Podcasts about zielmolek

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist aus genetischer Sicht eine sehr heterogene Erkrankung. Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) wie FLT3 sind in der Leukämogenese von zentraler Bedeutung. Durch Mutationen aktivierte RTKs sind allerdings alleine nicht in der Lage eine AML zu induzieren. Die Kooperation mit anderen Mutationen ist hierfür notwendig. Zu den am häufigsten gemeinsam auftretenden Mutationen in der AML gehören NPM1- und FLT3-ITD- (internal tandem duplication) Mutationen. Klinische Daten zeigen, dass eine FLT3-ITD die gute Prognose von NPM1-mutierten (NPM1c+) Patienten in Abhängigkeit des FLT3-ITD-mRNA-Levels in negativer Weise beeinflusst. Dies lässt auf ein pathogenes Zusammenwirken beider Genmutationen in der AML schließen, welches im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Dazu wurde basierend auf der humanen AML-Zelllinie OCI-AML3 mittels stabiler, lentiviraler Transduktion das erste zelluläre Modellsystem etabliert, das die relevanten Genotypen (NPM1c+/FLT3-ITD; NPM1c+/FLT3-WT) sowie unterschiedliche Verhältnisse von FLT3-ITD zu FLT3-WT (ITD/WT) im NPM1-mutierten Hintergrund modelliert. Zunächst wurde die NPM1-Mutation sowie die Funktionalität des FLT3-WT- und FLT3-ITD-Rezeptors in den nativen und transgenen Zellen bestätigt. Mit Hilfe des Zellmodells konnte gezeigt werden, dass Zellen, die beide Mutationen tragen, in vitro wie auch in vivo einen Wachstumsvorteil besitzen. Dieser vergrößerte sich zudem mit zunehmendem ITD/WT-Verhältnis. Ab einem bestimmten ITD/WT-Verhältnis konnte dieser Wachstumsvorteil in vitro mit einem FLT3-Inhibitor über eine gewisse Dauer gehemmt werden. Diese Ergebnisse könnten auf ein Zusammenwirken der beiden Mutationen bei der Leukämogenese hinweisen und eine Ursache für die schlechteren Überlebenskurven von Patienten mit beiden Mutationen und zunehmender FLT3-ITD-Last darstellen. Der insgesamt jedoch nur schwach ausgeprägte Phänotyp des etablierten Zellmodells erfordert zum eindeutigen Nachweis der funktionellen Interaktion von NPM1- und FLT3-ITD Mutationen ein alternatives Modellsystem. In diesem Zellmodell zeigten Zellen, die den FLT3-WT-Rezeptor überexprimierten, ebenfalls einen schwachen Wachstumsvorteil gegenüber nativen Zellen mit endogener FLT3-WT-Expression. Neben aktivierenden FLT3-Mutationen wie einer ITD, führen auch hohe FLT3-WT-Expressionslevel zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Kinase und verschlechtern die Prognose der Patienten. Deshalb wurde in dieser Arbeit mit der Untersuchung der transkriptionellen Regulation von FLT3, als mögliche Ursache hoher FLT3-WT-Expressionslevel, begonnen. In silico wurden im proximalen FLT3-Promotor Bindestellen für die hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren (TF) PAX5 und MYB identifiziert. Mit Hilfe des Dual-Luciferase® Reporter Assay Systems wurden PAX5 als schwacher Repressor und MYB als Aktivator des Flt3-Promotors bestätigt. Auch der Transkriptionsfaktor CEBPA verhielt sich auf gleiche Weise als Aktivator der Flt3-Promotoraktivität. Eine Punktmutation im CEBPA-Gen, die aus zwei AML-Fällen bekannt ist, führte zu einer erhöhten Flt3-Promotoraktivität. Die Identifizierung weiterer mutierter, FLT3-regulierender TF und ihre Korrelation mit der FLT3-Expression sollen zukünftig tiefere Einblicke in die transkriptionelle Regulierung von FLT3 als Ursache der FLT3-Überexpression in AML-Patienten gewähren. Für eine Reihe von in AML-Patienten gefundenen Mutationen ist deren Rolle in der Pathogenese der AML noch unbekannt. Dazu gehören Mutationen in den Rezeptortyrosinkinasen DDR1 und DDR2. In der vorliegenden Arbeit wurden DDR1- und DDR2-Mutationen stabil in Ba/F3 Zellen und transient in HEK-293T Zellen exprimiert, um ihr transformierendes Potential zu untersuchen und diese funktionell zu charakterisieren. Transgene, DDR1- und DDR2-exprimierende Ba/F3 Zellen zeigten keinen transformierenden Phänotyp. Weitere Untersuchungen zeigten eine konstitutive Phosphorylierung der extrazellulären DDR2-Mutanten (G222R, M291I) in HEK-293T Zellen und eine Adhäsion von Ba/F3 Zellen mit wildtypischem sowie mutiertem DDR1-Rezeptor in Anwesenheit des DDR-Liganden Kollagen. DDR1- und DDR2-Rezeptoren sind bisher vor allem in soliden Tumoren untersucht. Weitere funktionelle Analysen sind notwendig, um ihren Stellenwert bei der Entstehung von AML zu erfassen. Diese Arbeit zeigt, dass Rezeptortyrosinkinasen in der Leukämogenese auf unterschiedliche Weise eine wesentliche Rolle spielen können. Da Rezeptortyrosinkinasen zudem wichtige Zielmoleküle für therapeutische Ansätze darstellen, sind sie von besonderer Bedeutung.

