Podcasts about zellproliferation

Die Nachfrage nach Fleischprodukten steigt sowohl in Ländern der Europäischen Union als auch global weiterhin an - und dies trotz Lebensmittelskandalen, schlechten Haltungsbedingungen der Tiere und desaströsen Arbeitsbedingungen für die Angestellten der fleischverarbeitenden Industrie. An sogenanntes In-vitro-Fleisch sind viele Hoffnungen geknüpft: die Herstellung von In-vitro-Fleisch kommt ohne Massentierhaltung aus, benötige weniger Fläche und sei insgesamt umweltfreundlicher. Aber wie wird In-vitro-Fleisch eigentlich hergestellt? In Teil 2 erläutere ich die für die In-vitro-Fleischproduktion verwendeten Zelltypen. Welche Arten von Zellen kommen in Frage? Wie wird die Zellproliferation und -differenzierung gesteuert? Und wird für die Herstellung von In-vitro-Fleisch eigentlich Gentechnik angewendet?

Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von 8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern, dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht, ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert, jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371 Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens, zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren Behandlungen sind.

In westlichen Industrieländern stellt Schlaganfall eine der häufigsten Todesursachen dar und ist hauptursächlich für körperliche Behinderung. In einem hohen Maße kann Schlaganfall auf genetische Faktoren zurückgeführt werden, weshalb kürzlich eine genomweite Assoziationsstudie (GWAS) in der METASTROKE-Kohorte für ischämischen Schlaganfall durchgeführt wurde. Hierbei konnte die Chromosomenregion 7p21.1 als bisher stärkster Risikolokus für atherosklerotischen Schlaganfall identifiziert werden. Diese Region umfasst das Ende des HDAC9-Gens und den benachbarten intergenischen Bereich stromaufwärts der Gene TWIST1 und FERD3L. Der Haupt-SNP rs2107595 kolokalisiert mit einem DNase I-hypersensitiven Bereich sowie Histonmodifikations-Hotspots und könnte somit genregulatorische Konsequenzen besitzen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführte Genexpressionsstudien in humanen Blutzellen ergaben eine Dosis-abhängige Korrelation der HDAC9 mRNA-Spiegel mit dem rs2107595-Risikoallel. HDAC9 gehört zur Familie der Histondeacetylasen, die v.a. bei der Transkription eine wichtige Rolle spielen. Das rs2107595-Risikoallel verändert ein bioinformatisch vorhergesagtes Bindemotiv für E2F-Transkriptionsfaktoren, das beim häufigen Allel intakt ist. Untersuchungen der transkriptionellen Kapazität dieser Bindungsstelle zeigten eine erhöhte Aktivität des häufigen Allels im Vergleich zum Risikoallel. Zur Identifizierung dafür verantwortlicher DNA-interagierender Proteine wurde in Kollaboration mit dem Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried eine proteomweite Analyse von SNPs (PWAS) durchgeführt. Hierbei wurden die Proteine E2F3, E2F4, TFDP1 und Rb1 mit präferentieller Bindung an das häufige rs2107595-Allel identifiziert. E2F/TFDP/Rb-Komplexe sind ein zentraler Bestandteil des G1/S-Übergangs im Zellzyklus und regulieren somit die Zellproliferation. In gain- und loss-of-function-Experimenten von E2F3, E2F4 und der Rb-Proteinfamilie in humanen Zelllinien mit verschiedenen Genotypen für rs2107595 konnte eine unterschiedliche Regulation der HDAC9-Expression beobachtet werden. Nach Zellzyklus-Synchronisation konnten erhöhte HDAC9-Spiegel im Zeitraum der aktiven Phase von E2F3 gezeigt werden, was den Befund einer Regulation durch den E2F3/TFDP1/Rb1-Komplex stützt. Ein erhöhtes Risiko für Schlaganfall könnte also durch eine Risikoallel-vermittelte Störung dieses genregulatorischen Mechanismus entstehen.

Tissue Engineering (TE) ist ein neuer therapeutischer Ansatz, um dem Mangel an Spenderorganen oder -geweben gerecht zu werden. Er zielt darauf ab, Ersatzorgane herzustellen, um die Organfunktion des Empfängers zu verbessern oder zu ersetzen. Die drei Grundprinzipien des TE beinhalten die Nutzung von: 1) isolierten Zellen oder Zellersatz, 2) Signalmolekülen wie Wachstumsfaktoren, die die Zellproliferation fördern und 3) Matrices, das heißt natürlichen oder synthetischen Trägermaterialien. Durch die Nutzung von Biomaterialien als Trägermaterial können autologe zellbasierte Transplantate stabilisiert werden und damit ein strapazierfähiges künstliches Organ in vitro hergestellt werden. Mit dieser Untersuchung sollte die Tauglichkeit eines zellbesiedelten kollagenbasierten Gerüsts (collagen cell carrier - CCC) geprüft werden, Harnröhrenläsionen insbesondere Harnröhrenstrikturen als innovatives Therapiekonzept zu beheben. Dazu wurde die Viabilität und Proliferation humaner und porciner Urothelzellen ebenso wie deren Adhärenz auf dem neuen Zellträger untersucht. In vivo wurde die Biokompatibilität durch ektopische Transplantation im Nacktrattenmodell getestet und abschließend wurden zellbesiedelte Kollagenmatrices nach Induktion einer Harnröhrenstriktur in die Harnröhre von Minipigs eingesetzt. Sowohl die in vitro als auch die in vivo Daten belegten die exzellente Tauglichkeit von CCC als Trägermatrix zur Konstruktion artifizieller autologer Urotheltransplantate. Wurde eine große Anzahl an Zellen verwendet, so waren die metabolische Aktivität und Proliferation als auch die Adhärenz auf CCC vergleichbar mit der bei Aussaat auf Plastik. Das Nacktrattenmodell und das Minipigmodell wiesen die Biokompatibilität, die Integration und die Degradation der Zell-Matrix-Konstrukte in vivo nach. Damit sind die Ergebnisse dieser Studie von größter Bedeutung für die zukünftigen Therapiemöglichkeiten von Harnröhrenstrikturen und legen den Grundstein für die potentielle klinische Anwendung.

Zielsetzung und Fragestellung: Das Vorliegen knöcherner Defekte ist ein wesentliches klinisches Problem in zahlreichen chirurgischen Disziplinen. Das tissue engineering von Knochen stellt eine innovative Methode dar, welche die Möglichkeit eröffnet, ein Knochenersatzmaterial in theoretisch unbegrenzter Menge und vorbestimmbarer Form bei minimaler oder fehlender Hebedefektmorbidität zu gewinnen. Trotz dieses immensen Potenzials konnte sich das tissue engineering in klinisch relevanten Ausmaßen noch nicht durchsetzen. Ein wesentliches Problem wird in der bei zunehmender Größe der Leitschienen inhomogenen Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen vermutet. Bisher konnte dies jedoch quantitativ für das tissue engineering von Knochen nicht belegt werden. Folglich fehlen auch Strategien zur Überwindung dieses Problems nahezu gänzlich. Das Ziel der vorliegenden Untersuchung bestand daher darin, die Sauerstoffkonzentration im Zentrum besiedelter Leitschienen zunächst unter statischen Bedingungen zu messen und zu überprüfen, ob es zu Auswirkung auf das Überleben der Zellen kommt. Anschließend sollten die Bedingungen mit Hilfe eines dynamischen Zellkultursystems optimiert und wiederum der Einfluss auf die zentrale Sauerstoffkonzentration und das Zellüberleben ermittelt werden. Material und Methoden: Zylindrische Leitschienen aus demineralisierter boviner Matrix (DBM) mit einem Durchmesser von 9 mm und einer Höhe von 5 mm wurden unter Verwendung einer standardisierten Methodik mit 50.000 murinen präosteoblastären Zellen (MC3T3) besiedelt und anschließend unter statischen und dynamischen Bedingungen kultiviert. Unter statischen Bedingungen erfolgte der Mediumwechel (Mem alpha) alle 48 Stunden, während unter dynamischen Bedingungen eine kontinuierliche Mediumzufuhr mit Hilfe einer Pumpe erfolgte. Als Standardperfusionsgeschwindigkeit wurde 18 µl/min verwendet. Weitere Versuche erfolgten mit drei- (54 µl/min) und fünffacher (90 µl/min) Perfusionsgeschwindigkeit. Im Untersuchungszeitraum von sieben Tagen wurde die Sauerstoffkonzentration mit einer nadelartigen Sauerstoffsonde, die definiert ins geometrische Zentrum der Leitschiene appliziert wurde gemessen. Zusätzliche Messungen erfolgten unter statischen Bedingungen im umgebenden Medium, unter dynamischen Bedingungen im Mediumzu- und abfluss. Die Auswertung des Zellüberlebens und der Zellproliferation erfolgte mit Hilfe eines live-dead-assays sowie durch Zellzählung im Zentrum der Leitschiene. Ergebnisse: Unter statischen Zellkulturbedingungen kommt es im Zentrum der mit 50.000 Zellen besiedelten Leitschienen zu einem dramatischen Abfall der Sauerstoffkonzentration, wobei nach nur 5 Tagen die Sauerstoffkonzentration bei 0 % liegt. Konsekutiv kann im live-dead-assay ein ausgeprägtes Zellsterben, insbesondere im Zentrum der Leitschienen nachgewiesen werden. Hier konnten nach sieben Tagen keine überlebenden Zellen mehr beobachtet werden. Aus den Sauerstoffmessungen im umgebenden Medium sowie den Ergebnissen des live-dead-assay kann auf das Vorliegen eines deutlichen Sauerstoffgradienten von der Oberfläche zum Zentrum der besiedelten Leitschienen geschlossen werden. Diese Ergebnisse ließen sich bei Besiedlung mit 50.000 humanen SCP-Zellen bestätigen. Unter Verwendung dynamischer Zellkulturbedingungen konnte der Abfall der zentralen Sauerstoffkonzentration deutlich vermindert und die Fläche unter der Sauerstoffkurve (AUC) signifikant (p < 0,01) vergrößert werden. Darüber hinaus konnte eine deutliche Verbesserung des Zellüberlebens beobachtet werden, insbesondere fielen signifikant (p < 0,01) mehr überlebende Zellen im Zentrum der Leitschiene auf. Dennoch kommt es im Beobachtungszeitraum zu einem deutlichen Abfall der Sauerstoffkonzentration im Zentrum der Leitschiene. Durch eine Steigerung der Perfusionsgeschwindigkeit auf das Drei- (54 µl/min) beziehungsweise Fünffache (90 µl/min) konnte nochmals eine deutliche Verbesserung der Sauerstoffversorgung und des Zellüberlebens, insbesondere in den kritischen zentralen Arealen der Leitschiene, erreicht werden. Schlussfolgerungen: Zentrale Hypoxie stellt einen wesentlichen limitierenden Faktor für das Leitschienen-basierte tissue engineering von Knochen in klinisch relevanten Dimensionen dar. Daher sollte im Rahmen der Kultivierung von dreidimensionalen Konstrukten ein adäquates Monitoring der Sauerstoffversorgung gewährleistet sein. In der Optimierung der Sauerstoffversorgung innerhalb von dreidimensionalen Konstrukten liegt ein entscheidender Schlüssel für die Verbesserung der klinischen Einsetzbarkeit des tissue engineering von Knochen.

