzellanalyse gelang uns dann erstmalig die Identifikation der CD8+ Zelle, die ursächlich für die gesteigerten Syntheseantworten im posttraumatischen Verlauf verantwortlich ist. Die Synthesekapazität der CD4+ T-Helferzellen blieb nahezu unverändert. Eine Ausnahme bildete die prozentuale Abnahme IFN-g positiver Gedächtniszellen (CD45RO+) zugunsten einer zunehmenden Zahl IFN-g produzierender naiver T Helferzellen (CD45RA+). In der CD8+ Subpopulation kam es in der ersten Woche nach Verbrennungsverletzung zu einer signifikanten Steigerung der IL-2, IL-4 und IFN-g de novo Synthese, die interessanterweise bei weiterer, differenzierter Analyse eine positive Korrelation mit dem klinischen Verlauf ergab. Patienten, die verstarben, zeigten im Vergleich zu den Überlebenden signifikant erhöhte IL-4 und IL-2 Syntheseraten der CD8+ Zellen. Betrachtet man die IL-2 Synthese dieser CD8+ Zellen genauer, nahm nur die Zahl IL-2-produzierender CD8+CD45RA+ Zellen signifikant zu, verglichen mit dem Kontrollkollektiv, wobei beide Patientenkollektive an dieser Entwicklung partizipierten. Auch die IFN-g Synthese der CD8+CD45RA+ Subpopulation zeigte an allen Tagen post Trauma eine signifikante Zunahme gegenüber den Kontrollen ohne aber mit der Überlebensrate zu korrelieren. Dagegen war der prozentuale Anteil IFN-g produzierender CD8+ CD45RO+ Zellen von Verstorbenen signifikant gegenüber den Überlebenden reduziert und blieb auch an allen Untersuchungstagen deutlich hinter dem Kontrollniveau zurück, das von den überlebenden Patienten z. T. signifikant übertroffen wurde. Neben der funktionellen Charakterisierung über die Zytokinexpression (intrazellulär) kann der Aktivierungsstatus des Immunsystems durchflusszytometrisch auch über eine Oberflächenphänotypisierung ermittelt werden, ohne aber damit funktionell unterschiedliche Subpopulationen von T Zellen definieren zu können. Einen ersten Hinweis auf die Aktivierung des Immunsystems von Verbrennungspatienten erhielten wir über die signifikante Zunahme von IL-2Ra (CD25) tragenden T-Zellen in der ersten Woche nach Trauma. Aktivierte T-Zellen exprimieren darüberhinaus MHC-Klasse II-Moleküle und verschiedene Adhäsionsmoleküle, denen bei der Wechselwirkung der Zellen entscheidende Bedeutung zukommt. Akzessorische Moleküle erhöhen beispielsweise die Avidität der T-Zell-APC Interaktion und wirken kostimulatorisch. Wir konnten nach schwerer Verbrennungsverletzung eine verstärkte Expression des vorherrschenden T-Zellrezeptors (TCR) a/b und der akzessorischen T Zellmoleküle CD2, CD7, CD28, CD29 und CD80 nachweisen. Die Zunahme von CD28-Molekülen auf der Oberfläche von CD4+ und CD8+ T-Zellen ist besonders bemerkenswert, da mit zunehmender Signalstärke des über CD28 vermittelten Signals die Differenzierung einer T-Zelle auf die TH2-Entwicklung ausgerichtet wird. Die Aktivierung von T-Lymphozyten ist außerdem mit markanten Veränderungen im Expressionsmuster einzelner CD45 Isoformen verknüpft. Die Induktion der CD45RO Isoform und der Verlust von CD45RA waren beim Schwerstverbrannten besonders auffällig. Die durchflusszytometrische Bestimmung des Aktivierungsstatus des Immunsystems hat unseres Erachtens das Potenzial einer Standardmethode zur Ermittlung von Hochrisikopatienten mit deren Hilfe immunsupprimierte Patienten und solche mit SIRS und Sepsis unterschieden werden können. Die zentrale Vorbedingung für eine effektivere Sepsistherapie stellt eine verbesserte Diagnostik im Sinne kontinuierlicher zellbiologischer Informationen („Online-Monitoring“) am Krankenbett dar, um die meist sehr schnell wechselnden immuninflammatorischen Zustandsbilder direkt zu erkennen und einer zeitgerechten, individuell adaptierten Behandlungsintervention zuzuführen.

