Podcasts about substraten

Fräsen mit Wendeschneidplatten ist ersteinmal nichts neues. Das aber auch hier die Innovation und Entwicklung nicht stehen bleiben, beweist einmal mehr die Firma Walter Tools.  Optimierungen an den Geometrien, den Plattensitzen, den Substraten und vor allem auch an den Beschichtungen führen zu deutlichen Steigerungen von Performance und Standzeiten.  In dieser Podcast-Episode verraten Jasmin Kleine Hermelink und Nicole Howind, worauf es bei der Auswahl und dem richtigen Einsatz von Walter Wendeschneidplatten ankommt. Wie man durch das Walter-GPS zur richtigen Plattenauswahl und den passenden Schnittparametern gelangt, sowie viele weitere insights.   Hast du weitere Fragen, Anregungen oder Kritik? Dann schreibe mir einfach eine E-Mail an: info@rathmann-engineering.com Gerne kannst du mich auch über LinkedIn erreichen: https://bit.ly/3pe5icK    

Seit September 2021 ist die Verwendung von verarbeitetem Insektenprotein in Geflügel- und Schweinefutter zugelassen. Seitdem hat die Nachfrage der Futtermühlen stark zugenommen. Dahinter steckt unter anderem die Hoffnung, Soja teilweise ersetzen und damit ein Stück der Eiweißlücke schließen zu können. Versuche haben gezeigt, dass Insektenprotein Soja, abhängig vom Einsatzzweck, tatsächlich bis zu 100 % ersetzen kann. Auch wenn der Aminosäuregehalt in der Diskussion häufig als Manko angeführt wird, entscheidet laut der Experten vielmehr die Qualität des Insektenproteins über den Einsatzerfolg – und diese wiederum geht auf eine verlustfreie Gewinnung, eine schonende Verarbeitung und auf eine gute Verdaulichkeit zurück. Vor dem Hintergrund einer nachhaltigen Futtermittelerzeugung könnten Nutzinsekten künftig durchaus eine große Rolle spielen, insbesondere wenn sie im Sinne einer Kreislaufwirtschaft auf Substraten aus Reststoffen, zum Beispiel aus der Lebensmittelherstellung, erzeugt werden könnten. Was aber ist zurzeit erlaubt, was ist sinnvoll und ökonomisch vertretbar? Ist Insektenprotein tatsächlich eine Chance für die Nutztierfütterung oder sollten wir die Hoffnungen vielleicht noch nicht zu hoch ansetzen? Susanne Gäckler von der DLG und Dr. Christian Lambertz vom FiBL sprachen dazu mit Prof. Dr. Wilhelm Windisch von der TUM School of Life Sciences der Technischen Universität München und Heinrich Katz, Geschäftsführer der Hermetia Baruth GmbH und Vorstandsmitglied der Internationalen Plattform für die Nutzung von Insekten als Lebensmittel und Futter (IPIFF) und erhielten spannende Einblicke in die Chancen, aber auch Herausforderungen dieses noch jungen Industriezweigs. Hören Sie wieder rein ins Netzwerk Fokus Tierwohl und folgen Sie den Netzwerk-Experten bei ihrer Reise in die Welt der Nutzinsekten!

Am Ende geht es bei sportlicher Belastung erstmal um eins: Muskelkontraktionen. Damit eine entsprechende Muskelkette passend für die Fortbewegung kontrahiert, braucht es chemische Energie in Form von ATP. Dieses muss in den energieliefernden Systemen bereitgestellt werden. In der 42. Folge des HYCYS Podcasts „Junkmiles“ kümmern sich Daniel Beck (Journalist) und Björn Geesmann (Sportwissenschaftler) um die Energiesysteme, die aus essbaren Substraten oder körpereigenen Speichern am Ende ATP generieren. Wie sich diese Systeme hinsichtlich der Substrate, der Performance und der Kapazität unterscheiden und wie diese am Ende ineinandergreifen, erfahrt ihr in der neuen Junkmiles-Folge.

Hallo, schön, dass Du wieder dabei bist und wir uns mit dem Thema Stoffwechsel beschäftigen können. :) Dazu werden wir uns heute die kompetitive & nichtkompetitive Hemmung anschauen. Bevor wir aber damit starten, möchte ich Dir noch etwas zu Enzymen und Substraten erzählen, da diese hier eine wichtige Rolle spielen. Dann werde ich Dir die kompetitive und nichtkompetitive Hemmung nacheinander erklären und wiederholen, damit Du es auch sicher verstehst. Übrigens haben wir jetzt auch eine eigene Website, schaue doch gerne mal auf: https://www.9thwear.com vorbei. :) Dein Name als Unterstützer am Anfang jeder Podcast-Folge? Ich werde Dich am Anfang der nächsten Podcast-Folge namentlich aufführen. Wenn Dir der Podcast zu einem besseren Gefühl oder einer besseren Note verholfen hat, dann freue ich mich über Deine Unterstützung, damit können wir sicherstellen, dass wir weiterhin für Dich tolle Lerninhalte präsentieren können. Mit Paypal kannst Du uns mit folgendem Link unterstützen: https://www.paypal.me/abiturcrashkurs Auch mit einer Bewertung bei Apple Podcasts oder einer lieben Nachricht von Dir kannst Du uns gern unterstützen ❤ Audiovisuelle Direktion & Produktion: Christian Horn

