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Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Proteome von H. salinarum untersucht, die nach zellulären Kompartimenten unterschieden wurden in (1) das Flagellarmotor-Proteom (2) das Cytosolproteom und (3) das Membranproteom. Die Untersuchung des Flagellarmotors erfolgte hauptsächlich auf struktureller Basis mittels Elektronenmikroskopie. Es konnte eine Struktur mit zwei übereinanderliegenden Ringen isoliert werden, die beide an eine Flagelle gebunden sind. Aus weiteren Aufnahmen und Größenkorrelationen wurde ein Modell zum Flagellarmotor entworfen, welches eine Rotation beider Ringe beinhaltet. An diese Doppelringstruktur sind mehrere Flagellen über einen Hook gebunden, was dieses Modell damit vom bakteriellen Flagellarmotor unterscheidet. Bei der Untersuchung des Cytosolproteoms konnten insgesamt 840 Proteine mittels MALDI-MS-Fingerprint identifiziert werden, was einer Identifizierungsrate von 38% des löslichen Proteoms entspricht (Identifizierungsrate aller löslichen Proteine größer 20 kD: 61%). Es wurde eine massenkompatible Silberfärbung optimiert und ein semi-manuelles Verfahren zur in-Gel Spaltung entwickelt, mit dem 800 Proteine/Tag enzymatisch gespalten werden können. Für die anschließende Identifizierung wurde ein Standardprotokoll für die Proben- und Matrixpräparation entwickelt, welches sich im Vergleich zu anderen automatischen Präparationen als zuverlässiger und sensitiver gezeigt hat. Im Verlauf dieser Arbeit wurde von der Bioinformatikgruppe (Dr. F. Pfeiffer) das web-basierte HALOLEX-System entwickelt, welches als Ziel die vollständige Erfassung aller Fakten zu H. salinarum hat. Die generierten Daten (Gele, Proteinidentifizierungen, MALDI-Peaks, MS/MS-Peaks) werden innerhalb dieser Oberfläche zugänglich gemacht und erlauben detaillierte Nachanalysen. Für das Membranproteom wurde gezeigt, dass der etablierte Zellaufschluss mittels Niedrigsalz-Dialyse zu einer erheblichen Kontamination mit löslichen Proteinen führt. Ein Aufschluss unter Hochsalzbedingungen mit anschließender Dichtegradienten-Zentrifugation reinigt die Membran, jedoch dissoziiert die Zellmembran bei anschließender Niedrigsalz-Behandlung in hohem Maße in nicht pelletierbare Fragmente. Eine optimierte Membranaufarbeitung unter ständigen Hochsalzbedingungen, Dichtegradienten-Zentrifugation, Delipidierung und Solubilisierung in einer Detergenzienmischung (Triton X-100/ASB-14) führte bei anschließender zweidimensionaler Trennung (IEF/SDS) zur Identifizierung von fast ausschließlich peripheren Membranproteinen. Mit einer fluoreszenzmarkierten Membranfraktion konnte gezeigt werden, dass der Verlust von integralen Membranproteinen auf einer nahezu quantitativen Präzipitation der Membranproteine an derem pI beruht. Eine pI-unabhängige Strategie wurde mittels BAC/SDS etabliert, die speziell bei H. salinarum zu einer guten Proteinauftrennung führt. Die Identifizierung eines 13 TM-Antiporters (0,22 TM/kD, GRAVY +0,74) als dominantestes Protein dieser Membranfraktion zeigt die Anwendbarkeit dieses Systems. In einem Vergleich von Membranfraktionen aus aerob und phototroph gewachsenen Kulturen konnten so Unterschiede des Expressionsniveaus von Membranproteinen nachgewiesen werden. Aus theoretischen Berechnungen der vorhergesagten Membranproteine zeigte sich weiterhin, dass bei tryptischer Spaltung nicht ausreichend Peptid-Fragmente generiert werden, um mittels MALDI-Fingerprint-Analyse identifiziert zu werden. Diese (H. salinarum spezifische) Problematik kann mittels MS/MS umgangen werden. Bei der Kombination aus 1-D Gel und LC/MS/MS konnten schließlich 114 integrale Membranproteine identifiziert werden, was 20% des integralen Membranproteoms entspricht.

