Podcasts about aktivator

Die vergangen Tage hab ich mich viel mit den Ängsten und Befürchtungen von meinen Mitmenschen auseinander setzen dürfen. Es hat mich überrascht wie unterschiedlich wir Menschen in unseren Überzeugungen sind. Ich selbst hatte ja auch einige Wochen der Talfahrt hinter mir, an denen ich alles angezweifelt habe und danach bin ich erstmal eingetaucht in ein Alltagsleben ohne bewusste spirituelle Ausrichtung. Ich bin einfach nicht richtig dran gekommen. das war eine sehr spannende Erfahrung, ein bisschen verloren, auf jeden Fall erdend, aber auch Schwung holend um in die nächst höhere Ebene zu kommen. Und die Botschaft die ich von dort aus mit dir teilen möchte, erfährst du über diesen Podcast. es kann sein dass sie dich triggert, ich empfehle dir, bleib bis zum Schluss dran. Denn du weißt ja ein Trigger ist vom Ursprung her ein Aktivator, ein Auslöser, ein Anreger…

Hier ist die neuste Episode aus meiner Reihe «Female Intuition Talk» vor. In dieser Reihe stelle ich starke Frauen vor, die ihren ganz persönlichen Weg gehen. Frauen, die sich selbst und ihre Bestimmung leben. Meine heutige Gesprächspartnerin ist Jacqueline LeSaunier. Sie ist Trainerin für Intuition und Erweiterte Wahrnehmung, Aktivator des Höheren Bewusstseins und Autorin des … "Female Intuition Talk – Jacqueline LeSaunier" weiterlesen Der Beitrag Female Intuition Talk – Jacqueline LeSaunier erschien zuerst auf Hear your Soul.

Dankbarkeit ist ein Aktivator ist eine Brücke ist beim Schlüssel ist ein Tor dass uns zu Schönheit Frieden Gelassenheit und innerer Schönheit und Wertschätzung führt Dankbarkeit gepaart mit den Geschwistern Selbstliebe glauben Träume Visionen und vielen anderen großen und kleinen Geschwistern ist unendlich mächtig und reich und wertvoll und beschützen und gibt und teilt und macht unser Leben zufrieden tief und wertvoller und ist total an mit anderen wunderbaren dankbaren Wesen wie wunderbar bis gleich dein Leo :)

Mein größter Switch im Leben war tatsächlich, als ich den Aktivator für Fülle gefunden habe.   Und diesen aktiviere ich TÄGLICH!! Mehrmals! Immer wieder und zwar so, dass ich ON bin.   Denn wenn das  Mindset erstmal auf „Abwegen“ unterwegs ist, so richtig im Mangel, das habe ich genau diesen Aktivator nicht gesehen. Ihn nicht sehen wollen, so ist es noch konkreter ausgedrückt.    Podcast erzähle verrate ich Dir meinen persönlichen Aktivator für Fülle in meinem Leben und wie ich genau diesen aktiviere.   Es ist schon erstaunlich, was genau dieser Aktivator für eine Kraft hat.   So und so!    Gibt es grad einen Bereich in Deinem Leben, den Du optimieren willst?  Fehlt es Dir grad an etwas? Dann aktiviere Deinen Aktivator!!   Wie DU den Aktivator zur Fülle im Leben aktivierst?“   Hör in diesen Aktivator Podcast :)    Hab einen glücklichen Tag,       Von HERZen, Deine Bettina

In dieser Folge geht es um die ganzheitliche kieferorthopädische Behandlung. Du kennst mich als holistische Zahnärztin - was Du jedoch nicht weißt ist, dass ich einige Jahre als Kieferorthopädin gearbeitet habe. Der Kieferorthopäde ist ein Zahnarzt, der eine Weiterbildung zum Fachzahnarzt in der Kieferorthopädie gemacht hat. Dies Weiterbildung dauert 3 Jahre. Der Kieferorthopäde behandelt keine Löcher in den Zähnen sondern versorgt Dich mit einer Zahnspange. Heute spreche ich darüber, was der Unterschied zwischen einer klassischen und einer ganzheitlichen Kieferorthopädie ist. Bei einer ganzheitlichen kieferorthopädischen Behandlung steht nicht ein einzelner schiefer Zahn im Vordergrund, vielmehr wird das gesamte System betrachtet. Es werden gezielte Reize an die Zungen- und Wangenmuskulatur eingesetzt, die die Kieferentwicklung und das Kieferwachstum fördern. Am Ende findet jeder Zahn seinen Platz im Kiefer. Es werden (in der Regel) keine Zähne entfernt, um Platz zu schaffen. Der Kiefer wird in seiner Entwicklung unterstützt. In der Regel werden herausnehmbare Apparaturen eingesetzt. Die ganzheitliche Kieferorthopädie ist eine partnerschaftliche Behandlung. Die Partner sind der Patient, die Eltern, der Kieferorthopäde und weitere Therapeuten wie Osteopathen, Physiotherapeuten, Logopäden und andere. Weiterhin erfährst Du, wann der beste Zeitpunkt für eine kieferorthopädische Behandlung ist. Dieser ist nämlich: So früh wie möglich. Damit ist jedoch nicht gemeint, dass so früh wie möglich verschiedene Geräte getragen werden sollen um am Ende der Kieferentwicklung möglichst viele Geräte verbraucht zu haben. Ganz im Gegenteil. Natürlich erfährst Du auch Interessantes über die heute so modernen Alignerschienen, die gerne in der Erwachsenenbehandlung eingesetzt werden und festsitzende Zahnspangen. Hier findest Du mich: Praxis Dr. Jasper: https://drjasper.deMuskanadent: https://muskanadent.comYouTube: http://bit.ly/drjasper-youtube Podcast iTunes: https://bit.ly/drjasperFacebook Dr. Jasper: https://www.facebook.com/ZahnarztpraxisJasper/ Facebook Muskanadent: https://www.facebook.com/muskanadent/ Instagram Dr. Jasper: https://www.instagram.com/zahnarztpraxis_drannettejasper/ Instagram Muskanadent: https://www.instagram.com/drannettejasper_muskanadent/ Gratis Checkliste “So halten Deine Zähne ein Leben lang”: https://verzahnt.online Buche deine persönliche Sprechstunde mit mir: https://drannettejasper.de/online-sprechstunde/ Buch “Verzahnt”: https://www.m-vg.de/riva/shop/article/15075-verzahnt/?pl=3887e229-9ea5-4043 Buch "Yoga sei Dank" von Dr. Annette Jasper: https://www.komplett-media.de/de_yoga-sei-dank-_112788.html

Pogled v novo leto nam je usmerila papeževa okrožnica Vsi bratje. V Sloveniji so jo nekateri poglabljali v bralnem klubu, ki sta ga organizirala Socialna akademija in Aktivator.