Summary The current study presents a unique and intensified interdisciplinary geo-ecological study in the Karst of the Northern Calcareous Alps. This is a study focussing on fundamental research. The investigation area in question focusses on the Reiteralpe in the Berchtesgadener Alps, in which a range of research methods, which in their choice and range have not been used to this extent before, are optimal for further adaptation in silmiliar ecological systems and environments. The results of the study are elementary and moreover profound to the extent that mappings of outcrops have been identified which however have not been identified before by the scientists involved in researching this area over the past hundred years. It was possible to map outcrops of pleistocene loess deposits, holocene aeolian dust deposits and moreover laterite bauxite outcrops of the Gosau Formation thereby resulting in the production of new soil and diverse outcrop maps as well as presenting a new geological stratigraphy for the Berchtesgadener Alps. A combination of soil mapping techniques in combination with using geo-radar technology made it possible to identify a pleistocene glacial cirque and cirque threshhold at 1800m NN on a south slope which likewise had not been identified in the past. An extenive soil mapping programme taking microtopographical elements of mountain terrains into consideration were extensively investigated mainly focussing on geology, aspect, slope morphology, vegetational cover and elevation. Loess derived soils and (pre-) tertiary soils and holocene soils have been identified in association with mineralgogical anaysis as a result of the mappings. Functions relating to soil depth, grain size distribution of soil horizons, clay formation and spatial distribution in a high altitude mountain karst geo system have been undertaken.The intensely enriced aluminium and iron content of the soils associated with the Gosau Formations were mineralogically analysed and the intensively weathered terra fusca soil formations investigated. Precipitation sampling during summer months were analysed respective recent holocene aeolian dust deposits in quantity, quality, spatial distribution, silica grain size distribution and mineralogical composition. The results of which were transferred with a focus on the spatial micro topographical and gemorphological distribution. With this data, a correlation was made to organic horizons of polygentetcial soil formations.

In der vorgelegten Arbeit wurden Histonmethyltransferasen untersucht. Die beiden SET-Proteine, Enhancer of Zeste (E(z)) und PRset7 methylieren jeweils spezifische Lysine in den N-Termini der Histonmoleküle H3 bzw. H4 und wurden zu Beginn in E. coli exprimiert. In Histonmethyltransferase-(HMTase)-Versuchen konnte mit E(z) keine Aktivität erzielt werden. Mit einer eingeführten Mutation des aktiven Zentrums („E(z)mut“) und mit E(z) konnte nach der Inkubation mit Drosophila-Kernextrakten an beiden Proteinen die Histondeacetylase Rpd3 nachgewiesen werden, die enzymatisch aktiv war. Unsere Arbeitsgruppe konnte die HMTase-Aktivität eines E(z)-Komplexes bestätigen, die von einer (nicht-mutierten) SET-Domäne abhängt (Czermin et al., 2002). Die Untersuchungen zur Histonmethyltransferase PRset7 begannen mit Aktivitäts- und Spezifitätsversuchen an verschiedenen Substraten. Die nukleosomale Spezifität von PRset7 bestätigte sich gemäß den Ergebnissen von Fang et al. und Nishioka et al. (Fang et al., 2002; Nishioka et al., 2002b). PRset7 unterschied klar zwischen rekombinanten Nukleosomen (Histone rekombinant in E.coli exprimiert) und nativen Nukleosomen (Histone aus Drosophila-Embryos gereinigt), wobei letztere deutlich vermindert methyliert wurden. An rekombinanten, mit PRset7 methylierten Nukleosomen, konnte mit einem H4 K20-methyl-Antikörper eine H4 K20-Methylierung detektiert werden. Mit Hilfe verschiedener, rekombinanter Nukleosomen, deren H4-Moleküle N-terminal unterschiedlich lang waren, konnte die Substraterkennung bzw. -bindung von PRset7 auf maximal 9 Aminosäuren vor Lysin 20 eingegrenzt werden. Durch die Reinigung des Proteins wurde deutlich, dass kürzere Degradationsprodukte von PRset7 den wesentlichen Anteil der detektierten HMTase-Aktivität ausgemacht hatten, ohne die hohe nukleosomale Substratspezifität zu verlieren. Für die Substratherstellung weiterer in vitro-Versuche zur Beziehung zwischen H4-Acetylierung (K12 bzw. K16) und H4-Methylierung (K20) wurde die Histonacetyltransferase MOF rekombinant hergestellt, gereinigt und die enzymatische Aktivität bestätigt. Es ergab sich keine eindeutige positive oder negative gegenseitige Beeinflussung der beiden Modifikationen. Abschließend wurden die verwendeten Antikörper bezüglich ihrer Spezifität untersucht, welche gegeben war.

