Podcasts about auftrennung

Jochen Krisch und Marcel Weiß sprechen in den neuesten Exchanges über die angekündigte Auftrennung der verschiedenen Sparten von Alibaba und was vor allem eine daraus entstehende, neue internationale E-Commerce-Gruppe für Europa bedeuten wird, wo Alibaba heute schon mit AliExpress, Trendyol und Miravia vertreten ist. Werbepartner: commercetools ist ein führender Anbieter von Composable-Commerce-Lösungen und der Erfinder von Headless Commerce und MACH™. Die flexible, agile und skalierbare Architektur der Lösungen von commercetools ermöglicht es Hunderten von Marken weltweit wie Audi, BMW Group, Danone, flaconi und TROX, einzigartige Kundenerlebnisse zu schaffen und zu liefern. Für Unternehmen, die die TCO ihrer Commerce-Technologie senken und gleichzeitig einen hohen ROI erzielen möchten, hat commercetools ein eBook erstellt, das die Kosten ihrer B2C-, B2B- und D2C-Lösungen mit traditionellen monolithischen Plattformen vergleicht und eine neue Methode zur genaueren Berechnung der TCO bietet.  https://commercetools.com/resources/whitepaper/pivotal-trends-and-predictions-in-b2b-digital-commerce-in-2023?utm_source=Paid%2520Referral&utm_medium=Blog&utm_content=predictions-blog&utm_campaign=Vertical%2520-%2520B2B

Aus den Gesprächen der Ampel-Parteien wurde bekannt, dass sich die Bündnis-Grünen und die FDP die Auftrennung der Deutschen Bahn in Netz und Betrieb wünschen und dass die SPD mehrheitlich vorerst noch dagegen ist. Es steht dennoch ins Haus, dass die Trennungsentscheidung kommt. Dafür spricht, dass in der dazu öffentlich geführten Debatte für die Position derWeiterlesen

Unsere Forschungsgruppe hat eine neue, sensitive und robuste Methode entwickelt, um selektiv die Fettsäuren der Glycerophospholipidfraktion im Plasma zu bestimmen, welche nur wenig vom postprandialen Status des Probanden beeinflusst werden. Bei diesem neuen Verfahren wird die konventionelle Lipidextraktion und deren Auftrennung durch eine methanolische Ausfällung der Proteine mit zusätzlicher Ausfällung von Triglyceriden und Cholesterinestern ersetzt. In Kombination mit basenkatalysierter Synthese von Methylestern bei Raumtemperatur wird die ausschließliche Umesterung der Glycerophopholipid (GPL) Fettsäuren gesichert. In der Vergangenheit hat sich gezeigt, dass sich dieses Verfahren nicht einfach von Plasma auf Erythrozyten übertragen lässt, sodass es notwendig war, die Anwendbarkeit der Plasma-GPL Methode auf Erythrozyten zu überprüfen, zu optimieren und zu validieren, bevor sie in klinischen Studien Anwendung finden kann. Im Rahmen dieser Untersuchung bestimmten wir auch den Omega-3-Index und verglichen diese mit in der Literatur beschriebenen Werten. Außerdem haben wir eine robuste Methode für die Analyse von Wangenschleimhaut Glycerophopholipid (GPL) gebundenen Fettsäuren entwickelt, welche nur wenig Probenmaterial benötigt und einfach anzuwenden ist. Die genannten Methoden zur Extraktion von GPL wurden im Rahmen einer klinischen Interventionsstudie evaluiert. Dabei wurden vor allem der Docosahexanensäure(DHA)-Anstieg im zeitlichen Verlauf der Studie zwischen den verschiedenen Kompartimenten Plasma, Erythrozyten und Wangenschleimhautzellen verglichen und Korrelationen berechnet, um eine Aussage darüber treffen zu können, welcher Biomarker, welche Änderungen widerspiegelt und wie geeignet die Analyse von GPL der Fettsäuren im Vergleich zu langjährig etablierten Markern, wie Gesamt-Phospholipide ist.