Napetosti v naši družbi vzbujajo v nas vedno večje nelagodje in strah pred prihodnostjo. Mnogi izpostavljajo, da dialog ni več mogoče. Pa je res tako? Predstavniki pobude Aktivator so se o tem na Dunaju pogovarjali z vodjo akademijo za evangelizacijo Ottom Neubauerjem, ki ima veliko izkušenj na tem področju. Preko Skypa sta se nam pridružila Jernej Kastelec in Peter Perše. Spregovorila sta tudi o tem, kakšna je na poti dialoga vloga nas kristjanov.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist aus genetischer Sicht eine sehr heterogene Erkrankung. Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) wie FLT3 sind in der Leukämogenese von zentraler Bedeutung. Durch Mutationen aktivierte RTKs sind allerdings alleine nicht in der Lage eine AML zu induzieren. Die Kooperation mit anderen Mutationen ist hierfür notwendig. Zu den am häufigsten gemeinsam auftretenden Mutationen in der AML gehören NPM1- und FLT3-ITD- (internal tandem duplication) Mutationen. Klinische Daten zeigen, dass eine FLT3-ITD die gute Prognose von NPM1-mutierten (NPM1c+) Patienten in Abhängigkeit des FLT3-ITD-mRNA-Levels in negativer Weise beeinflusst. Dies lässt auf ein pathogenes Zusammenwirken beider Genmutationen in der AML schließen, welches im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Dazu wurde basierend auf der humanen AML-Zelllinie OCI-AML3 mittels stabiler, lentiviraler Transduktion das erste zelluläre Modellsystem etabliert, das die relevanten Genotypen (NPM1c+/FLT3-ITD; NPM1c+/FLT3-WT) sowie unterschiedliche Verhältnisse von FLT3-ITD zu FLT3-WT (ITD/WT) im NPM1-mutierten Hintergrund modelliert. Zunächst wurde die NPM1-Mutation sowie die Funktionalität des FLT3-WT- und FLT3-ITD-Rezeptors in den nativen und transgenen Zellen bestätigt. Mit Hilfe des Zellmodells konnte gezeigt werden, dass Zellen, die beide Mutationen tragen, in vitro wie auch in vivo einen Wachstumsvorteil besitzen. Dieser vergrößerte sich zudem mit zunehmendem ITD/WT-Verhältnis. Ab einem bestimmten ITD/WT-Verhältnis konnte dieser Wachstumsvorteil in vitro mit einem FLT3-Inhibitor über eine gewisse Dauer gehemmt werden. Diese Ergebnisse könnten auf ein Zusammenwirken der beiden Mutationen bei der Leukämogenese hinweisen und eine Ursache für die schlechteren Überlebenskurven von Patienten mit beiden Mutationen und zunehmender FLT3-ITD-Last darstellen. Der insgesamt jedoch nur schwach ausgeprägte Phänotyp des etablierten Zellmodells erfordert zum eindeutigen Nachweis der funktionellen Interaktion von NPM1- und FLT3-ITD Mutationen ein alternatives Modellsystem. In diesem Zellmodell zeigten Zellen, die den FLT3-WT-Rezeptor überexprimierten, ebenfalls einen schwachen Wachstumsvorteil gegenüber nativen Zellen mit endogener FLT3-WT-Expression. Neben aktivierenden FLT3-Mutationen wie einer ITD, führen auch hohe FLT3-WT-Expressionslevel zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Kinase und verschlechtern die Prognose der Patienten. Deshalb wurde in dieser Arbeit mit der Untersuchung der transkriptionellen Regulation von FLT3, als mögliche Ursache hoher FLT3-WT-Expressionslevel, begonnen. In silico wurden im proximalen FLT3-Promotor Bindestellen für die hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren (TF) PAX5 und MYB identifiziert. Mit Hilfe des Dual-Luciferase® Reporter Assay Systems wurden PAX5 als schwacher Repressor und MYB als Aktivator des Flt3-Promotors bestätigt. Auch der Transkriptionsfaktor CEBPA verhielt sich auf gleiche Weise als Aktivator der Flt3-Promotoraktivität. Eine Punktmutation im CEBPA-Gen, die aus zwei AML-Fällen bekannt ist, führte zu einer erhöhten Flt3-Promotoraktivität. Die Identifizierung weiterer mutierter, FLT3-regulierender TF und ihre Korrelation mit der FLT3-Expression sollen zukünftig tiefere Einblicke in die transkriptionelle Regulierung von FLT3 als Ursache der FLT3-Überexpression in AML-Patienten gewähren. Für eine Reihe von in AML-Patienten gefundenen Mutationen ist deren Rolle in der Pathogenese der AML noch unbekannt. Dazu gehören Mutationen in den Rezeptortyrosinkinasen DDR1 und DDR2. In der vorliegenden Arbeit wurden DDR1- und DDR2-Mutationen stabil in Ba/F3 Zellen und transient in HEK-293T Zellen exprimiert, um ihr transformierendes Potential zu untersuchen und diese funktionell zu charakterisieren. Transgene, DDR1- und DDR2-exprimierende Ba/F3 Zellen zeigten keinen transformierenden Phänotyp. Weitere Untersuchungen zeigten eine konstitutive Phosphorylierung der extrazellulären DDR2-Mutanten (G222R, M291I) in HEK-293T Zellen und eine Adhäsion von Ba/F3 Zellen mit wildtypischem sowie mutiertem DDR1-Rezeptor in Anwesenheit des DDR-Liganden Kollagen. DDR1- und DDR2-Rezeptoren sind bisher vor allem in soliden Tumoren untersucht. Weitere funktionelle Analysen sind notwendig, um ihren Stellenwert bei der Entstehung von AML zu erfassen. Diese Arbeit zeigt, dass Rezeptortyrosinkinasen in der Leukämogenese auf unterschiedliche Weise eine wesentliche Rolle spielen können. Da Rezeptortyrosinkinasen zudem wichtige Zielmoleküle für therapeutische Ansätze darstellen, sind sie von besonderer Bedeutung.

