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Die akute myeloische Leukämie (AML) ist aus genetischer Sicht eine sehr heterogene Erkrankung. Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) wie FLT3 sind in der Leukämogenese von zentraler Bedeutung. Durch Mutationen aktivierte RTKs sind allerdings alleine nicht in der Lage eine AML zu induzieren. Die Kooperation mit anderen Mutationen ist hierfür notwendig. Zu den am häufigsten gemeinsam auftretenden Mutationen in der AML gehören NPM1- und FLT3-ITD- (internal tandem duplication) Mutationen. Klinische Daten zeigen, dass eine FLT3-ITD die gute Prognose von NPM1-mutierten (NPM1c+) Patienten in Abhängigkeit des FLT3-ITD-mRNA-Levels in negativer Weise beeinflusst. Dies lässt auf ein pathogenes Zusammenwirken beider Genmutationen in der AML schließen, welches im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Dazu wurde basierend auf der humanen AML-Zelllinie OCI-AML3 mittels stabiler, lentiviraler Transduktion das erste zelluläre Modellsystem etabliert, das die relevanten Genotypen (NPM1c+/FLT3-ITD; NPM1c+/FLT3-WT) sowie unterschiedliche Verhältnisse von FLT3-ITD zu FLT3-WT (ITD/WT) im NPM1-mutierten Hintergrund modelliert. Zunächst wurde die NPM1-Mutation sowie die Funktionalität des FLT3-WT- und FLT3-ITD-Rezeptors in den nativen und transgenen Zellen bestätigt. Mit Hilfe des Zellmodells konnte gezeigt werden, dass Zellen, die beide Mutationen tragen, in vitro wie auch in vivo einen Wachstumsvorteil besitzen. Dieser vergrößerte sich zudem mit zunehmendem ITD/WT-Verhältnis. Ab einem bestimmten ITD/WT-Verhältnis konnte dieser Wachstumsvorteil in vitro mit einem FLT3-Inhibitor über eine gewisse Dauer gehemmt werden. Diese Ergebnisse könnten auf ein Zusammenwirken der beiden Mutationen bei der Leukämogenese hinweisen und eine Ursache für die schlechteren Überlebenskurven von Patienten mit beiden Mutationen und zunehmender FLT3-ITD-Last darstellen. Der insgesamt jedoch nur schwach ausgeprägte Phänotyp des etablierten Zellmodells erfordert zum eindeutigen Nachweis der funktionellen Interaktion von NPM1- und FLT3-ITD Mutationen ein alternatives Modellsystem. In diesem Zellmodell zeigten Zellen, die den FLT3-WT-Rezeptor überexprimierten, ebenfalls einen schwachen Wachstumsvorteil gegenüber nativen Zellen mit endogener FLT3-WT-Expression. Neben aktivierenden FLT3-Mutationen wie einer ITD, führen auch hohe FLT3-WT-Expressionslevel zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Kinase und verschlechtern die Prognose der Patienten. Deshalb wurde in dieser Arbeit mit der Untersuchung der transkriptionellen Regulation von FLT3, als mögliche Ursache hoher FLT3-WT-Expressionslevel, begonnen. In silico wurden im proximalen FLT3-Promotor Bindestellen für die hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren (TF) PAX5 und MYB identifiziert. Mit Hilfe des Dual-Luciferase® Reporter Assay Systems wurden PAX5 als schwacher Repressor und MYB als Aktivator des Flt3-Promotors bestätigt. Auch der Transkriptionsfaktor CEBPA verhielt sich auf gleiche Weise als Aktivator der Flt3-Promotoraktivität. Eine Punktmutation im CEBPA-Gen, die aus zwei AML-Fällen bekannt ist, führte zu einer erhöhten Flt3-Promotoraktivität. Die Identifizierung weiterer mutierter, FLT3-regulierender TF und ihre Korrelation mit der FLT3-Expression sollen zukünftig tiefere Einblicke in die transkriptionelle Regulierung von FLT3 als Ursache der FLT3-Überexpression in AML-Patienten gewähren. Für eine Reihe von in AML-Patienten gefundenen Mutationen ist deren Rolle in der Pathogenese der AML noch unbekannt. Dazu gehören Mutationen in den Rezeptortyrosinkinasen DDR1 und DDR2. In der vorliegenden Arbeit wurden DDR1- und DDR2-Mutationen stabil in Ba/F3 Zellen und transient in HEK-293T Zellen exprimiert, um ihr transformierendes Potential zu untersuchen und diese funktionell zu charakterisieren. Transgene, DDR1- und DDR2-exprimierende Ba/F3 Zellen zeigten keinen transformierenden Phänotyp. Weitere Untersuchungen zeigten eine konstitutive Phosphorylierung der extrazellulären DDR2-Mutanten (G222R, M291I) in HEK-293T Zellen und eine Adhäsion von Ba/F3 Zellen mit wildtypischem sowie mutiertem DDR1-Rezeptor in Anwesenheit des DDR-Liganden Kollagen. DDR1- und DDR2-Rezeptoren sind bisher vor allem in soliden Tumoren untersucht. Weitere funktionelle Analysen sind notwendig, um ihren Stellenwert bei der Entstehung von AML zu erfassen. Diese Arbeit zeigt, dass Rezeptortyrosinkinasen in der Leukämogenese auf unterschiedliche Weise eine wesentliche Rolle spielen können. Da Rezeptortyrosinkinasen zudem wichtige Zielmoleküle für therapeutische Ansätze darstellen, sind sie von besonderer Bedeutung.