The ubiquitin-proteasome system (UPS) is the major system for nucleo-/cytoplasmic proteolysis in eukaryotes. Here, proteolytic substrates are recognized by the proteasome, a large protease, after their covalent modification with chains of the small protein ubiquitin. Chaperones are important components of the UPS. In yeast, the AAA ATPase Cdc48 mediates the degradation of artificial Ubiquitin Fusion Degradation (UFD) substrates and of Spt23 p90, a transcription factor that regulates the OLE1 gene. In these processes, Cdc48 is assisted by multiple accessory factors, such as the ubiquitin E4 enzyme Ufd2 or Ufd3, a protein of unclear function. ufd3 mutants display certain similarities to mutants in deubiquitylating enzymes. Here, I show that Ufd2/E4 and Ufd3 bind to Cdc48 via the same interaction site and compete with each other for Cdc48 binding. Ufd2 binding results in substrate multiubiquitylation and degradation via the proteasomal receptors Rad23 and Dsk2, which interact with Ufd2. Ufd3 binding to Cdc48 blocks this pathway and results in the stabilization of Cdc48 substrates. In this function, Ufd3 is assisted by the newly identified deubiquitylating enzyme Otu1 which also interacts with Cdc48. In conclusion, the stability of Cdc48 substrates is determined by an equilibrium between the antagonistic activities of Ufd2/E4, Ufd3 and Otu1.

Die Inaktivierung des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressors spielt eine Rolle in der Entstehung von verschiedenen gut- und bösartigen Tumoren mit hoher Gewebespezifität. Als substraterkennende Untereinheit des CBCVHL Ubiquitin Ligase Komplexes steuert VHL den sauerstoffabhängigen Abbau des Transkriptionsfaktors HIF1/2α. HIF1/2α aktiviert die Transkription einer Vielzahl von Faktoren, die für den Energiehaushalt der Zelle und die Blutgefäßneubildung von entscheidender Bedeutung sind. Die Akkumulation von HIF1/2α führt zu deren konstitutiver Expression und fördert somit das Wachstum von Tumoren durch eine verbesserte Nährstoffversorgung. Der sauerstoffabhängige Mechanismus der HIF-Erkennung wird durch die Aktivität einer neuen Familie von Prolylhydroxylasen reguliert, die möglicherweise ihrerseits eine Reihe von zellulären Substraten haben. Trotz der guten Korrelation zwischen bestimmten, den HIF-Abbau beeinflussenden VHL-Mutationen und dem Auftreten von verschiedenen Krankheitssubtypen sind noch nicht alle Phänotypen im Zusammenhang mit VHL erklärbar. Vor allem die Identifizierung neuer Substrate für den CBCVHL Komplex ist für ein umfassendes Verständnis der VHL-Krankheit von Interesse. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Methoden zur Identifizierung neuer Substrate von VHL angewendet. Durch Affinitätschromatographie mit einem rekombinanten Komplex aus VHL, Elongin B und Elongin C (VCB) konnte Daxx als neuer Interaktor von VHL identifiziert werden. Daxx bindet Elongin B/C-unabhängig an VHL, und seine Stabilität wird nicht durch VHL reguliert. Zudem bildet Daxx einen Komplex mit dem VHL-Substrat HIF1α. Dies weist auf eine mögliche Funktion von VHL neben seiner Rolle als Ubiquitin Ligase hin, z.B. in der Regulation von Daxx als transkriptionellem Repressor. In einem funktionalisierten „TwoHybrid“-Screen konnte der Mechanismus der HIF-Regulation in S. cerevisiae rekonstituiert werden. Dies ermöglichte die Identifizierung weiterer potentieller VHL-Substrate, unter anderem Diacylglycerol Kinase iota (DGKι). DGKι weist zwei Erkennungsmotive für Prolylhydroxylasen auf und wird in Gehirn und Retina exprimiert. In diesem Organen kommt es bei VHL-Patienten zur Entstehung von Hämangioblastomen. DGKι wird in vivo ubiquityliert und bindet sowohl an VHL, als auch an zwei der drei bekannten Prolylhydroxylasen. Mit Mutanten von DGKι konnte allerdings gezeigt werden, dass Bindung und Ubiquitylierung nicht über den gleichen Mechanismus erfolgen wie bei HIF1α. Möglicherweise spielen Ubiquitylierung und VHL-Bindung getrennte Rollen in unterschiedlichen zellulären Prozessen. Es wird zunehmend deutlicher, dass VHL nicht nur eine Komponente des CBCVHL Komplexes bildet, sondern weitere Funktionen in der Zelle erfüllt. VHL spielt eine Rolle in der Assemblierung der Fibronektinmatrix, der Regulation von Mikrotubulistabilität und –dynamik und der Transkriptionskontrolle. Eine weitere Charakterisierung des nicht-degradativen Einflusses von VHL auf die in dieser Arbeit beschriebenen Bindungspartner ist nötig, um die zelluläre Wirkungsweise von VHL vollständig zu verstehen.