Der Typ-2-Diabetes mellitus ist durch eine chronische Hyperglykämie charakterisiert, welche auf eine Kombination aus peripherer Insulinresistenz und Dysfunktion der insulinproduzierenden β-Zellen des endokrinen Pankreas zurückzuführen ist. Um eine bessere Prävention und Therapie dieser häufig vorkommenden Stoffwechselerkrankung zu ermöglichen, war es das Ziel der vorliegenden Dissertation, neue Aspekte der β-Zelldysfunktion in der Pathogenese des Typ-2-Diabetes mellitus aufzuklären. Im ersten Teil dieser Arbeit sollten auf zellulärer Ebene am Typ-2-Diabetesmodell der db/db-Maus neue Erkenntnisse über die sequenzielle Abfolge von Ereignissen gewonnen werden, welche sich im endokrinen Pankreas bei der Entwicklung eines Typ-2-Diabetes abspielen. Durch den direkten Vergleich diabetesresistenter db/db-Mäuse mit C57BL/6J-Hintergrund (db/db B6) und diabetessuszeptibler db/db-Mäuse mit C57BLKS/J-Hintergrund (db/db BKS) wurde erstmalig gezeigt, dass beide Mausstämme eine ähnlich ausgeprägte Insulinresistenz aufweisen und zunächst in der Lage sind, den dadurch erhöhten Insulinbedarf effektiv zu kompensieren. Der sich ab einem Alter von 9 Wochen bei db/db BKS-Mäusen manifestierende Typ-2-Diabetes ist auf einer altersbedingten, inadäquaten Expansion der β-Zellmasse begründet, welche aus einer abnehmenden β-Zellhyperproliferation und einer signifikant gestei-gerten Apoptose der β-Zellen resultiert. Da kompensatorische Defizite der β-Zellmasse möglicherweise auch die humane Typ-2-Diabetesentstehung entscheidend beeinflussen, ist bei prädisponierten Personen eine frühzeitige therapeutische Unterstützung der β-Zellmasse als erfolgversprechende Maßnahme zur Prävention eines Typ-2-Diabetes mellitus vorstellbar. Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit sollten neue Gene identifiziert werden, die eine regulatorische Funktion in den β-Zellen einnehmen und deshalb mögliche Angriffspunkte für neue Therapieformen der β-Zelldysfunktion beim Typ-2-Diabetes darstellen. In Voruntersuchungen wurden die Proteine OPG (Osteoprotegerin) und SOCS2 („suppressor of cytokine signaling 2“) zur genaueren Analyse ausgewählt. Die Hypothese einer positiven Regulatorfunktion von OPG in den pankreatischen β-Zellen konnte zunächst durch die Feststellung einer zeitlichen Korrelation zwischen der β-zellspezifischen OPG-Expression und den kompensatorischen β-Zellveränderungen während der murinen Schwangerschaft bekräftigt werden. In vitro-Versuche an den Insulinomzelllinien Ins-1E und MIN6 sowie an isolierten C57BL/6-Pankreasinseln ergaben, dass das Sekretionsprotein OPG keinen signifikanten Einfluss auf die glukosestimulierte Insulinsekretion und Proliferation von β-Zellen ausübt. OPG wird jedoch durch Zytokine in Ins-1E-Zellen induziert und schützt diese Zellen partiell vor einer IL-1β-induzierten Apoptose. Somit kann eine Rolle von OPG als autokriner Überlebensfaktor pankreatischer β-Zellen postuliert werden. Dieser protektive Effekt geschieht vermutlich unabhängig von den klassischen OPG-Liganden RANKL und TRAIL über eine Inhibierung der IL-1β-induzierten MAP-Kinasen JNK1/2, p38 und ERK1/2. Die physiologische Funktion von SOCS2 wurde sowohl in vivo an SOCS2-Knockout-Mäusen als auch in vitro an Ins-1E-Zellen und isolierten Pankreasinseln untersucht. Dabei konnte kein signifikanter Einfluss von SOCS2 auf die GH-induzierte β-Zellproliferation und die zytokininduzierte Apoptose der β-Zellen demonstriert werden. Unter Anwendung glukosestimulierter Insulinsekretionsversuche und Glukosetoleranztests wurde des Weiteren nachgewiesen, dass SOCS2 weder in vitro noch in vivo die Funktion von β-Zellen signifikant beeinflusst. Auch ein Effekt von SOCS2 auf die Insulinsensitivität konnte an SOCS2-Knockout-Mäusen ausgeschlossen werden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass SOCS2 - im Gegensatz zu SOCS1 und SOCS3 - keine nicht-kompensierbaren Effekte auf die Physiologie pankreatischer β-Zellen und auf den Glukosemetabolismus ausübt. Erklärt werden kann dies wahrscheinlich durch die hohe Redundanz innerhalb der SOCS-Proteinfamilie. Zusammenfassend tragen die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der pankreatischen β-Zellphysiologie und der Pathogenese des Typ-2-Diabetes mellitus bei und ermöglichen es dadurch, die diesbezügliche Entwicklung präventiver und therapeutischer Maßnahmen voranzutreiben.