Das Protein α-Synuklein (α-SYN) spielt eine kritische Rolle in der Pathogenese des Morbus Parkinson. So wird angenommen, dass die Aggregation dieses Proteins für die Degeneration von dopaminergen Nervenzellen des Mittelhirns und den damit verbundenen motorischen Symptomen verantwortlich ist. Während dieser pathophysiologische Zusammenhang allgemein anerkannt ist, bleibt der Einfluss von α-SYN auf nicht-motorische Systeme des Gehirns und somit auf prämotorische Symptome, wie die häufig früh im Krankheitsverlauf auftretende Riechstörung, relativ unerforscht. Der Riechkolben bildet die erste zentrale Stelle für die Verarbeitung von Geruchseindrücken und stellt eine von wenigen Gehirnregionen mit einer außergewöhnlich hohen neuronalen Plastizität dar, da er kontinuierlich mit neuen adult-geborenen Nervenzellen versorgt wird. Selbst im erwachsenen Gehirn - wenn auch in geringerer Anzahl - wandern in diese Region neuronale Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone (SVZ) und dem rostralen migratorischen Strom (RMS) ein, die in lokale Interneurone ausdifferenzieren und in bestehende Netzwerke integrieren. Dabei bilden neue Nervenzellen funktionelle Synapsen mit bereits vorhandenen Neuronen aus und tragen zur Riechwahrnehmung bei. Aufgrund seiner Funktion an der Synapse könnte α-SYN insbesondere einen Einfluss auf die Reifung und Integration von adult-geborenen Neuronen mit möglichen pathophysiologischen Konsequenzen für den Geruchssinn haben. Um die Plastizität im Riechkolben von transgenen α-SYN Mäusen zu untersuchen, eignet sich besonders die Zwei-Photonen-Mikroskopie, da mit dieser Technik neuronale Strukturen bis hin zu einzelnen Synapsen im intakten neuronalen Netzwerk der lebenden Tiere über mehrere Tage bis Monate verfolgt werden können. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Riechkolben des verwendeten Mausmodells histopathologisch und funktionell untersucht. Die transgenen A30P α-SYN Mäuse wiesen pathologische α-SYN Ablagerungen in Mitralzellen auf, und zeigten Störungen in der feinen Geruchsdiskriminierung. Anschließend wurde eine Subpopulation von adult-geborenen Neuronen, dopaminerge periglomeruläre Neurone, die bekannterweise sensibel auf α-SYN reagieren, genetisch markiert. Mittels intravitaler Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde der neuronale Umsatz, der kontinuierliche Neugewinn und Verlust an dopaminergen Nervenzellen, in A30P α-SYN und Wildtypmäusen über einen Zeitraum von 2,5 Monaten beobachtet. Dabei wurde kein Unterschied in der Anzahl an Zellen gemessen, die ihren Zielort im Riechkolben erreichen, und möglicherweise in das Netzwerk integrieren. In den transgenen α-SYN Mäusen wiesen diese Neurone jedoch eine signifikant verkürzte Überlebensspanne auf, was insgesamt in einem Nettoverlust an Neuronen in der Glomerulärzellschicht resultierte. Interessanterweise waren von dem Zelluntergang vor allem adult-geborene Neurone, die erst kürzlich ins Netzwerk integrierten, betroffen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die frühen Schritte der neuronalen Eingliederung und Differenzierung in einen dopaminergen Phänotyp in A30P α-SYN Mäusen nicht beeinträchtigt sind, sondern vielmehr ihr längerfristiges Fortbestehen und Überleben in dem olfaktorischen Netzwerk. Möglicherweise trägt diese instabile Integration und damit gestörte Homöostase von funktionellen neuen Neuronen zu der verminderten Fähigkeit der Geruchsdiskriminierung in A30P α-SYN Mäusen bei. Um die der Riechstörung zugrunde liegenden pathophysiologischen Veränderungen weiter aufzuklären, wurde im zweiten Teil der Arbeit der Einfluss von aggregations-anfälligem A30P α-SYN auf die strukturelle und funktionelle Entwicklung von Körnerzellen, die 95% der adult-geborenen Neurone darstellen, untersucht. Während die biologischen Eigenschaften und physiologischen Mechanismen von Körnerzellen mit ihrer Rolle bei der Verarbeitung von olfaktorischen Eindrücken weitestgehend aufgeklärt sind, ist nur wenig über die synaptische Funktion und strukturelle Plastizität dieser adult-geborenen Neurone unter pathologischen Bedingungen bekannt. Deshalb wurde im Folgenden die Funktionsweise von adult-geborenen Körnerzellen an dendrodendritischen Synapsen mit stabilen Mitralzellen, die pathologisch verändertes α-SYN akkumulieren, genauer charakterisiert. Diese synaptischen Verbindungen sind von wesentlicher Bedeutung für die Geruchsdiskriminierung. Dazu wurden die gesamten dendritischen Bäume einzelner Nervenzellen mittels zeitlich kodierter lentiviraler Transduktion markiert und chronisch mikroskopiert, wobei einzelne dendritische Spines über mehrere Wochen wiederholt aufgesucht und in hoher Auflösung aufgezeichnet wurden. Adult-geborene Körnerzellen in A30P α-SYN Mäusen waren durch eine reduzierte Komplexität des Dendritenbaumes und eine erniedrigte Spineplastizität, bedingt durch einen verminderten natürlichen Zugewinn an dendritischen Spines während der kritischen Phase der Nervenzellreifung, gekennzeichnet. Dieses Spinedefizit blieb in ausgereiften und integrierten Körnerzellen bestehen. Funktionell waren die unvollständig gereiften Körnerzelldendriten durch eine signifikant verminderte elektrische Kapazität und eine gesteigerte intrinsische Erregbarkeit und Reaktionsfreudigkeit auf depolarisierende Eingangssignale gekennzeichnet, während der Spineverlust mit einer verminderten Frequenz von erregenden postsynaptischen Miniaturströmen (mEPSCs) korrelierte. Die in dieser Arbeit beschriebenen, durch A30P α-SYN vermittelten, Veränderungen der adult-geborenen Neurone wirken sich folglich störend auf die Verarbeitung von olfaktorischen Inputs aus, und könnten deshalb von pathophysiologischer Relevanz für das Verständnis von Riechstörungen in frühen Stadien des Morbus Parkinson sein. Um diesen Veränderungen therapeutisch entgegenzuwirken, wurde den transgenen Mäusen über mehrere Monate eine Substanz mit anti-aggregativen Eigenschaften verabreicht. Diese zeigte keinen therapeutischen Effekt auf das Überleben und die Spinedichte von adult-geborenen Neuronen in A30P α-SYN Mäusen. Insgesamt liefert diese Arbeit neue, fundamentale Einblicke in die A30P α-SYN-abhängige Regulation der strukturellen Plastizität als ein pathophysiologisches Korrelat für Morbus Parkinson.

Ziel: 1)Etablierung einer immortalisierten hMSC-Zelllinie durch lentivirale hTERT-Transduktion. 2)Untersuchung der biologischen Effekt einer lentiviralen Transduktion von hTERT auf hMSCs. 3)Aufklärung des Transformationspotenyials von hTERT-transduzierten hMSCs. Material und Methoden: hMSCs wurden mit Lentiviren, die hTERT enthieten, transduziert. Konale hMSCs-hTERT wurden durch Isolation einzelner Zellen gewonnen. Die Expression von hTERT wurde mittels RT-PCR bestätigt. Die Zellproliferation wurde durch morphologische Beobachtung und Berechnung der “population doubling level”(PDL) und “population doubling time”(PDT) überwacht. Die Verhinderung der Seneszenz durch hTERT-Transduktion wurde durch Seneszenz-assoziierte β-gal-Färbung bestätigt. Dabei dienten nicht-transduziert hMSCs als Kontrollen. Der Stammzellcharakter von hMSC-hTERT wurde durch adipogene, chondrogene und osteogene Differenzierung überprüft. Zur Untersuchung der potenziellen tumorösen Transformation von lentiviral transduzierten hMSCs wurden Karyotypisierung und FISH-Analyse durchgeführt. Des Weiteren wurde der zeitliche Verlauf der Tumorsuppressor-Gene-Expression von RB1,TP53 und p21 untersucht, ein in vitro Softagar-Assay und in vivo Nacktmäusen Klonale und heterogene hMSCs-hTERT implantiert. Ergebnisse: hTERT wurde erfolgreich in hMSCs transduziert und “single-cell-picking”-Klone(SCP) konnten etabliert werden. In der RT-PCR wurde die hTERT-Expression bestätigt. Nicht-transduzierte hMSCs zeigten keine hTERT-Expression. Sowohl klonale, als auch heterogene hTERT-transduzierte hMSCs konnten über mehr als 500 Tage Kultiviert werden, während nicht-transduzierte hMSCs nach weniger als 250 Tagen seneszent wurden. Drei Phasen des Wachstums mit unterschiedlichen PDL und PDT konnten in hMSCs-hTERT beobachtet werden. Die Zellmorphologie der hMSCs-hTERT veränderte sich von einem gemischten Phänotyp in der “initialen Phase”(PDT 2,3 bis 5,5, PDL 20,7 bis 27,1) zu einem vermehrten Auftreten von flachen Zellen in der “Plateau-Phase” (PDT 9,2 bis 22,1, PDL 30,6 bis 48,2). Dies war ganz im zeitlichen Einklang mit dem Alterungsprozess von nicht transduzierten hMSCs. In der letzten und andauernden Phase zeigte sich eine hohe Anzahl von schnell wachsenden, kleinen und spindelförmigen Zellen (PDT von 2,1 bis 6,1, PDL 53,7 bis 105,6), welche aus einem Selbstselecktionierungsprozess in einer kontinuierlichen in-vitro Kultur hervorgegangen waren. Die erhaltene Differenzieungs-Kapazität der hTERT-transduzierten hMSCs wurde sowohl für klonale als auch heterogene hMSCs-hTERT durch eine positive Adipogenese-spezifische Oil-red-O-Färbung, Chondrogenese-spezifische Toluidinblau-Färbung und Osteogenese-spezifische von-Kossa-Färbung bestätigt. Zur Untersuchung einer potentiellen malignen Transformation der hMSCs-hTERT wurde eine Karyotyp-Analyse durchgeführt, die keine Auffälligkeiten zeigte. Darüber hinaus konnte eine unveränderte RB1, TP53 und p21 Tumorsuppressor-Gen-Expression nachgewiesen werden. Als Hinweis auf eine erhaltene Kontaktinhibition zeigten sich im Softagar-Assay keine Kolonien. Nach subkutaner Implantation der Zellen im Nacktmaus-Modell zeigte sich histologisch in vivo keine Tumorformation. Fazit: Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass eine lentivirale Transduktion von hMSCs mit hTERT eine effiziente und relative sichere Methode zur Erzeugung immortalisierter hMSCs ist. Obwohl es notwedig ist die Differenzierungskapazität und onkogene Potenzial für einen noch längeren Zeitraum zu untersuchen, konnte nach mehr als 500 tage in Zellkultur nachgewiesen werden, dass klonal expandierte lentivital hTERT-transduzierte hMSCs eine viel versprechende Zelllinie für die Forschung, aber möglicherweise auch für therapeutische Anwendungen zum Beispiel im Bereich “Tissue engineering” sein könnte.