Die Verwendung akustischer Oberflächenwellen (OFW) zum Transport kleinster Flüssigkeitsmengen stellt eine besonders elegante Methode dar ein mikrofluidisches System zu realisieren. Der Transport kleinster Flüssigkeitsmengen durch eine OFW bringt große Vorteile mit sich. Das System besitzt keine beweglichen Bauteile, ist von außen leicht zugänglich und wird ausschließlich durch Planartechnologie hergestellt. Ein wesentlicher Bestandteil zur Anfertigung dieser Arbeit war die Untersuchung akustisch induzierter Mischvorgänge. Die Fluidik im flüssigkeitsgefüllten Spalt und speziell der Mischvorgang in einem engen Spalt wurde betrachtet. Mit diesen Betrachtungen erhielt man die Möglichkeit, die Wirkung des elektrischen Feldes der OFW, das bei Ausbreitung einer OFW auf einem piezoelektrischen Substrat vorhanden ist, zu untersuchen. Durch die Verringerung des mechanischen Einfluss' auf die Flüssigkeit ergab sich die Möglichkeit die Wirkung des elektrischen Feldes der OFW auf eine im Spalt befindliche Nanotubelösung zu beobachten. Füllte man eine Nanotubelösung in den Spalt, erfuhren die Nanotubes Kräfte durch die Fluidik und das elektrische Feld. Das Zusammenspiel der beiden Kräfte bietet die Möglichkeit Nanotubes auszurichten. Wie Nanotubes wurden auch Flüssigkristallmoleküle ausgerichtet und der dazu notwendige Aufbau in eine geeignete Optik integriert. Bei den Untersuchungen erwiesen sich Scherwellenbauteile als geeignete Testsysteme die Ergebnisse einer weiteren Prüfung zu unterziehen. Mit Untersuchung der Eigenschaften der Scherwellenbauteile, zeigte sich ihre Einsatzmöglichkeit in der Mikrofluidik für Aktorik und Sensorik. Mit Verwendung der Scherwellenbauteile bot sich im weiteren an Volumenmoden und Modenkonversion zu studieren. Es zeigte sich, dass Volumenmoden in der akustisch getriebenen Fluidik sehr vorteilhaft eingesetzt werden können, um kleinste Mengen Flüssigkeiten zu mischen. Dazu zeigte sich die Möglichkeit auf, die Technik der akustisch getriebenen Fluidik auf beliebige Materialien zu erweitern und für Mischeraufbauten zu nutzen. Neben dem Mischen verschiedener Bestandteile ist die Trennung verschiedener Inhalte einer Flüssigkeit betrachtet worden. Unter Verwendung elektrischer Felder wurde Separation eines elektrophoretisch beweglichen Farbstoffs aus einem akustisch getriebenen Fluss in einem kontinuierlich fließenden System betrachtet. Bei diesen Untersuchungen wurde auch die Verwendbarkeit planarer Elektroden gezeigt und die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Wasser auf Elektrolyte. Mit den Erfahrungen dieser Untersuchungen wurde zum Abschluss eine Gelelektrophorese für einen Chip mit akustisch getriebener Fluidik entwickelt. Das System lies sich ohne Technologiebruch in ein Gesamtsystem integrieren. Dieses Beispiel für eine Anwendung des Systems zeigt die Verwendbarkeit für Alltagsprobleme wie der Analyse.

Die Innenmembran von Mitochondrien besitzt zwei Translokasen für den Import von Proteinen. Der TIM23-Komplex vermittelt die Translokation über und in die Innenmembran, der TIM22-Komplex inseriert Proteine mit mehreren hydrophoben Segmenten in die Innenmembran. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Komponenten dieser Translokationsmaschinerien in N. crassa und S. cerevisiae identifiziert und charakterisiert werden. In N. crassa waren zu Beginn der Arbeit im Vergleich zu S. cerevisiae nur wenige Komponenten der TIM-Translokasen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Tim22, Tim54 und Tim44 in N. crassa identifiziert. Dies wurde entweder durch die Verwendung degenerierter Primer in PCR-Reaktionen mit cDNA aus N. crassa oder durch Durchmustern von Datenbanken erreicht. Die identifizierten Proteine des TIM22-Komplexes wurden bezüglich ihrer Lokalisation und Topologie untersucht. Es handelt sich bei Tim22 um ein Membranprotein der inneren mitochondrialen Membran mit vier Transmembranhelices, das sowohl den N- als auch den C-Terminus in den Intermembranraum exponiert. Tim54 ist ebenso in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt nur eine Transmembranhelix. Der größte Teil des Proteins liegt im Intermembranraum, nur wenige Aminosäurereste befinden sich in der mitochondrialen Matrix. Ferner wurde der TIM22-Komplex von N. crassa charakterisiert. Dazu zählten die Untersuchungen der beteiligten Komponenten, der Komplexgröße und der Stabilität des Komplexes. In N. crassa besteht der TIM22-Komplex aus den Komponenten Tim22, Tim54, Tim9 und Tim10, die einen etwa 350 kDa großen Komplex bilden. Für spätere funktionelle Untersuchungen wurde der TIM22-Komplex bzw. Tim22 alleine gereinigt. Beides wurde in Lipidvesikel rekonstituiert. Dieses Verfahren bietet die Grundlage für Untersuchungen in einem definierten experimentellen System, wie Proteine der Carrier-Familie in Lipidmembranen inseriert werden. In S. cerevisiae wurde mit Tim16 eine neue Komponente des mitochondrialen Importmotors des TIM23-Komplexes identifiziert. Dies konnte durch Koreinigung mit einer weiteren Komponente des Importmotors, Tim14, erreicht werden. Die strukturelle Vorhersage für Tim16 ähnelt stark der des J-Proteins Tim14. Tim16 fehlt allerdings das für die Funktion von J-Proteinen essentielle HPD-Motiv. Tim16 ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und peripher mit der inneren mitochondrialen Membran assoziiert. Durch Depletion von Tim16 wird der Import von Substraten in Mitochondrien beeinträchtigt, die vom mitochondrialen Importmotor abhängig sind. Durch Koimmunopräzipitationen und Quervernetzungsexperimente wurde Tim16 als neue Komponente des mitochondrialen Importmotors der TIM23-Translokase definiert. Funktionell spielt Tim16 eine große Rolle für die Integrität des Importmotors. Die genaue Struktur des Importmotors, seine Regulation und dessen Dynamik im Zuge der Translokation von Präproteinen muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden.