1. Aus chromosomaler DNA von A. woodii wurde durch heterologe Starteroligonukleotide ein Bereich des Flagellingens mittels PCR amplifiziert. Durch die Verwendung dieses DNA-Fragmentes als Sonde wurden weitere 6 kBp an chromosomaler DNA von A. woodii kloniert, sequenziert und analysiert. 2. Innerhalb dieses klonierten DNA-Abschnittes wurden zwei partielle und fünf vollständige offene Leserahmen lokalisiert, die jeweils über eine Shine-Dalgarno-Sequenz verfügten und größer als 300 Bp waren. Durch Sequenzvergleiche ließ sich das Flagellingen (fliC) identifizieren. Stromaufwärts von fliC wurden offene Leserahmen (flgL, flgK) gefunden, die für die Haken-assoziierten Proteine 1 und 3 des A. woodii-Flagellums kodieren, sowie ein Leserahmen (orfA) dessen abgeleitetes Produkt keine Ähnlichkeit keinem bekannten Protein ähnlich ist. Durch die Expression von orfA in Minizellen von E. coli DK6 wurde aber gezeigt, daß orfA für ein Protein kodiert. Stromabwärts vom Flagellingen wurden keine Flagellengene identifiziert. Die abgeleiteten Produkte, der hier lokalisierten ORFs orfB und orfC zeigten keine Ähnlichkeiten zu in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen. Am 3'-Ende des klonierten DNA-Abschnittes war ein partieller ORF (orfD) vorhanden, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz große Ähnlichkeiten zu dNTP-Zucker modifizierenden Enzymen aufwies. 3. Aus Sphäroplasten von A. woodii wurden durch Solubilisierung, differentielle Zentrifugation und eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation ganze Flagellen inklusive des Haken-Basalkörper- Komplexes gereinigt. Durch die Analyse der Präparation in der SDS-PAGE wurden neben dem Flagellin sechs weitere Proteine als Bestandteil der Flagellen identifiziert. 4. Durch die elektronenmikroskopische Analyse der Haken-Basalkörper-Komplexe der Na + -abhängigen Flagellen von A. woodii konnte gezeigt werden, daß diese aus einem Haken, Stab und einem MS-Ring aufgebaut sind. Unterhalb des MS-Rings waren weitere Strukturen vorhanden. Diese Struktur entspricht den aus den H + -abhängigen Flagellen der Gram-positiven Organismen bekannten Strukturen. Durch die Gefrierbruchmethode konnten in der Cytoplasmamembran von A. woodii im elektronenmikroskopischen Bild Partikelringe nachgewiesen werden. Diese entsprechen in Struktur und Größe den Mot-Komplexen der H + -abhängigen Flagellen aus E. coli.5. Zur Analyse der Untereinheitenzusammensetzung der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurden Antiseren gegen die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und β generiert. Hierzu wurden die Untereinheiten a, b, c  und β als MalE-Fusionen in E. coli produziert und gereinigt. Die Untereinheit c2/c3 wurde durch Chloroform:Methanol-Extraktion aus der Cytoplasmamembran von A. woodii angereichert und durch Elektroelution aus einer SDS-PAGE gereinigt. 6. Durch die Analyse der Cytoplasma- und Membranfraktion mit den fünf Antiseren ließen sich die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und ˜ in der Cytoplasmamembran nachweisen. 7. Die Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurde durch Blue-Native-PAGE aus der Membranfraktion isoliert. Durch die Auftrennung der ATPase in ihre Untereinheiten und deren aminoterminale Sequenzierung wurden die Untereinheiten a, b, c2/c3, α , β γ,δ und ε identifiziert. 8. Durch immunologische Methoden wurde die Untereinheit c1, das in F1FO-ATPasen einmalige 16-kDa-Proteolipid, als Untereinheit der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii erkannt. Die Na + -F1FO- ATPase von A. woodii ist die erste F1FO-ATPase mit einem Heterooligomer aus 8- und 16-kDa-Proteolipiden. 9. Die Untereinheit c1 wurde in A. woodii unabhängig vom Substrat und der Na + -Konzentration produziert. Allerdings wurden Hinweise auf eine erhöhte Expression des gesamten atp-Operons in Methanol-gezogenen-Zellen erhalten. 10. Ein Verfahren zur Reinigung der Na + -F1FO-ATPase unter Erhalt ihrer Untereinheitenstruktur wurde entwickelt. Die Na + -F1FO-ATPase wurde aus der Membranfraktion von A. woodii solubilisiert und durch Gelfiltration über Sephacryl S-400 und eine Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Das gereinigte Enzym besaß alle neun Untereinheiten. Die spezifische Aktivität der gereinigten ATPase betrug 7 U mg Protein -1 und seine molekulare Masse 600 kDa.

