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Die Generierung genetisch modifizierter Organspendertiere stellt eine Möglichkeit dar, die Überlebenszeit eines porcinen Xenotransplantats in einem humanen Empfänger zu verlängern. So könnte durch Transgenexpression von TGF-b1 oder TRAIL auf dem Xenotransplantat möglicherweise die zelluläre Abstoßungsreaktion inhibiert werden. Grundlagen zur Untersuchung dieser Strategien in-vivo wurden durch die hier analysierten Tiermodelle in Maus und Schwein geschaffen. In Mäusen wurde ein Modell eines Mifepristone-induzierbaren Genregulatorsystems etabliert, das die gewebespezifische und zeitlich kontrollierte Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 ermöglichen sollte. In diesem System sollte der chimäre Transaktivator GLVPc nur im Herzen exprimiert werden, und dieser sollte in doppelt-transgenen (dtg) Mäusen erst nach Verabreichung des Induktors Mifepristone eine auf das Herz beschränkte, zeitlich kontrollierbare Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 induzieren. Eine herzspezifische Expression sollte durch den murinen alpha myosin heavy chain (aMyHC)-Promotor erreicht werden. Schon die Analyse der einfach-transgenen Mauslinien ergab jedoch eine ubiquitäre Expression von mRNA des Transaktivators bzw. des konstitutiv aktiven TGF-b1 in allen untersuchten Organen. Außerdem wurde im Herzen von dtg Mäusen eine von der Mifepristone-Gabe unabhängige hohe Transgenexpression von TGF-b1 nachgewiesen und eine Expressionssteigerung von TGF-b1 nach Mifepristone-Gabe war nicht reproduzierbar. Auffällig war überdies die hohe Letalität dtg Mäuse innerhalb der ersten vier Lebenswochen. Somit wurde durch das verwendete Genregulationssystem keine auf das Herz beschränkte, zeitlich kontrollierbare Transgenexpression von TGF-b1 erreicht. Da jedoch konstitutiv aktives TGF-b1 im Myokard dtg Mäuse synthetisiert wurde, könnten diese Herzen dennoch für Transplantationsversuche verwendet werden. Dadurch wäre zumindest die Untersuchung der Wirkung von TGF-b1 auf das Transplantatüberleben möglich. Sollten transgene Schweine für die Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 erstellt werden, so wäre allerdings ein anderes bzw. modifiziertes Genregulationssystem zu verwenden, welches eine sichere zeitliche und gewebespezifische Kontrolle der TGF-b1-Expression gewährleistet. Des Weiteren dürfte der bei den Mäusen verwendete aMyHC-Promotor für eine hohe Transgenexpression im Schweineherzen nicht geeignet sein. Das untersuchte porcine Tiermodell umfasste verschiedene transgene Schweinelinien, die ein Expressionskonstrukt für humanen TRAIL unter der Kontrolle des murinen H-2Kb-Promotors integriert haben. Transgenexpression wurde in zahlreichen Organen mit höchsten Expressionsniveaus in Milz und Lunge detektiert, was auf eine gewebespezifische Expression des Transgens durch den murinen Promotor hinwies. Des Weiteren wurde humanes TRAIL-Protein nur in der Zellmembranfraktion von Gewebelysaten detektiert und sollte daher für eine Interaktion mit Rezeptoren zugänglich sein. Überdies war eine Regulation der humanen TRAIL-Expression durch den murinen Promotor in aktivierten transgenen Lymphozyten zu beobachten, welche erhöhte Expressionsniveaus gegenüber nicht stimulierten Lymphozyten aufwiesen. Daher kann vermutet werden, dass die humane TRAIL-Expression bei Auftreten von Entzündungsreaktionen erhöht sein dürfte. Die biologische Wirksamkeit des Transgens wurde durch einen TRAIL-spezifischen Apoptose-induzierenden Effekt von transgenen Lymphoblasten auf Jurkat-Zellen gezeigt. All dies sind Voraussetzungen für einen möglichen protektiven Effekt von humanem TRAIL zur Verhinderung einer Zell-vermittelten