Thu, 12 Nov 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10823/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10823/1/Schulz_Alexandra.pdf Schulz, Alexandra ddc:610, ddc:600, Medizinische F

Die adoptive T-Zelltherapie ist eine attraktive Alternative zu konventionellen Therapien zur Behandlung von malignen Erkrankungen. So konnten bereits Tumorremissionen bei Melanompatienten nach adoptivem T-Zelltransfer erreicht werden (Dudley et al, 2002b; Morgan et al, 2006). Während im autologen System jedoch oft nur unzureichende Antitumorantworten zu generieren sind, zeigt der Erfolg der allogenen Stammzelltransplantation, dass im allogenen System T-Zellen hoch effektiv Tumorzellen bekämpfen können. Die allogene Stammzelltransplantation konnte auch bei B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen, wie beispielsweise der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL), mit Hilfe eines Transplantat-gegen-Leukämie-Effektes (Graft-versus-Leukemia, GvL) lang andauerndes, krankheitsfreies Überleben bewirken. Sie birgt aber ein sehr hohes Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko auf Grund der Transplantat-gegen-Wirts-Erkrankung (Graft-versus-Host-Disease, GvHD) in sich. Die im Transplantat enthaltenen T Zellen sind hierbei sowohl für den erwünschten GvL-Effekt verantwortlich, gleichzeitig aber auch für die unerwünschte GvHD (Horowitz et al, 1990; Kolb et al, 2004). Zur Minimierung des Risikos einer GvHD könnten T Zellen eingesetzt werden, die spezifisch und allorestringiert Peptide von tumorspezifischen Antigenen erkennen und somit bevorzugt Tumorzellen angreifen. Die Reaktivität der T Zellen kann durch einen T Zellrezeptor (TZR)-Transfer auf sekundäre Zellen übertragen werden. Diese transgenen Zellen können dann mittels adoptivem T Zelltransfer im Patienten zur selektiven Bekämpfung von Tumorzellen zum Einsatz kommen. In Vorarbeiten wurde FMNL1 (formin related protein in leukocytes 1) als hoch attraktives tumorassoziiertes Antigen identifiziert, das in der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) und in anderen Lymphomen, sowie in Zelllinien solider Tumoren stark überexprimiert wird, während es in gesunden Zellen fast ausschließlich in hämatopoetischen Zellen vorkommt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, allorestringierte FMNL1-peptidspezifische T-Zellen zu isolieren, zu charakterisieren und den T-Zellrezeptor dieser T-Zellen in sekundäre Zellen zu transduzieren. Hierzu wurden Peptide des tumorassoziierten Antigens FMNL1 mit Hilfe von Prädiktionsalgorithmen vorhergesagt und in T Zell-Stimulationsansätzen eingesetzt. Unter Einsatz von HLA-A2-positiven T2-Zellen als antigenpräsentierende Zellen, die mit dem prädizierten synthetischen Peptid FMNL1-PP2 beladen waren, ist es gelungen allorestringierte, FMNL1-PP2-spezifische T Zellen eines gesunden HLA-A2-negativen Spenders zu isolieren. Von 67 T-Zellklonen bzw. oligoklonalen T-Zellen konnte bei neun T-Zellklonen Allorestriktion und FMNL1-PP2-Peptidspezifität nachgewiesen werden. Der T-Zellklon SK22 war für diese neun T-Zellklone, die auf Sequenzebene einen identischen T-Zellrezeptor aufwiesen, repräsentativ. Der T-Zellklon SK22 zeigte in Reaktion auf peptidbeladene T2-Zellen eine hohe Peptidspezifität für FMNL1-PP2 im Kontext mit dem für SK22 allogenen HLA-A2. Nach Zielzellerkennung sezernierte der T-Zellklon Zytokine wie IFNγ, TNFα, GM-CSF und teilweise IL2. Der T Zellklon zeigte eine hohe Aktivität und mittlere Avidität gegen FMNL1 PP2-beladene T2-Zellen. Des Weiteren wurde die Reaktivität gegen unbeladene native Zellen getestet. Der T-Zellklon SK22 erkannte verschiedene Zellen, wenn sie HLA-A2-positiv waren und gleichzeitig FMNL1 exprimierten. Hierzu zählten zum einen maligne Zellen, darunter verschiedene Epstein-Barr-Virus (EBV)-positive und EBV-negative Lymphomzelllinien und die Nierenzellkarzinomzelllinie RCC26, die gut erkannt wurden sowie CD40-aktivierte CLL-Zellen, die schwächer erkannt wurden. Bei der Untersuchung von gesundem Gewebe wurden FMNL1-exprimierende HLA-A2-positive periphere Blutleukozyten (PBL) schwach und B-Zellen in mittlerer Stärke erkannt. HLA-A2-positive Zellen, die FMNL1 nicht exprimieren, wie beispielsweise Lungenfibroblasten, wurden vom T-Zellklon SK22 nicht erkannt. Der T Zellklon zeigte Kreuzreaktivität gegen neun verschiedene lymphoblastoide Zelllinien (LCL), die Allelvarianten von HLA-A2 exprimierten. Zusätzlich wurden 4 von 18 HLA-A2-negativen LCL-Zelllinien erkannt. Jeweils zwei dieser vom T Zellklon SK22 erkannten HLA-A2-negativen LCL-Zelllinien trugen ein gemeinsames MHC-Klasse-I-Molekül. Eines davon war HLA-A*3303, welches durch die Erkennung der HLA-A*3303-positiven Transfektante der C1R-Zelllinie bestätigt werden konnte. Das andere war HLA-A*6802, welches zur HLA-A2-Superfamilie gehört. Der T-Zellrezeptor des T-Zellklons SK22 wurde identifiziert, sequenziert und kloniert, sowie mit Hilfe von Retroviren in sekundäre Zellen eingebracht. Durch den Transfer des T Zellrezeptors von SK22 in sekundäre Zellen konnte nachgewiesen werden, dass dieser T Zellrezeptor für die spezifische Reaktivität des T-Zellklons SK22 verantwortlich war. Dies zeigte sich in der T-Zellrezeptor-Oberflächenexpression nach Transduktion in Jurkat76-CD8α-Zellen und in der Übertragung der Funktionalität des T-Zellklons in PBL. Der T Zellrezeptor von SK22 ist ein „schwacher“ Rezeptor, da er in der Konkurrenzsituation mit einem weiteren Rezeptor nur in geringem Grade an der Zelloberfläche von PBL exprimiert wurde. Durch einen Austausch der jeweiligen konstanten Regionen der T-Zellrezeptor-SK22-Sequenzen durch die konstanten Bereiche eines murinen T-Zellrezeptors konnten in der Summe verbesserte Expressionswerte in Jurkat76-Zellen und eine verbesserte Funktionalität in PBL erreicht werden. Der T-Zellklon SK22 zeigte Allorestriktion, FMNL1-PP2-Peptidspezifität und Zytotoxizität gegen FMNL1-exprimierende Zellen, insbesondere gegen Tumorzellen. Die beobachtete Kreuzreaktivität ist Fokus weiterführender Untersuchungen. Im Fall des T-Zellrezeptors von SK22 bedeutet es, dass Spender und Patienten sorgfältig nach Analyse des gesamten MHC-Klasse-I-Expressionsmuster ausgewählt werden müssen. Im Rahmen einer haploidentischen Stammzelltransplantation ist jedoch der klinische Einsatz dieses spezifischen T-Zellrezeptors zur Behandlung von B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen und anderen FMNL1-überexprimierenden Tumorerkrankungen vielversprechend.