ATX-II wurde ursprünglich aus dem Gift der Seeanemone Anemonia sulcata isoliert und ist als potenter Aktivator spannungsgesteuerter Natriumionenkanäle (Navs) bekannt, da es einen persistierenden Na+-Strom induziert. Vor Kurzem wurden bestimmte Nav Subtypen mit menschlichem Schmerz in Verbindung gebracht. Somit liegt es nahe, dass detaillierte Kenntnisse über die Regulierung von Navs für die Entwicklung neuer Pharmaka im Bereich der Schmerztherapie von Vorteil sind. Auch der durch einen alternativen Inaktivierungsmechanismus entstehende resurgent current spielt nach Erkenntnissen der jüngsten Zeit eine Rolle im Schmerzgeschehen. Er kann einen Angriffspunkt für neue Analgetika darstellen, so man seine Entstehung und mögliche Modifikationen entschlüsseln kann. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob ATX-II resurgent currents von Navs in großen und kleinen murinen DRGs verändern bzw. induzieren kann. Zudem sollte beleuchtet werden, ob und wenn ja, welche Wirkung das Toxin auf periphere A- und C Schmerzfasern hat. Die Auswirkungen von ATX-II auf Navs wurden in großen und kleinen DRGs der Maus sowie in Zelllinien mit whole-cell voltage-clamp Messungen untersucht. Gesunde humane Probanden bewerteten Empfindungsänderungen (Schmerz und Juckreiz) nach intrakutaner Injektion von ATX-II. Mit Hilfe des "Laser Doppler Imagers" wurde das mögliche Auftreten eines Axon Reflex Erythems untersucht. Die mittels des FACS Zellsortierers nach Zellgröße sortierten DRGs wurden mit RT-qPCR auf ihren Gehalt an Nav1.6, Nav1.7 und 4 mRNA untersucht. ATX-II verstärkte resurgent currents in großen DRGs, zeigte in kleinen jedoch keinen Effekt. Im heterologen Expressionssystem trat ein resurgent current erst auf, wenn 4 Peptid über die Intrazellulärflüssigkeit zur Verfügung stand. Korrelierend zu den Befunden auf Zellebene rief ATX-II bei intrakutaner Injektion im Menschen nur solange stechenden Schmerz und veränderte mechanische Empfindung hervor, wie die A-Fasern für die Schmerzleitung verfügbar waren. Nachdem ein Nervenkompressionsblock angelegt und die Leitung via A-Fasern blockiert war, waren die ATX-II vermittelten Effekte verschwunden. Zudem konnte kein Axon Reflex Erythem gefunden werden, das ein Zeichen für eine C-Schmerzfaser-Aktivierung wäre. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass geringe Konzentrationen von ATX-II eine selektive Wirkung auf große DRGs haben. Erst durch Hinzufügen von 4-Peptid ist es möglich mit dem Toxin resurgent current in kleinen DRGs sowie Zelllinien mit heterolog exprimierten Nav1.6 und Nav1.7 zu induzieren. Dies lässt darauf schließen, dass es kleinen DRGs an 4 in ausreichender Menge mangelt und deshalb kein resurgent current sichtbar ist. Ebenso übt ATX-II einen Effekt auf A Fasern aus, die mit großen DRGs verbunden sind, wohingegen C-Fasern weitgehend unbeeinflusst bleiben. Die intrakutane Injektion von ATX-II führt zu stechendem Schmerz und einer Juckreiz ähnlichen Empfindung, die sich durch A-Faser-Block verhindern lässt. Daraus kann man schließen, dass ATX-II in niedrigen Konzentrationen als spezifischer A-Faser Aktivator fungiert.

Sowohl aktiviertem Protein C (aPC) als auch Antithrombin (AT) werden neben ihrer Bedeutung als physiologische Gerinnungsinhibitoren immunmodulatorische Potenz zugeschrieben. Sie scheinen daher geeignet, die gestörte Immunfunktion wie sie beispielsweise nach Trauma beobachtet wird, günstig zu beeinflussen. Dies könnte der Entstehung von septischen Komplikationen durch eine gestörte Infektabwehr entgegen wirken oder die Organsysteme vor den Folgen überschießender systemischer Entzündungsreaktionen schützen. Während jedoch mittlerweile eine große Anzahl klinischer und experimenteller Arbeiten zur Anwendung dieser Substanzen vorliegt, sind die Wirkungen auf humane Immunzellen nach wie vor nicht abschließend geklärt. Ziel dieser Studie war daher die Charakterisierung möglicher Effekte von aPC und AT auf die zelluläre Immunfunktion unter Berücksichtigung eines sogenannten „Priming“ der Zellen durch vorausgehendes Gewebetrauma (Operation oder schwere Unfallverletzung). Daneben sollte auch die Frage einer möglichen Wechselwirkung von aPC und AT geklärt werden. Außerdem wurde der Einfluss von Heparin auf ein immunmodulatorisches Potential von AT untersucht. Im Rahmen der vorliegenden kontrollierten ex-vivo Studie erfolgte der Einschluss von zwölf viszeralchirurgischen sowie neun polytraumatisierten Patienten. Als Vergleichskollektiv dienten zwölf gesunde Probanden. An mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC), die mittels Ficoll-Separation an den Tagen 1, 3 und 7 nach Trauma gewonnen wurden, untersuchten wir den Einfluss von physiologischen (aPC 4 µg / ml, AT 1 IE / ml) oder supraphysiologischen (aPC 100 µg / ml, AT 20 IE / ml) Konzentrationen der Gerinnungsinhibitoren. Bei operierten Patienten erfolgte präoperativ eine zusätzliche Abnahme. Gesunde Probanden spendeten einmalig Blut und dienten als Referenzgruppe. PBMC wurden in serumfreiem Medium kultiviert und mit aPC bzw. AT (allein oder zusammen) für 60 Minuten präinkubiert. Der entzündliche Stimulus erfolgte mit LPS bzw. OKT3. Zellkulturen wurden dann mit oder ohne Stimulus für 20 Stunden (LPS) oder 72 (OKT3) Stunden inkubiert. Für die Zugabe ansteigender Heparindosen erfolgte die analoge Herstellung von LPS-stimulierten Ansätzen mit supraphysiologischer AT Konzentration. Die Messung der Zytokinspiegel erfolgte mit dem Bioplex Suspension Array System aus den Zellkulturüberständen. Bei gesunden Probanden konnten wir unter LPS-Stimulation in Gegenwart von AT (20 IE / ml) signifikante Abfälle sowohl von TNF-α als auch IL-10 beobachten. Im Patientenkollektiv zeigte sich für TNF-α der gleiche Effekt. Für IL-10 zeigte sich ebenfalls der bei gesunden Probanden beobachtete Abfall der LPS-induzierten IL10-Spiegel, hier jedoch ohne statistische Signifikanz. In unstimulierten Proben führte AT (20 IE / ml) zu einer signifikanten Erhöhung der TNF-α Spiegel. Ein Effekt von AT in der Konzentration 1IE / ml konnte nicht gezeigt werden. Für aPC konnte im LPS-Model kein Einfluss auf die Immunantwort von PBMC unter serumfreien Bedingungen nachgewiesen werden. Nach Aktivierung mit OKT3 kam es durch AT (20 IE / ml) zu einem teils signifikanten Abfall von IFN-γ, und IL-13, wohingegen aPC (100 µg / ml) zu einem Anstieg beider Zytokine führte. Sowohl AT als auch aPC führten zu signifikant erhöhten IL-6 Spiegeln in OKT3-stimulierten Ansätzen. Allerding erhöhte nur AT signifikant die Freisetzung von IL-6 und IFN-γ in unstimulierten Ansätzen. Bei gleichzeitiger Gabe von aPC und AT zeigten sich mit AT 20 IE / ml vergleichbare Spiegel. In Ansätzen die Heparin enthielten zeigte AT (20 IE / ml) eine unveränderte Reduzierung der IL-10 und TNF-α Spiegel. Unsere Ergebnisse zeigen somit für beide Substanzen eine immunmodulatorische Potenz in supraphysiologischen Konzentrationen. Antithrombin führt ex-vivo mit Ausnahme von IL-6 und im Unterschied zu aPC zu einer breiten Suppression der Zytokinfreisetzung aus stimulierten PBMC. Mit Heparin in Dosierungen bis 200IE konnte dieser Effekt nicht antagonisiert werden. Demgegenüber ist aPC in einem serumfreien ex-vivo Modell ein Aktivator der lymphozytären TH1-Antwort in humanen PBMC, hat also entgegen häufig postulierter Vorstellungen klare proinflammatorische Effekte, zumindest auf humane Immunzellen. Die klinische Bedeutung dieser Beobachtungen und die zugrunde liegenden Mechanismen bedürfen der weiteren Klärung.