Formine spielen eine wichtige Bedeutung bei der Regulierung polarisierter Aktin-gesteuerter Prozesse. Dies betrifft beispielsweise die Zellmigration, den Vesikeltransport, die Morphogenese und die Zytokinese (Faix und Grosse 2006). In früheren Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass das Protein Formin-like 1 (FMNL1) in Zellen von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), anderen Leukämien und Lymphomen und in Zelllinien, die von soliden Tumoren stammen, überexprimiert wird. Im gesunden Gewebe wird es fast ausschließlich in hämatopoetischen Zellen exprimiert. Diese selektive Expression macht FMNL1 zu einem attraktiven Ziel für neuartige Immuntherapien bei malignen und entzündlichen Erkrankungen (Krackhardt, Witzens et al. 2002; Schuster, Busch et al. 2007). In Vorarbeiten der Gruppe wurde ein allorestringierter T-Zellklon mit einem definierten T-Zellrezeptor identifiziert, der ein Peptid von FMNL1 erkennt und eine starke Antitumor-Aktivität gegen Lymphom- und Nierenzellkarzinom-Zelllinien, Epstein-Barr-Virus (EBV)-transformierte B-Zellen und von CLL-Zellen zeigt (Schuster, Busch et al. 2007). Allerdings sind die Funktion und Regulation von FMNL1 – beide wichtig für die Validierung dieses Proteins als Antigen – noch nicht gut untersucht. Frühere Arbeiten haben eine Beteiligung von FMNL1 bei der Neuausrichtung des MTOC (Mikrotubulin-organisierendes Zentrum) in Richtung der immunologischen Synapse und zusätzlich bei der Zytotoxizität von T-Zellen beschrieben (Gomez, Kumar et al gezeigt. 2007). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das murine FRL, das zu 85% homolog zum menschlichen FMNL1 ist, an der Zelladhäsion und Motilität von Makrophagen sowie an der Fc-Rezeptor-vermittelten Phagozytose beteiligt ist (Yayoshi-Yamamoto, et al Taniuchi hat. 2000; Seth, Otomo et al. 2006). Das Ziel dieses Projekts war es, die Funktion von FMNL1 für die weitere Validierung dieses Proteins als mögliche Zielscheibe für neue Anti-Tumor-Therapien zu untersuchen. Wir haben eine neue Spleißvariante (FMNL1) identifiziert, die am C-terminalen Ende ein residuelles Intron aufweist, welches einen Einfluss auf die Diaphanous-autoinhibierende-Domäne (DAD) hat. Im Gegensatz zu anderen FMNL1-Spleißvarianten, die eine zytoplasmatischen Lokalisierung aufweisen, zeigt diese Speißvariante eine kortikale und membranständige Lokalisation in verschiedenen Zelllinien. Eine FMNL1 Mutante, bei der die DAD-Domäne fehlt (FMNL1ΔDAD), weist eine ähnliche Lokalisierung auf. Das weist darauf hin, dass es bei FMNL1 zu einer Deregulierung der Autoinhibition kommt, die zu einer konstitutiv aktiven Form von FMNL1 führt, die möglicherweise bei der zellulären Transformation eine Rolle spielen könnte. FMNL1 und FMNL1ΔDAD können eine polarisierte, nicht mit einer Apoptose-assoziierten Blasenbildung an der Membran hervorrufen, die von Myosin, Aktin undTubulin abhängig ist, aber unabhängig von Src und ROCK zu sein scheint. Wir haben außerdem nachgewiesen, dass FMNL1 als myristoyliertes Protein vorliegt und konnten zeigen, dass die N-terminale Myristoylierung wichtig für die Regulierung der Funktion von FMNL1 ist, indem sie eine schnelle und reversible Membran-Lokalisierung ermöglicht. Des Weiteren haben wir gezeigt, dass FMNL1, das auch am kontraktilen Ring und Kortex von FMNL1-transfizierten mitotischen Zellen lokalsiert ist, die Zellproliferation moderat verstärkt. Eine gemeinsame Lokalisierung von menschlichem endogenem FMNL1 und -Tubulin am Kortex und den mitotischenden Spindeln von sich teilenden T-Zellen weist ebenfalls auf eine Rolle von FMNL1 in der Mitose und dem Zellwachstum hin. Überexpression von FMNL1 konnte eine höhere Konzentration von intrazellulärem freiem Calcium nach Zell-Stimulation induzieren, was auf eine Beteiligung von FMNL1 am Calcium-Signalweg deutet. Unsere Ergebnisse eröffnen neue Einblicke in die Regulation und Funktion von FMNL1 und zeigen dessen Beteiligung an unterschiedlichen Polarisierungsprozessen. Die Identifizierung von Interaktionspartnern von FMNL1 in verschiedenen hämatopoetischen Zellen sowie die weitere funktionelle Charakterisierung der Spleißvarianten wird von besonderer Bedeutung sein, und möglicherweise zur Entwicklung einer spezifischen therapeutischen Beinflussung maligner und entzündlicher Erkrankungen beitragen.

Haematopoiese, die Bildung der Blutzellen aus haematopoietischen Stammzellen, ist ein Prozess, der im Knochenmark von Vertebraten stattfindet. Zur Steuerung von Erhalt, Differenzierung und Selbst-Erneuerung haematopoietischer Stammzellen ist das Einwirken diverser Faktoren aus verschiedenen zellulären Milieus von essentieller Bedeutung. Die Proteinfamilie der EBF (early B-cell factor) Transkriptionsfaktoren besteht aus 4 Mitgliedern, welche sowohl untereinander als auch evolutionär stark konserviert sind. Eine essentielle Rolle von EBF1 in der Haematopoiese, genauer in der Entstehung früher B-Zellen konnte bereits nachgewiesen werden. Die Expression von EBF2, einem weiteren Mitglied dieser Familie, konnte in haematopoietischen Organen wie dem Knochenmark, genauer in Osteoblasten, gezeigt werden. Ebf2-exprimierende osteoblastäre Zellen sind dem Endosteum angelagert und stellen eine molekulare Nische dar, die zum Erhalt haematopoietischer Zellen beiträgt. Wie gezeigt werden konnte ist die Anzahl von Osteoblasten proportional zur Anzahl haematopoietischer Stammzellen. Die gezielte Zerstörung von Ebf2 in mutanten Mauslinien führt dazu, dass es zu einer verminderten Anzahl haematopoietischer Stammzellen im Knochenmark kommt. Dieser Phänotyp beruht auf einer direkten Störung der stammzellunterstützenden Funktion von unreifen Osteoblasten in EBF2-defizienten Mäusen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Analyse EBF2-defizienter Zellen einen Beitrag zur besseren Charakterisierung der Stammzellnische leisten kann. Durch den Vergleich der Expressionsmuster von Ebf2+/- und Ebf2-/- osteoblastären Zellen der Maus konnte Ang1, ein Mitglied der RNAse5-Familie in EBF2-defizienten Zellen als vermindert exprimiert gefunden werden. Dieses sezernierte Protein spielt eine Hauptrolle bei der Bildung von Blutgefäßen. Auch ist bekannt, dass Ang1 an Zellen bindet, in diese eingebracht wird und dort durch die Stimulation der rRNA-Transkription die Ribosomenbiogenese und somit die Zellproliferation beeinflussen kann. Das verringerte Ang1-Level in der haematopoietischen Stammzellnische könnte so einen Einfluss auf die Proliferation der Stammzellen haben. Analysen dieser Arbeit identifizieren Ang1 als direktes Zielgen von EBF2. In vitro konnte durch eine gleichzeitige Verminderung der Expression von Ebf1, 2 und 3 in osteoblastären Zellen mittels RNAi eine weitere Verringerung der stammzellunterstützenden Funktion der Osteoblasten gezeigt werden. Um diesen Effekt in vivo untersuchen zu können, wurde ein Mausmodell zur gleichzeitigen Expressionsverminderung von Ebf1, 2 und 3 generiert.

Während der Zellproliferation müssen Zellwachstum und Zellteilung koordiniert werden. Die Kopplung erfolgt in der Hefe durch einen Komplex aus Nop7p, Erb1p und Ytm1p, der sowohl an der Ribosomenbiogenese als auch an der Kontrolle der DNA-Replikation beteiligt ist. Die homologen Proteine Pes1, Bop1 und WDR12 werden in Säugern von Zielgenen des Transkriptionsfaktors c-Myc, einem zellulären Onkoprotein, kodiert. In dieser Arbeit wurde die Existenz eines evolutionär konservierten Komplexes aus Pes1, Bop1 und WDR12 (PeBoW-Komplex) in Säugern belegt. Dabei wurde gezeigt, dass Bop1 als zentrales Protein des Komplexes agiert und die Interaktion von Pes1 und WDR12 vermittelt. Die Integrität des Komplexes ist wesentlich für seine Funktion. Die Depletion einzelner Komponenten sowie die Überexpression des integrierenden Proteins Bop1 hemmen die Reifung der Vorläufer-rRNA der großen ribosomalen Untereinheit sowie die Proliferation der Zellen. Bop1-Überexpression führt zur Ausbildung von zwei Subkomplexen aus Bop1 und Pes1 bzw. Bop1 und WDR12. Während der Bop1/Pes1-Subkomplex als Teil der pre-Ribosomen im Nukleolus lokalisiert, wird WDR12 durch Bop1-Überexpression im Zytoplasma gehalten und fehlt im Nukleolus zur Ausbildung eines funktionellen PeBoW-Komplexes. Pes1 und WDR12 können unabhängig in den Nukleolus translozieren, während Bop1 dafür die Interaktion mit Pes1 benötigt. Untersuchungen zur Stabilität der einzelnen PeBoW-Komponenten zeigten, dass monomeres Bop1 extrem instabil ist, durch Inkorporation in den PeBoW-Komplex aber vor Abbau geschützt wird. Möglicherweise werden hierdurch interne PEST-Sequenzen in Bop1 maskiert. Die Menge an Bop1 ist somit abhängig von der Anwesenheit von Pes1 und WDR12. Die gegenseitige Abhängigkeit der Stabilität aller drei PeBoW-Komponenten konnte in weitergehenden Experimenten gezeigt werden. Schließlich wurde untersucht, ob der PeBoW-Komplex die Ribosomenbiogenese mit der DNA-Replikation über Interaktion mit dem ORC-Komplex, wie in der Hefe beschrieben, koordiniert. Mit Hilfe der BiFC-Methode konnte eine Interaktion von Pes1 mit Orc6, eines Faktors des ORC-Komplexes, gezeigt werden. Die koordinierende Funktion des PeBoW-Komplexes für Zellwachstum und Zellproliferation scheint von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert zu sein.