Desoxyribonuklerinsäure (DNA), die Erbinformation, definiert die Struktur und Funktion jeder Zelle. In Eukaryoten ist sie um Oktamere aus den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 gewunden. Sie bilden mit der DNA höhere Strukturen, das sog. Chromatin. Die Struktur des Chromatins beeinflusst direkt die Aktivität der gebundenen DNA. Eukaryoten besitzen daher viele molekulare Mechanismen zu ihrer Veränderung, z.B. posttranslationale Modifizierungen (PTMs) von Histonproteinen oder den Austausch von kanonischen Histonen mit Histonvarianten (z.B. H3.1, H3.2, H3.3, u.a.). Für einige Varianten sind ihnen eigene, charakteristische PTMs beschrieben, z.B. die Phosphorylierung des Serins 31 der Variante H3.3 (H3.3S31ph). Die Histone Code Hypothesis postuliert, dass PTMs von Histonen in festen Mustern vorliegen können. Die Switch Hypothesis beschreibt die Regulation von Bindemolekülen an Histone durch benachbarte PTMs. Auf ihrer Grundlage wurde die These der Doppelmodifizierung einer bekannten Trimethylierung der Aminosäure (AS) Lysin 79 mit einer mutmaßlichen Phosphorylierung der AS Threonin 80 auf Histon H3 aufgestellt (H3K79me3T80ph). Neben der Etablierung eines einfachen Systems zur Identifizierung bisher unbeschriebener Phosphorylierungen bestand ein zweites Ziel dieser Arbeit im Nachweis der Phosphorylierung von H3 Threonin 80 in vivo. Eine weitere Zielsetzung lag in der genaueren Charakterisierung der bereits beschriebenen Varianten-spezifischen PTM H3.3S31ph, deren Expression zwar eng umschrieben ist, über deren spezifische Funktionen, Kinase und mögliche Effektorproteine aber wenig bekannt ist. Um einen Überblick über Phosphorylierungen verschiedener Histonroteine zu gewinnen, wurden unterschiedliche Polyacrylamidgel-Elektrophoresen Verfahren (PAGE) etabliert. Zum Einsatz kamen A/U-, T/A/U- und 2D-T/A/U-PAGE Verfahren. Sie ermöglichten in Übereinstimmung mit der Literatur die Auftrennung bekannter PTM und stehen nun für weiterführende Studien zur Verfügung. Der massenspektrometrische Nachweis der putativen PTM H3K79me3T80ph in vivo gelang nicht. Trotz optimierter Versuchsbedingungen konnte die Phosphorylierung weder in der MALDI-ToF, noch in der Orbitrap MS/MS nachgewiesen werden. Initiale Antikörperdaten wurde aufgrund einer aufgedeckten Kreuzreaktivität in Frage gestellt. Obgleich nicht mit letzter Sicherheit gesagt werden kann, dass H3K79me3T80ph in vivo nicht existiert, wurde die These letztlich verworfen. Die molekularbiologische Untersuchung der Varianten-spezifischen PTM H3.3S31ph ergab bei verifizierter Überexpression und Chromatin-Integration punktmutierter Histone übereinstimmend Hinweise auf einen Effekt der PTM auf die Zellteilung. Es konnte gezeigt werden, dass Serin 31 bzw. ihre PTM H3.3S31ph sowohl Zellzyklus, als auch Wachstums- und Proliferationsgeschwindigkeiten von HeLa Zellen beeinflusst. Dies argumentiert für eine aktivierende Funktion von H3.3S31ph in der Mitose. Weiter konnten mithilfe eines ELISAs fünf potentielle Proteinkinasen für H3.3S31ph identifiziert werden. Vorrangig kommt dabei die nukleäre Kinase PIM1 in Betracht. Zur weiteren Untersuchung potentieller Effektorproteine wurde in vitro ein molekularbiologisches Modellsystem etabliert. Es steht nun für weiterführende Studien zur Verfügung. Erste Vorarbeiten konnten bereits zeigen, dass hier evtl. Interaktionen mit dem Linkerhiston H1 eine wichtige Rolle spielen.