Blutgerinnung und Entzündung sind zwei stark miteinander verknüpfte Vorgänge im menschlichen Körper. Es ist gängige Meinung, dass während einer Sepsis die systemische Entzündung unweigerlich zu einer Aktivierung des Gerinnungssystems und einer gleichzeitigen Inhibition des blutgerinnungshemmenden Systems sowie der Fibrinolyse führt. Durch die massive Aktivierung der Gerinnung kommt es zu einer sogenannten Verbrauchskoagulopathie, bei der vor allem die antikoagulatorische Kapazität stark reduziert ist. So ist die Aktivität von ATIII und APC, zwei der wichtigsten körpereigenen Gerinnungsinhibitoren, während der Sepsis erheblich vermindert. Rekombinant hergestelltes APC hat als Xigris® seit 2002 die europäische Zulassung zur Behandlung der schweren Sepsis. In einer klinischen Studie der Phase 3 wurde eine Reduktion der 28-Tage Sterblichkeit durch die Gabe von APC bei Patienten mit schwerer Sepsis festgestellt. Im Gegensatz zu APC zeigte ATIII in einer Studie der Phase 3 an Patienten mit schwerer Sepsis keine Reduktion der 28-Tage Sterblichkeit. Es ist generell akzeptiert, dass das septische Mehrorganversagen durch die systemische Immunantwort des Organismus auf eine Infektion und die daraus resultierende überschießende systemische Freisetzung inflammatorischer Mediatoren vermittelt wird. Die Freisetzung dieser Mediatoren erfolgt unter anderem aus Monozyten. Durch den entzündlichen Stimulus während einer Verletzung oder Sepsis wird auf Monozyten neben der Freisetzung von Zytokinen auch TF induziert, der Rezeptor und Aktivator von FVII. Der Komplex aus TF und FVIIa stellt den Anfangspunkt der exogenen Gerinnung dar. Seit einigen Jahren wird rFVIIa als „rescue therapy“ zur Kontrolle schwerer traumatisch verursachter Hämorrhagien diskutiert. Dabei soll durch die Gabe von rFVIIa die Gerinnung spezifisch am Ort der Verletzung verstärkt werden. Da durch das Trauma und die damit verbundene Entzündungsreaktion Monozyten vermutlich TF exprimieren, stellen auch diese Zellen einen potentiellen Angriffspunkt für rFVIIa dar. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war, mögliche gerinnungsunabhängige immunmodulatorische Eigenschaften dieser, in der Intensivmedizin verwendeten, körpereigenen Substanzen zu untersuchen. Im Speziellen sollte die Auswirkung der Pro- bzw. Antikoagulantien auf die LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von Monozyten untersucht werden, ein wichtiger Bestandteil in der Entstehung von Sepsis und MODS. Dazu wurde ein Versuchsmodell mit einer humanen, monozytären Zelllinie, MonoMac6, etabliert. Die Produktion von IL-1β, IL-8 und TNFα wurde intrazellulär mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Im Zellkulturüberstand wurden die Konzentrationen von IL-1β, IL-8, IL-10 und TNFα mit einem Luminex-100 System gemessen. Zusätzlich wurde für rFVIIa der Einfluss auf die LPS-induzierte IL-1β-, IL-6-, IL-8- und TNFα-Synthese von CD14+ Monozyten in PBMCs durchflusszytometrisch erfasst. In der vorgelegten Arbeit konnte eine limitierende Wirkung von APC und ATIII auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten festgestellt werden. APC verminderte die IL-1β-, IL-10- und TNFα-Ausschüttung signifikant, wobei Überstandsmessungen die eindeutigsten Ergebnisse zeigten. Der Effekt von ATIII ließ sich durchflusszytometrisch besser bestimmen, als aus dem Überstand. Es zeigte sich eine signifikant verminderte LPS-induzierte IL-1β- und TNFα-Produktion der Monozyten. Zusätzlich wurde der Effekt von Heparin auf die ATIII-Wirkung untersucht, da es mehrere Hinweise auf eine negative Beeinflussung der ATIII-Therapie in der Sepsis durch gleichzeitige Gabe von Heparin gibt. In der vorgelegten Arbeit konnte interessanter Weise kein antagonisierender Effekt von Heparin auf die immunologische Wirkung von ATIII festgestellt werden. Neben dem positiven Effekt durch die Wiederherstellung der Antikoagulation während der Sepsis, kann APC auch zur Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen Pro- und Antiinflammation beitragen. APC vermindert sowohl die Synthese pro-, als auch die antiinflammatorisch wirkender Mediatoren, was eine Erklärung für die Wirksamkeit bei dem sehr heterogenen Kollektiv der Sepsispatienten sein könnte. ATIII reduziert nach unseren Ergebnissen lediglich die Synthese der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β, nicht aber die von IL-10. Geht man davon aus, dass APC deshalb wirksam ist, weil es sowohl eine überschießende Pro- als auch Antiinflammation dämpfen kann, wäre das eine Erklärung für das Fehlen des klinischen Wirksamkeitsnachweises für ATIII bei Patienten mit schwerer Sepsis. Für rFVIIa ergab sich ein messbarer, aber nicht eindeutig charakterisierbarer immunmodulatorischer Effekt auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten. Bei MonoMac6 Zellen zeigte sich ein leicht begrenzender Effekt auf die IL-8- und TNFα-Produktion. Die Behandlung von PBMCs mit rFVIIa ergab keine veränderte LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von CD14+ Monozyten. In verschiedenen Versuchsabläufen wurden MonoMac6 Zellen zur Erhöhung der TF-Expression vor der Inkubation mit rFVIIa mit TNFα oder LPS behandelt. Dabei zeigte sich je nach Messmethode und Vorbehandlung außer einer geringen Steigerung der TNFα-Synthese LPS-vorbehandelter Monozyten kein Effekt. Zusätzlich wurde eine Transfektion der MonoMac6 Zellen mit TF durchgeführt. In Versuchen mit dieser Zelllinie ergab sich eine erhöhte TNFα-Synthese unter rFVIIa-Einfluss. Dieses Ergebnis ist jedoch mit Vorsicht zu betrachten, da die Reaktion der transfizierten Zellen auf LPS alleine im Kontrollexperiment nicht der des Wildtyps entsprach. Eine rFVIIa-induzierte Bildung von Thrombin kann ebenfalls in die Immunreaktion eingreifen, dies illustriert die in der vorgelegten Arbeit unter Thrombineinfluss gemessene, stark verminderte LPS-induzierte IL-10 Ausschüttung. Allerdings konnte der direkte immunmodulatorische Effekt von rFVIIa weder mit der Komplexbildung aus TF und rFVIIa noch mit der von rFVIIa vermittelten Produktion von Thrombin in Verbindung gebracht werden. Die immunmodulatorische Wirkung von rFVIIa auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten konnte mit den in der vorgelegten Arbeit verwendeten Modellen nicht abschließend geklärt werden und lässt noch viel Raum für weitere Untersuchungen. Transfektionsversuche mit anderen monozytären Zelllinien oder die Selektion von TF-exprimierenden Immunzellen aus kritisch kranken Patienten wären mögliche Versuchsansätze für die Zukunft. Auch ein geeigneter Stimulus zur Induktion von TF auf isolierten humanen Monozyten, der nicht gleichzeitig die Zytokinsynthese anregt, würde vielversprechende Möglichkeiten bieten.