Die Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathion-Peroxidase (PHGPx), ein Mitglied der Selen-abhängigen Glutathion-Peroxidase Familie, ist an der Detoxifikation von Sauerstoffradikalen beteiligt und übernimmt somit eine wesentliche Funktion beim Schutz des Organismus vor oxidativem Stress. Die PHGPx liegt in drei unterschiedlichen Formen, der zytosolischen, der mitochondrialen und der spermienkern-spezifischen Form vor. Durch gezielte Inaktivierung des PHGPx-Gens mittels eines konditionalen Knock-out-Mausmodells sollte deren Funktion in vivo analysiert werden. Die ubiquitäre Inaktivierung führte kurz nach der Gastrulation zu früher embryonaler Letalität (E7,5) in PHGPx-Knock-out-Embryonen. Die Knock-out-Embryonen waren in der Lage, alle drei Keimblätter, Ektoderm, Mesoderm und Endoderm, auszubilden. Ebenso war die für Mausembryonen typische Dreiteilung der Fruchtanlage durch Embryonal-, Exozölom- und Ektoplazentarhöhle erkennbar. Zu Beginn der Neurulation traten hingegen morphologische Abnormalitäten in Knockout-Embryonen auf. Diese waren charakterisiert durch hyperplastische Missbildungen vor allem in den anterioren Strukturen des embryonalen Ekto- und Mesoderms sowie im extraembryonalen Bereich. Weiterführende Studien zeigten, dass die Expression einiger für die Neurulation essenzieller Gene bei den PHGPx-Knock-out-Embryonen im Vergleich zu Wildtyp-Embryonen deutlich von anterior nach posterior verschoben waren. Dies deutet darauf hin, dass die PHGPx neben ihrer Rolle als zelluläres Antioxidans möglicherweise noch weitere Funktionen in der Regulation der Zellproliferation und Zelldifferenzierung innehat. Dies wird zurzeit anhand von primären Zellkultursystemen analysiert. Die frühe Letalität der PHGPx-Knock-out-Embryonen zeigte, dass die PHGPx eine essenzielle Funktion bereits zu Beginn der Embryonalentwicklung übernimmt. Aufgrund dieses Befunds sollte die Erstellung eines embryonalen Expressionsprofils Aufschluss darüber geben, in welchen Geweben die PHGPx exprimiert wird und bei welchen Organen bzw. Organsystemen sie in der weiteren Embryonalentwicklung beteiligt ist. Die embryonale Expressionsstudie zeigte, dass die PHGPx bis etwa Tag 12 der Embryonalentwicklung ubiquitär exprimiert war. Danach war eine starke Expression in der Leber, im Herzen und in den neuronalen Geweben zu erkennen, sowie in allen Epithelien wie beispielsweise der Lunge und des Magen-Darm-Traktes, später auch in der Haut. Bemerkenswert war ein starker Rückgang der Expression in der Leber, dem Hauptorgan der embryonalen Hämatopoese, kurz vor dem Zeitpunkt der Geburt. Dies implementiert, dass die PHGPx eine bedeutende Rolle in der Hämatopoese spielt. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die zytosolische Form der PHGPx ubiquitär exprimiert war, wohingegen die mitochondriale und die spermienkern-spezifische Formen nur im Hodengewebe detektiert werden konnten. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass ausschließlich die zytosolische Form der PHGPx essenziell für die frühe Embryonalentwicklung ist.

Untersuchungen strahleninduzierter Änderungen der Proliferation und des Zelltodes stellen Schwerpunkte der radiobiologischen Forschung dar. Aus strahlentherapeutischer Sicht interessieren hier im Besonderen die in Tumoren nach Strahlenexposition zu findenden Genexpressionsänderungen, die assoziiert mit strahleninduzierten Änderungen der Proliferation und des Zelltods auftreten. Detaillierte Kenntnisse der diesen biologischen Prozessen zugrundeliegenden Änderungen auf Genexpressionsebene könnten dazu beitragen, die Effizienz der Strahlentherapie humaner und tierischer Tumoren zu verbessern. So ist eine große Anzahl an für Proliferation und Apoptose kodierenden Genen bekannt. Es sind bisher jedoch nicht alle an der Proliferationskontrolle beteiligten Gene gefunden worden. Ebenso wird postuliert, dass auch andere Formen des Zelltodes als Apoptose auf Genexpressionsebene reguliert werden. Deshalb wurde mithilfe eines Mikroarrays mit 11.835 Genen ein Screening nach differentiell exprimierten Genen an strahlenexponierten A549 Zellen (humanen Lungenkarzinomzellen) vorgenommen. Hierzu wurden die Zellen synchronisiert, in der S-Phase mit 5 Gy bestrahlt und an den Zeitpunkten, die der Ausbildung des G2-Blocks und dem Anstieg mikrokernhaltiger und abnormaler Zellen zeitlich vorausgingen, das Screening durchgeführt. Die geeigneten Zeitpunkte wurden zuvor anhand durchflusszytometrischer Zellzyklusuntersuchungen und der Messung des Zelltodes (MAA-Assay) bestimmt. Die hybridisierten Mikroarrays wurden nach dem Digitalisieren unter Zuhilfenahme einer geeigneten Software interaktiv ausgewertet. Es konnten maximal 987 exprimierte Gene gefunden werden, was 12 % aller Gene des Mikroarrays entsprach. Setzte man die Genexpression der mit 5 Gy bestrahlten Zellen ins Verhältnis zu der Kontrolle, konnten 101 Gene als differentiell exprimiert ermittelt werden. Die Anzahl der herunterregulierten differentiell exprimierten Gene übertraf die Anzahl der hochregulierten differentiell exprimierten Gene zu jedem gemessenen Zeitpunkt immer ca. um den Faktor 4. Des Weiteren wurden die differentiellen Genexpressionen relativ zur Kontrolle der unterschiedlichen Zeitpunkte miteinander verglichen, wobei eine auffällige homogene Herunterregulation der Gene festzustellen war. Nach Einteilung der differentiell exprimierten Gene in funktionelle Gruppen konnten viele Gene, die für den Aufbau des Zytoskeletts kodierten, ermittelt werden. Hierbei standen im Vordergrund vor allem Gene für Tubulinproteine und Aktin. Des Weiteren konnten 8 Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, identifiziert werden. Der Anteil bekannter, die Proliferation ("cyclin-dependent kinase inhibitor 1A" (p21, Cip1), "prothymosin, alpha") bzw. die Apoptose ("Caplain" und "TNF receptor-associated factor 1", "Caspase recruitment domain protein 14") regulierender Gene war gering. In Übereinstimmung mit zuvor durchgeführten Untersuchungen in anderen in vitro Modellen konnte eine aktive Herunterregulation bestimmter biologischer Funktionen (z.B. Zytoskelett, Proteinbiosynthese) bei gleichzeitiger Inhibition anderer Funktionen (Proliferation)gezeigt werden ("active silencing"). Da die Aussagen des Mikroarrays nur semiquantitativ sind, müssen die Ergebnisse noch durch ein quantitatives Verfahren (RTQ-PCR) validiert und ergänzt werden. Die vorläufigen Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise darauf, dass neben den bekannten Zellproliferation und Zelltod kodierenden Genen in einem erheblichen Maß auch andere funktionelle Gengruppen wie z.B. Zytoskelett- und ribosomale Proteine kodierende Gene beteiligt sind und die Zelle im Sinne eines "active silencings" durch Abschalten verschiedener Zellfunktionen ihren eigenen Untergang vorbereitet.