Xenotransplantatabstoßung. Die Selektion von bisher nicht oder wenig untersuchten Linien erfolgte durch Analyse der Transgenexpression auf peripheren Blutlymphozyten. Dies stellte einen Kompromiss dar, um kosten- und zeitsparend gut exprimierende transgene Schweine für die Zucht von homozygoten und/oder multitransgenen Tieren zu selektionieren. Nicht nur das Expressionsmuster von humanem TRAIL und die Regulation durch den H-2Kb-Promotor in transgenen Schweinen, sondern auch die Analyse der Sequenz und der Expression des endogenen porcinen TRAIL sind in Bezug auf ihren möglichen Einfluss auf des Überleben des Xenotransplantats von Interesse. Die Aminosäuresequenz von porcinem TRAIL hat 86 % Ähnlichkeit mit der von humanem TRAIL. Eine mögliche Interaktion von porcinem TRAIL mit humanen Rezeptoren ist anzunehmen. Außerdem wurde eine gewebespezifische und entwicklungsabhängige Expression von porcinem TRAIL in zahlreichen Organen nachgewiesen. Dies dürfte mit den verschiedenen Funktionen von porcinem TRAIL in Zusammenhang stehen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Proteome von H. salinarum untersucht, die nach zellulären Kompartimenten unterschieden wurden in (1) das Flagellarmotor-Proteom (2) das Cytosolproteom und (3) das Membranproteom. Die Untersuchung des Flagellarmotors erfolgte hauptsächlich auf struktureller Basis mittels Elektronenmikroskopie. Es konnte eine Struktur mit zwei übereinanderliegenden Ringen isoliert werden, die beide an eine Flagelle gebunden sind. Aus weiteren Aufnahmen und Größenkorrelationen wurde ein Modell zum Flagellarmotor entworfen, welches eine Rotation beider Ringe beinhaltet. An diese Doppelringstruktur sind mehrere Flagellen über einen Hook gebunden, was dieses Modell damit vom bakteriellen Flagellarmotor unterscheidet. Bei der Untersuchung des Cytosolproteoms konnten insgesamt 840 Proteine mittels MALDI-MS-Fingerprint identifiziert werden, was einer Identifizierungsrate von 38% des löslichen Proteoms entspricht (Identifizierungsrate aller löslichen Proteine größer 20 kD: 61%). Es wurde eine massenkompatible Silberfärbung optimiert und ein semi-manuelles Verfahren zur in-Gel Spaltung entwickelt, mit dem 800 Proteine/Tag enzymatisch gespalten werden können. Für die anschließende Identifizierung wurde ein Standardprotokoll für die Proben- und Matrixpräparation entwickelt, welches sich im Vergleich zu anderen automatischen Präparationen als zuverlässiger und sensitiver gezeigt hat. Im Verlauf dieser Arbeit wurde von der Bioinformatikgruppe (Dr. F. Pfeiffer) das web-basierte HALOLEX-System entwickelt, welches als Ziel die vollständige Erfassung aller Fakten zu H. salinarum hat. Die generierten Daten (Gele, Proteinidentifizierungen, MALDI-Peaks, MS/MS-Peaks) werden innerhalb dieser Oberfläche zugänglich gemacht und erlauben detaillierte Nachanalysen. Für das Membranproteom wurde gezeigt, dass der etablierte Zellaufschluss mittels Niedrigsalz-Dialyse zu einer erheblichen Kontamination mit löslichen Proteinen führt. Ein Aufschluss unter Hochsalzbedingungen mit anschließender Dichtegradienten-Zentrifugation reinigt die Membran, jedoch dissoziiert die Zellmembran bei anschließender Niedrigsalz-Behandlung in hohem Maße in nicht pelletierbare Fragmente. Eine optimierte Membranaufarbeitung unter ständigen Hochsalzbedingungen, Dichtegradienten-Zentrifugation, Delipidierung und Solubilisierung in einer Detergenzienmischung (Triton X-100/ASB-14) führte bei anschließender zweidimensionaler Trennung (IEF/SDS) zur Identifizierung von fast ausschließlich peripheren Membranproteinen. Mit einer fluoreszenzmarkierten Membranfraktion konnte gezeigt werden, dass der Verlust von integralen Membranproteinen auf einer nahezu