Hintergrund Humane mesenchymale Stammzellen sind ein viel versprechendes Ziel für die ex vivo Gentherapie, und Lentiviren sind exzellente Vehikel für den Gentransfer in hMSCs, da sie hohe Transduktionsfrequenzen mit langfristiger Genexpression erreichen. Dennoch könnte die Seneszenz von hMSCs die therapeutische Anwendung, infolge von zeitaufwendiger Zellselektion und Virus Titration, limitieren. Diese Arbeit beschreibt optimierte Protokolle für hoch effizienten ex vivo lentiviralen Gentransfer in hMSCs und eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu bestimmen. Methoden EGFP wurde als Markergen/-protein verwendet, um verschiedene lentivirale Expressionsvektoren herzustellen. Die Produktion von Lentiviren wurde mit verschiedenen Verpackungssystemen getestet. Der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde durch Polybrene und Blasticidinselektion erhöht. hMSCs von verschiedenen Spendern wurden mittels PCR und Western Blot analysiert. Regulierte Genexpression wurde durch Herstellung eines Tet-On selbstregulierten Expressionsvektors erreicht. Mit einem p24 ELISA-Test wurden übrig gebliebene virale Partikel im Zellkulturüberstand detektiert. Die Effizienz des lentiviralen Gentransfers wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet und mittels qRT-PCR und FACS-Analyse quantifiziert. Die lentiviralen Titer wurden mit qRT-PCR der exprimierten Transgene bestimmt. Die hMSC Differenzierung wurde histologisch untersucht. Ergebnisse Selbstinaktivierende lentivirale Vektoren der dritten Generation zeigten hoch effizienten Gentransfer in hMSCs bei der Verwendung von Polybrene. Die Blasticidinselektion hat den Prozentsatz der transgenen Zellen weiter erhöht unter Selektion von Zellen die mehrere Transgenkopien tragen. Die positiven Effekte von Polybrene und der Blasticidinselektion sind nicht von hMSCs eines speziellen Spenders abhängig. Präzise Regulation der Genexpression wurde durch Herstellung eines selbstregulierten Tet-On-Expressionssystems erreicht. Keine viralen Antigene wurden im Zellkulturüberstand nach aufeinander folgenden Medienwechseln detektiert, was auf die Abwesenheit von infektiösen Partikeln nach einigen Tagen hindeutet. In dieser Arbeit wurde ein starker linearer Zusammenhang zwischen der Virusverdünnung und der Stärke der Transgenexpression mittels qPCR Analysen beobachtet, wodurch die Virustitration durch Quantifizierung der Transgenexpression ermöglicht wird. Abschließend wurde durch Differenzierung in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung gezeigt, dass transduzierte hMSCs ihren Stammzellcharakter beibehalten haben und dass die Transgenexpression durch die Differenzierung nicht beeinflusst wurde. Schlussfolgerungen Die Quantifizierung der Transgen-Kopienanzahl durch qRT-PCR ist eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer nach dem ex vivo Gentransfer in hMSCs zu bestimmen. Die in dieser Arbeit optimierte und charakterisierte Methode für die effiziente lentivirale Transduktion von humanen mesenchymalen Stammzellen, in Verbindung mit regulierbarer Transgenexpression, ist ein sicheres, verlässliches und leistungsstarkes Verfahren und bildet eine aussichtsreiche Grundlage für zukünftige Gentherapie und Tissue Engineering Anwendungen in hMSCs.