Atheromatöse Plaques sind vulnerabel, und deren Ruptur kann die Bildung gefäßverschließender plättchen- und fibrinreicher Thromben induzieren, welche akute Myokardinfarkte und ischämische Schlaganfälle verursachen können. Bisher geht man davon aus, dass der Plaque-„tissue factor“ als Aktivator der extrinsischen Blutgerinnung und Stimulator der Thrombin-vermittelten Plättchenaktivierung und Aggregation die bedeutendste prothrombogene Substanz atheromatöser Läsionen darstellt. Zu Beginn dieser Arbeit war nicht geklärt, ob und wie das lipidreiche atherosklerotische Plaquematerial auch direkt mit den Thrombozyten im Blut interagieren und auf diese Weise die Bildung eines gefäßverschließenden Plättchenthrombus induzieren kann. Die atheromatösen Läsionen von mehr als 60 verschiedenen Patienten mit Karotisstenose wurden mittels Endarterektomie isoliert und Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positive, morphologisch äußerst heterogene Strukturen in den Plaques identifiziert, welche direkt die Adhäsion, Sekretion und Aggregation von Plättchen in Puffer, Plasma und Blut stimulierten. Darüber hinaus lösten die Plaques auch die Bildung von Thrombozyten-Monozyten-Aggregaten sowie eine plättchenbeschleunigte Fibrinbildung und Gerinnung aus. Unter arteriellen Flussbedingungen induzierten die kollagenpositiven Komponenten des Plaquematerials die Adhäsion, das Ausbreiten und die Aggregatbildung der Thrombozyten. Die Plaque-stimulierte Plättchenaggregatbildung erfolgte sehr rasch (< 5 min) und wurde in Hirudin-antikoaguliertem Blut beobachtet, was darauf schließen lässt, dass diese direkt und unabhängig von der Plaque-„tissue factor“-vermittelten Koagulation erfolgte und sehr wahrscheinlich für die initiale und schnelle Thrombusbildung nach einer Plaqueruptur in vivo von Bedeutung ist. Sowohl die Ergebnisse mit humanen, als auch mit murinen Blutplättchen wiesen auf eine essentielle Rolle morphologisch diverser Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positiver Plaquestrukturen und des thrombozytären Kollagenrezeptors GPVI bei der durch atheromatöse Läsionen stimulierten Plättchenformveränderung, Adhäsion, Ausbreitung, Sekretion und Aggregation im statischen System und unter arteriellen Flussbedingungen hin. Der zweite bedeutende thrombozytäre Kollagenrezeptor, das Integrin α2β1, schien hingegen nicht an der durch die atheromatösen Läsionen hervorgerufenen Plättchenadhäsion und Aggregation im statischen System und unter Fluss beteiligt zu sein. Diese Beobachtungen führten zur Annahme, dass die Verabreichung von z. B. spezifischen anti-GPVI-Antikörpern oder löslichem GPVI-Protein, welche die Interaktion des thrombozytären GPVI-Rezeptors mit dessen Liganden im Plaquegewebe (Kollagen Typ I/Typ III) inhibieren, viel versprechende neue und effektive antithrombotische Strategien zur frühen Prävention kardio- und cerebrovaskulärer Gefäßverschlüsse darstellen könnten. Der thrombozytäre VWF-Rezeptor GPIbα war weder im gerührten System, noch unter Fluss mit niedrigeren Scherraten von 500 s-1 von Bedeutung für die durch atheromatöse Plaques induzierte Plättchenaggregation im Blut. Unter arteriellen Flussbedingungen mit höheren Scherraten von 1500 s-1 allerdings resultierte die Blockade von GPIbα in einer starken Reduktion (77±5%) der Plaque-stimulierten Thrombozytenadhäsion und Aggregatbildung. Dies lässt darauf schließen, dass unter diesen Strömungebedingungen auch die Interaktion des VWF mit dem Plättchen-GPIbα-Rezeptor eine wichtige Rolle für die Thrombusbildung nach Plaqueruptur spielt. Sowohl die ADP-Rezeptor-Antagonisten MRS2179 (P2Y1-Antagonist) und AR-C69931MX (P2Y12-Antagonist), als auch Aspirin® konnten die Plaque-vermittelte Thrombozytenaggregation in gerührtem PRP und Blut signifikant verringern, wobei die Kombination aller drei Plättchenhemmer am effektivsten wirkte und die Plaque-induzierte Aggregation vollständig inhibierte. Unter arteriellem Fluss (Scherraten: 1500 s-1) wirkten MRS1279, AR-C69931MX sowie deren Kombination allerdings deutlich weniger effizient als im statischen System und reduzierten die Plaque-stimulierte Plättchenaggregatbildung nur um 35±14%, 32±13% und 58±12%. Überraschender Weise führte die Zugabe von Aspirin® unter Fluss zu keiner signifikanten Reduktion der Plaque-induzierten Thrombozytenaggregatbildung. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ADP-Rezeptor-Antagonisten sowie Aspirin® die Bildung eines gefäßverschließenden Thrombus nach Plaqueruptur eher ineffizient hemmen dürften. Die atheromatösen Plaquehomogenate verschiedener Patienten wiesen unterschiedliche thrombozytenaktivierende Eigenschaften auf, welche weder auf deren variierenden Gehalt an löslichem Kollagen, noch auf die unterschiedliche Morphologie der Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positiven Plaquekomponenten zurückgeführt werden konnte. Weiterhin verhielt sich sowohl fibrilläres als auch lösliches Kollagen Typ I und Kollagen Typ III anders als das Plaquematerial bezüglich der Plättchenaggregation im PRP. Die Bindung des thrombozytären GPVI-Rezeptors an das Plaquematerial stellte die Voraussetzung für die Plättchenaktivierung der Plaques dar, wobei jedoch keine eindeutige positive Korrelation zwischen der GPVI-Bindung und der Aktivität der atheromatösen Läsionen verschiedener Patienten hergestellt werden konnte. Der Grund für die unterschiedliche Thrombozytenaktivierung induziert durch das Plaquematerial verschiedener Patienten bleibt letztlich also unklar. Die weitere Erforschung möglicher Ursachen für die unterschiedlichen plättchenaktivierenden Eigenschaften der lipidreichen atheromatösen Läsionen verschiedener Patienten stellt eine interessante und vor allem klinisch relevante zukünftige Fragestellung dar.