Maligne Erkrankungen sind in den Industrieländern, nach Herz-Kreislauferkrankungen, die zweithäufigste Todesursache. Aufgrund der Erfolge bei der Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wird Schätzungen zufolge Krebs in den nächsten Jahren die häufigste Todesursache in den entwickelten Ländern sein. Trotz des klinischen und wissenschaftlichen Fortschritts ist die Prognose der meisten Tumorentitäten unverändert schlecht. Eine der Hauptursachen ist der Mangel an spezifischen Markern, um eine geeignete Frühdiagnostik, Vorsorge und Therapie zu ermöglichen. Biomarker, wie tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene, werden als potente Strukturen diskutiert, Karzinome bereits im Frühstadium zu diagnostizieren und im Rahmen von Therapien als Zielstrukturen eingesetzt zu werden. Seit einigen Jahren werden daher systematische Techniken zur Identifizierung neuer Tumorantigene entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine bestehende Technologie zur Identifizierung von Tumorantigenen weiterentwickelt und optimiert werden. Die in der Arbeitsgruppe etablierte Technik namens AMIDA (Autoantibody-mediated Identification of Antigens) basiert auf der spezifischen Autoantikörper-vermittelten Selektion und Aufreinigung potenzieller Tumorantigene und deren anschließender zweidimensionaler Auftrennung und Isolierung. AMIDA ermöglicht prinzipiell die Identifizierung von Tumorantigenen, die durch posttranslationale Modifikationen immunogen wurden, wobei für die Isolierung das komplette Proteom zur Verfügung steht. Es wurde eine allogene Variante etabliert, welche die Technik unabhängig von autologen Tumorbiopsien macht (allo-AMIDA). Neben der Einführung geeigneter Kontrollen kann allo-AMIDA nun im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Der Vorteil von allo-AMIDA gegenüber AMIDA und anderen Strategien ist, neben der schnellen und reproduzierbaren Durchführung, die nunmehr universelle Einsetzbarkeit der Methode. Zur Identifizierung von Tumorantigenen werden lediglich Seren von Tumorpatienten und eine geeignete Tumorzelllinie benötigt. Allo-AMIDA wurde am Beispiel von Karzinomen des Kopf-Hals-Bereiches eingesetzt und führte zur Identifizierung von insgesamt 12 potenziellen Tumorantigenen. Neun der 12 Tumorantigene wiesen zum Zeitpunkt der Identifizierung eine Assoziation mit Tumoren auf, fünf davon sind etablierte Tumorantigene, was die Eignung von allo-AMIDA zur Identifizierung von TAs beweist. Für die allo-AMIDA-Antigene Grb-2 und Hsp-27 konnte eine starke Expression in Tumorzellen der Kopf-Hals-Entität gezeigt werden. Drei der allo-AMIDA Antigene waren bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen assoziiert. Eines dieser Proteine – hnRNP H (heterogeneous ribonucleoprotein H) – stellte sich als geeigneter Marker für Tumorzellen des Kopf-Hals-Bereiches heraus. Es konnte auf Transkript- und Proteinebene gezeigt werden, dass hnRNP H bereits in hyperplastischem Epithelien vermehrt gebildet wird und mit zunehmender Karzinogenese in den meisten primären Tumoren bzw. Metastasen dieser Tumorentität stark überexprimiert ist. Interessanterweise war diese starke Expression auf Tumorzellen beschränkt. In anderen Tumorentitäten (Kolon-, Pankreas-, Mamma-Karzinom) war hnRNP H ebenfalls stark über-exprimiert, die Expression in humanen nicht-malignen Geweben war sehr heterogen. Da bis dato wenige Informationen über die Funktion dieses nukleären Proteins bekannt sind, wurde hnRNP H detaillierter analysiert. In der Literatur wird diskutiert, dass hnRNP H am alternativen Spleißen von prä-mRNAs bzw. an der Regulation dieses Prozesses beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Repression von hnRNP H durch RNAi zur Apoptose von Tumorzelllinien führt. Mittels Genexpressionanalyse konnten potenzielle Zielgene im Bereich Apoptose identifiziert werden, die von hnRNP H durch alternatives Spleißen reguliert werden. hnRNP H ist an der Regulation des Bcl-X-Gens beteiligt, was von Garneau und Kollegen (2005) kürzlich ebenfalls gezeigt werden konnte. Die Regulation von ARAF1 durch hnRNP H wurde erstmals gezeigt; ein potenzieller Weg, wie die Deregulation von ARAF1 Apoptose induzieren kann, wird vorgeschlagen. Die Validierung der Zielgene von hnRNP H im Kontext von Tumorzellen ist Gegenstand laufender Projekte und weiterer