Jasmonate sind Phytohormone mit vielfältiger Wirkung in Entwicklung und Stressmanagement der Pflanzen. Über die Perzeption und Transduktion der Jasmonatsignale ist bisher kaum etwas bekannt. Unter Verwendung des synthetischen Jasmonat-Analogons 6-Azido-1-oxoindanoyl(14C)isoleucinmethylester (IndAz(14C)IleMe) als Radioligand wurde eine spezifische Bindestelle in Sojabohne (Glycine max) biochemisch charakterisiert, in der Erwartung, eine Bindestelle für Jasmonate zu beschreiben. Die IndAz(14C)IleMe-Bindung erwies sich als spezifisch, saturierbar und reversibel. Da es sich aber um eine niedrigaffine Bindestelle handelt und die Affinität verschiedener Jasmonate und synthetischer Indanoyl-Isoleucin-Konjugate nicht mit deren biologischer Aktivität in Sojabohne korreliert, dürfte es sich bei der IndAz(14C)IleMe-Bindestelle nicht um einen Jasmonatrezeptor handeln. Sowohl bei Jasmonaten als auch bei Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten wurden Methylester gegenüber den entsprechenden freien Säuren bevorzugt gebunden. Ein Enzym, das den Liganden umsetzt, scheint nicht vorzuliegen, da die IndAz(14C)IleMe-Bindung kein pH-Optimum aufwies und keine Umsetzung des Liganden beobachtet wurde. Mit fortschreitendem Alter der Pflanze nahm die Bindungsaktivität zu. Die IndAz(14C)IleMe-Bindestelle kommt in verschiedenen höheren Pflanzenarten vor, war hauptsächlich in der Wurzel nachweisbar und wurde in der Zellwand lokalisiert. Da die Bindestelle weder mit Salzen noch mit Detergenzien extrahiert werden konnte, gegenüber Proteinase K, DTT, Periodat, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Pectinase und Pectolyase resistent und zu 50 % hitzestabil war, wird vermutet, dass ein in der Zellwand fest verankertes Protein vorliegt. Zu den intrazellulären Signalvermittlern von Pflanzen gehört Calcium, nicht nur im Cytosol, sondern auch im Zellkern. In transgenen Nicotiana tabacum BY-2-Zellen wurden mit Hilfe des Photoproteins Aequorin erstmals jasmonatinduzierte Änderungen der Calciumkonzentration in beiden Kompartimenten gezeigt. Auch ein Vertreter aus der Gruppe der Phytoprostane, Phytoprostan B1 Typ II, löste Calciumantworten in Cytosol und Zellkern aus. JA und OPDA induzierten unterschiedliche Calciumsignaturen, die sich jeweils aus einer cytosolischen Calciumantwort gefolgt von einem Calciumsignal im Zellkern zusammensetzten. Die Unterschiede in Form, Höhe und Kinetik der einzelnen Antworten lassen auf zwei verschiedene Signaltransduktionswege bei JA und OPDA schließen. MeJA war in beiden Kompartimenten inaktiv und demonstriert dadurch, dass MeJA nicht immer, wie häufig angenommen wird, wie JA wirkt. Durch das Isoleucin-Konjugat der JA (JA-Ile) wurde eine dritte Calciumsignatur ausgelöst, die sich von der JA-induzierten Calciumsignatur durch das Fehlen der JA-ähnlichen cytosolischen Calciumantwort unterscheidet. Dieser Befund lässt vermuten, dass die Unterscheidung von JA- und JA-Ile-Signalen möglicherweise auf Ebene des Calciums stattfindet. Eine Struktur-Aktivitätsanalyse mit Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten bestätigte, dass die Konjugation mit Isoleucin zur Veränderung der Calciumsignatur führt. Die unkonjugierte 1-Oxoindan-4-carbonsäure (Ind) verhielt sich wie JA, das Konjugat Ind-Ile wie JA-Ile. Ferner wurde gezeigt, dass für die Induktion der Calciumantworten eine freie, negativ geladene Carboxylgruppe unerlässlich ist. Neben MeJA erwiesen sich JA-IleMe, Ind-IleMe und 3-(Nitro-methyl)-2-((Z)-pent-2-enyl)cyclopentanon als inaktiv. 6-substituierte Indanoyl-Isoleucin-Konjugate zeichnen sich durch verstärkte biologische Aktivität aus. Tatsächlich verlieh der Ethyl-Substituent dem IndEt-IleMe calciuminduzierende Aktivität im Zellkern. Bei den freien Säuren Ind-Ile und IndEt-Ile wurde aber keine Aktivitätssteigerung durch Substitution festgestellt. Die Untersuchung der Expression einiger JA-responsiver Gene zeigte, dass unter den Versuchsbedingungen, die die Induktion von Calciumantworten ermöglichten, keine jasmonatinduzierte Genexpression erfolgte. Sollten die beschriebenen Calciumsignale die Expression bestimmter Gene vermitteln, ist eine ausgewählte Gruppe von Genen zu erwarten, deren Expression eventuell einen besonderen physiologischen Zustand der Zellen erfordert.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

Die ersten transgenen Tiere wurden durch viralen Gentransfer erzeugt. Für die initialen Versuche wurden prototypische Retroviren, wie der murine Leukämievirus (MuLV), verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, daß die proviralen Gene in diesen Mäusen stark methyliert waren und nicht oder nur in geringen Mengen exprimiert wurden ("gene silencing"). Ein Durchbruch für die virale Transgenese kam erst mit der Verwendung lentiviraler Vektoren. Lentiviren sind in der Lage eine Vielzahl verschiedener Zelllinien (auch terminal differenzierte Zellen) effizient zu transduzieren und ihre virale DNA stabil in das Wirts-Chromosom zu integrieren. Obwohl bereits transgene Nagetiere durch lentivirale Vektoren erzeugt werden konnten, waren initiale Versuche in höheren Säugetieren (Affen) nicht erfolgreich. Dies warf die Frage auf, ob lentiviraler Gentransfer in höheren Säugetieren anwendbar ist. Transgene Schweine und Rinder wären von großer biomedizinischer Bedeutung. Ihre potentiellen Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine über klinische Modelle zur Untersuchung humaner Erkrankungen bis hin zur Xenotransplantation. Obwohl mit der klassischen DNA-Mikroinjektion transgene Schweine und Rinder erzeugt werden können, ist das Verfahren in diesen Spezies jedoch sehr ineffizient und dementsprechend kostenintensiv. Da hohe Produktionskosten den möglichen Anwendungen entgegenstehen, wurde versucht ein effizientes Verfahren, daß auf lentiviralem Gentransfer beruht, zu entwickeln. Für die Entwicklung der lentiviralen Transgenese in Schweinen wurden Zygoten mit Lentiviren infiziert und in Empfänger transferiert. Die verwendeten Vektoren trugen einen eGFP-Reporter, um die Effizienz der Transduktion schnell und einfach beurteilen zu können. Von den 46 geborenen Ferkeln waren 32 transgen und 30 zeigten Transgen-Expression (65%). Die hohe Transgenese-Rate, die mit dem lentiviralen Gentransfer erreicht werden konnte, stellt eine 27fache Steigerung der Effizienz im Vergleich zur klassischen DNA-Mikroinjektion dar. Die Untersuchung der transgenen Ferkel zeigte Transgen-Expression in allen Organe und keinen sichtbaren Mosaicismus der F0-Tiere. Des weiteren konnte eine nahezu lineare Korrelation zwischen der Anzahl der integrierten Proviren und der Höhe der Transgen-Expression gezeigt werden. Die Expression der lentiviralen Transgene war stabil und wurde nicht nach der Geburt der Tiere abgeschaltet. Durch die Wahl geeigneter Promotoren war es möglich sowohl ubiquitäre, als auch Gewebe-spezifische Expression (in der Haut) zu erreichen. Die integrierten Proviren wurden über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben und in der F1-Generation unverändert stark exprimiert. Die Weitergabe der integrierten Proviren an die nächste Generation ist die Basis für Erzeugung transgener Linien. Zur Erzeugung transgener Rinder wurden initial ebenfalls Zygoten infiziert. Diese wurden in vitro bis zum Blastozysten-Stadium (Tag 7) kultiviert. Überraschenderweise zeigten die Blastozysten nur sehr geringe Transgen-Expression. Nachdem durch Transfer solcher Blastozysten keine transgenen Nachkommen erzeugt werden konnten, wurde zur Infektion von Oozyten (vor der Befruchtung) gewechselt. In den aus Oozyten-Infektion stammenden Blastozysten war die Gentransfer-Rate wesentlich höher (insgesamt 83% eGFP+ Blastozysten) und die eGFP-Fluoreszenz um ein Vielfaches intensiver. Acht eGFP-positive Blastozysten wurden in vier Empfänger transferiert, was zur Geburt von vier transgenen Rindern führte. Alle erzeugten transgenen Rinder zeigten stabile Expression des Transgens in allen untersuchten Organen. Als eine weitere Methode zur Erzeugung lentiviral transgener Rinder wurde der Kerntransfer (NT) untersucht. Hierzu wurden Haut-Fibroblasten vom Rind lentiviral transduziert und als Donor-Zellen verwendet. Dieser Ansatz war zwar wesentlich ineffizienter als die direkte Infektion von Oozyten, trotzdem konnte ein transgenes Rind erzeugt werden, das starke Transgen-Expression zeigte. Da die Expression lentiviraler Integranten offenbar durch das klassische Klonen nicht abgeschaltet wird, eröffnet diese Methode viele Möglichkeiten für die Produktion transgener Tiere. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die epigenetische Regulation lentiviraler Vektoren untersucht. Dazu wurden transgene Founder-Schweine verpaart, um Tiere mit einzelnen lentiviralen Integranten (F1-Generation) zu erzeugen. Die Expressions-Analyse dieser Schweine zeigte, daß etwa 1/3 der Proviren nur schwach bzw. gar nicht exprimierten. Durch Southern Blot Analysen mit Methylierungs-sensitiven Restriktions-Enzymen wurde der Grad der proviralen Methylierung bestimmt. Dieser korrelierte negativ mit der Transgen-Expression. Zur genaueren Analyse der Methylierungs-Dichte wurden die verschiedenen Proviren mittels Bisulfit-Sequenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, daß in den schwach bzw. nicht-exprimierenden Integranten nahezu alle CpG-Dinukleotide innerhalb der untersuchten Sequenzen methyliert waren. Um den Einfluß der Methylierung auf die Expression zu untersuchen, wurde von einem nicht-exprimierenden Schwein Haut-Fibroblasten isoliert und mit dem Methylase-Inhibitor 5-AzaC inkubiert. Dadurch konnte die abgeschaltete eGFP-Expression wieder reaktiviert werden. Dagegen hatte der Histon-Deacetylase Inhibitor TSA keinen starken Einfluß auf die Transgen-Expression. Chromatin-Modifikationen durch TSA-abhängige HDACs scheinen also bei der epigenetischen Regulation lentiviraler Vektoren in Schweinen keine entscheidende Rolle zu spielen. Abschließend konnte durch einen Methylierungs-sensitiven Southern Blot gezeigt werden, daß der Grad der DNA-Methylierung durch Hemmung zellulärer Methylasen (mit 5-AzaC) signifikant reduziert wurde. Lentiviraler Gentransfer stellte sich als eine sehr effiziente Methode zur Erzeugung transgener Schweine und Rinder heraus. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch hohe Transgenese-Raten und hohe Transgen-Expression aus. Außerdem werden die lentiviralen Integranten über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben. Obwohl die Transkription einiger Proviren epigenetisch reguliert wurde, ist die Häufigkeit des aufgetretenen Silencings deutlich geringer als bei prototypischen Retroviren.