Die Familie der Sorting Nexine (SNX) umfasst 33 bekannte Mitglieder, jedoch ist der Funktionsmechanismus vieler Sorting Nexine bislang nicht aufgeklärt. Auf der Suche neuer Modulatoren der βAPP-Proteolyse konnte im Rahmen eines Expressionsklonierungs-Screens (Schobel et al., 2006) ein bislang nicht beschriebenes Protein, Sorting Nexin 33 (SNX33), als Aktivator der βAPP-Proteolyse identifiziert werden. SNX33 ist ein phosphoryliertes Protein, das ubiquitär exprimiert wird und zudem eine hohe Homologie zu den Proteinen SNX9 und SNX18 aufweist. SNX33 ist im Zytosol lokalisiert, kann jedoch auch Membran-assoziiert vorliegen. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression von SNX33 zu einer Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose und in Folge dessen zu einer etwa 50% -igen Reduktion der βAPP-Endozytose führt. Die von SNX33 induzierte Endozytosehemmung wird durch die SH3-Domäne des Proteins vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführte Koimmunpräzipitationsstudien zeigten, dass SNX33 mittels seiner SH3-Domäne mit Dynamin interagiert und auf diese Weise möglicherweise dessen Funktion moduliert. In Übereinstimmung mit den durchgeführten Zellkultur-Experimenten führte eine Überexpression von SNX33 im Modellorganismus Caenorhabditis elegans ebenfalls zu einem Dynamin-Funktionsverlust. Da SNX33 Expression zu einer generellen Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose führt, handelt es sich dabei nicht um einen spezifischen βAPP-Modulator. Konsequenz einer reduzierten βAPP-Internalisierung ist eine starke Zunahme der neurotrophen sAPPα-Bildung sowie - je nach verwendeter Zelllinie - ein leichter Anstieg bzw. eine geringe Reduktion der pathogenen sAPPβ-Generierung. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression der homologen Proteine SNX9 und SNX18 ebenfalls zu einer Zunahme der βAPP-Spaltung führt. Es handelt sich also um einen Effekt, der von der ganzen Sorting Nexin-Subgruppe (SNX33/SNX9/SNX18) vermittelt wird. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass diese Funktion innerhalb dieser Subgruppe konserviert ist. Transfektion von SNX1 führte zu keiner Änderung der βAPP-Proteolyse, was bedeutet, dass dieser Effekt nicht von der gesamten Sorting Nexin-Familie vermittelt wird. Interessanterweise ist die Spaltung von βAPP besonders sensitiv bezüglich einer veränderten Endozytose-Rate, da die Proteolyse der Transmembranproteine L-Selektin und des Tumornekrosisfaktor-Rezeptors 2 (TNFR2) unter SNX33 Überexpressionsbedingungen nicht signifikant verändert war. Ein siRNA-vermittelter Knock-Down von SNX33 führte zu keiner generellen Endozytoseinhibition in HEK293 Zellen, es konnte keine veränderte βAPP-Endozytoserate beobachtet werden. Die Bildung von sAPPα- und sAPPβ war in Folge dessen unverändert. Auch ein lst-4/SNX33-Knock-Down in C. elegans führte überraschenderweise zu keiner Inhibition der Dynamin-Funktion, äußerte sich jedoch in einer Fehlfunktion der Insulin-Signaltransduktion. SNX33-Knock-Down in humanen Zellen brachte keine nachweisbare Beeinträchtigung des Insulinsignalweges mit sich, jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Homologen SNX9 und SNX18 einen Verlust von SNX33 kompensieren können. Dabei gilt zu beachten, dass eine Funktionsübernahme durch homologe Proteine in C. elegans nicht möglich ist, da dieser Organismus nur ein einziges homologes Protein der SNX33/SNX9/SNX18-Subgruppe besitzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit präsentierten sowie diskutierten Daten zeigen, dass SNX33 in unterschiedliche zellulärer Prozesse involviert ist. SNX33 ist ein neu identifizierter Modulator der Zelle, der für zentrale Signalwege und Vorgänge, wie zum Beispiel der Insulinrezeptor-Signaltransduktion und Endozytose, von Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Modellorganismus C. elegans kann im humanen Zellkultursystem ein durch siRNA induzierter Funktionsverlust von SNX33 durch die homologen Proteine SNX9 und SNX18 kompensiert werden.