Grundlegend für die Entwicklung molekularer Werkzeuge ist es, Kontrolle über das Verhalten einzelner Moleküle zu erlangen. Ein Beispiel dafür ist das gezieltes An- und Abkoppeln ein-zelner Moleküle an Oberflächen, das eine Basis für eine Vielzahl von Anwendungen bietet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde unter Verwendung der AFM- Einzelmolekülkraftspektroskopie untersucht, wie und unter welchen Umständen einzelne Polyelektrolytmoleküle an funkti-onalisierte oder unfunktionalisierte Oberflächen binden und es wurden Ansätze entwickelt, wie dieses Bindungsverhalten beeinflusst werden kann: ∑ Abhängig von den experimentellen Rahmenbedingungen und der Dissoziationskonstante der untersuchten Bindungen, kann die angelegte Kraftrate einen Einfluß auf die gemessene Abrisskraft haben. Ist dies der Fall, muss eine differenzierte Analyse der gemessenen Daten erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Ansätze entwickelt, die eine effiziente und aussagekräftige Datenanalyse über das gesamte Spektrum an messbaren Wechselwirkungen ermöglichen. ∑ Aufgrund ihrer vielfältigen Anwendungsmöglichkeit ist die Polyelektrolytadsorption an feste Substrate im Blickpunkt des Interesses, sowohl im akademischen als auch im industriellen Bereich. Bei der Adsorption von Polyelektrolytmolekülen an Oberflächen sind viele verschiedene Arten von nichtkovalenten Wechselwirkungen beteiligt. Auf der Basis von kraftspektroskopischen Untersuchungen auf unterschiedlichen Substraten wurden erstmals Ansätze entwickelt, die es erlauben, verschiedenste Arten von Wechselwirkungen zu identifizieren und zu charakterisieren. ∑ Extern angelegte elektrische Felder bieten eine Möglichkeit, direkt auf einzelne geladene Moleküle Einfluss zu nehmen. Um dieses Konzept zu realisieren, wurde ein ent-sprechender Aufbau entwickelt, der eine Kombination von Elektrochemie und Kraft-spektroskopie ermöglicht. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindungsstärke von Polyelektrolyten an leitfähige Substrate über anziehende Potenziale verstärkt und über abstoßende Potenziale erniedrigt werden kann. Beim Anschalten anziehender Potenziale konnten individuelle Polyelektrolytmoleküle auch über größere Entfernungen ein-gefangen werden. Mittels an- und abstoßender Spannungspulse konnte erstmals gezeigt werden, dass einzelne Polyelektrolytmoleküle wiederholt an- und abgekoppelt werden können.