Fragestellung: Das Ovarialkarzinom ist die fünfthäufigste Krebserkrankung bei Frauen. Trotz radikaler chirurgischer Interventionen und nachfolgender Chemotherapie beträgt das Fünfjahresüberleben nur 42%. Die anhaltend schlechte Prognose macht die Suche nach Zielmolekülen im Sinne einer „targeted therapy“ zur Erweiterung des Behandlungsspektrums nötig. Diese Arbeit soll neue Erkenntnisse über die Expression acht verschiedener Rezeptoren der Kernrezeptorsuperfamilie (THRα2, THRα1, THRα1/2, THRβ, THRβ1, RXRα, PPARγ und VitDR) im Ovarialkarzinom bringen und Aussagen zu ihrem prognostischen Stellenwert ermöglichen. Patienten und Methoden: Das untersuchte Kollektiv besteht aus Patientinnen, die an unserer Klinik zwischen 1990 und 2002 aufgrund eines Ovarialkarzinoms operiert wurden. Die Gewebeproben wurden nach den gängigen Methoden der Immunhistochemie bearbeitet, die Färbungen mittels IRS-Score bewertet und mit SPSS statistisch ausgewertet. Ergebnisse: Alle von uns untersuchten Rezeptoren werden im Ovarialkarzinom exprimiert und zeigen zusätzlich zu ihrem nukleären Vorkommen eine Koexpression im Zytoplasma. Speziell PPARγ und THRβ1 kommen überwiegend extranukleär vor. Die Analyse der Rezeptorexpression nach histopathologischen Subtypen ergab eine Spezifität von THRβ1 für klarzellige Ovarialtumore. THRα1/2 ist in allen Subtypen außer dem muzinösen exprimiert. Bei Tumorprogression erlischt die Expression mehrerer Rezeptoren: Mit Verschlechterung des Gradings kommt es zum Verlust von THRα2 in serösen Ovarialkarzinomen und tendenziell auch im Gesamtkollektiv. Beim serösen Ovarialkarzinom wirkt sich dies verkürzend auf das Überleben aus. Auch die Expression des THRβ1 in klarzelligen Tumoren und des VitDR in serösen Karzinomen sinkt signifikant mit der Verschlechterung des Gradings. In fortgeschrittenen FIGO-Tumorstadien verlieren die Karzinome außerdem ihre THRβ1 Rezeptoren, sowie seröse Tumoren tendenziell ihre THRα1/2 Rezeptoren. Zusammenfassung 4 THRβ erfährt als einziger Rezeptor eine Expressionszunahme bei Tumorprogression und ist im Stadium III der FIGO-Klassifikation deutlich überexprimiert. Die zytoplasmatische Expression von THRα2, THRβ und VitDR scheint zudem die Mortalität zu erhöhen. Außerdem zeigt sich eine lange Reihe an Rezeptorkorrelationen. Diskussion: Im Zuge der Entdifferenzierung des Gewebes zeigte sich für mehrere Rezeptoren (THRα2, THRα1/2 und THRβ1) ein intranukleärer Expressionsverlust. Die intranukleäre und zytoplasmatische Expression der von uns untersuchten Rezeptoren korreliert dabei umgekehrt proportional miteinander (Ausnahme VitDR). Eine persistierende intranukleäre THRα2-Expression ermöglich zumindest im serösen Ovarialkarzinom ein längeres Überleben, während die zytoplasmatische Expression von THRα2, THRβ und VitDR im Gesamtkollektiv hochsignifikant das Mortalitätsrisiko steigert. Diese Translokation im Rahmen der Tumorprogression könnte evtl. durch einen Enzündungsprozess oder durch eine Schilddrüsenstörung ausgelöst sein. Weitere Untersuchungen mit Vergleich der Rezeptorexpression im gesunden Ovarialgeweben und simultaner Messung von Schilddrüsenhormonen und Entzündungsparametern sind ausstehend. Die intranukleäre Expression von THRβ hingegen nimmt bei Tumorprogression zu. Sein Stellenwert in der Kanzerogenese des Ovarialkarzinoms ist genau wie seine Bedeutung in der Krebsentstehung anderer Tumore noch nicht geklärt. RXRα, PPARγ und THRα1 scheinen im Ovarialkarzinom eine untergeordnete Rolle zu haben.

Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von 8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern, dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht, ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert, jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371 Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens, zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren Behandlungen sind.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen neuen Wirkstoff für die Therapie des Morbus Alzheimer zu entwickeln. Morbus Alzheimer ist die häufigste Demenzerkrankung in Deutschland (1). Charakteristisch für diese neurodegenerative Erkrankung ist die zu-nehmende Verschlechterung der kognitiven Leistungsfähigkeit, die mit einem Untergang von Nervenzellen und Synapsen einhergeht. Für die neuropathologische Diagnose des Morbus Alzheimer ist der Nachweis von extrazellulären Aβ-Plaques und intrazellulären versilberbaren Strukturen, den sogenannten neurofibrillären Bündeln (tangles) entscheidend (5). Die Enzyme, die zu der Bildung dieser Aggregate, die im Wesentlichen aus fehlgefalteten körpereigenen Proteinen, dem β-Amyloid bzw. dem Tau-Protein bestehen, beitragen, sind die primären Zielmoleküle in der Wirkstoffentwicklung auf diesem Gebiet in den letzten 20 Jahren gewesen. So wurde eine große Zahl von Wirkstoffen bzw. thera-peutischen Ansätzen identifiziert, die effektiv in vitro und in vivo die Bildung dieser Aggregate inhibieren (1). Die erhofften Effekte auf die alters- und amyloid-abhängigen Defizite bei der Lern- und Gedächtnisleistung konnten durch klinische Studien jedoch nicht belegt werden (73). Eine mögliche Erklärung für den Misserfolg dieser sehr auf-wändigen Studien ist, dass Veränderungen durch Ablagerungen von fibrillärem Aβ bzw. Tau zu irreversiblen Schädigungen führen und somit eine ausschließlich auf Aβ- bzw. Tau fokussierte Therapie nach Ausbruch der Krankheit möglicherweise nicht ausrei-chend ist. Mit den in der Arbeitsgruppe etablierten zellbasierten Assays ist es möglich, Wirkstoffe zu identifizieren, die die Störung der Speicherung von Kalzium im endoplasmatischen Retikulum (ER), einen pathophysiologisch relevanten Mechanismus der Pathogenese des Morbus Alzheimer, modulieren (120). Dieser Ansatz verfolgt somit nicht die seit Jahren praktizierte Strategie, die Aβ- bzw. Tau-Aggregation direkt zu hemmen, sondern der für die Akkumulation dieser Proteine ursächlichen Schädigung von Nervenzellen und deren synaptischen Kontakten entgegenzuwirken. Ziel war es, innovative Wirkstoffe zu entwickeln, die Störungen der zytosolischen Kalziumkonzentration bzw. der Kal-ziumfreisetzung aus dem ER in einer frühen Phase der neuronalen Schädigung normali-sieren. Optimierte Vertreter der neu entdeckten Strukturklasse der Tetrahydrocarbazolamine stabilisieren in der Tat die Kalziumfreisetzung aus dem ER, verbessern den Energiehaushalt der Zelle und verringern die Bildung toxischer Aβ-Peptide. Der genaue Wirkmechanismus der Tetrahydrocarbazolamine konnte in dieser Arbeit jedoch nicht entschlüsselt werden und wird Gegenstand zukünftiger Forschungs-projekte sein müssen. Als mögliches Target bieten sich zum Beispiel IP3-Rezeptoren an. Eine mögliche Interaktion mit diesen könnte dazu führen, dass weniger Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum in das Zytosol austritt. Die identifizierten Verbindungen haben zusätzlich einen positiven Effekt auf die Aktivität der Mitochondrien, was wiederum zu einer Steigerung der Energiebereitstellung der Zelle führt und einen Effekt auf die Produktion von Aβ-Peptiden hat (56). Auch Kalzium beeinflusst über eine indirekte Hemmung der β-Sekretase die Menge an gebildetem Aβ (157). In Folge dessen wirken Tetrahydrocarbazolamine sehr wahrscheinlich über verschiedene Mechanismen auf die Bildung der toxischen Aβ-Peptide. Eine synergistische Verstärkung ist daher durchaus denkbar. Tetrahydrocarbazolamine besitzen somit eine Wirkung auf drei verschiedene Mechanismen, die bereits zu Beginn der Pathogenese von Morbus Alz-heimer eine wichtige Rolle spielen. Zurzeit befinden sich nach den uns zugänglichen Informationen keine anderen Substanzen in der präklinischen oder klinischen Entwick-lung, die ein ähnlich breites Wirkprofil aufweisen. In den anschließend durchgeführten Therapieversuchen in transgenen Mausmodellen des Morbus Alzheimer konnte allerdings kein Effekt auf die Anzahl und Größe von Plaques festgestellt werden. Dies ist vermutlich vor allem der kurzen Behandlungsdauer zuzuschreiben. Eine längere Behandlung mit gea_133 war auf Grund einer Lebertoxizität, die wahrscheinlich ursächlich für das Sterben der Tiere in der 3. Behandlungswoche war, nicht möglich. Ein zentraler Punkt der zukünftigen Erforschung dieser Substanzklasse wird die Entwicklung und Testung von Derivaten sein, die keine Lebertoxizität aufweisen.