Das natürliche Vitamin Nikotinsäure wird seit 1955 in pharmakologischer Dosierung als Medikament zur Behandlung von Dyslipidämien und bei arteriosklerotischen Gefäßveränderungen verwendet. Von Nikotinsäure konnte als erstem Medikament bereits 1975 im Coronary Drug Project nachgewiesen werden, dass es die Mortalität nach Myokardinfarkt signifikant und anhaltend reduziert. Nikotinsäure senkt den LDL-Plasmaspiegel und erhöht den HDL-Spiegel. Während der Nikotinsäureeffekt auf LDL vielfach untersucht wurde, ist über den Mechanismus der HDL-Erhöhung bisher wenig bekannt. Nikotinsäure stimuliert massiv die PGD2-Synthese in vivo. Der Hauptmetabolit von PGD2, das 15-deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2, wurde kürzlich als wichtigster endogener Aktivator des nukleären Transkriptionsfaktors PPAR erkannt. PPAR ist entscheidend an der Regulation des Scavenger Rezeptors CD36 und des zellulären Cholesterinexporters ABCA-1 beteiligt. Diese Rezeptoren dominieren die zelluläre Aufnahme modifizierter LDL-Partikel und die Ausschleusung zellulären Cholesterins auf HDL-Partikel und damit die Cholesterinhomöostase in Monozyten/Makrophagen in der Gefäßwand. Deshalb war es Ziel der Arbeit an einem Makrophagenmodell zu untersuchen, ob Nikotinsäure Scavenger-Rezeptoren und zelluläre Cholesterin-Transporter tatsächlich beeinflusst und so über einen gesteigerten reversen Cholesterintransport aus der Peripherie zur Leber seinen klinischen Nutzen vermitteln könnte. Als Modelle wurden die differenzierte humane Monozytenlinie MM6, die humane hepatische Linie HepG2 und frisch präparierte humane Monozyten verwendet. Die Expression der Scavenger Rezeptoren CD36, SR-BI, LOX-1, des LDL-R, des Cholesterinexporters ABCA-1, des Transkriptionsfaktors PPAR und von -Aktin wurden durch reverse Transkription der spezifischen mRNAs, nachfolgende PCR und Quantifizierung der Amplifikate über HPLC bestimmt. Die Proteinexpression von CD36 und PPAR wurden mittels spezifischer Antikörper nach Fluoreszenzmarkierung im FACS gemessen. Die Änderung des zellulären Cholesteringehalts durch Inkubationen mit Nikotinsäure, oxLDL und delipidiertem HDL wurde nach zellulärer Lipidextraktion in einem adaptierten enzymatischen Assay gemessen. Im Makrophagenmodell stimulierte die Inkubation der Zellen mit Nikotinsäure schon nach 3 h und mindestens bis 48 h anhaltend die Transkription von PPAR, des PPAR abhängigen Scavenger-Rezeptors CD36 und des zellulären Cholesterinexporters ABCA-1. Dagegen blieb die Transkription des ApoB-spezifischen LDL-R und des Scavenger-Rezeptors LOX-1 unverändert. Vergleichbare Effekte waren auch am Hepatozytenmodell nachweisbar. Die Effekte auf die PPAR und CD36 Expression waren tendenziell auch auf Proteinebene nachweisbar. Die Stimulation von CD36 und ABCA-1 durch Nikotinsäure konnte auf RNA-Ebene auch an frisch präparierten peripheren Monozyten von Normalpersonen nachgewiesen werden. Die funktionelle Bedeutung der Nikotinsäureeffekte wurde in einem Cholesterin-Aufnahme und Efflux-Assay überprüft. Dabei reduzierte die Inkubation mit Nikotinsäure den zellulären Cholesteringehalt basal und unter oxLDL-Exposition und steigerte den zellulären Cholesterin-Efflux auf delipidiertes HDL. Diese neuen Effekte der Nikotinsäure auf mehrere Lipid-Rezeptoren und -Transporter können Lipidablagerungen in der Gefäßintima reduzieren, der Schaumzellbildung entgegenwirken und durch vermehrte Einschleusung von zellulärem Cholesterin in den reversen Cholesterintransport zurück zur Leber die HDL-Spiegel erhöhen. Diese peripheren Effekte der Nikotinsäure ergänzen die Effekte von Statinen und liefern ein Rational für einen potentiell überadditiven klinischen Nutzen durch die Kombinationstherapie, die gegenwärtig klinisch geprüft wird.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, (i) die regulatorische Funktion bestimmter integraler Membranproteine im Dictyostelium Zytoskelett und (ii) die biochemische Interaktion einer Kinase eines infektiösen Bakteriums mit Aktin aus der Wirtszelle genauer zu analysieren. (i) Die ubiquitären Mitglieder der CD36/LIMPII-Familie sind integrale Membranproteine, die als Lipidrezeptoren und Zelladhäsionsproteine in der Plasmamembran oder - mit bisher unbekannter Funktion - in Membranen endosomaler Vesikel vorkommen. In Dictyostelium discoideum führte die Inaktivierung eines lysosomalen Membranproteins aus dieser Gruppe zur Suppression des Phänotyps einer Profilin-minus Mutante. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des D. discoideum-Genoms konnte festgestellt werden, daß es neben diesem DdLmpA noch die beiden weiteren homologen Proteine DdLmpB und DdLmpC gibt. Da der Mechanismus der Suppression des Profilin-minus Phänotyps ungeklärt ist, wurden die beiden Isoformen im Rahmen der vorliegenden Arbeit genauer charakterisiert. Sowohl für DdLmpB wie auch für DdLmpC konnte die familientypische Membran-Topologie einer Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Dabei weist die zentrale, lumenale Domäne beider Proteine zahlreiche Glykosylierungen auf. Durch Immunofluoreszenz und Saccharosegradienten wurde die Lokalisation der drei Isoformen an endolysosomalen Vesikeln nachgewiesen. Es stellte sich dabei heraus, daß die drei DdLmp-Proteine in unterschiedlichen Vesikelpopulationen auftraten. Auch “pulse-chase“-Experimente mit TRITC-Dextran und nachfolgender Markierung der Vesikel mit DdLmp-spezifischen Antikörpern ergaben unterscheidbare Zeitmuster für die Rekrutierung der Membranproteine in Vesikeln. Die für DdLmpA oft beobachtete Kolokalisation mit Makropinosomen konnte z.B. für DdLmpB und DdLmpC nur selten festgestellt werden. Nach zahlreichen Versuchen und der Konstruktion von verschiedenen Vektoren konnte am Ende der praktischen Arbeiten eine DdLmpB-minus Mutante im Wildtyp-Hintergrund isoliert werden. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Aktin und der Kinase YopO, die durch Yersinia enterocolitica als Effektorprotein in die Wirtszelle transloziert wird, biochemisch genauer untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß G-Aktin und nicht F-Aktin für die Aktiverung der YopO-Kinase verantwortlich ist. Dabei tritt Nichtmuskel-Aktin im Vergleich zum Muskel-Aktin als ein deutlich besserer Aktivator von YopO auf. Obwohl die aktivierte Kinase in vivo das Aktin-Zytoskelett beeinflußt, ist Aktin offensichtlich kein Substrat von YopO. Mittels Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß sowohl die native Kinase YopO als auch das durch Punktmutation inaktivierte YopO K269A die Polymerisierungskinetik von Aktin behindern. Für eine mutmaßliche Aktin-Binderegion von 20 Aminosäuren aus dem C-terminalen Ende konnte hingegen kein Effekt beobachtet werden. Der Einfluß von aktinbindenden Proteinen, aktinmodifizierenden Substanzen und YopO-bindenden GTPasen auf die Aktivierung der Kinase durch Aktin deutet darauf hin, dass die Aktivität der Kinase in der Wirtszelle nicht nur durch Aktin alleine, sondern auch durch weitere Zytoskelett-Komponenten reguliert wird.

Lysophosphatidsäure gilt als einer der grundlegendsten und wichtigsten Mediatoren höherer Organismen, sie wirkt als Wachstumsfaktor bzw. Aktivator auf eine Vielzahl von Effektorzellen. In der vorliegenden Arbeit wird ein bislang unbekannter Weg der LPA-Entstehung während der Modifikation von Lipoproteinen nachgewiesen und die entstandene LPA mit Hilfe einer neu etablierten Methode der sequentiellen Lipidextraktion von Lipoproteinen quantifiziert. So findet sich während der milden Oxidation von LDL ein deutlicher Anstieg des LPA-Gehalts auf eine Aktivität von etwa ein nmol Palmitoyl-LPA/mg mox-LDL-Protein. Dies ist eine Menge, die bei den bislang beschriebenen Zellsystemen nachweislich Effekte hervorruft. Hier wurde dies für Thrombozyten aufgezeigt: Die in mox-LDL enthaltene LPA ruft dosisabhängig Gestaltwandel oder Aggregation in gewaschenen Thrombozyten hervor. Damit wurde erstmals die Thrombozyten-aktivierende Substanz in milde oxidierten Lipoproteinen benannt, quantifiziert und in einen funktionellen Kontext gestellt. Vergleichbare Resultate ergaben sich für verschiedene andere milde LDL-Modifikationsformen, wie mm-LDL und interessanterweise auch für analoge Modifikationen von HDL. Ganz wesentlich trug die Verwendung eines Desensibilisierungsassays zum Beweis bei, daß LPA der in all diesen modifizierten Lipoprotein-Spezies enthaltene, allein relevante Plättchenagonist ist. Da oxidierte Lipoproteinspezies als Schlüsselelemente in der Pathogenese von Arteriosklerose, Thrombose und kardiovaskulären Erkrankungen erachtet werden, rückt LPA ins Zentrum der Abläufe bei Plaqueruptur und arterieller Thrombose; es dürfte ebenfalls eine relevante Rolle spielen bei Initiation und Progression atheromatöser Veränderungen. Es ist zu erwarten, daß mox- und mm-Lpp in zu Plättchen vergleichbarer Weise auch weitere Effektorzellen aktivieren und beispielsweise zur Proliferation anregen, etwa Endothelzellen, Fibroblasten und glatte Gefäßmuskelzellen.