Analysen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Proteomstudien an Halobacterium salinarum durchgeführt, die sich generell in drei unabhängige Themenblöcke unterteilen lassen. Zunächst erfolgte die Erfassung des cytosolischen Proteoms auf standardisierten 2-D Gelen. Hierfür wurde die Auftrennung auf sogenannten Zoom-Gelen aufgrund der engen pI-Verteilung halobakterieller Proteine etabliert. Die erschöpfende Analyse der so aufgetrennten Proteine wurde mit der peptide mass fingerprinting Methode im Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. So konnten so 40% des zugänglichen cytosolischen Proteininventars identifiziert und auf Referenz 2-D Gelen kartiert werden. Des Weiteren konnten die massenspektrometrischen Proteinidentifizierungen zur intensiven Verbesserung der in vielen Fällen nicht eindeutigen Genomannotation herangezogen werden. Durch die Korrelationsanalyse von experimentellen und theoretischen pI-Werten konnten weitere Annotationsfehler behoben werden. Das Zusammenspiel von Genomik und Proteomik erlaubte die Identifizierung eines Bereichs ehemaliger Plasmid DNA, die in das Chromosom eingewandert ist. Weiter konnte für ein Plasmid gezeigt werden, dass dieser ehemalig chromosomale DNA und somit eine Reihe wichtiger und essentieller Gene enthält und deshalb eher als zweites Chromosom angesehen werden sollte. Nach der Inventarisierung folgten Analysen zur differentiellen Expression cytosolischer Proteine in Abhängigkeit unterschiedlicher Wachstumszustände. Hierbei wurde das aerobe Wachstum unter Standardbedingungen mit Wachstum unter Mangelbedingungen wie in synthetischem Medium oder unter anaeroben phototrophen Bedingungen verglichen. Bei der Analyse dieser Zustände mittels 2-DE konnten nur wenig regulierte Proteine identifiziert werden. Generell stellte sich die 2-DE aufgrund schwankender Reproduzierbarkeit und des geringen dynamischen Bereichs der gewählten Färbemethode für diese vergleichenden Analysen als wenig geeignet heraus. Die Verwendung isotopenmarkierter Sonden erlaubte hingegen einen detaillierten Einblick in die Regulationen auf Proteomebene unter besagten Bedingungen. Mit dem methodischen Ansatz der 1D-SDS PAGE LC-MALDI-TOF/TOF Analyse konnten von einem beträchtlichen Teil (ca. 40%) des cytosolischen Proteoms Regulationsinformationen erhalten werden. Auch hier zeigte sich, dass unter anaeroben phototrophen Bedingungen überraschend wenige Proteine reguliert werden müssen, damit sich der Organismus auf diese Lebensbedingung einstellen kann. Wachstum unter Nährstoffmangel in synthetischem Medium induziert überwiegend Proteine der Aminosäure- und Nukleotid-Biosynthese sowie Proteine, die am Proteinschutz und der Glykolyse beteiligt sind. Unter Standardwachstum wurden Proteine als induziert identifiziert, die bei nicht ausreichendem Vorhandensein wachstumslimitierend wirken würden. Dies waren hauptsächlich Enzyme der Thiamin und Cobalamin Biosynthese sowie des Peptid-Transportes und -Abbaues. Auch die CO2-Fixierung und die nachfolgende Gluconeogenese sind induziert. Durch die Verwendung unterschiedlicher Proteomik Ansätze konnte am Ende der Großteil der cytosolischen Proteine von H. salinarum identifiziert werden. Es scheinen nahezu alle chromosomalen Proteine auch unter Standard Wachstumsbedingungen expremiert zu werden, was starke Regulationen der Proteinkonzentrationen in Abhängigkeit unterschiedlicher Lebensbedingungen nicht notwendig macht. Der Organismus kann sich so schnell ohne großen energetischen Aufwand an wechselnde Lebensbedingungen anpassen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum untersucht. Hierbei konnten zunächst über radioaktive in vivo Markierung phosphattragende Proteine identifiziert werden. Ebenfalls gelang es, die ersten halobakteriellen Serin und Threonin Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Generell zeigte sich jedoch, dass das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum eher gering ist. Bei den identifizierten Phosphorylierungen handelte es sich ausschließlich um katalytische Zwischenprodukte. Für die Existenz von regulativen Ser/Thr oder Tyr Proteinphosphorylierungen waren keine eindeutigen Hinweise zu finden. Weiter gelang es, eine Vielzahl von N-terminal acetylierten Proteinen als eine weitere Form der posttranslationalen Modifikationen zu identifizieren.