Die Charakterisierung und Kultivierung von Tumorzelllinien mit Hilfe einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur gilt als Standardmethode in der Zellbiologie. Dreidimensionale (3D) Modelle gewinnen jedoch immer mehr an Bedeutung, da sie die Tumorbiologie in Bezug auf physiologisch relevante Zusammenhänge bei der Tumorentstehung und –progression besser abbilden als eine herkömmliche 2D-Kultur. Die auf poly-HEMA beschichteten Zellkulturplatten induzierten multizellulären Tumorspheroide reflektieren die Morphologie von avaskularen Tumoren und Mikrometastasen. In der vorliegenden Arbeit werden anhand von HER2-überexprimierenden Tumorzelllinien die Unterschiede der HER2-Signalaktivierung und –weiterleitung in 2D- und 3D-Kultur umfassend beschrieben. In 3D-Kultur konnte ohne Zugabe von zusätzlichen Wachstumsfaktoren eine stärkere HER2-Phosphorylierung beobachtet werden. Bei der Brusttumorlinie SKBR-3 bildet HER2 in 2D-Kultur bevorzugt Heterodimere mit HER3, wohingegen in Spheroiden HER2-Homodimere vorliegen. Diese Homodimere lokalisieren in lipidreichen Mikrodomänen und begünstigen die Aktivierung des Ras-MAPK-Wegs, der die Proliferation der Tumorzellen reguliert. Mit Hilfe des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab, der spezifisch für HER2 ist, kann die Proliferation der Zellen und die Phosphorylierung von HER2 im 3D-System besser inhibiert werden. Zusätzlich konnte in 3D eine Herunterregulierung des HER2/HER3 assoziierten PI3K-Akt-Signalwegs nachgewiesen werden. Bei SKBR-3 war in 3D-Kultur neben der stärkeren Phosphorylierung von MAPK auch die Aktivierung der Integrin 4/Rac1/PAK2-Signalkaskade zu beobachten. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit in 3D-Kultur die Zelllinie SKBR-3 HR generiert, die resistent gegen die Behandlung mit Trastuzumab ist. Die Charakterisierung dieser Linie zeigte eine verstärkte Expression von DARPP-32 und eine gesteigerte HER2/HER3-Heterodimerbildung, gefolgt von einer Hochregulierung des PI3K-Akt-Wegs. Das Gen für DARPP-32 liegt im ERBB2-Amplikon und liegt bei vielen Brusttumorproben und –zelllinien amplifiziert vor. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierte Resistenz reversibel ist und die erneut Trastuzumab responsiven Zellen eine schwächere Expression von DARPP-32 aufwiesen, gefolgt von einer reduzierten Aktphosphorylierung. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass das beschriebene 3D-Modell einige in vivo Aspekte des HER2-Signalmusters besser reflektiert und deshalb als Basis für die weitere Aufklärung des Wirkmechanismus von Trastuzumab dienen kann. Außerdem kann dieses 3D-System zur Identifizierung von neuen Zielmolekülen herangezogen werden um Therapiestrategien zu entwickeln, welche eine Behandlung der HER2-positiven Patientenpopulation erlaubt, die bisher nur suboptimal auf die Behandlung mit Trastuzumab angesprochen haben.