Knorpeldefekte lassen sich nicht zufriedenstellend therapieren, da bis heute ein kontrollierter regenerativer Gewebeaufbau unmöglich war. Eine neue Strategie wäre eine Kombination von Chondrozytentransplantation mit gentherapeutischen Methoden, z. B. die stabile Ex-vivo-Transduktion von primären Chondrozyten mit retroviralen Vektoren, die gewebeaufbauende Zytokine exprimieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb Etablierung und Optimierung des retoviralen Gentransfers in primäre Kaninchenchondrozyten und die Beobachtung von Verbleib, Vitalität und Genexpression der Zelltransplantate in vivo. Transduzierte Zellen sollten ohne weitere Selektionsverfahren für eine spätere Transplantation verwendet werden können. Da regulierbare Genexpression in einem solchen Modell von Vorteil ist, war ein weiteres Ziel die Entwicklung retroviraler Tet-On-Vektoren. Es wurden konstitutiv exprimierende retrovirale Vektoren und Tet-On-Vektoren kloniert und Retroviren mit unterschiedlichen Infektionsspektren generiert. Effizienz und Stabilität des Gentransfers wurden ohne weitere Selektionsverfahren mit Hilfe konstitutiv nlslacZ-exprimierender retroviraler Vektoren in vitro und in vivo beurteilt. Zusätzlich wurde stellvertretend für ein therapeutisches Gen der Wachstumsfaktor hbmp-2 transferiert. Retrovirale Ein-Vektor-Systeme, die den reversen Transaktivator rtTA2s-M2 und den Tet-responsive Promotor enthielten, wurden in vitro durch die Expression der Reportergene nlslacZ oder egfp in verschiedenen Zelllinien getestet. Mit VSV.G-pseudotypisierten Retroviren konnte eine Transduktionseffizienz von bis zu 99 % erzielt werden, amphotrope Viren waren deutlich weniger effizient. Transduzierte Chondrozyten zeigten in vitro über mindestens 12 Wochen eine stabile Transgenexpression, die auch in 3D-Kultur auf Kollagenschwämmen fortbestand. In vivo war für mindestens drei Wochen Transgenexpression nachweisbar. hbmp-2 transduzierte Zellen exprimierten zudem dieses Transgen in vitro. Die neu entwickelten Tetrazyklin-induzierbaren Retroviren zeigten eine starke Basalexpression bei nur geringer Steigerung nach Induktion mit Doxyzyklin. Die Transduktionseffizienz dieser Retroviren war wesentlich geringer als bei der Verwendung konstitutiv exprimierender Vektoren. VSV.G-pseudotypisierte Retroviren sind eine optimale Methode für den retroviralen Gentransfer in primäre Kaninchenchondrozyten ohne weitere Selektionsverfahren. Neben dem Transfer von Markergenen ist dies die Grundlage für den Transfer von therapeutischen Genen, um deren Effekt in vitro und in vivo zu untersuchen. Zudem wurde ein neuartiger universal einsetzbarer Vektor entwickelt, der die Klonierung in die retroviralen U3 Region und somit die Konstruktion retroviraler Double-copy-Vektoren erlaubt. Die Entwicklung zuverlässiger retroviraler Tet-On-Vektoren bleibt weiterhin eine Herausforderung für die Zukunft.

Neue Therapieansätze zur Krebsbehandlung aus dem Bereich der Gen- und Immuntherapie haben als Ergänzung zu den konventionellen Behandlungsmethoden besondere Bedeutung erlangt. Zu ihnen zählen u.a. die Suizidgentherapie und die Verwendung Zytokin-Gen-modifizierter Tumorzellvakzine. Beide Strategien wurden in der vorliegenden Arbeit herangezogen, um eine Immunantwort gegen das murine B-Zell-Lymphom A20 zu erzeugen. 1. Versuche mit HSV-tk-Gen-transduzierten Lymphomzellen. Das Prinzip der Suizidgentherapie mit dem HSV-tk/GCV-System beruht auf der Transduktion des HSV-tk-Gens in Tumorzellen, die dadurch gezielt durch GCV abgetötet werden können. Dabei werden auch nicht-transduzierte, angrenzende Zellen miterfasst („Bystander“-Effekt). Ganciclovirsensible, HSV-tk-Gen-transduzierte A20-Zellen (A20-TK) zeigten in vitro einen eingeschränkten „Bystander“-Effekt. In vivo konnten A20-TK-Zellen nur bei jeder dritten Maus vollständig durch GCV eliminiert werden, wobei sich jedoch bei der Hälfte der überlebenden Tiere eine dauerhafte, systemische Antitumorantwort induzieren ließ. 2. Versuche mit HSV-tk-Gen-transduzierten Triomzellen. Die Triomzelle BiV, hervorgegangen aus der Fusion des Lymphoms A20 mit der Hybridomzellinie 2.4G2, dirigiert Tumorantigene über die Expression eines anti-Fc-Rezeptor-Antikörpers an APC und führt auf diese Weise zur Tumorabstoßung. Trotz Xenogenität sind BiV-Zellen jedoch bis zu 11 Wochen nach Immunisierung in vivo nachweisbar. Auch HSV-tk-Gen-transduzierte BiV-Zellen (BiV-TK) konnten trotz GCV-Verabreichung vier Wochen post iniectionem in den Milzen immunisierter Mäuse nachgewiesen werden, allerdings in niedriger Frequenz. Obwohl nicht alle BiV-TK-Zellen durch GCV in vivo eliminiert werden, hatte eine frühzeitige Rückholung der Zellen einen verminderten Antitumoreffekt zur Folge. Im Gegensatz dazu beeinflusste eine späte GCV-Gabe die Tumorabstoßung nicht. Dies deutet darauf hin, dass für einen potenten Tumorschutz die langdauernde Verfügbarkeit von Vakzinezellen im Sinne einer persistierenden Antigenquelle erforderlich sein könnte. 3. Versuche mit GM-CSF-Gen-transfizierten Triomzellen. GM-CSF-Gen-transfizierte Triomzellen (BiV-BNG) schützten in Präimmunisierungsversuchen effektiver vor Tumorwachstum als Wildtyp-BiV-Zellen, bei therapeutischer Applikation wurde der Antitumoreffekt jedoch überaschenderweise aufgehoben. Durch Blockierung der Triomzell-vermittelten Tumorantigen-Heranführung an APC durch BiVneg-BNG bzw. den Antikörper 2.4G2 konnte die ursprüngliche Antitumorantwort vollständig bzw. teilweise wiederhergestellt werden. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre eine hemmende Interaktion zwischen intaktem BiV-Protein und GM-CSF, resultierend in einer Hemmung der APC. Offenbar beschränkt sich die Hemmung nur auf die betroffene APC, denn BiV-BNG hob den Therapieeffekt von A20-BNG bzw. BiV bei simultaner Applikation nicht auf. Die Applikationsroute als mögliche Ursache der Wirkungslosigkeit von BiV-BNG im Therapieansatz wurde durch Änderung des Präimmunisierungsprotokolls ausgeschlossen. Da IL-4-defiziente Mäuse bei therapeutischer BiV-BNG-Gabe eine bessere Überlebensrate erreichten als Wildtypmäuse, könnte der aufgehobene Therapieeffekt von BiV-BNG mit einer Verschiebung des Th1/Th2-Verhältnisses zu Gunsten einer Th2-Antwort zusammenhängen.