Die Anpassung der Gewebsdurchblutung an die unterschiedlichen Bedarfssituationen, setzt ein koordiniertes Verhalten der Gefäße im mikrovaskulären Gefäßnetz voraus. Diese Koordination der vasomotorischen Reaktionen im mikrovaskulären Gefäßsystem, ist möglicherweise auf die interzelluläre Kommunikation der Endothelzellen angewiesen. Die Endothelzellen und glattten Muskelzellen der Blutgefäße sind über Gap Junctions gekoppelt, auch eine myoendotheliale Kopplung wird diskutiert. Dadurch können Signale in Form von Ionen (und damit Änderungen des Membranpotentials) oder kleinen Moleküle über solche interzellulären Kanäle entlang der Endothelzellschicht weitergegeben werden. Völlig unbekannt ist aber, ob die Permeabilität dieser endothelialen Gap Junctions reguliert wird. Deshalb wurde in dieser Arbeit untersucht, ob vom Endothel gebildete lokal wirksame Gewebshormone (Autakoide, wie NO und Prostacyclin) die Durchlässigkeit der Gap Junctions beeinflussen. Hierzu wurde in konfluenten Kulturen von humanen umbilikalvenösen Endothelzellen (n=190) die Ausbreitung der Farbstoffe Carboxyfluoresein und Calcein nach Injektion in eine einzelne Endothelzelle in die benachbarten Endothelzellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß der injizierte Farbstoff tatsächlich nur über interzelluläre Kanäle von einer Zelle zur nächsten gelangt. Diese Kanäle werden von Connexinen gebildet, denn ein Peptid, das das Aneinanderdocken der Connexine verhindert, reduzierte die Ausbreitung des fluoreszierenden Farbstoffs. Daher kann mit dieser Methode tatsächlich die Kopplung der Zellen über Gap Junctions untersucht werden. Die erhobenen Daten zeigen, daß die Anzahl der fluoreszierenden Zellen nach Hemmung der NO-Synthase mit Nw-nitro-L-Arginin (L-NA, 30µmol/L) um bis zu 29% zunahm, während die anschließende erneute Freisetzung von NO durch zwei differente NO-Donoren (SNAP bzw. SNP, 1 µmol/L) die Zahl der fluoreszierenden Zellen wieder auf den Ausgangswert reduzierte oder sogar unterhalb den, der unbehandelten Kontrollzellen senkte. Diese durch NO hervorgerufene Wirkung blieb in Anwesenheit des Hemmstoffes der löslichen Guanylatcyclase ODQ (10 µmol/L) oder der Radikalfänger Tiron und Superoxiddismutase unverändert. Dies weist daraufhin, daß es sich bei dieser durch NO hervorgerufenen Hemmung um einen direkten Effekt von NO handelt, der weder über die Bildung von cGMP noch über eine gesteigerte Peroxynitritproduktion vermittelt wird. Auch eine Hyperpolarisation der Endothelzellen durch den Aktivator von KATP-Kanälen HOE234 (1 µmol/L) hatte keinen Einfluß auf die Kopplung der Zellen. Im Gegensatz dazu hatte NO in Anwesenheit der Hemmstoffe der Tyrosinphosphatase Orthovanadat (100 µmol/L) und Phenylarsinoxid (1 µmol/L) keinen Einfluß mehr auf die endotheliale Kommunikation via Gap Junctions. Dagegen führte die Behandlung der Zellen mit dem Tyrosinkinase Inhibitor Genistein (100 µmol/L) zu einer deutlichen Reduktion der endothelialen Kopplung (-14%), die mit der Wirkung von NO vergleichbar war. Daraus läßt sich schließen, daß die durch NO hervorgerufene Wirkung auf die interzelulläre Kommunikation über eine Verminderung der Tyrosinphosphorylierung vermittelt zu werden scheint. Außerdem zeigen diese Daten, daß Prostacyclin die endotheliale Kopplung signifikant steigert, und das diese Wirkung über das gebildete cAMP vermittelt wird. Denn nicht nur das Prostacyclin Analogon Iloprost (1 µmol/L), sondern auch der Aktivator der Adenylatcyclase Forskolin (30 µmol/L), verbesserte die Ausbreitung des Farbstoffes signifikant . Schließlich zeigen die Ergebnisse auch, daß die beiden vom Endothel gebildeten Substanzen sich gegenseitig in ihrer Wirkung auf die endothelialen Gap Junctions beeinflussen können. Die erhobenen Daten zeigen erstmals eine Rolle von NO und Prostacyclin in der Regulation der Permeabilität endothelialer Gap Junctions. Diese Regulationsmöglichkeit und die Auswirkungen einer vermehrten oder verminderten Kopplung der Endothelzellen wirft zahlreiche neue Fragestellungen auf z. B. hinsichtlich der Pathophysiologie der coronaren Herzkrankheit oder auch des arteriellen Hypertonus und bietet damit auch die Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten.

Die Transkription von proteincodierenden Genen wird in Eukaryonten durch RNA-Polymerase II und die Generellen Transkriptionsfaktoren, die an den Promotor eines Klasse II Genes binden, bewerkstelligt. Eine Regulation der Aktivitaet dieser molekularen Maschine erfolgt durch Aktivator- und Repressorproteine, die sequenzspezifisch an regulatorische Sequenzen dieser Gene binden. Fuer die Funktion von Aktivatoren ist nicht nur die Interaktion derselben mit der Transkriptionsmaschine sondern auch die Wechselwirkung mit akzessorischen Proteinen (Cofaktoren) essentiell. Diese fungieren als eine Art Transmitter fuer regulatorische Signale, welche den Zusammenbau bzw. die Aktivitaet der Maschine steuern. Die RNA-Polymerase II Transkription laesst sich in einem zellfreien in-vitro-System unter Verwendung einfacher Modellgene rekonstituieren. Dieses Testsystem wurde zur Identifizierung und Reinigung neuer Cofaktoren verwendet, von denen zwei in dieser Arbeit kloniert und naeher charakterisiert wurden. Einer dieser Faktoren (PAQ) ist Teil eines Multiproteinkomplexes, der Mediator genannt wird, und, wie in dieser Arbeit gezeigt, eine generelle regulatorische Funktion in der Zelle aufweist. Das zweite klonierte Protein (VACID) vermittelt spezifisch die Wirkung des Herpes simplex Virus Aktivators VP16, indem es sowohl an VP16 als auch an Mediator bindet und dessen Aktivitaet reguliert, was letztlich zu einer drastischen Stimulation der RNA-Polymerase II-Transkription fuehrt.