Thu, 12 Mar 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9876/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9876/1/Paptistella_Michaela.pdf Paptistella, Michaela ddc:610, ddc:60

Das Epithelial Cell Adhesion Molecule, kurz EpCAM, ist ein transmembranes Zelladhäsionsmolekül, dessen Expression mit einer erhöhten Proliferation epithelialer Zellen einhergeht. Die veränderten proliferativen Eigenschaften werden durch eine EpCAM-vermittelte Signaltransduktion hervorgerufen, die u.a. die Transkription des Proto-Onkogens c-myc induziert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EpCAM die Transkription weiterer „down stream“-Zielmoleküle reguliert. Die mRNA-Synthese des Transkriptions-faktors Egr-1 wird durch EpCAM reprimiert. Dagegen induziert EpCAM die Transkription der Gene für RhoB und Calmodulin I. Außerdem korreliert in unterschiedlichen Karzinomzelllinien die native EpCAM-Expression mit der Transkriptionsrate von Calmodulin I. Zur Identifikation intrazellulärer Interaktionspartner wurde mit der kurzen zytoplasmatischen Domäne (26 Aminosäuren) von EpCAM ein Two-Hybrid Screening in Hefen durchgeführt. Es konnten 17 potentielle Interaktionspartner aus einer humanen cDNA-Bank identifiziert werden. Für die zwei Signaltransduktions-moleküle FHL2 und Cyclophilin A war es möglich, eine Interaktion mit EpCAM in humanen Zellen nachzuweisen. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass die C-terminale LIM-Domäne von FHL2 für eine Assoziation mit EpCAM notwendig ist. Somit konnte in dieser Arbeit die Grundlage für eine weitere Analyse der EpCAM-vermittelten Signaltransduktion geschaffen werden.

Maligne Erkrankungen sind die zweithäufigste Todesursache in den industrialisierten Nationen. Trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten haben sich die Prognosen nur bei einigen Tumorentitäten signifikant verbessert. Die Hauptprobleme sind nach wie vor das Fehlen valider Marker für die Frühdiagnose und hohe Rezidivraten, die aufgrund mangelnder Detektion von disseminierten Tumorzellen entstehen. Tumorantigene erlangen eine immer wichtigere Bedeutung, da sie zur Visualisierung von okkulten Tumorzellen und als Zielstrukturen der spezifischen adoptiven Immuntherapie dienen können. Tumorantigene (TAs) bzw. eine gesteigerte humorale Antwort gegen TAs, besitzen außerdem ein großes Potenzial als zirkulierender Biomarker in der Frühdiagnose. In dieser Arbeit wurde am Beispiel von Karzinomen der oberen Atemwege eine neue Technik zur Identifizierung von TAs entwickelt (AMIDA, Autoantibody Mediated Identification of Antigens), welche einige Limitationen der bereits etablierten SEREX- und PROTEOMEX-Technik umgeht. AMIDA ermöglicht es, im Gegensatz zu SEREX, TAs zu identifizieren, die durch posttranslationale Modifikationen oder aberrante Lokalisationen immunogen wurden. Diese TAs sind häufig tumorspezifisch und eignen sich hervorragend als Biomarker oder als Zielstrukturen für Therapien. Der Vorteil von AMIDA gegenüber PROTEOMEX ist die Immunpräzipitation von Antigenen aus primären Tumorbiopsien mit autologen Serumantikörpern, vor der Auftrennung in einer 2D-Gelelektrophorese und der anschließenden Identifizierung der TAs im Massenspektrometer. Dadurch können TAs aus dem kompletten Proteom identifiziert werden und nicht nur aus der Proteinauswahl, die in einer klassischen 2D-Gelelektrophorese auftrennbar ist. AMIDA führte zur Identifizierung von 27 unterschiedlichen, potenziellen Tumorantigenen, wobei sechzehn TAs bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen und weitere vier nicht mit HRK assoziiert wurden. Hierbei stellte sich Zytokeratin 8 (CK8) als interessanter Marker für okkulte Tumorzellen heraus, da es bereits in hyperplastischem Rachenepithel vermehrt gebildet und in Neoplasien bzw. Metastasen ausschließlich von Tumorzellen stark überexprimiert wird. CK8 ist zudem ein interessantes Zielmolekül für Immuntherapien mit monoklonalen Antikörpern, da es auf Karzinomzellen ektopisch an der Zelloberfläche lokalisiert. Darüber hinaus zeigten Patienten mit HR-Karzinomen im Vergleich zu gesunden Probanden bereits in sehr frühen Tumorstadien eine deutlich gesteigerte humorale Antwort gegen CK8, was Serumantikörper gegen CK8 zu einem potenziellen zirkulierenden Biomarker in der Frühdiagnose macht. Zwei weitere AMIDA-TAs, AAA-TOB3 bzw. das hypothetische Protein KIAA1273, werden ebenfalls in HRK überexprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei AAA-TOB3 und KIAA1273 um zwei Isoformen handelt, die von einem Genlokus kodiert, jedoch von zwei unterschiedlichen Promotoren reguliert werden. Beide Isoformen sind Transmembranproteine, die in Mitochondrien lokalisieren und deren Expression direkt von c-Myc reguliert wird. Eine frühere Studie von Da Cruz (2003) zeigte, dass das murine Homolog von AAA-TOB3 pro-apoptotische Eigenschaften hat, wenn es in humanen Zellen überexprimiert wird. Dies konnte in dieser Arbeit für die humanen Isoformen nicht belegt werden. Im Gegenteil, die Repression der beiden Proteine führte zu einer vermehrten Apoptose. Dies lässt eher auf eine für das Zellwachstum bzw. die Zellproliferation notwendige Funktion dieser beiden Proteine schließen und könnte die Überexpression in Tumoren erklären.