Maligne Erkrankungen sind die zweithäufigste Todesursache in den industrialisierten Nationen. Trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten haben sich die Prognosen nur bei einigen Tumorentitäten signifikant verbessert. Die Hauptprobleme sind nach wie vor das Fehlen valider Marker für die Frühdiagnose und hohe Rezidivraten, die aufgrund mangelnder Detektion von disseminierten Tumorzellen entstehen. Tumorantigene erlangen eine immer wichtigere Bedeutung, da sie zur Visualisierung von okkulten Tumorzellen und als Zielstrukturen der spezifischen adoptiven Immuntherapie dienen können. Tumorantigene (TAs) bzw. eine gesteigerte humorale Antwort gegen TAs, besitzen außerdem ein großes Potenzial als zirkulierender Biomarker in der Frühdiagnose. In dieser Arbeit wurde am Beispiel von Karzinomen der oberen Atemwege eine neue Technik zur Identifizierung von TAs entwickelt (AMIDA, Autoantibody Mediated Identification of Antigens), welche einige Limitationen der bereits etablierten SEREX- und PROTEOMEX-Technik umgeht. AMIDA ermöglicht es, im Gegensatz zu SEREX, TAs zu identifizieren, die durch posttranslationale Modifikationen oder aberrante Lokalisationen immunogen wurden. Diese TAs sind häufig tumorspezifisch und eignen sich hervorragend als Biomarker oder als Zielstrukturen für Therapien. Der Vorteil von AMIDA gegenüber PROTEOMEX ist die Immunpräzipitation von Antigenen aus primären Tumorbiopsien mit autologen Serumantikörpern, vor der Auftrennung in einer 2D-Gelelektrophorese und der anschließenden Identifizierung der TAs im Massenspektrometer. Dadurch können TAs aus dem kompletten Proteom identifiziert werden und nicht nur aus der Proteinauswahl, die in einer klassischen 2D-Gelelektrophorese auftrennbar ist. AMIDA führte zur Identifizierung von 27 unterschiedlichen, potenziellen Tumorantigenen, wobei sechzehn TAs bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen und weitere vier nicht mit HRK assoziiert wurden. Hierbei stellte sich Zytokeratin 8 (CK8) als interessanter Marker für okkulte Tumorzellen heraus, da es bereits in hyperplastischem Rachenepithel vermehrt gebildet und in Neoplasien bzw. Metastasen ausschließlich von Tumorzellen stark überexprimiert wird. CK8 ist zudem ein interessantes Zielmolekül für Immuntherapien mit monoklonalen Antikörpern, da es auf Karzinomzellen ektopisch an der Zelloberfläche lokalisiert. Darüber hinaus zeigten Patienten mit HR-Karzinomen im Vergleich zu gesunden Probanden bereits in sehr frühen Tumorstadien eine deutlich gesteigerte humorale Antwort gegen CK8, was Serumantikörper gegen CK8 zu einem potenziellen zirkulierenden Biomarker in der Frühdiagnose macht. Zwei weitere AMIDA-TAs, AAA-TOB3 bzw. das hypothetische Protein KIAA1273, werden ebenfalls in HRK überexprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei AAA-TOB3 und KIAA1273 um zwei Isoformen handelt, die von einem Genlokus kodiert, jedoch von zwei unterschiedlichen Promotoren reguliert werden. Beide Isoformen sind Transmembranproteine, die in Mitochondrien lokalisieren und deren Expression direkt von c-Myc reguliert wird. Eine frühere Studie von Da Cruz (2003) zeigte, dass das murine Homolog von AAA-TOB3 pro-apoptotische Eigenschaften hat, wenn es in humanen Zellen überexprimiert wird. Dies konnte in dieser Arbeit für die humanen Isoformen nicht belegt werden. Im Gegenteil, die Repression der beiden Proteine führte zu einer vermehrten Apoptose. Dies lässt eher auf eine für das Zellwachstum bzw. die Zellproliferation notwendige Funktion dieser beiden Proteine schließen und könnte die Überexpression in Tumoren erklären.

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist weltweit der zweithäufigste bösartige Tumor. Fernmetastasen eines CRC treten zumeist in Leber und Lunge auf, sind nur in seltenen Fällen operativ entfernbar und sprechen nicht auf derzeit verfügbare Chemotherapien an. Die Identifizierung von Genen und die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, durch welche sie zur Tumorprogression eines CRC beitragen, liefert eine Grundlage für die Prävention oder Behandlung der zumeist tödlich verlaufenden Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des metastatischen Phänotyps in Kolonkarzinomzellen verantwortlich sind. Hierzu wurden mittels der Genchip-Technologie die Transkriptionsprofile von insgesamt fünf Tumor-Zelllinien erstellt und nach stringenten Auswahlkriterien miteinander verglichen. Zuerst wurde ein CRC-Zellmodell verwendet, das aus einer in der Nacktmaus nicht-metastasierenden humanen Primärtumor-Zelllinie KM12C und zwei davon abgeleiteten, stark zur Leber metastasierenden Zelllinien, KM12SM und KM12L4A bestand. In diesem überwiegend isogenen Zellmodell wurden 145 Gene in beiden metastasierenden Zelllinien als dereguliert im Vergleich zu der nicht-metastasierenden Zelllinie identifiziert. Die Transkriptionsprofile eines weiteren humanen CRC-Zellmodells, bestehend aus einer nicht-metastasierenden Zelllinie HCT116 und einer stark zur Lunge metastasierenden Zelllinie HCT116U5.5 wurden ebenfalls verglichen und 72 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Ein Vergleich der Datensätze aller Transkriptionsprofile ermöglichte die Identifizierung von Vimentin und Trop-2 (TACSTD2, „Tumorassoziierter Vermittler von Kalziumsignalen“) als in allen metastasierenden Zelllinien überexprimiert. Die hohe Homologie des bisher noch weitestgehend unerforschten Trop-2 zu Trop-1 (Ep-CAM), einem regulatorischen Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das überwiegend von aggressiven Tumorarten exprimiert wird und die Proliferation von Tumorzellen stimulieren kann, machten Trop-2 für weiterführende Expressions- und Funktionsstudien zu einem interessanten Zielgen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Expressionsstudien in einer Vielzahl von Tumorbiopsien zeigten deutlich erhöhte mRNA- und Proteinspiegel von Trop-2 in Metastasen aus CRC im Vergleich zu den Primärtumorgeweben. Zusätzlich zu diesem neuen Befund in CRC wurde in dieser Arbeit erstmalig eine erhöhte Expression von Trop-2 in Schild-drüsenkarzinomen und in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben nachgewiesen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Trop-2 für die Metastasierung von Karzinomzellen des Kolons wurden stabile Transfektanten für Trop-2 in der nicht-metastasierenden Zelllinie KM12C generiert. Die konstitutiv Trop-2 exprimierenden Zellklone zeigten erhöhte Cyclin D1-Proteinspiegel bei unveränderter Zellproliferation gegenüber den Vektorkontrollen. Die Induktion von Cyclin D1 könnte mit der Identifizierung eines ebenfalls erhöhten Proteinspiegels von ß-Catenin in den Trop-2 exprimierenden Transfektanten in Zusammenhang stehen. Somit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Einfluss von Trop-2 auf den Tcf/ß-Catenin Signalweg. Zusätzlich demonstrierte ein Migrationstest erhöhte mobile Eigenschaften von Trop-2 exprimierenden Zellen in vitro, während sich die invasive Fähigkeit der Transfektanten, in vitro durch eine Matrigelschicht zu wandern, nicht von den Vektorkontrollen unterschied. Die induzierte Expression von Trop-2 in der Mehrzahl von Metastasen des kolorektalen Karzinoms sowie in Tumoren von Lunge und Schilddrüse war eine neue Beobachtung. Diese Ergebnisse demonstrieren das Potential von Hochdurchsatzmethoden wie die hier verwendete Genchip-Technologie in Kombination mit geeigneten Zellmodellen. In der vorliegenden Arbeit führte sie zur Identifizierung von Trop-2 als einen Marker der Tumorprogression und Metastasierung von verschiedenen humanen Karzinomen.

Die Organisation der DNA in Nukleosomen hat einen großen Einfluss auf die Regulation von grundliegenden Prozessen wie Transkription, Replikation oder Reparatur der DNA im Zellkern. Um die hinderliche Natur des Chromatins bei diesen fundamentalen Prozessen zu überwinden, existieren mehrere verschiedene Chromatin modifizierende Proteinkomplexe im Zellkern. Chromatin Remodelling Komplexe nützen die Energie der ATP-Hydrolyse um die Position der Nukleosomen so zu verändern, dass verschiedene Abschnitte der DNA für die Interaktion mit regulierenden Faktoren zugänglich werden. Ein Klasse solcher Remodelling Faktoren beinhalten die ATPase ISWI als katalytische Untereinheit. Das Protein wurde zuerst in Drosophila entdeckt und die drei verschiedenen ISWI enthaltenden Komplexe, nämlich NURF, ACF und CHRAC, wurden ausführlich in diesem Modellorganismus untersucht. Homolog zur Fruchtfliege existieren sehr ähnliche Protein Komplexe beim Menschen. Wir haben das humane ISWI mit den Isoformen Snf2h und Snf2L im Prostatakarzinom untersucht. In einem Tissue Microarray wurden Gewebeproben mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern gegen ISWI gefärbt. Es folgte ein quantitativer Vergleich der Färbungsintensitäten im Karzinomgewebe sowie in gutartigem Gewebe der Prostata durch Anwendung von digitaler Bildanalyse. Das Ergebnis war eine signifikant stärkere Färbung im neoplastischen Gewebe. Eine Anreicherung von ISWI in Krebszellen ist besonders interessant im Kontext der bekannten Funktionen des Proteins für DNA-Replikation, Zellproliferation und Regulation der Chromatinstruktur. In einem zweiten Projekt sind wir zum Modell der Fruchtfliege zurückgekehrt und entwickelten monoklonale Antikörper gegen Toutatis, das zu einer Proteinfamilie gehört, die auch einige bekannte Interaktionspartner von ISWI umfasst. Die Proteine dieser Familie haben vermutlich eine regulatorische Funktion in den Remodelling Komplexen, denn am Beispiel von Acf1 wurde gezeigt, dass sie die nukleosomale Bindung sowie die Effizienz und Richtung der Mobilisierung von Nukleosomen modifizieren. Unsere Antikörper wurden etabliert, um Toutatis enthaltende Komplexe durch Western Blot Analyse von gereinigten Drosophila-Extrakten und Immunfluoreszenz zu charakterisieren. Mit diesen Methoden fanden wir eine Koelution von Toutatis mit der ATPase Brahma und dem Strukturprotein Spectrin alpha sowie eine Lokalisation in der Lamina des Zellkerns. Ein mögliches Zusammenspiel dieser Proteine in einem neuen Chromatin Remodelling Komplex mit einer Beteiligung an der DNA-Reparatur wird diskutiert.

