Podcasts about leserahmen

Thu, 11 Feb 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11184/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11184/1/Teepe_Carola.pdf Teepe, Carola ddc:610, ddc:600, Me

Das zur Familie der Herpesviridae, Unterfamilie Gammaherpesvirinae, gehörende murine Herpesvirus 68 (MHV-68) besitzt mit 118 kbp wie die zu den Betaherpesvirinae gehörenden murinen und humanen Cytomegalieviren (MCMV und HCMV) mit ca. 230 kbp ein sehr großes Genom. Die Mehrzahl der 80 offenen Leserahmen wurde noch nicht charakterisiert. Zur Untersuchung dieser Gene ist die zufällige Herstellung viraler Mutanten die effiziente Methode, um zu neuen Erkenntnissen bezüglich ihrer Funktion zu gelangen. Aufgrund des großen Anteils nicht oder nur wenig charakterisierter Gene am viralen Genom und der oftmals nur geringen Homologie zu offenen Leserahmen anderer nah verwandter Herpesviren ist für MHV-68 ein Verfahren der „forward genetics“ diejenige Möglichkeit, welche den größten Erfolg verspricht. Dies beinhaltet eine ungezielte Mutagenese des viralen Genoms mit blinder Rekonstitution und nachfolgender Charakterisierung derjenigen Rekombinanten, welche einen interessanten Phänotypen zeigten. Bisher war die Herstellung rekombinanter MHV-68-Klone sehr arbeitsintensiv, da man diese gänzlich mit den Mitteln durchführen musste, welche die Methodik der Zellkultur zur Verfügung stellte. Aufgrund der Klonierung des MHV-68-Genoms als ein künstliches bakterielles Chromosom (BAC), der Etablierung des Verfahrens der Transposonmutagenese und mittels der Möglichkeit der Rekonstitution viraler Rekombinanten durch invasive Bakterien wurde diese Methode der klassischen oder forward genetics möglich. In dieser Arbeit wurde erstmals eine Mutagenese des Genoms von MHV-68 durchgeführt, die resultierenden viralen Rekombinanten rekonstituiert und einer phänotypischen Untersuchung unterzogen. Hierbei wurde das Wachstum der Mutanten auf sechs verschiedenen Zelllinien verglichen. Dies sollte grob augenscheinliche Unterschiede der rekombinanten Viren im Vergleich zu einer Wildtyp-Kontrolle nachweisen, wobei die von Brune et al. bereits etablierte Methodik an die Erfordernisse des MHV-68-Genoms angepasst werden konnte. Bezüglich des viralen Wachstums in Endothelzellen auffällig erscheinende Mutanten zeigten eine Häufung der Tn-Insertionen in der Genregion um ORF 10. Wachstumskurven bestätigten die Rolle von ORF 10 für die Fähigkeit des Virus in Endothelzellen zu replizieren. Dieses ist der erste Hinweis für eine interessante biologische Funktion dieses viralen ORFs, die in weiteren Arbeiten zu sichern und zu analysieren ist.