Die vorliegende Dissertation untersucht mit Hilfe der Microarray-Technologie die Auswirkungen gängiger Zytostatika auf die globale Genexpression humaner Tumor- und Normalzellen und evaluiert deren Gemeinsamkeiten und Unterschiede. Darüber hinaus werden niedermolekulare Inhibitoren, die spezifisch gegen onkologische Targets gerichtet sind, in ähnlicher Weise analysiert und mit einer RNAi-vermittelten Herabregulierung desselben Zielmoleküls verglichen. Der Vergleich der Expressionsmuster lässt darauf schließen, inwieweit die Effekte verschiedener Substanzen übereinstimmen, und ermöglicht aufgrund dessen eine Aussage über ihre Spezifität.

Das humanpathogene Bakterium H. pylori persistiert im Gastroduodenaltrakt für Jahre oder sogar Jahrzehnte und löst durch die Kolonisation der Magenmukosa eine chronische Entzündungsreaktion aus. In den meisten Fällen bleibt diese symptomlos, es können jedoch auch schwerwiegende Erkrankungen wie ein Magen- oder Zwölffingerdarm-Geschwür oder Magenkrebs daraus hervorgehen. Obwohl die Infektion eine starke zelluläre und humorale Immunantwort hervorruft, kann H. pylori durch das Immunsystem nicht eliminiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von H. pylori auf die Proliferation und Aktivierung von CD4+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass H. pylori zwei Faktoren besitzt, um die Expansion der T-Zellen zu hemmen. Der eine, nicht näher charakterisierte Faktor scheint mit der Oberfläche der Bakterien assoziiert zu sein und inhibiert die Proliferation der T-Zellen bei direktem Kontakt der Bakterien mit den Zellen. Der zweite Faktor wurde als vakuolisierendes Zytotoxin VacA identifiziert, das, wie bisher bekannt war, in Epithelzellen die Bildung saurer Vakuolen auslöst. T-Zellen produzieren, wenn sie aktiviert werden, den Wachstumsfaktor IL- 2, beginnen sich zu vermehren und setzen eine Immunreaktion gegen das Pathogen in Gang. Das VacA-Toxin hemmt jedoch die Bildung von IL-2 und bewirkt eine Hemmung des Zellzyklus bei T-Zellen, indem es die Expression der Cycline D3 und E reprimiert. Diese sind essentiell für die Aktivierung des Retinoblastom-Proteins, das den Übergang des Zellzyklus von der G1- in die S-Phase vermittelt. Durch die Hemmung der IL-2-Produktion und die Erniedrigung der Oberflächenlokalisation von CD25, der -Kette des IL-2-Rezeptors, unterbricht VacA die Signaltransduktion, die normalerweise über den IL-2-Rezeptor zur Expression der Cycline führt. Die Hemmung der IL-2-Produktion durch VacA erfolgt auf transkriptioneller Ebene, indem die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) verhindert wird. Die anderen für die Transkription des IL-2-Gens essentiellen Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-B werden durch VacA nicht beeinflusst. Die Stimulation der T-Zellen aktiviert zwei Haupt-Signalwege: einer führt über den MAPKinase / ERK-Kinase Weg zur Aktivierung von AP-1 und NF-B, der andere löst eine Erhöhung der Calcium-Konzentration im