Perkutane Interventionsverfahren stellen ein etabliertes und wichtiges Behandlungskonzept der Arteriosklerose dar. Ihr Ergebnis wird getrübt durch hohe Restenoseraten nach z.B. Ballon-Angioplastie. Wesentlich für die Ausbildung und den Grad einer postinterventionellen Restenose ist die Reendothelialisierung der zerstörten Intima, weshalb es von besonderem Interesse ist, intrazelluläre Signalübertragungswege, welche nach Zerstörung eines Endothelzellmonolayers in den überlebenden Zellen ablaufen, zu untersuchen, um potentielle Angriffspunkte z.B. für eine pharmakologische Modulation der Endothelzellantwort nach Angioplastie zu finden. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Signalübertragungswege an einem Modell zur Verletzung vaskulärer Endothelzellmonolayer in vitro untersucht. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf Untersuchung des an der Regulation der Zellproliferation beteiligten Transkriptionsfaktors und Proto-Oncogens AP-1 bzw. dessen mRNA-Vorstufe c-fos. An humanen vaskulären Endothelzellen (HUVEC) wurde in Zellkultur mittels Northern-Blot Analysen und Electrophoretic mobility shift assays untersucht, ob c-fos und AP-1 nach Endothelzellverletzung exprimiert bzw. aktiviert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Endothelzellverletzung im vorliegenden Modell eine starke Expression von c-fos sowie die Aktivierung des korrespondierenden Transkriptionsfaktors AP-1 bewirkt. Diese Aktivierung wird gesteuert durch einen Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration sowie unter Beteiligung negativ regulierender G-Protein, der Proteinkinase C sowie von Protein-Tyrosinkinasen. Keine Beteiligung konnte nachgewiesen werden für MAPKinasen, Proteinkinase A sowie die CamKinasen. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern in Zusammenschau mit publizierten Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen wichtige Erkenntnisse für eine weiterführende Untersuchung der Signalübertragungswege in huamnen Endothelzellen nach z.B. perkutaner Angioplastie und führen in Zukunft zu neuen Ansatzpunkten für die Pharmakotherapie vaskulärer Läsionen, z.b. durch drug-eluting Stents.

Fri, 16 Apr 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2083/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2083/1/Toepolt_Kristin.pdf Töpolt, Kristin

Schwefellost ist ein blasenbildendes Alkylanz, welches auch heute noch eine Bedrohung durch seinen potenziellen Einsatz als chemischen Kampfstoff bei terroristischen Attacken oder durch den akzidentiellen Kontakt mit den sog. Rüstungsaltslasten darstellt. Die klinischen Effekte auf der Haut nach Kontakt mit Schwefellost treten nach einer Latenzzeit von mehreren Stunden auf. Sie reichen von Rötung über Blasenbildung bis hin zu nekrotischer Geschwürbildung und zeichnen sich durch eine verzögerte Wundheilung aus. Eine Kausaltherapie ist bisher noch nicht etabliert. Obwohl die Rolle von inflammatorischen Zytokinen, die nach Kontakt mit toxischen Chemikalien ausgeschüttet werden, bereits untersucht wurde, existieren hinsichtlich Schwefellost nur spärliche Daten. Von besonderem Interesse ist die symptomfreie Latenzzeit nach Schwefellost-Kontamination, in der der inflammatorische Prozess, unter anderem durch die Ausschüttung von Zytokinen, in Gang gesetzt wird. Durch die nähere Untersuchung des Pathomechanismus könnten sich neue Behandlungskonzepte von Schwefellost-Verletzungen ergeben. Vier verschiedene epitheliale Zelllinien (A 549, SCL II, HaCaT und NHEK) wurden eingesetzt, um den Effekt von Schwefellost auf Proliferationsverhalten, Vitalität und Zytokin-Sekretion näher zu untersuchen. In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass eine Schwefellost-Exposition bei allen vier untersuchten Zelllinien die Proliferation schon in Konzentrationsbereichen hemmte, bei denen noch keinerlei Einfluss auf die Vitalität (gemessen als metabolische Aktivität) der Einzelzelle erkennbar war. Der zytotoxische Effekt von Schwefellost nahm mit steigender Dosis zu, wobei sich die zytotoxische Wirkung mit zunehmendem Zeitintervall zwischen Exposition und Vitalitätsmessung verstärkte. Es wurde die Zytokin-Ausschüttung in den ersten acht Stunden nach Schwefellost-Exposition untersucht, wobei die Schwefellost-Konzentration so gewählt wurde, dass sie in vivo zu Blasenbildung führte. Die Zytokinmessungen im Zellkulturüberstand zeigten deutlich, dass durch eine Schwefellost-Exposition mit 500 µM für 30 Minuten die Zytokin-Ausschüttung im Vergleich zu den Kontrollkulturen gesteigert wurde, und sie mit zunehmendem Zeitintervall nach der Exposition größer wurde. Während bei den A 549-Zellen nur eine vermehrte Ausschüttung von IL-6 und IL-8 festgestellt werden konnte, zeigte sich bei den SCL II-Zellen nach Schwefellost-Exposition eine gesteigerte Sekretion von IL-6, IL-8 und TNF-a. Bei den HaCaT-Zellen und den Keratinozyten kam es bei allen vier untersuchten Zytokinen (IL-1a, IL-6, IL-8 und TNF-a) zu einer Konzentrationserhöhung im Kulturüberstand. Für HaCaT-Zellen konnte gezeigt werden, dass mit zunehmender Schwefellost-Konzentration die Interleukin-6 Konzentration im Zellkulturüberstand anstieg. Die Daten zeigen, dass nach Exposition mit Schwefellost die Zellproliferation, der Zelltod und die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren von der Konzentration und der Zeit nach der Exposition abhängig sind.

Die Ionenkanäle des renalen Tubulus- und Sammelrohrsystems bestimmen die Funktion der adulten Säugetierniere. Sie müssen mit der Entwicklung der permanenten Niere (Metanephrogenese) erworben werden und können auch entwicklungsspezifische Aufgaben haben. Ziel dieser Arbeit ist die erstmalige systematische Beschreibung der Expression und entwicklungsspezifischen Rolle von Ionenkanälen während der Metanephrogenese. Methoden: Die ontogenetische mRNA-Expression der Kir Kalium-Kanal-Untereinheiten Kir6.1, SUR2 und ROMK1-3 (Kir1.1a-c) wurde mittels RT-PCR von Primärkulturen im Sammelrohrepithel quantifiziert, die ontogenetische Kir6.1- und ROMK-Protein-Expression mittels Immunhistochemie in Sammelrohr- und Nephron-Epithelien untersucht. Der Effekt von cAMP auf die ROMK-mRNA-Expression wurde gemessen und der Einfluss von Kalium-Kanalmodulatoren auf das Wachstum von Nephron-Kulturen in vitro und von HEK293 Nierenepithel-Zellen bestimmt. Ferner wurde die ontogenetische mRNA-Expression des ENaC-Natrium-Kanals und der Chlorid-Kanäle CFTR, CLC-2 und ICLn mittels RT-PCR im Sammelrohrepithel quantifiziert. Alle Experimente wurden an Ratten oder Mäusen durchgeführt. Ergebnisse: (i) Die mRNA der KDNP-(KATP)-Kanaluntereinheiten Kir6.1/SUR2 war in frühen Ureterknospen-Generationen (embryonaler Tag E14) hoch exprimiert und nach der Geburt herunterreguliert. In gleicher Weise war Kir6.1-Protein im embryonalen Sammelrohrepithel und Nephron ubiquitär apolar exprimiert. Im Gegensatz hierzu war Kir6.1 im adulten Nephron ausschließlich im Proximalen Tubulus nachweisbar (apikal > basolateral). Die spezifische Aktivierung von KNDP-(KATP)-Kir6.1/SUR2-Kanälen in Nephronkulturen und HEK293-Zellen steigerte die Zellproliferation, was auf eine wachstumsregulierende Rolle der frühen Kir6.1/SUR2-Expression hinweist. Somit könnten zelluläre Entwicklungsprogramme der Niere die Wachstumsrate über die Expression von Kalium-Kanälen regulieren. (ii) Die mRNA des apikalen sekretorischen Sammelrohr-Kalium-Kanals ROMK2(Kir1.1b) war von Beginn der Entwicklung an in Ureterknospen/Sammelrohrepithelien exprimiert und stieg während der Reifung des Kortikalen Sammelrohrs um den Faktor 4 an (postnatale Tage P7-28). Diese Zunahme spiegelt den Erwerb der adulten Natrium-retinierenden Funktion des Sammelrohrepithels wider. Die Protein-Expression von ROMK war in embryonalen Nierenepithelien ubiquitär und apolar nachweisbar, jedoch postnatal auf die apikale Plasmamembran des aufsteigenden Teils der Henle'schen Schleife und des Sammelrohrs beschränkt. Die ROMK-mRNA-Expression in embryonalen Sammelrohrepithelien war durch cAMP stimulierbar. (iii) Während der frühen Genese des Sammelrohrsystems wurden die mRNAs der Chlorid-Kanäle CFTR, CLC-2 und ICLn exprimiert, die sehr wahrscheinlich an der aus Ureterknospen bekannten hohen fraktionellen Chlorid-Leitfähigkeit beteiligt sind. Während der postnatalen Sammelrohrepithel-Reifung wurde die mRNA des apikalen Natrium-Kanals ENaC transkriptionell hochreguliert. So kann rechtzeitig die NaCl-resorbierende Funktion der Niere des Neugeborenen sicher gestellt werden (zusammen mit der Heraufregulation von ROMK).

Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand in der Etablierung einer dissoziierten Kultur mesencephaler Vorläuferzellen der Ratte und deren nicht-virale Modifikation mittels kationischer Lipide. In Vorversuchen wurden Faktoren zur Optimierung nicht-viraler Transfektionsverfahren ermittelt. Zur Untersuchung des Einflusses der Zellproliferation auf die Transfektionseffizienz, wurden LAN-5 Neuroblastomzellen in zwei Ansätzen mit unterschiedlichem mitotischen Index mittels Effectene (Qiagen, Hilden) transfiziert. Es konnte gezeigt werden, dass proliferierende LAN-5 Zellen fast 15-fach höhere Transfektionsraten bei der Transfektion mit Effectene erzielen. In dem selben Versuchsansatz wurde die Transfektionsrate des klonierten RSV-GFP, basierend auf dem pRep7-Konstrukt, mit der des bereits bekannten CMV-GFP Plasmids verglichen. Im Gegensatz zu den Erwartungen wurden mit dem pRep7-Konstrukt deutlich niedrigere Effizienzen beobachtet. Das VM-Gewebe wurde in dissoziierten in vitro Kulturen gemäß den Protokollen von Studer und Kollegen (1998) kultiviert. Durch Gabe von bFGF wurden die neuronalen Vorläuferzellen zunächst expandiert, und erst durch Entzug von bFGF und Zugabe von fetalem Kälber Serum setzte die Differenzierung ein. Dies konnte mit immunhistochemischen Markern nachgewiesen werden. Da die Protokolle zur Transfektion von organotypischen VM-Kulturen mit Effectene zu toxisch für dissoziierte Vorläuferzellen waren, musste die eingesetzte Menge an Effectene (Qiagen, Hilden) um das 10-fache reduziert werden. Im Vergleich zu Effectene, erzielten die getesteten Versuchslipide (Qiagen, Hilden) bis zu 31-mal höhere Transfektionseffizienzen. Die immunhistochemische Charakterisierung der transfizierten Zellen belegte die Transfektion TH-positiver Neurone. Durch die vorgelegte Arbeit konnten Methoden zur genetischen Modifikation primären mesencephalen Gewebes etabliert werden, die auf chemisch genau definierten Lipid-Komponenten beruhen und die nicht mit den Risiken viraler Vektorsysteme behaftet sind. Durch den effizienten Einsatz Lipid-vermittelten Gentransfers entstehen damit neue Perspektiven für einen möglichen Einsatz nicht-viraler Transfektionsverfahren in ex vivo Gentherapie-Ansätzen.

Bisher wird in der Literatur keine standardisierte tierexperimentelle Methode beschrieben, mit der in der Frühphase der Knochenheilung ausreichend interfragmentäres Gewebevolumen für die histologische, biochemische oder immunocytochemische Analyse gewonnen werden kann. Es wird ein entsprechend variiertes Distanzosteosynthesemodell vorgestellt, das aus dem Frakturbereich der Kaninchentibia ausreichend Gewebe für differenzierte Analysen liefert. Mit guter Vaskularität, hoher Knochenappositionsrate sowie schneller Zellproliferation und –differenzierung scheint der Kaninchenknochen für relativ begrenzte Untersuchungszeiträume und für Fragestellungen zur Frühphase der Knochenheilung besonders geeignet. Untersuchungen an diesem Modell zum qualitativen und quantitativen Nachweis unterschiedlicher Zellen im interfragmentären Raum zu verschiedenen Zeitpunkten der Frakturheilung werden beschrieben, besondes berücksichtigt dabei neuropeptidpositive Nervenfasern, vor allem das Calcitonin gene-related peptide (CGRP). Daten und Fakten zu Vorkommen, Verteilung, Struktur, Sequenz und Biochemie des Peptids, wie sie die aktuelle internationale Literatur dokumentiert, ergänzen den experimentellen Teil der Arbeit. An der Tibia von insgesamt 30 Tieren wurde – in einem standardisierten operativen Verfahren – ein definierter interfragmentärer Raum geschaffen. Nach Ablauf des vorgesehenen Beobachtungszeitraumes erfolgte die Tötung der Tiere vor Entnahme des jeweiligen Präparates. Nach Freilegen der Osteosynthese wurde im interfragmentären Raum ein definiertes 3mm dickes zylinderförmiges Segment entnommen und fixiert; außerdem wurden jeweils osteotomienah und –fern zwei weitere Gewebeproben aus dem Markraum der Tibia isoliert. Die anschließenden Untersuchungen im gewonnenen Material umfaßten mikroskopische Analysen der Morphologie von Hämatom, Fibringerüst, Granulationsgewebe während unterschiedlicher Phasen der Frakturheilung, die immunocytochemische Darstellung neuropeptidpositiver Fasern und mikroskopische qualitative und quantitative Analysen neuropeptidpositiver Fasern zu den gewählten Zeitpunkten. Bei den nach 5 Tagen getöteten Tieren fanden sich in den untersuchten Präparaten vor allem ein konsolidiertes Frakturhämatom. Ein feines Fibrinnetz war in den Randgebieten des interfragmentären Raumes zu sehen. Gefäßlakunen, Kapillaren und Mineralisationsinseln waren nicht erkennbar. In der zweiten Tiergruppe konnte gezeigt werden, daß nach 10 Tagen der Abbau schollig zerfallener Erythrozyten durch Phagozyten weiter vorangeschritten war; Der Zellgehalt verringerte sich insgesamt zugunsten einer beginnenden Faserbildung. Das Fibrinnetz hatte weiter zugenommen und zeigte vereinzelt Septen; Am 15. Tag postop. war das Fibrinnetz nicht mehr erkennbar, stattdessen neu entstandenes Bindegewebe, Gefäßstrukturen und vereinzelte Mineralisations-inseln. Perivaskulär, an den Gefäßsinusoiden und begleitend zu Precursorzell-ansammlungen ließen sich frühestens am 10. und spätestens am 15. Tag nach der Osteotomie mit Hilfe immunocytochemischer Verfahren neuropeptidpositive Fasern nachweisen. In diesen Untersuchungen konnte CGRP im Gegensatz zu bisher durchgeführten Versuchen unterschiedlicher Autoren erstmals schon in der Frühphase der Frakturheilung nachweisen werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, da die Innnervation des Knochens ein hochentwickeltes regulatorisches Element repräsentiert, das sowohl lokale Anforderungen registriert wie auch durch Freisetzung aktiver Neuropeptide den gesamten Knochenstoffwechsel unmittelbar beeinflußt. Wie aus früheren Studien hervorgeht, sind Neuropeptide dort zahlreich vorhanden, wo hohe Knochenstoffwechselraten zu verzeichnen sind. Außerdem sind sie häufig in unmittelbarer Nähe von Blutgefäßen konzentriert. Die Beobachtung, daß CGRP während der frühen Frakturheilung hauptsächlich in der Nähe von Blutgefäßen auftritt, legt den Schluß nahe, daß es durch seine bekannten vasodilatierenden Eigenschaften den Blutfluß in die verletzte Region verstärkt und so die Knochenheilung unterstützt. Experimentelle Untersuchungen zeigen, daß neurale Einflüsse auf den Knochen von Neuropeptiden vermittelt werden. Wie alle regulativen Proteine und Faktoren agieren Neuropeptide über Second-messenger-Systeme und können auch in niedrigen Konzentrationen das Remodeling beeinflussen. Durch ihre sensorische Funktion nehmen Nervenfasern mechanische Ansprüche wahr und setzen im weiteren Verlauf Neuropeptide frei. Sie sind in der Lage, die Lücke zwischen systemischen und primär lokalen regulativen Elementen zu füllen. Grundsätzlich ist die Selbstheilung des Knochens durch die Größe des Defekts limitiert. Meist sind chirugische Interventionen nötig und die unterschiedlichsten Hilfsmittel unumgänglich. In jüngster Zeit sind v.a. Knochenersatzmaterialien von zunehmender Bedeutung. Ihre Zukunft scheint in der Entwicklung osteoinduktiver Implantate zu liegen. Auch unter diesem Aspekt gewinnt unser Distanzosteosynthesemodell besondere Bedeutung. Der große interfragmentäre Raum bietet optimale Bedingungen für gezielte Untersuchungen, die zur Weiterentwicklung von Knochen-ersatzmaterialien führen können.