IL-12, ein heterodimeres Zytokin bestehend aus IL-12p40 und IL-12p35, wird hauptsächlich von Zellen des angeborenen Immunsystems als Antwort auf intrazelluläre Pathogene gebildet und induziert eine TH1 vermittelte Immun- reaktion. Hühner IL-12p40 wurde in einer EST-Datenbank identifziert und vollständig kloniert. Der Vergleich des Hühner IL-12p40 Gens mit verschiedenen Säugerhomologen ergab Aminosäureidentitäten von 39,7% bis 43,5%. In der Hühnergenomsequenz wurde das IL-12p40 Gen auf Chromosom 13 lokalisiert, es ist 4898bp lang und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Der korrespondierende offene Leserahmen besteht aus 945bp und kodiert für ein 315 Aminosäuren langes Protein. ChIL-12p40 wurde sowohl in prokaryotischen als auch in einem eukaryotischen System exprimiert und unter denaturierenden bzw. nativen Bedingungen aufgereinigt. Mit Hilfe des aus E. coli gewonnen ChIL-12p40 wurde ein polyklonales Kaninchen-a-ChIL-12p40 Antiserum entwickelt, das sowohl ChIL-12p40 aus prokaryotischem Expressionssystem als auch aus dem eukaryotischen Schneider SL-3-System erkennt und im Westernblot ChIL-12p40-Mengen bis zu 7,5ng detektiert. Die Klonierung der Hühner IL-12p35 Kette mit Hilfe von PCR mit Oligonukleotiden, spezifsch für hochkonservierte Regionen in Säugerhomologen, war nicht erfolgreich. Erst nach der Veröffentlichung der Hühnergenomsequenz konnte das Hühner IL-12p35 Gen auf Chromosom 9 identifziert wer- den. Die genomische Sequenz ist 1797bp lang und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Die kodierende Region ist 615bp lang und kodiert für ein 205 Aminosäuren langes Protein, das 26,8% bis 31,2% Identität zum Säuger aufweist. Die Gene für Hühner IL-12p40 und IL-12p35 wurden durch einen Linker hintereinander kloniert und als IL-12p40/p35 -"Flexi-IL-12" exprimiert. Zur Analyse der Expression von IL-12p40 wurde RT-PCR auf cDNA Proben durchgeführt, die von verschiedenen Zelllinien, Geweben sowie stimulierten und unstimulierten Zellen stammten. IL-12p40 Signale wurden in HD-11-, RP9-, 2D8-, T16G5-, JJ1G9-, OU2-, CEC32-Zellen und mit IL-2 stimulierten Milzleukozyten detektiert. Zur weiteren Kontrolle wurde auch IFNg und IL-18 per PCR nachgewiesen. In einem in vitro Zellsystem wurde nachgewiesen, dass das rekombinant hergestellte Hühner IL-12p40 konzentrationsabhängig Milzzellen zur Sekretion von IFNg stimuliert.

Die Superfamilie der ABC-Proteine ist eine der größten bisher bekannten Proteinfamilien. Ihre Mitglieder enthalten ein oder zwei nukleotidbindende Domänen mit je einem Walker A- und B-Motiv, sowie das charakteristische ABC-Motiv. Ein Großteil darunter sind Membranproteine, die zusätzlich ein oder zwei Transmembrandomänen besitzen. Diese ABC-Transporter sind vor allem in Mensch und Hefe charakterisiert, wo sie in zahlreichen Transportprozessen über die Membranen involviert sind. Über die Funktion der ABC-Transporter in pflanzlichen Organismen ist wenig bekannt, jedoch gibt es Hinweise dass diese Proteinfamilie in Pflanzen auch an der Kompartimentierung von Fremdstoffmetaboliten beteiligt ist. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurden 103 ABC-Transportergene annotiert, die sich in 9 Subfamilien aufteilen. Experimentell nachgewiesen wurden bisher lediglich 6 Mitglieder aus 2 Subfamilien. In dieser Arbeit wurden 28 ABC-Transporter aus 6 Subfamilien, davon 4 bisher nicht untersuchte, hinsichtlich organspezifischer Expression und Induktionsverhalten nach Herbizid- bzw. Safenerbehandlung untersucht. Dazu wurde ein DNA-Array ("Detox-Array") mit genspezifischen Sonden zur parallelen Transkriptanalyse etabliert. Zusätzlich wurden in Zusammenarbeit mit anderen Projekten weitere Genfamilien mit einbezogen, die potenziell an der Detoxifizierung von Xenobiotika beteiligt sind (Cytochrom P450 Monooxygenasen, Glutathion-S-Transferasen und UDP-Glycosyltransferasen), um Koregulationen einzelner Mitglieder der unterschiedlichen Genfamilien untersuchen zu können. Um die Unterscheidung auch hoch homologer Mitglieder dieser Familien zu ermöglichen, wurden Sonden aus dem 3‘-untranslatierten Bereich dieser Gene entwickelt und auf ihre Eignung zur Transkriptmessung untersucht. Die Expressionsanalyse der ABC-Transporter in Wurzeln, Stängeln, Blättern, Blütenständen und Schoten zeigte neben den sechs bereits bekannten ABC-Transportern Transkripte von 21 weiteren Vertretern. Die meisten waren in der Wurzel (26 von 28) nachzuweisen, die wenigsten (7 von 28) im Blatt. Am höchsten exprimiert waren AtMRP12 und AtPDR8 in der Wurzel und AtMRP5 in der Schote. Die Induktion der ABC-Transporter durch Xenobiotika wurde an Pflanzen 24h oder 36h nach Behandlung mit unterschiedlichen Chemikalien (Primisulfuron, Bromoxynil, Benoxacor) in sublethalen Dosen untersucht. Für die beiden Herbizide typische Schäden konnten erst 3 Tage nach der Behandlung beobachtet werden. Neben der in der Literatur beschriebenen Primisulfuron-Induktion von AtMRP3 (Tommasini et al., 1997) waren AtPDR8, AtMRP5, AtMRP4 und AtAOH1 transient nach 24h induziert. Mit einem Antiserum, das gegen die Subfamilie der PDR-Transporter erzeugt worden war, konnte deren Induktion durch Primisulfuron und Benoxacor auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Eine spezifische 6-fache Induktion nach Bromoxynil-Behandlung zeigte der ABC-Transporter AtTAP1. Die sechs genannten ABC-Transporter stellen somit Kandidaten dar, die an der Kompartimentierung von Metaboliten beteiligt sein können. Dabei kann es sich entweder um Primisulfuron- bzw. Bromoxynilmetabolite oder durch die Behandlung mit den Xenobiotika entstandene endogene Metabolite handeln. Eine Hauptkomponentenanalyse der Expressionsprofile zeigte, dass auf der Basis der auf dem Detox-Array vertretenen, aus dem Entgiftungs- und Sekundärmetabolismus ausgewählten Genfamilien eine eindeutige Unterscheidung der Antwort auf die verschiedenen Herbizide abgeleitet werden kann. Weitere Daten aus Kollaborationen mit anderen Projekten wurden in einer zweiten Hauptkomponentenanalyse mit einbezogen und zeigen, dass die Unterschiede vor allem auf die sekundären Auswirkungen der Herbizide zurückzuführen sind. Die dabei gefundene Koregulation der Primisulfuron-Behandlung mit der Reaktion auf das Signalmolekül Salicylsäure und ein bakterielles Pathogen ließ weiter schließen, dass Primisulfuron einen Elicitor-ähnlichen Effekt auf die Pflanze hat. Zur weiterführenden Funktionsanalyse von ABC-Transportern wurden parallel zu diesen Arbeiten knock-out Mutanten gesucht. In einer Kollektion des MPI für Züchtungsforschung in Köln konnten zwei Mutanten identifiziert werden, die jeweils ein En-Transposon innerhalb der offenen Leserahmen von AtPDR4 bzw. AtMDR4 besitzen.