Die Inhibition der b-Sekretase stellt derzeit einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie der Alzheimer Krankheit dar. Der Hauptanteil der b-Sekretase Aktivität ist auf BACE-1, eine neuartige membrangebundene Typ I Aspartylprotease, zurückzuführen. Um gezielt spezifische und wirksame Inhibitoren entwickeln zu können, ist es notwendig, die Eigenschaften und katalytischen Spezifitäten der Protease genauer zu verstehen. Da neben BACE-1 eine weitere hochgradig homologe Aspartylprotease, BACE-2, bekannt ist, ist es für die Suche nach Inhibitoren ferner von Bedeutung, charakteristische Unterschiede zwischen den beiden Enzymen zu kennen, um mögliche Kreuzreaktionen der Inhibitoren minimieren zu können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die beiden Enzyme bezüglich ihrer posttranslationalen Modifikationen und insbesondere ihrer katalytischen Spezifitäten vergleichend zu analysieren. Als Modell für die durchgeführten Experimente dienten HEK293 Zellen, mit exogener Expression der beiden Proteasen, sowie dem Substrat bAPP. Beide Proteine werden in ähnlicher Weise durch die kovalente Bindung komplexer Kohlehydrateinheiten modifiziert. Matures BACE-1 besitzt im Vergleich zu BACE-2 eine eine längere Halbwertszeit. In vitro werden beide Enzyme durch CK1 an homologen Serinen in der zytoplasmatischen Domäne phosphoryliert. Während für BACE-2 bisher nicht schlüssig gezeigt werden konnte, dass auch in vivo eine Phosphorylierung erfolgt, wurde für BACE-1 S498 auch als Phosphorylierungsstelle in vivo bestätigt. Mittels Biotinylierung konnte demonstriert werden, dass beide BACE-Proteasen effizient an die Zelloberfläche transportiert werden. Im Gegensatz zu BACE-1, welches rasch in endosomale Kompartimente reinternalisiert wird und phosphorylierungsabhängig zurück zum TGN transportiert wird, wird BACE-2 entweder durch Spaltung der Ektodomäne in den extrazellulären Raum sezerniert, oder aber unmittelbar nach der Reinternalsierung ins Zellinnere in lysosomalen Kompartimenten abgebaut. Dieser Unterschied begründet vermutlich die unterschiedlichen Halbwertszeiten der beiden Proteine und erhöht gleichzeitig die Gesamtverweildauer von BACE-1 in endosomalen Kompartimenten, die aufgrund ihres pH-Wertes günstige Bedingungen für die proteolytische Aktivität des Enzyms schaffen. Hinsichtlich der katalytischen Spezifität bezüglich des membrangebundenen bAPP unterscheiden sich BACE-1 und BACE-2 grundlegend. Während BACE-1 die erwarteten b-Sekretase Spaltungen an Asp1 und Glu11 der Ab-Domäne katalysiert, spaltet BACE-2 vorzugsweise zwischen Phe19 und Phe20 der Ab-Domäne, wodurch Spaltprodukte entstehen, die denen der a-Sekretase Spaltung ähneln. Durch Koexpression der beiden Enzyme konnte gezeigt werden, dass BACE-2 die BACE-1 abhängige Prozessierung des Substrates direkt oder indirekt beeinflussen kann. Die Behandlung der entsprechenden Zelllinien mit BFA oder Monensin belegt, dass BACE-1 bereits in den frühen Kompartimenten des sekretorischen Prozessierungsweges proteolytisch aktiv sein kann, während BACE-2 auch nach exogener Expression keine Aktivität in diesen Kompartimenten zeigt. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen wurde bewiesen, dass BACE-1 und BACE-2 entgegen bisheriger Annahmen nicht ausschließlich die proteolytische Spaltung membrangebundener bAPP Substrate katalysieren, sondern zudem Ab-Peptide, nach ihrer Freisetzung durch g-Sekretase, C-terminal verkürzen können. In vitro Versuche zeigen, dass BACE-1 selbst in der Lage ist, Ab 1-40 an Position 34 zu spalten und dieser Schnitt nicht wie bislang angenommen durch g-Sekretase katalysiert wird. Dieser Vorgang führt in vivo zu einer Reduktion der amyloidogenen Ab 1-40/42 Peptide. Da sich der Nachweis des Ab 1-34 Peptides mittels konservativer Proteinanalytik schwierig gestaltet, erklärt sich, warum in Zelllinien mit exogener BACE-1 Expression keine merkliche Steigerung der Ab-Sezernierung bzw. teilweise sogar eine Reduktion detektierbar war. Letztendlich bietet die Beobachtung, dass auch Peptide als Substrate für die BACE fungieren können, interessante Ansatzpunkte für die Suche nach neuen physiologischen Substraten und Inhibitoren. Die Analyse des subzellulären Transportes und die Charakterisierung, sowohl pro- als auch antiamyloidogener Enzymaktivitäten der beiden Proteasen BACE-1 und BACE-2 liefert neue Grundlagen für die Entwicklung therapeutischer Inhibitoren und für die Suche neuer Substrate.