Die Rolle der Transduktion beim horizontalen Gentransfer ist bislang wenig untersucht. Die Bedeutung, die diesem Mechanismus beim Austausch von genetischem Material in der Natur zukommt, kann nur geklärt werden, wenn möglichst umfassende Informationen über das Vorkommen von transduzierenden Bakteriophagen verfügbar sind. Zur Erforschung des Ausmaßes des phagenvermittelten Gentransfers war es notwendig, Methoden zu entwickeln, die nicht auf die Verfügbarkeit kultivierbarer Indikatorbakterien zum Nachweis von Phagen sowie Spender- und Empfängerstämme zum Nachweis der Transduktion angewiesen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur indikatorunabhängigen Identifizierung transduzierender Bakteriophagen entwickelt. In Phagenpartikel verpackte DNA wurde als Template für die PCR-Amplifikation von bakterieller 16S rDNA eingesetzt. Dabei wurden PCR-Primer verwendet, die eine Amplifikation der 16S rRNA-Gene der meisten Eubakteria ermöglichen. Die Sequenzierung der klonierten Amplifikationsprodukte ermöglichte die retrospektive Identifizierung der Wirtsbakterien. Zur Etablierung dieser Methode wurde der generell transduzierende Salmonella-Phage P22 eingesetzt. Erste Anwendungen auf verschiedene Umweltproben zeigten, daß dieser Ansatz den Nachweis generell transduzierender Bakteriophagen ohne Isolierung und Kultivierung der Wirtszellen ermöglicht. Daher ist es auch möglich, Phagen, die am Gentransfer beteiligt sind, ohne Selektion durch die derzeit kultivierbaren Wirte zu detektieren. Schon in den ersten Testanwendungen konnten Phagen von 26 verschiedenen Gramnegativen Bakterienspezies nachgewiesen werden, bei denen bisher keine transduzierenden Viren bekannt waren. Die Untersuchung einer Moorquellwasserprobe brachte Informationen über Phagen mit bisher unbekannten Wirtszellen. Die hier vorgestellte Methode kann als Prototyp des indikatorunabhängigen Nachweises generell transduzierender Phagen für prinzipiell alle Bakterienarten gelten. Unter Einsatz verschiedener 16S rDNA-Primerpaare ist der Suche nach transduzierenden Partikeln in der Umwelt nahezu keine Grenze gesetzt. Dieser Ansatz erlaubt sowohl die Überprüfung einer Probe auf das Vorkommen transduzierender Phagen mit unterschiedlichen Wirtsspezifitäten als auch die gezielte Suche nach am DNA-Transfer beteiligten Phagen spezieller Vertreter der Prokaryonten. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der bisher unbekannten Salmonella-Phagen 7D, PS79 und A12. Es konnte gezeigt werden, daß diese nicht mit P22 sowie anderen prominenten Bakterienviren verwandt sind und daher drei neue Phagenfamilien repräsentieren. Mikrobiologische Untersuchungen erbrachten, daß es sich dabei um zwei temperente und einen virulenten generell transduzierenden Phagen handelt. Bezüglich ihrer morphologischen und Nukleinsäure-Merkmale zählen sie zur Familie der Caudovirales. Die Phagen wurden in Hinsicht auf ihr Wirtsspektrum sowie auf phagenvermittelte Schutzmechanismen lysogener Zellen untersucht. Im Rahmen der molekulargenetischen Analyse konnte die Größe der Phagengenome ermittelt werden und für 7D und PS79 konnten Restriktionskarten für acht bzw. sieben Enzyme erstellt werden. Der Phage A12 entzog sich, wahrscheinlich aufgrund ausgeprägter DNASekundärstrukturen, einer ausführlichen Restriktionskartierung, so daß diese auf ein Enzym beschränkt werden mußte. Untersuchungen PS79-lysogener Zellen weisen darauf hin, daß der Prophage als extrachromosomale Replikationseinheit vorliegt. Für den Phagen 7D wurde die Integration durch ortsspezifische Rekombination sowie der Integrationsort auf dem Chromosom von Salmonella nachgewiesen. Die Charakterisierung der Phagen 7D, PS79 und A12 erbrachte neue Informationen über die Vielfalt generell transduzierender Bakteriophagen bei Salmonella. Insgesamt zeigen die erzielten Ergebnisse deutlich, daß der horizontale Transfer genetischen Materials durch Transduktion, insbesondere im Hinblick auf die Sicherheitsforschung im Zusammenhang mit der Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen, nicht länger als vernachlässigbarer Faktor eingestuft werden kann.