Zytoplasma aus, was die Ca2+-abhängige Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert daraufhin den Transkriptionsfaktor NFAT und NFAT wird in den Zellkern transportiert, wo es zusammen mit AP-1 und NF-B die Transkription des IL-2-Gens initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass VacA die Translokation von NFAT in den Kern durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität von Calcineurin verhindert. Dies hat zur Folge, dass NFAT-abhängige Gene, wie das IL-2- Gen oder das für CD25 codierende Gen, nicht abgelesen werden können. Dass Calcineurin ein geeignetes Zielmolekül ist, um eine Immunantwort zu unterdrücken, zeigen auch die medizinisch bedeutsamen Substanzen FK506 (Tacrolimus) und Cyclosporin A. Beide V Zusammenfassung 91 Substanzen verursachen durch Hemmung von Calcineurin eine starke Immunsuppression. In DNA-Microarray-Analysen wurde untersucht, ob VacA einen ähnlich drastischen Effekt auf die Funktion der T-Zellen hat wie FK506. Dabei zeigte der Vergleich der Genexpression von VacA- und FK506-behandelten T-Zellen, dass VacA eine Untergruppe der Gene, die auch von FK506 reprimiert werden, herunterreguliert, wie z.B. die Gene für die Zytokine Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1, MIP-1, Single C Motif-1 (SCM-1) und SCM- 1. VacA scheint also die Genaktivität von T-Zellen ähnlich wie FK506 zu modulieren, was auf einen ähnlichen Mechanismus, nämlich die Calcineurin-Hemmung schließen lässt. Da das VacA-Toxin ein sekretiertes Protein ist, das auch in den tieferen Schichten des Magengewebes nachgewiesen werden kann, erreicht H. pylori nicht nur die vereinzelt im Magenepithel vorkommenden T-Zellen, sondern auch die T-Zellen, die bei der Infektion in die Lamina propria, eine tiefere Schicht der Magenmukosa, einwandern. Durch die Unterdrückung der T-Zell-Aktivierung und die Repression von Zytokin-Genen, die wichtig sind für die Modulation der Immunantwort, induziert H. pylori so vermutlich eine lokale Immunsuppression, die seine Eliminierung durch das Immunsystem verhindert und eine chronische Infektion des Magens ermöglicht. In einem zweiten Projekt wurde die Spaltung von CagA in ein 100 kD- und ein Tyrosinphosphoryliertes 40 kD- Fragment nach dessen Translokation in diverse Zelltypen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung nicht nur in Makrophagen, sondern auch in dendritischen Zellen und in T-Zellen auftritt. Die Spaltung scheint von der Tyrosin-Phosphorylierung des CagA-Proteins und von Calcium abhängig zu sein. Dabei wurde die Ca2+-abhängige Protease Calpain in einem in vitro-Ansatz als ein CagAprozessierendes Enzym identifiziert. Auch in Makrophagen kann die Spaltung von CagA in P100 und P40P-Tyr durch den Calpain-Inhibitor Calpeptin verhindert werden. Die Tatsache, dass transloziertes CagA in allen getesteten eukaryontischen Zelltypen außer der Magenepithelzellinie AGS prozessiert wird, deutet darauf hin, dass diese Prozessierung eine biologische Bedeutung hat.