Die extrazelluläre Matrix umgibt Zellen, stabilisiert Gewebe und reguliert Zellfunktionen. Bestandteile der ECM transduzieren Signale durch Zellmembranrezeptoren, sog. Integrine. Integrine vermitteln Änderungen der Zellmorphologie, Proliferation, Differenzierung und Apoptose in Zellen. Die Frage ob die ECM eine wichtige Rolle in der Physiologie und Tumorgenese der Hypophyse spielt, ist immer noch offen. In der vorliegenden Arbeit wurden zum ersten Mal die regulatorischen Möglichkeiten der ECM in der Hypophyse dargestellt. Es wurde der Einfluß der extrazellulären Matrix auf das Wachstum und die Zytokinsekretion von follikulostellaren Zellen, sowie Hormonsekretion, Proliferation und Signaltransduktion in kortikotropen Zellen untersucht. Desweiteren werden in dieser Arbeit Änderungen der Expression von Laminin, als auch deren mögliche funktionale Konsequenzen innerhalb der Prolaktinomgenese demonstriert. In der follikulostellaren Zellinie TtT-GF konnte gezeigt werden, daß Fibronektin und Kollagen I die Zellproliferation stimulieren. Simultan führte nur Kollagen I zu einer Erhöhung der Interleukin-6 Sekretion, welches ein bekannter Wachstumsfaktor für follikulostellare Zellen ist. Die signifikante Hemmung der Proliferation von FS-Zellen bei Kombination von Kollagen I mit einem anti-IL6-Antikörper läßt darauf schließen, daß Kollagen I die Proliferation und Zytokinsekretion von follikulostellaren Zellen reguliert. Die Fibronektin vermittelte Proliferationsteigerung scheint dagegen einem anderen Mechanismus zugrunde zu liegen. In der kortikotropen Tumorzellinie AtT-20 konnte nachgewiesen werden, daß die ACTH Sekretion durch Fibronektin, Laminin und Kollagen I inhibiert wird. Ein Reporterkonstrukt bestehend aus dem POMC Promoter und Luciferasegen zeigte ähnliche Ergebnisse, was auf eine Hemmung der ACTH Sekretion bereits auf Ebene der POMC-Transkription schließen läßt. Im Gegensatz dazu konnte keine signifikante Veränderung der ACTH Sekretion in normalen Hypophysenzellen festgestellt werden. AtT-20 Zellproliferation wurde durch Kollagen IV und Fibronektin stimuliert, wogegen Kollagen I und Laminin zu einer Inhibition führten. Parallel dazu fand eine Veränderung der Zellform statt. Ein möglicher integrinvermittelter Signalweg umfasst die Aktivierung von Rac, einer kleinen GTPase, mit der konsekutiven Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) und einer runden Zellform. Es konnte gezeigt werden, daß eine Inhibition der AtT-20 Proliferation durch Laminin mit einer signifikanten Erhöhung der reaktiven Sauerstoffradikalen und einer runden Zellform einhergeht. Dieser Effekt war mit NAcetylcystein (NAC), einem ROS-Antagonisten, umkehrbar und am ehesten Rac vermittelt. Unter Kollagen IV fand ebenfalls eine Inhibition des Zellwachstums statt. AtT-20 Zellen nahmen auch hier eine runde Zellform an und produzierten, wenn auch weniger stark als Laminin und Kollagen I, ROS. Dieser Effekt war jedoch nicht durch NAC umkehrbar. Kollagen I führte dagegen zu einer Steigerung der Proliferation und ROS-Produktion, sowie zu ausgebreiteten als auch runden Zellen. Diese z.T. gegensätzlichen durch Kollagen I+IV vermittelten Effekte könnten durch simultane Aktivierung alternativer Mechanismen, wie z.B. eine integrinbedingte Aktivierung als auch Hemmung von Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, verursacht sein. Ein weiterer, oft mit Fibronektin assoziierter Signalweg, beinhaltet die integrinvermittelte Aktivierung von Rho, einer weiteren kleinen GTPase. Die fehlende ROS Erhöhung, der Einsatz eines β1-integrin stimulierenden Antikörpers, sowie die integrinunabhängige Stimulation von Rho durch Lysophosphatidatsäure läßt auf eine Rho assoziierte Proliferationserhöhung in AtT-20 Zellen durch Fibronektin schließen. In GH3 Zellen führte Laminin zu einer Abnahme der Prolaktinsekretion und zur Inhibition der Proliferation. Im Gegensatz dazu konnten keine Veränderungen der Prolaktinsekretion in normalen Rattenhypophysenzellen beobachtet werden. Übereinstimmend zeigte sich im Dopamin2 Rezeptor defizienten Mausprolaktinom, einem Knock-Out in vivo Modell für spontane Prolaktinomentwicklung, und humanen Prolaktinom eine bereits sehr frühe Abnahme der Lamininexpression. Diese Hemmung der Lamininexpression während der Prolaktinomgenese könnte einen weiteren Faktor für erhöhte Hormonproduktion und Zellproliferation in Prolaktinomen darstellen. Die hier erstmalig beschriebenen Auswirkungen der extrazellulären Matrix auf Hypophysenzellproliferation und -hormonsekretion verdeutlichen die wichtige, aber wenig erforschte Rolle der ECM in der Hypophyse. Diese Resultate sind nicht nur neue Ansatzpunkte der Hypophysenphysiologie und -pathophysiologie, sondern lassen auch die Weitläufigkeit der unterschiedlichen regulativen Systeme innerhalb der Hypophyse erkennen.

Die Aktivierung von T-Lymphozyten ist ein essentieller Prozeß für die Regulation der adaptiven Immunantwort. Hierbei werden in Folge einer Antigen-Exposition über verschiedene Oberflächenrezeptoren intrazelluläre Signaltransduktionsprozesse initiiert, welche in einer klonalen Expansion von T-Lymphozyten sowie deren Differenzierung zu Effektor- oder Gedächtniszellen resultieren. Die Spezifität dieser Prozesse wird durch die Wechselwirkung zwischen dem jeweiligen T-Zell-Antigenrezeptor (TCR) und einem Antigen-beladenen MHC-Molekül vermittelt, einer Interaktion, die allerdings nicht hinreichend für eine vollständige und dauerhafte Aktivierung der T-Zelle ist. Hierzu ist die Aktivierung sogenannter akzessorischer Oberflächenrezeptoren nötig, welche sowohl zur Verstärkung der Zell-Zell-Adhäsion als auch zur Induktion intrazellulärer Signalwege beitragen. Ein costimulatorisches Signal für naive T-Lymphozyten vermittelt zum Beispiel das CD28-Molekül, wodurch der Übergang dieser Zellen in einen anergischen Zustand verhindert und Zellproliferation ermöglicht wird. Zur Verstärkung der Zell-Zell-Interaktion tragen demgegenüber vor allem Adhäsionsmoleküle wie Selektine, Cadherine und Integrine bei. Der einzige Vertreter der β2-Integrinfamilie auf Lymphozyten, LFA-1, stand im Zentrum der im Folgenden beschriebenen Analysen. Es gab bereits Anhaltspunkte dafür, daß LFA-1 neben seiner Adhäsionsfunktion auch in Signaltransduktionsprozesse involviert ist. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der LFA-1-vermittelten Signalwege bislang unvollständig charakterisiert. Dies liegt vor allem darin begründet, daß eine hochaffine Ligandenbindung erst nach einer Konformationsänderung des Integrins erfolgen kann. Eine solche Aktivierung des Integrins wird beispielsweise durch Stimulation der T-Lymphozyten über den T-Zell-Antigenrezeptor induziert, wodurch sich jedoch LFA-1-abhängige Signale mit denen des TCRs überlagern. Daher wurde im Verlauf der hier vorliegenden Arbeit ein auf Fusionsproteinen basierendes experimentelles System etabliert, welches eine aktivierungsunabhängige Untersuchung der LFA-1-vermittelten Signaltransduktion ermöglicht. Hierdurch wurde gezeigt, daß in humanen T-Lymphozyten die Aggregation der zytoplasmatischen Domäne der Integrin β2-Kette (CD18-Untereinheit) zur Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, zur IL-2-Promotoraktivierung sowie zum Anstiegs des Phosphotyrosingehalts zellulärer Proteine führte. Die Modulation dieser charakteristischen T-Zell- Aktivierungsparameter wird durch die zytoplasmatische Domäne der β2-Untereinheit von LFA-1 induziert, nicht aber durch die intrazellulären Anteile der Integrin αL- bzw. β1-Kette. Weiterhin konnte demonstriert werden, daß ein für die β2-Untereinheit spezifisches NPXFSequenzmotiv für deren Signalfunktion erforderlich ist. Dieselbe Region ist ebenso für die Signaltransduktion des nativen LFA-1-Gesamtmoleküls von elementarer Bedeutung. Überdies zeigten Untersuchungen in TCR-defizienten T-Zellen, daß die Oberflächenexpression des T-Zell-Rezeptors für den LFA-1-induzierten Signalweg essentiell ist. Demgegenüber erfolgte die intrazelluläre Calciummobilisierung durch das CD28-Molekül auch unabhängig von einer Expression des TCRs. Insgesamt konnte durch die vorliegenden Analysen die wesentliche Bedeutung des zytoplasmatischen Anteils der β2-Untereinheit des LFA-1-Integrins für den Prozeß der T-Zell-Aktivierung dokumentiert werden. Darüberhinaus wurde eine bisher unbekannte funktionelle Kooperativität zwischen LFA-1 und Komponenten des T-Zell-Antigenrezeptors aufgezeigt.