Die Superfamilie der ABC-Proteine ist eine der größten bisher bekannten Proteinfamilien. Ihre Mitglieder enthalten ein oder zwei nukleotidbindende Domänen mit je einem Walker A- und B-Motiv, sowie das charakteristische ABC-Motiv. Ein Großteil darunter sind Membranproteine, die zusätzlich ein oder zwei Transmembrandomänen besitzen. Diese ABC-Transporter sind vor allem in Mensch und Hefe charakterisiert, wo sie in zahlreichen Transportprozessen über die Membranen involviert sind. Über die Funktion der ABC-Transporter in pflanzlichen Organismen ist wenig bekannt, jedoch gibt es Hinweise dass diese Proteinfamilie in Pflanzen auch an der Kompartimentierung von Fremdstoffmetaboliten beteiligt ist. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurden 103 ABC-Transportergene annotiert, die sich in 9 Subfamilien aufteilen. Experimentell nachgewiesen wurden bisher lediglich 6 Mitglieder aus 2 Subfamilien. In dieser Arbeit wurden 28 ABC-Transporter aus 6 Subfamilien, davon 4 bisher nicht untersuchte, hinsichtlich organspezifischer Expression und Induktionsverhalten nach Herbizid- bzw. Safenerbehandlung untersucht. Dazu wurde ein DNA-Array ("Detox-Array") mit genspezifischen Sonden zur parallelen Transkriptanalyse etabliert. Zusätzlich wurden in Zusammenarbeit mit anderen Projekten weitere Genfamilien mit einbezogen, die potenziell an der Detoxifizierung von Xenobiotika beteiligt sind (Cytochrom P450 Monooxygenasen, Glutathion-S-Transferasen und UDP-Glycosyltransferasen), um Koregulationen einzelner Mitglieder der unterschiedlichen Genfamilien untersuchen zu können. Um die Unterscheidung auch hoch homologer Mitglieder dieser Familien zu ermöglichen, wurden Sonden aus dem 3‘-untranslatierten Bereich dieser Gene entwickelt und auf ihre Eignung zur Transkriptmessung untersucht. Die Expressionsanalyse der ABC-Transporter in Wurzeln, Stängeln, Blättern, Blütenständen und Schoten zeigte neben den sechs bereits bekannten ABC-Transportern Transkripte von 21 weiteren Vertretern. Die meisten waren in der Wurzel (26 von 28) nachzuweisen, die wenigsten (7 von 28) im Blatt. Am höchsten exprimiert waren AtMRP12 und AtPDR8 in der Wurzel und AtMRP5 in der Schote. Die Induktion der ABC-Transporter durch Xenobiotika wurde an Pflanzen 24h oder 36h nach Behandlung mit unterschiedlichen Chemikalien (Primisulfuron, Bromoxynil, Benoxacor) in sublethalen Dosen untersucht. Für die beiden Herbizide typische Schäden konnten erst 3 Tage nach der Behandlung beobachtet werden. Neben der in der Literatur beschriebenen Primisulfuron-Induktion von AtMRP3 (Tommasini et al., 1997) waren AtPDR8, AtMRP5, AtMRP4 und AtAOH1 transient nach 24h induziert. Mit einem Antiserum, das gegen die Subfamilie der PDR-Transporter erzeugt worden war, konnte deren Induktion durch Primisulfuron und Benoxacor auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Eine spezifische 6-fache Induktion nach Bromoxynil-Behandlung zeigte der ABC-Transporter AtTAP1. Die sechs genannten ABC-Transporter stellen somit Kandidaten dar, die an der Kompartimentierung von Metaboliten beteiligt sein können. Dabei kann es sich entweder um Primisulfuron- bzw. Bromoxynilmetabolite oder durch die Behandlung mit den Xenobiotika entstandene endogene Metabolite handeln. Eine Hauptkomponentenanalyse der Expressionsprofile zeigte, dass auf der Basis der auf dem Detox-Array vertretenen, aus dem Entgiftungs- und Sekundärmetabolismus ausgewählten Genfamilien eine eindeutige Unterscheidung der Antwort auf die verschiedenen Herbizide abgeleitet werden kann. Weitere Daten aus Kollaborationen mit anderen Projekten wurden in einer zweiten Hauptkomponentenanalyse mit einbezogen und zeigen, dass die Unterschiede vor allem auf die sekundären Auswirkungen der Herbizide zurückzuführen sind. Die dabei gefundene Koregulation der Primisulfuron-Behandlung mit der Reaktion auf das Signalmolekül Salicylsäure und ein bakterielles Pathogen ließ weiter schließen, dass Primisulfuron einen Elicitor-ähnlichen Effekt auf die Pflanze hat. Zur weiterführenden Funktionsanalyse von ABC-Transportern wurden parallel zu diesen Arbeiten knock-out Mutanten gesucht. In einer Kollektion des MPI für Züchtungsforschung in Köln konnten zwei Mutanten identifiziert werden, die jeweils ein En-Transposon innerhalb der offenen Leserahmen von AtPDR4 bzw. AtMDR4 besitzen.