1. Es wurde eine Methode entwickelt, die POR nach der Solubilisierung aus Etioplasten chromatographisch zur Homogenität zu reinigen. Die spezifische Aktivität konnte gegenüber der POR in Etioplasten annähernd um das 14-fache gesteigert werden. Dabei wurden alle endogenen Pigmente und Lipide abgetrennt. So konnte erstmals überzeugend mit isolierter POR aus Pflanzen gezeigt werden, daß eine Bindung an das Substrat oder das Vorhandensein einer Membranumgebung keine Voraussetzung für den Erhalt der Aktivität darstellt. 2. Mittels detaillierter Pigment- und Proteinanalysen, inklusive densitometrischer Verfahren, konnte nachgewiesen werden, daß in Etioplasten ein Molekül Pchlide a an ein Molekül POR gebunden ist. 3. Substratspezifitätsstudien mit Substratanalogen zu Pchlide a zeigten, daß strukturelle Veränderungen an den Seitenketten des Porphyrinringes A und B, nicht aber Modifikationen am Ring D oder am isozyklischen Ring E, von der POR akzeptiert werden und zu photokonvertierbaren Substraten führen. Die Ergebnisse dieser Versuche lieferten ein neues Modell zu dem Mechanismus der Katalyse. Demzufolge sind die Ringe D und E am Boden der Enzymtasche fixiert und eine Enolatbildung an der Carbonylgruppe des Ringes E an der die Reaktion beteiligt. Die Ringe A und B liegen mehr oder weniger außerhalb der Enzymtasche. Erstmals konnte die Photokonvertierbarkeit von Pchlide b, Zn-[3-acetyl]-Protopheide a und Zn-[3-formyl]-Protopheide a gezeigt werden. 4. Kinetische Untersuchungen mit den Substratanalogen stellten die Auswirkungen der verschiedenen Seitenkettenmodifikationen auf die Reaktionsgeschwindigkeit heraus. Die Pigmente ließen sich in drei Gruppen mit einer „schnellen“ (z. B. Pchlide a), einer „mittelschnellen“ (z. B. [8-Vinyl]-Pchlide a) und einer „langsamen“ (z. B. Zn-71-OH-Protopheide a) Reaktionsgeschwindigkeit einteilen. Ein komplementärer Zusammenhang zwischen Fluoreszenz- und Photoreaktion-Quantenausbeute konnte nicht festgestellt werden. 5. Über die Bestimmung der KM-Werte für Pchlide a und Pchlide b (0,47 µM, respektive 0,63 µM) wurde demonstriert daß die Affinität beider Pigmente zu der PORA aus Hafer annähernd gleich groß ist. Chlorophyll c1 konnte als kompetetiver Hemmstoff für die POR identifiziert werden. 6. Bei der Photoreduktion tritt Substrathemmung auf. Dies konnte bei einem Überschuß an Pchlide a oder Pchlide b gegenüber der POR (> 1 mol Substrat/1 mol POR) gezeigt werden. 7. An solubilisierten Etioplastenmembranen und an solubilisierter, weitgehend aufgereinigter POR konnten die unterschiedlichen spektralen in vivo-Formen des photoaktiven endogenen Pchlide a dargestellt werden. Die nach der Photoreduktion auftretende spektrale Verschiebung des Chlide a (von A680 nm nach A672 nm), die mit dem in vivo auftretenden Shibata-Shift vergleichbar ist, konnte in diesen Proben gezeigt werden. Die in der Literatur postulierte Ursache des Shibata-Shift`s, eine Freisetzung des Chlide a aus den ternären Komplexen (POR-NADPH-Chlide a), kann anhand der hier erzielten Ergebnisse bestätigt werden. 8. Es wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe an solubilisierter und zur Homogenität gereinigter POR erstmals der Einfluß von Lipiden auf den spektralen Verlauf der Photoreduktion gezeigt werden kann. Nach der Dialyse einer Mischung von Einzelkomponenten (gereinigte POR, NADPH, MGDG/DGDG/Zn-Protopheide a-Gemisch) gegen 80 % Glycerin konnte die Photoumwandlung langwellig-absorbierender ternärer Komplexe, sowie die mit dem Shibata-Shift vergleichbare Verschiebung des Produktes in vitro dargestellt werden. 9. Die Ergebnisse dieser Rekonstitutionsversuche weisen darauf hin, daß in vivo die Einbettung der ternären Komplexe in die spezielle Lipidumgebung der Prolamellarkörper für die Bildung von unterschiedlich absorbierenden spektralen Formen des photoaktiven Pchlide a verantwortlich sind.