Salmonellosen gehören weltweit zu den drei häufigsten registrierten, lebensmittelbedingten bakteriellen Darmerkrankungen. Dabei sind bestimmte S. enterica-Subspezies-I-Serovare an einen speziellen Wirt adaptiert, andere Serovare zeigen hingegen ein breites Wirtsspektrum. Der Krankheitsverlauf einer Salmonellose wird aber auch von der Spezies des infizierten Wir- tes bestimmt. Je nach infiziertem Wirt können beispielsweise milde bis akute Enterocolitis, aber auch schwere systemische Infektionen beobachtet werden. Um sich im Laufe ihrer Evolution optimal an ihre Wirte anzupassen, haben Salmonella spp. nach der Abspaltung vom kommensalen E. coli schrittweise neue Virulenzeigenschaften er- worben. Dies geschah vor allem über horizontalen Gentransfer (Ochman und Moran, 2001). Im ersten Schritt wurde die Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 (SPI1), später SPI2 erworben. Beide Inseln kodieren jeweils einen Typ-III-Translokationsapparat und dazu gehörende trans- lozierte Effektorproteine, welche die Wirtszellreaktionen zum Vorteil des Pathogens modulie- ren. Die Inseln sind zu unterschiedlichen Phasen der Salmonellosen aktiv. Das für die Wirts- zellinvasion verantwortliche Typ-III-Translokationssystem von SPI1 kann auch Effektoren in die Wirtszellen schleusen, die außerhalb der SPI1 kodiert sind. Der in SPI1 kodierte Translo- kationsapparat ist in Salmonella spp. hoch konserviert (Li et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der translozierten Effektorproteine bei der Evolu- tion von Salmonella spp. hin zu tierpathogenen Erregern untersucht. Es konnte gezeigt wer- den, daß die meisten SPI1-abhängig translozierten Effektoren (SipA, SipB, SipC, SptP, SopB, SopD und SopE2), ob innerhalb oder außerhalb von SPI1 kodiert, ebenfalls hoch konserviert vorliegen. Phylogenetische Analysen zeigten, daß diese konservierten Effektoren früh in der Salmonella-Entwicklung, nämlich zwischen 50 und 160 Millionen Jahren (im Zeitrahmen der SPI1-Aufnahme), akquiriert wurden. So handelt es sich hierbei um Faktoren mit einer basalen bzw. zentralen Virulenzfunktion, die Salmonella spp. von kommensalen Escherichia spp. unterscheiden. Es konnte gezeigt, daß die konservierten Effektorproteine SopE2 und SopB maßgeblich an der Wirtszellinvasion beteiligt sind (Mirold et al., 2001). Diese Invasion-vermittelnden Effek- toren sind weit entfernt von SPI1, in separaten chromosomalen Loci, kodiert. Diese Beobach- tung steht in gewissem Widerspruch zur klassischen Definition der Pathogenitätsinsel. Die invasionsrelevanten Effektoren SopB und SopE2 bilden zusammen mit dem SPI1- Translokationsapparat eine funktionelle Einheit (ein sogenanntes „Invasionsvirulon“), obwohl sie nicht -wie für Pathogenitätsinseln postuliert- auf demselben chromosomalen Element ko- diert sind. Zusammen mit den phylogenetischen Daten aus dieser Arbeit, deuten diese Ergeb- nisse daraufhin, daß der letzte gemeinsame Vorfahre aller heutigen Salmonella spp. bereits sämtliche für die Wirtszellinvasion benötigten Effektorproteine kodierte und daß die Modula- tion der Signaltransduktionswege in der Wirtszelle in S. bongori und in sämtlichen S. enteri- ca-Subspezies konserviert sind. Es wird vielmehr ein Translokationsmodul durch die SPI1 bereitgestellt, durch das sowohl konservierte als auch variabel vorkommende Effektorproteine in die Wirtszelle geschleust werden können. Es konnten jedoch auch Variationen festgestellt werden. Die beiden für die Effektorproteine SopE- und AvrA-kodierenden Gene sind variabel in der Salmonella-Population verteilt. AvrA ist am Rande der SPI1 kodiert und es wird vermutet, daß es nicht zum Kern der SPI1 gehört. Das variable SopE ist bei Zentisom 60 des Salmonella-Chromosoms, abgetrennt von SPI1 (Zentisom 63), kodiert. Das variable Effektorprotein SopE und wahrscheinlich auch AvrA tragen vermutlich als „Adaptationsproteine“ zur Feinmodulation der Wechselwirkung mit dem Wirt bei. Vermutlich existieren noch wesentlich mehr variable Effektorproteine, die zu dieser Feinanpassung beitragen. In dieser Arbeit wurde weiterhin der horizontale Transfer von sopE detailliert untersucht. SopE ist in Typhimurium auf SopEΦ, einem Bakteriophagen der P2-Familie, kodiert. SopE ist das erste Effektorproteingen, bei dem die horizontale Übertragung über den Mechanismus der lysogenen Konversion nachgewiesen werden konnte. Bisher war bei Salmonella spp. nur der Phagen-vermittelte horizontale Transfer durch Transduktion bekannt. Die spezifische Integra- tionsstelle von SopEΦ in das Salmonella-Chromosom wurde näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, daß SopEФ in der attL-Region eines bereits integrierten kryptischen Propha- gen (CP4-57) integriert ist, der seinerseits in ssrA, dem Gen für die kleine stabile tmRNS, integriert ist. Epidemiologische Untersuchungen wiesen zudem darauf hin, daß der Erwerb des sopE-Gens durch lysogene Konversion mit SopEФ einen selektiven Vorteil gegenüber sopE-negativen Typhimurium-Stämmen darstellen. SopE-tragende S. enterica-Subspezies-I-Serovar Typhi- murium-Stämme lösten in den siebziger und achtziger Jahren verstärkt Epidemien aus. Darü- berhinaus konnte gezeigt werden, daß SopEФ-Lysogene eine gesteigerte Virulenz aufweisen. Dies wurde sowohl in Zellkulturversuchen (diese Arbeit) als auch in Rinderinfektionsversu- chen (Zhang, zur Publikation eingereicht) experimentell nachgewiesen. Schließlich wurde in dieser Arbeit auf die Koevolution von Salmonella spp. und Virulenzfak- tor-tragenden Bakteriophagen untersucht. Es wurde festgestellt, daß die genetischen Mecha- nismen, welche den Modulaustausch zwischen Bakteriophagen vermitteln, auch dazu führen, die Flexibilität der Salmonella spp. bezüglich der Wirtsanpassung zu steigern. Dieser Mecha- nismus stellt möglicherweise für die Bakterien und damit auch für die assoziierten Bakteri- ophagen einen Selektionsvorteil dar. Es wurde beobachtet, daß der Virulenzfaktor SopE in einigen Serovaren der S. enterica-Subspezies-I nicht auf einem P2-ähnlichen sondern auf ei- nem lambdoiden Bakteriophagen kodiert ist. Es konnte demzufolge zum ersten Mal beobach- tet werden, daß ein Virulenz-vermittelndes Effektorproteingen in dem Genom zweier ver- schiedener Phagenfamilien kodiert ist und durch diese Phagen möglicherweise horizontal transferiert werden kann. Die ermittelten DNS-Sequenzen um sopE lassen vermuten, daß eine konservierte sopE-tragende Kassette (oder „Moron“) durch homologe Rekombination zwi- schen den zwei verschiedenen Bakteriophagenfamilien (P2- und lambdoid) transferiert wor- den ist. Diese Art des Transfers von Virulenzgen-Modulen zwischen verschiedenen Phagen- Familien erlaubt die flexible Neukombination von Phagen-kodierten Effektorproteinen. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß variabel vorkommende translozierte Effektorpro- teine die Pathogen-Wirt-Beziehung optimieren können. Neukombinationen dieser Effektoren können über horizontalen Transfer hergestellt werden und somit die optimale Anpassung an die jeweiligen Wirte gewährleisten. Dabei spielt der horizontale Transfer von Virulenzgenen über konvertierende Bakteriophagen eine wesentliche Rolle. Günstige Kombinationen von variablen Effektorproteinen sind wahrscheinlich entscheidend an der Entstehung neuer Epi- demiestämme beteiligt. Die effizienten horizontalen Transfermechanismen zwischen ver- schiedenen Salmonella spp. als auch zwischen verschiedenen Phagenfamilien tragen so dazu bei, daß Salmonella spp. ein äußerst breites Spektrum von Wirten infizieren können und daß neue Epidemieklone mit höherer Frequenz entstehen können.