quantitativen Präzipitation der Membranproteine an derem pI beruht. Eine pI-unabhängige Strategie wurde mittels BAC/SDS etabliert, die speziell bei H. salinarum zu einer guten Proteinauftrennung führt. Die Identifizierung eines 13 TM-Antiporters (0,22 TM/kD, GRAVY +0,74) als dominantestes Protein dieser Membranfraktion zeigt die Anwendbarkeit dieses Systems. In einem Vergleich von Membranfraktionen aus aerob und phototroph gewachsenen Kulturen konnten so Unterschiede des Expressionsniveaus von Membranproteinen nachgewiesen werden. Aus theoretischen Berechnungen der vorhergesagten Membranproteine zeigte sich weiterhin, dass bei tryptischer Spaltung nicht ausreichend Peptid-Fragmente generiert werden, um mittels MALDI-Fingerprint-Analyse identifiziert zu werden. Diese (H. salinarum spezifische) Problematik kann mittels MS/MS umgangen werden. Bei der Kombination aus 1-D Gel und LC/MS/MS konnten schließlich 114 integrale Membranproteine identifiziert werden, was 20% des integralen Membranproteoms entspricht.

MIPs (major intrinsic proteins) sind eine Gruppe von Transport-Proteinen, die ubiquitär in Archaea, Pro- und Eukaryoten zu finden sind. Neben spezifischen Wasserkanalproteinen (Aquaporine) sind einige Mitglieder dieser Familie permeabel für andere kleine und ungeladene Moleküle, wie z.B. Glycerin. Als Grundlage zur Funktionsaufklärung der 38 MIP-Mitglieder in A. thaliana wurden ihre transkriptionellen Reaktionen untersucht. Dazu wurde ein DNA-Array mit Sonden aus dem 3´-untranslatierten Bereich dieser Gene entwickelt, der die Unterscheidung der oft hoch homologen Mitglieder auf Transkript-Ebene zuließ, wozu längere cDNA-Sonden nicht geeignet sind. Eine TIP1;2 cDNA-Sonde, die Teile der kodierenden Sequenzen enthielt, zeigte in einem Hybridisierungsexperiment eine 40 %-ige Kreuzhybridisierung mit dem homologen TIP1;1. Die Spezifität der Sonden wurde in Zusammenarbeit mit dem Munich Information Center for Protein Sequences bioinformatisch überprüft. Das stringente Auswahlkriterium dieser Analysen, woraufhin eine Sonde bis zu einer 70 %-igen Homologie über 70 bp nicht kreuzhybridisiert, konnte auch experimentell gestützt werden. Der Vergleich der Signalintensitäten einer 172 bp langen, spezifischen Sonde mit einer 774 bp langen cDNA-Sonde ließ zudem darauf schließen, dass die Spezifität der verwendeten 3´-UTR-Sonden die Sensitivität nicht beeinträchtigte. Eine Organ-spezifische Expressions-Analyse zeigte, dass MIPs in allen untersuchten Organen (Wurzeln, Blätter, Stängeln, Blüten und Schoten) exprimiert werden. Die meisten MIPs (24 von 38) und die höchsten Expressionsniveaus wurden in der Wurzel detektiert. In Blättern konnten hingegen nur 11 von 38 MIP-Mitgliedern nachgewiesen werden. Die geringsten Expressionen zeigten die Mitglieder aus der NIP- und SIP-Subfamilie. Zu den am höchsten und in der Pflanze ubiquitär exprimierten MIPs zählten die PIP-Mitglieder PIP1;1, PIP1;2 und PIP2;1 sowie die TIP-Mitglieder TIP1;1 und TIP2;1, von denen bekannt ist, dass sie als Wasserkanal-Proteine fungieren. Die Möglichkeit, die Wasserpermeabilität von Membranen regulieren zu können, dürfte somit von zentraler Bedeutung in der ganzen Pflanze sein. Neben ubiquitär exprimierten MIPs sind einige nur ausschließlich oder bevorzugt in bestimmten Organen zu finden, z.B. PIP1;4, PIP2;6 und PIP2;7 in der Blüte und NIPs hauptsächlich in der Wurzel. Deren Funktion könnte neben einem Organ- oder Zell-spezifischen Wassertransport auch die Permeation anderer ungeladener Moleküle beinhalten, da die Transporteigenschaften dieser Mitglieder nicht geklärt sind. Das Expressionsprofil der MIP-Genfamilie in verschiedenen Organen sowie die unterschiedliche Reaktion auf Wasserstress (s.u.) lassen auf differenzielle Funktionen der einzelnen MIP-Mitglieder schließen. Lediglich TIP1;1 und TIP1;2 konnten nach diesen Kriterien nicht eindeutig unterschieden werden. Durch Zugabe von 100 mM NaCl und 200 mM Sorbiotol zu hydroponisch angezogenen A. thaliana-Pflanzen wurde über einen Zeitraum von 48 Stunden die transkriptionelle Reaktion der MIP-Familie auf diese Wasserstressbedingungen verfolgt. In Wurzeln wurde festgestellt, dass innerhalb der ersten 24 Stunden bei beiden Stressoren die hoch exprimierten PIP-Aquaporine PIP1;1 und PIP2;2 sowie PIP1;3 reprimiert, TIPAquaporine wie TIP1;1 und TIP2;1 zu diesem Zeitpunkt jedoch unbeeinflusst sind. Die Pflanze verringert demnach bei Wasserstress zuerst die Wasserpermeabilität der Plasmamembran, sofern sich die transkriptionelle Suppression auf Proteinebene widerspiegelt. Interessanterweise zeigte sich im Blatt eine frühe Repression der hoch exprimierten TIPAquaporine TIP1;1 und TIP2;1. Die in der Wurzel reagierenden Aquaporine aus der PIPSubfamilie zeigen im Blatt jedoch keine transkriptionellen Änderungen. Zusammenfassung 95 Diese frühen Repressionen von TIP1;1 und TIP2;1 lassen vermuten, dass es in Blättern wichtig ist, möglichst rasch unter Wasserstress die Wasserpermeabilität des Tonoplasten zu senken. Dies könnte der Stabilisierung des Zell-Turgors dienen und/oder mit einem verringerten Blattwachstum einhergehen. Die ähnlichen Transkriptionsantworten und Kinetiken der MIPs bei NaCl- und Sorbitolstress lassen zudem vermuten, dass MIPs auch unter NaCl-Stress primär auf die osmotische Veränderung in der Nährlösung reagieren bzw. über ähnliche Signalwege reguliert werden. Die parallele Untersuchung transkriptioneller Änderungen von bekannten Stress-Markergenen und Genen des Sekundärmetabolismus unter NaCl- und Sorbitolstress ergab zusätzliche Hinweise auf überlappende und Stressor-spezifische Reaktionen in Wurzeln und Blättern. Eine bekannte Reaktion auf Salz- und osmotischen Stress ist die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies, die sowohl als Signalmoleküle fungieren als auch Schädigungen verursachen können. Die Induktionen der beiden Peroxidasen GPX1 und PRXCB in Blättern und Wurzeln deuten auf eine Beteiligung bei Entgiftungsreaktionen von H2O2 unter Wasserstress hin. Einzelne Mitglieder aus der Familie der UDP-Glycosyltransferasen und Cytochrom P450-Monooxygenasen, wie UGT74F2 und CYP81D1, zeigten bei Salz- und Sorbitolstress überlappende Reaktionen, was darauf hindeutet, dass spezifische Teile des Sekundärstoffmetabolismus ähnlich beeinflusst werden. Daneben zeigten andere Mitglieder aus diesen Gen-Familien spezifische Reaktionen auf die beiden Stressoren. So waren in der Wurzel nach 48 Stunden Sorbitolstress viele CYPs und UGTs reprimiert. Die Pflanze scheint also exklusiv bei Sorbitolstress spezifische, in ihrer genauen Funktion noch unbekannte Teile des Sekundärmetabolismus zu supprimieren. Die unterschiedlichen Reaktionen einer Reihe weiterer Gene auf Salz oder Sorbitol in Blättern und Wurzeln identifizierten zudem differenzielle Stress-Antworten innerhalb der Pflanze. Es wurden zwei Insertionsmutanten in den MIP-Genen PIP2;1 und PIP1;4 isoliert. Transkript-Untersuchungen dieser Mutanten zeigten, dass durch das Ausschalten dieser PIPs alle anderen MIP-Mitglieder, sowohl bei ungestressten als auch unter NaCl-Stress- Bedingungen, keine Änderungen in ihrer Transkriptionsantwort im Vergleich zum Wildtyp zeigen. Möglicherweise besitzen die untersuchten PIP-Mitglieder eine spezifische Funktion, die andere MIPs nicht kompensieren können, oder möglicherweise kommt es in der Pflanze zu veränderten Reaktionen, die anhand der vorliegenden Untersuchungen nicht erkennbar waren.