1. Aus chromosomaler DNA von A. woodii wurde durch heterologe Starteroligonukleotide ein Bereich des Flagellingens mittels PCR amplifiziert. Durch die Verwendung dieses DNA-Fragmentes als Sonde wurden weitere 6 kBp an chromosomaler DNA von A. woodii kloniert, sequenziert und analysiert. 2. Innerhalb dieses klonierten DNA-Abschnittes wurden zwei partielle und fünf vollständige offene Leserahmen lokalisiert, die jeweils über eine Shine-Dalgarno-Sequenz verfügten und größer als 300 Bp waren. Durch Sequenzvergleiche ließ sich das Flagellingen (fliC) identifizieren. Stromaufwärts von fliC wurden offene Leserahmen (flgL, flgK) gefunden, die für die Haken-assoziierten Proteine 1 und 3 des A. woodii-Flagellums kodieren, sowie ein Leserahmen (orfA) dessen abgeleitetes Produkt keine Ähnlichkeit keinem bekannten Protein ähnlich ist. Durch die Expression von orfA in Minizellen von E. coli DK6 wurde aber gezeigt, daß orfA für ein Protein kodiert. Stromabwärts vom Flagellingen wurden keine Flagellengene identifiziert. Die abgeleiteten Produkte, der hier lokalisierten ORFs orfB und orfC zeigten keine Ähnlichkeiten zu in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen. Am 3'-Ende des klonierten DNA-Abschnittes war ein partieller ORF (orfD) vorhanden, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz große Ähnlichkeiten zu dNTP-Zucker modifizierenden Enzymen aufwies. 3. Aus Sphäroplasten von A. woodii wurden durch Solubilisierung, differentielle Zentrifugation und eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation ganze Flagellen inklusive des Haken-Basalkörper- Komplexes gereinigt. Durch die Analyse der Präparation in der SDS-PAGE wurden neben dem Flagellin sechs weitere Proteine als Bestandteil der Flagellen identifiziert. 4. Durch die elektronenmikroskopische Analyse der Haken-Basalkörper-Komplexe der Na + -abhängigen Flagellen von A. woodii konnte gezeigt werden, daß diese aus einem Haken, Stab und einem MS-Ring aufgebaut sind. Unterhalb des MS-Rings waren weitere Strukturen vorhanden. Diese Struktur entspricht den aus den H + -abhängigen Flagellen der Gram-positiven Organismen bekannten Strukturen. Durch die Gefrierbruchmethode konnten in der Cytoplasmamembran von A. woodii im elektronenmikroskopischen Bild Partikelringe nachgewiesen werden. Diese entsprechen in Struktur und Größe den Mot-Komplexen der H + -abhängigen Flagellen aus E. coli.5. Zur Analyse der Untereinheitenzusammensetzung der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurden Antiseren gegen die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und β generiert. Hierzu wurden die Untereinheiten a, b, c  und β als MalE-Fusionen in E. coli produziert und gereinigt. Die Untereinheit c2/c3 wurde durch Chloroform:Methanol-Extraktion aus der Cytoplasmamembran von A. woodii angereichert und durch Elektroelution aus einer SDS-PAGE gereinigt. 6. Durch die Analyse der Cytoplasma- und Membranfraktion mit den fünf Antiseren ließen sich die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und ˜ in der Cytoplasmamembran nachweisen. 7. Die Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurde durch Blue-Native-PAGE aus der Membranfraktion isoliert. Durch die Auftrennung der ATPase in ihre Untereinheiten und deren aminoterminale Sequenzierung wurden die Untereinheiten a, b, c2/c3, α , β γ,δ und ε identifiziert. 8. Durch immunologische Methoden wurde die Untereinheit c1, das in F1FO-ATPasen einmalige 16-kDa-Proteolipid, als Untereinheit der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii erkannt. Die Na + -F1FO- ATPase von A. woodii ist die erste F1FO-ATPase mit einem Heterooligomer aus 8- und 16-kDa-Proteolipiden. 9. Die Untereinheit c1 wurde in A. woodii unabhängig vom Substrat und der Na + -Konzentration produziert. Allerdings wurden Hinweise auf eine erhöhte Expression des gesamten atp-Operons in Methanol-gezogenen-Zellen erhalten. 10. Ein Verfahren zur Reinigung der Na + -F1FO-ATPase unter Erhalt ihrer Untereinheitenstruktur wurde entwickelt. Die Na + -F1FO-ATPase wurde aus der Membranfraktion von A. woodii solubilisiert und durch Gelfiltration über Sephacryl S-400 und eine Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Das gereinigte Enzym besaß alle neun Untereinheiten. Die spezifische Aktivität der gereinigten ATPase betrug 7 U mg Protein -1 und seine molekulare Masse 600 kDa.

Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zur funktionellen Genomforschung in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Ein bei der Sequenzierung des Hefegenoms identifizierter offener Leserahmen, YOR179c, zeigte im Rahmen einer Datenbankanalyse eine erstaunliche Sequenzähnlichkeit zu dem bereits bekannten mRNA-3’-Prozessierungsfaktor Brr5. Dies legte die Vermutung nahe, dass es sich bei dem noch nicht näher charakterisierten Leserahmen ebenfalls um ein Gen handeln könnte, das für einen mRNA-3’- Prozessierungsfaktor codiert. Zunächst wurde durch eine Northern-Blot-Analyse eine dem Leserahmen entsprechende mRNA nachgewiesen. Des weiteren konnte auch ein Protein der erwarteten Größe anhand von polyklonalen Antikörpern, die gegen Yor179c gerichtet waren, detektiert werden. Diese Resultate belegen, dass es sich bei dem offenen Leserahmen YOR179c tatsächlich um ein exprimiertes Gen handelt. Eine Beteiligung des Yor179c-Proteins an der 3’-Prozessierung von mRNA-Vorläufern konnte anschließend anhand folgender Kriterien nachgewiesen werden: -Das Yor179c-Protein wurde als Fusionskonstrukt mit dem „green fluorescent protein“ im Kern lokalisiert, in dem Zellkompartiment, in dem auch der Prozess der mRNA-3’- Prozessierung abläuft. -Der letale Phänotyp eines Brr5-defizienten Hefestammes konnte durch Expression eines chimären Brr5/Yor179c-Gens, in dem der sequenzähnliche Bereich von Brr5 durch denjenigen von Yor179c ersetzt worden war, aufgehoben werden. -Ein in vivo Vergleich der Poly(A)-Schwänze eines Wildtyp und eines USY3-Stammes, der kein Yor179c-Protein mehr synthetisieren konnte, ergab eine erhöhte Polyadenylierungseffizienz des USY3-Stammes. -Immunochemische Analysen zeigten, dass nach Entfernung von Yor179c aus einem Hefe-Ganzzellextrakt dieser nicht mehr fähig war, eine mRNA-3’- Prozessierungsreaktion durchzuführen. -Dieser mRNA-3’-Prozessierungsdefekt eines depletierten Wildtyp-Extraktes konnte durch Expression eines extrachromosomal eingeführten YOR179c-Gens in den Wildtyp- Stamm komplementiert werden. -Durch Coimmunpräzipitationen wurde nachgewiesen, dass Yor179c mit dem mRNA-3’- Prozessierungsfaktor Brr5 und dem Polyadenylierungsfaktor Fip1 in vitro interagiert. Nachdem es sich bei Yor179c um ein Protein handelt, das für die Überlebensfähigkeit der Hefe nicht essentiell ist und ein Yor179c-defizienter Hefestamm ein vorgegebenes Substrat unter bestimmten Bedingungen durchaus prozessieren kann, muss zwar eine elementare Beteiligung von Yor179c an der mRNA-3’-Prozessierung ausgeschlossen werden, insgesamt kann jedoch aus den erhaltenen Daten gefolgert werden, dass Yor179c sowohl am Proteinkomplex, der den endonukleolytischen Schnitt katalysiert, als auch an der anschließenden Polyadenylierungsreaktion beteiligt ist. Die Ergebnisse sind konsistent mit der Vermutung, dass Yor179c eine Rolle bei der Ausbildung und Stabilisierung dieser Proteinkomplexe spielt. Diese Schlussfolgerungen konnten in jüngster Zeit durch weiterführende Experimente in einem kooperierenden US-amerikanischen Labor, dem unser Material zur Verfügung gestellt wurde, untermauert und bestätigt werden.