In der Zellbiologie leisten Elastizitätsmessungen auf der Submikrometerskala an lebenden Zellen wichtige Beiträge zur Aufklärung von Fragen der Zellmechanik. Vor diesem Hintergrund wurde in dieser Arbeit die Methode der Elastizitätsmessung mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) erweitert, um quantitative Elastizitätsuntersuchungen auch an äußerst weichen dünnen Proben durchführen zu können. Die diskutierten Proben sind dabei mit einem Elastizitätsmodul von einigen Kilopascal extrem weich und haben gleichzeitig eine Dicke von lediglich einigen 100 Nanometern. Bisherige Analysemethoden der Elastizitätsmessungen basierten meist auf dem sogenannten Hertzmodell: einem theoretischen Modell, das zum einen nur die Eindrückung in äußerst dicke Proben beschreibt und zum anderen lediglich von der AFM-Spitze abweichende Stempelgeometrien beinhaltet. Mit dem Hertzmodell berechnete Elastizitätswerte mußten daher stets als Näherung verstanden werden. Für die Analyse elastischer Eigenschaften mit dem AFM ist die genaue Kenntnis der mechanischen Wechselwirkung zwischen AFM-Spitze und Probe von zentraler Bedeutung. Diese wurde mit der Finite-Elemente-Methode (FEM) untersucht, indem die vollkommen elastische Eindrückung der AFM-Spitze in gummielastische Proben simuliert wurde. Hierbei wurde insbesondere der Einfluß der Probendicke und der Geometrie des eindrückenden Stempels auf das Kraft-Eindrückungsverhalten charakterisiert. Mit Hilfe der FEM konnte gezeigt werden, daß im Falle dünner Proben zwei unterschiedliche Ursachen bei der Analyse der Elastizitätsmessungen durch das Hertzmodell, zu einem systematischen Überschätzen des berechneten Elastizitätsmoduls führen: Einerseits die vom Hertzmodell abweichende Geometrie der AFM-Spitze und andererseits die geringe Probendicke. Letzteres führt zur Detektion des harten Substrates im Kraft-Eindrückungsprozeß. Erst bei einer Probendicke von über 1,5 µm führt das Hertzmodell bei den untersuchten weichen Proben und Auflagekräften von unter 1 nN nur noch zu geringen Abweichungen in der Elastizitätsanalyse. Dagegen ist mit dem Hertzmodell eine exakte Bestimmung der Topographie selbst extrem weicher Proben mit geringer Dicke möglich. Dazu wird der Kontaktpunkt im Kraft- Eindrückungsprozeß mittels Hertzmodell berechnet. Die Höhe der Probe wird dabei geringfügig unterschätzt, die Abweichung bewegt sich in der Größenordnung des Radius der AFM-Spitze. Zur Verbesserung der Elastizitätsanalyse wurde mit Hilfe simulierter Kraft-Eindrückungskurven eine parametrische Erweiterung des Hertzmodells entwickelt, welche sowohl die Geometrie der AFM-Spitze als auch die Dicke der Proben berücksichtigt. Das Parametrische Modell wurde für Probendicken unter 1 µm optimiert. Es ermöglicht nun die Bestimmung des Elastizitätsmoduls unabhängig von der Dicke der Probe, wodurch die Methode der Elastizitätsmessung mittels AFM deutlich verbessert werden konnte. Im Falle von homogenen Materialien ermöglicht das Parametrische Modell eine exakte Bestimmung der Dicke und des Elastizitätsmoduls der Probe. Außerdem sind mit Hilfe des Parametrischen Modells feinste Inhomogenitäten der Probe detektierbar. So ist es gelungen in Gelatinekeilen von lediglich einigen 100 nm Dicke noch tiefenabhängige Elastizitätsveränderungen aufzuspüren. Die parallele Anwendung des Hertzmodells und des Parametrischen Modells erlaubt nun auch bei inhomogenen Materialien sowohl eine exakte Bestimmung von Topographie als auch der Elastizität weicher Oberflächenschichten. Als Anwendungsbeispiel von Zellelastizitätsmessungen wurde das Adhäsionsverhaltens von Osteoblasten auf verschiedenen Substratmaterialien charakterisiert. Das Adhäsionsverhalten einzelner Zellen auf den verschiedenen Substraten wurde dabei aus den resultierenden Unterschieden in Elastizität und Morphologie der Zellen beurteilt. Diese Methode ermöglicht einen neuen Zugang zur Untersuchung der Biokompatibilität der Substratmaterialien auf zellulärer Ebene in vitro. An aktiven Herzmuskelzellen wurde das AFM zur Detektion der mechanischen Kontraktion der Zellen verwendet. In einem konfluenten Rasen synchronisiert pulsierender Zellen konnte die Veränderung der Pulsamplitude mit der lateralen Verschiebung von Kontraktionszentren korreliert werden. In den Kontraktionszentren erfolgt dabei ein Anheben (positive Amplitude) in den passiven Zwischenbereichen dagegen ein Absenken der Zelloberfläche (negative Amplitude). An aktiven Einzelzellen ist es erstmalig gelungen die Kontraktion als Funktion des Ortes zu messen. Als Parameter mit der geringsten Schwankung und damit möglicherweise als charakteristisch für die individuelle Zelle haben sich die Halbwertsbreite und Anstiegszeit der Pulse erwiesen. Durch Variationen der Auflagekraft konnten Einzelzellen gezielt belastet und deren Leistungsvermögen abgeschätzt werden. Die Zellen konnten dabei Kräfte bis zu 300 nN anheben und erreichten eine Mindestleistung von bis zu 0,5 pW.