Die LQYLWUR Selektion ermöglicht es aus kombinatorischen Nukleinsäurebibliotheken Oligonukleotidsequenzen zu identifizieren, die verschiedenste Zielmoleküle mit hoher Affinität und Spezifität binden können. Dadurch haben sich Aptamere zu einer potenten Alternative zu den in der Diagnose, Therapie und als Forschungsreagentien etablierten Antikörper entwickelt. Mit Hilfe der SELEX-Technologie (6ystematic (volution of /igands by (;ponential Enrichment) ist es in dieser Arbeit gelungen, 2' amino-stabilisierte RNA-Aptamere gegen das Neuropeptid Y und ein ausgewähltes, funktionell relevantes Prionproteinepitop zu generieren. Die Anreicherung funktioneller Sequenzen erfolgte durch einen affinitätschromatographischen Prozess. Zudem sollten bereits vorliegende RNA-Aptamere, die gegen das rekombinante Prionprotein in früheren Arbeiten selektiert wurden, charakterisiert werden. Das Neuropeptid Y (NPY), bestehend aus 36 Aminosäuren, gehört zur Familie der pankreatischen Polypeptide und ist bei der Steuerung einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse von Bedeutung. Es wird angenommen, daß durch selektive Bindung unterschiedlicher NPY-Konformationen an die einzelnen GProtein gekoppelten NPY-Rezeptorsubtypen (Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 und Y6) unterschiedliche Signale vermittelt werden können. Dieses differentielle Bindungsverhalten von NPY an seine Rezeptorsubtypen ist bisher unvollständig verstanden. Die in dieser Arbeit generierten Anti-NPY-Aptamere binden ihr Zielmolekül -NPY- mit einer Affinität von 370 nM und sind durch eine hohe Spezifität innerhalb der pankreatischen Polypeptidfamilie charakterisiert. Die Bindungsregion des Aptamers an den C-Terminus des Neuropeptid Y wurde durch Kartierungs-Experimente mit NPY-Analoga LQ YLWUR bestimmt. Die NPY-Analoga stellen sowohl verschiedene Untereinheiten von NPY, als auch Modifikationen des Peptides, die zu Rezeptorsubtypspezifitäten führen, dar. Durch Punktmutationen im C-terminalem NPY-Bereich konnte u.a. gezeigt werden, daß die Aminosäure Arginin an Position 33 für die Komplexbildung von NPY und Aptamer essentiell ist. In den Bindungsstudien in Gegenwart selektiver Agonisten zeigte sich, daß die Bindungseigenschaften von NPY am Y2 Rezeptor weitgehend mit denen an das Aptamer übereinstimmen. Die Kompetition des Aptamers mit den Rezeptoren um 3H-NPY wurde an Zellen, die die Rezeptoren NPY-Y1, NPY-Y2, bzw. NPY-Y5 exprimieren, untersucht. Das Aptamer verdrängte NPY mit besonders hoher Affinität am Y2 Rezeptor im Vergleich zur Verdrängung am Y1- bzw. Y5-Rezeptor. Die Anti-NPY-Aptamere weisen ein Bindungsverhalten am NPY vergleichbar zum Y2-Rezeptor auf und stellen damit ein wertvolles Werkzeug zur selektiven Charakterisierung der Interaktion zwischen NPY und seinen Rezeptoren dar. Von entscheidender Bedeutung für die Pathogenese der übertragbaren spongiformen Enzephalopathien ist die infektiöse Form des Prionproteins (PrPSc). Es wird angenommen, daß PrPC durch einen posttranslationalen Prozeß in PrPSc konvertiert werden kann. Trotz identischer Primärstruktur unterscheiden sich die beiden Prionproteinisoformen (PrPC und PrPSc) grundlegend in ihren biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften. Die in früheren Arbeiten selektierten Prionprotein-Aptamere sollten im Hinblick auf ihr diagnostisches Potential charakterisiert werden. Erste strukturelle Untersuchungen führten zu der Annahme, daß die RNA-Aptamere ein G-Quartett als stabilisierendes Sekundärstrukturmotiv ausbilden können. Sowohl Kartierungsstudien mit unterschiedlichen Prionproteinpetiden als auch Bindungsstudien mit N-terminal trunkiertem PrPSc zeigten, daß der N-Terminus für die Bindung der Aptamere essentiell ist. In Gelshiftexperimenten mit verschiedenen Hirnhomogenaten konnte die spezifische Bindung der Aptamere an authentisches PrP gezeigt werden. Aufgrund der fehlenden PrPSc-Isoformspezifität der untersuchten Aptamere ist eine diagnostische Anwendung kaum denkbar. Die Bindung der Aptamere in der pKsensitiven, N-terminalen Prionproteindomäne läßt eine Anwendung in Kombination mit Proteinase K-Verdau in Analogie zu den derzeit benutzten BSE-Testverfahren nicht zu. Im letzten Teil der Arbeit sollten RNA-Aptamere gegen einen für die Konversion wichtigen Bereich des Prionproteins (AS 90-129) generiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß die in einer vorgeschalteten Prionpeptidselektion (AS 90-129) identifizierten Aptamere in der Lage sind, ihr Zielmolekül im Gesamtkontext des Prionproteins zu erkennen. In funktionellen Studien in persistent Prion-infizierten Neuroblastomzellen wurde eine statistisch signifikante und spezifische Reduktion der Akkumulation von GHQRYR synthetisiertem PrPSc zu hochmolekularen Aggregaten in Gegenwart einer ausgewählten Aptamersequenz beobachtet. Im Verlauf der Pathogenese von spongiformen Enzephalopathien korreliert die PrPSc- Aggregatbildung mit Infektiosität und Neurodegeneration. Damit bieten die selektierten Aptamere möglicherweise eine Ausgangsbasis um Therapeutika zu entwickeln, die den Verlauf der Prionerkrankungen beeinflussen.