1. Es wurde eine Methode entwickelt, die POR nach der Solubilisierung aus Etioplasten chromatographisch zur Homogenität zu reinigen. Die spezifische Aktivität konnte gegenüber der POR in Etioplasten annähernd um das 14-fache gesteigert werden. Dabei wurden alle endogenen Pigmente und Lipide abgetrennt. So konnte erstmals überzeugend mit isolierter POR aus Pflanzen gezeigt werden, daß eine Bindung an das Substrat oder das Vorhandensein einer Membranumgebung keine Voraussetzung für den Erhalt der Aktivität darstellt. 2. Mittels detaillierter Pigment- und Proteinanalysen, inklusive densitometrischer Verfahren, konnte nachgewiesen werden, daß in Etioplasten ein Molekül Pchlide a an ein Molekül POR gebunden ist. 3. Substratspezifitätsstudien mit Substratanalogen zu Pchlide a zeigten, daß strukturelle Veränderungen an den Seitenketten des Porphyrinringes A und B, nicht aber Modifikationen am Ring D oder am isozyklischen Ring E, von der POR akzeptiert werden und zu photokonvertierbaren Substraten führen. Die Ergebnisse dieser Versuche lieferten ein neues Modell zu dem Mechanismus der Katalyse. Demzufolge sind die Ringe D und E am Boden der Enzymtasche fixiert und eine Enolatbildung an der Carbonylgruppe des Ringes E an der die Reaktion beteiligt. Die Ringe A und B liegen mehr oder weniger außerhalb der Enzymtasche. Erstmals konnte die Photokonvertierbarkeit von Pchlide b, Zn-[3-acetyl]-Protopheide a und Zn-[3-formyl]-Protopheide a gezeigt werden. 4. Kinetische Untersuchungen mit den Substratanalogen stellten die Auswirkungen der verschiedenen Seitenkettenmodifikationen auf die Reaktionsgeschwindigkeit heraus. Die Pigmente ließen sich in drei Gruppen mit einer „schnellen“ (z. B. Pchlide a), einer „mittelschnellen“ (z. B. [8-Vinyl]-Pchlide a) und einer „langsamen“ (z. B. Zn-71-OH-Protopheide a) Reaktionsgeschwindigkeit einteilen. Ein komplementärer Zusammenhang zwischen Fluoreszenz- und Photoreaktion-Quantenausbeute konnte nicht festgestellt werden. 5. Über die Bestimmung der KM-Werte für Pchlide a und Pchlide b (0,47 µM, respektive 0,63 µM) wurde demonstriert daß die Affinität beider Pigmente zu der PORA aus Hafer annähernd gleich groß ist. Chlorophyll c1 konnte als kompetetiver Hemmstoff für die POR identifiziert werden. 6. Bei der Photoreduktion tritt Substrathemmung auf. Dies konnte bei einem Überschuß an Pchlide a oder Pchlide b gegenüber der POR (> 1 mol Substrat/1 mol POR) gezeigt werden. 7. An solubilisierten Etioplastenmembranen und an solubilisierter, weitgehend aufgereinigter POR konnten die unterschiedlichen spektralen in vivo-Formen des photoaktiven endogenen Pchlide a dargestellt werden. Die nach der Photoreduktion auftretende spektrale Verschiebung des Chlide a (von A680 nm nach A672 nm), die mit dem in vivo auftretenden Shibata-Shift vergleichbar ist, konnte in diesen Proben gezeigt werden. Die in der Literatur postulierte Ursache des Shibata-Shift`s, eine Freisetzung des Chlide a aus den ternären Komplexen (POR-NADPH-Chlide a), kann anhand der hier erzielten Ergebnisse bestätigt werden. 8. Es wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe an solubilisierter und zur Homogenität gereinigter POR erstmals der Einfluß von Lipiden auf den spektralen Verlauf der Photoreduktion gezeigt werden kann. Nach der Dialyse einer Mischung von Einzelkomponenten (gereinigte POR, NADPH, MGDG/DGDG/Zn-Protopheide a-Gemisch) gegen 80 % Glycerin konnte die Photoumwandlung langwellig-absorbierender ternärer Komplexe, sowie die mit dem Shibata-Shift vergleichbare Verschiebung des Produktes in vitro dargestellt werden. 9. Die Ergebnisse dieser Rekonstitutionsversuche weisen darauf hin, daß in vivo die Einbettung der ternären Komplexe in die spezielle Lipidumgebung der Prolamellarkörper für die Bildung von unterschiedlich absorbierenden spektralen Formen des photoaktiven Pchlide a verantwortlich sind.

Dieses Buch ist ein Beitrag zur zeitgenössischen Diskussion über das Universa-lienproblem. Es eignet sich auch zur Einführung in die Ontologie. Kap. 1: Darstellung der Ontologie David Armstrongs. Kap. 2: Rekonstruktion der Ontologie des polnischen Husser-Schülers und Phänomenologen Roman Ingarden. Kap. 3: Kritik am Universalienrealismus. Die Schwierigkeit liegt weniger in der Annahme von Universalien als in der Annahme von Substraten. Kap. 4: Die „Feldontologie“ wird entwickelt, als Alternative zur Substanzonto-logie.