Maligne Erkrankungen sind die zweithäufigste Todesursache in den industrialisierten Nationen. Trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten haben sich die Prognosen nur bei einigen Tumorentitäten signifikant verbessert. Die Hauptprobleme sind nach wie vor das Fehlen valider Marker für die Frühdiagnose und hohe Rezidivraten, die aufgrund mangelnder Detektion von disseminierten Tumorzellen entstehen. Tumorantigene erlangen eine immer wichtigere Bedeutung, da sie zur Visualisierung von okkulten Tumorzellen und als Zielstrukturen der spezifischen adoptiven Immuntherapie dienen können. Tumorantigene (TAs) bzw. eine gesteigerte humorale Antwort gegen TAs, besitzen außerdem ein großes Potenzial als zirkulierender Biomarker in der Frühdiagnose. In dieser Arbeit wurde am Beispiel von Karzinomen der oberen Atemwege eine neue Technik zur Identifizierung von TAs entwickelt (AMIDA, Autoantibody Mediated Identification of Antigens), welche einige Limitationen der bereits etablierten SEREX- und PROTEOMEX-Technik umgeht. AMIDA ermöglicht es, im Gegensatz zu SEREX, TAs zu identifizieren, die durch posttranslationale Modifikationen oder aberrante Lokalisationen immunogen wurden. Diese TAs sind häufig tumorspezifisch und eignen sich hervorragend als Biomarker oder als Zielstrukturen für Therapien. Der Vorteil von AMIDA gegenüber PROTEOMEX ist die Immunpräzipitation von Antigenen aus primären Tumorbiopsien mit autologen Serumantikörpern, vor der Auftrennung in einer 2D-Gelelektrophorese und der anschließenden Identifizierung der TAs im Massenspektrometer. Dadurch können TAs aus dem kompletten Proteom identifiziert werden und nicht nur aus der Proteinauswahl, die in einer klassischen 2D-Gelelektrophorese auftrennbar ist. AMIDA führte zur Identifizierung von 27 unterschiedlichen, potenziellen Tumorantigenen, wobei sechzehn TAs bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen und weitere vier nicht mit HRK assoziiert wurden. Hierbei stellte sich Zytokeratin 8 (CK8) als interessanter Marker für okkulte Tumorzellen heraus, da es bereits in hyperplastischem Rachenepithel vermehrt gebildet und in Neoplasien bzw. Metastasen ausschließlich von Tumorzellen stark überexprimiert wird. CK8 ist zudem ein interessantes Zielmolekül für Immuntherapien mit monoklonalen Antikörpern, da es auf Karzinomzellen ektopisch an der Zelloberfläche lokalisiert. Darüber hinaus zeigten Patienten mit HR-Karzinomen im Vergleich zu gesunden Probanden bereits in sehr frühen Tumorstadien eine deutlich gesteigerte humorale Antwort gegen CK8, was Serumantikörper gegen CK8 zu einem potenziellen zirkulierenden Biomarker in der Frühdiagnose macht. Zwei weitere AMIDA-TAs, AAA-TOB3 bzw. das hypothetische Protein KIAA1273, werden ebenfalls in HRK überexprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei AAA-TOB3 und KIAA1273 um zwei Isoformen handelt, die von einem Genlokus kodiert, jedoch von zwei unterschiedlichen Promotoren reguliert werden. Beide Isoformen sind Transmembranproteine, die in Mitochondrien lokalisieren und deren Expression direkt von c-Myc reguliert wird. Eine frühere Studie von Da Cruz (2003) zeigte, dass das murine Homolog von AAA-TOB3 pro-apoptotische Eigenschaften hat, wenn es in humanen Zellen überexprimiert wird. Dies konnte in dieser Arbeit für die humanen Isoformen nicht belegt werden. Im Gegenteil, die Repression der beiden Proteine führte zu einer vermehrten Apoptose. Dies lässt eher auf eine für das Zellwachstum bzw. die Zellproliferation notwendige Funktion dieser beiden Proteine schließen und könnte die Überexpression in Tumoren erklären.

1. Aus chromosomaler DNA von A. woodii wurde durch heterologe Starteroligonukleotide ein Bereich des Flagellingens mittels PCR amplifiziert. Durch die Verwendung dieses DNA-Fragmentes als Sonde wurden weitere 6 kBp an chromosomaler DNA von A. woodii kloniert, sequenziert und analysiert. 2. Innerhalb dieses klonierten DNA-Abschnittes wurden zwei partielle und fünf vollständige offene Leserahmen lokalisiert, die jeweils über eine Shine-Dalgarno-Sequenz verfügten und größer als 300 Bp waren. Durch Sequenzvergleiche ließ sich das Flagellingen (fliC) identifizieren. Stromaufwärts von fliC wurden offene Leserahmen (flgL, flgK) gefunden, die für die Haken-assoziierten Proteine 1 und 3 des A. woodii-Flagellums kodieren, sowie ein Leserahmen (orfA) dessen abgeleitetes Produkt keine Ähnlichkeit keinem bekannten Protein ähnlich ist. Durch die Expression von orfA in Minizellen von E. coli DK6 wurde aber gezeigt, daß orfA für ein Protein kodiert. Stromabwärts vom Flagellingen wurden keine Flagellengene identifiziert. Die abgeleiteten Produkte, der hier lokalisierten ORFs orfB und orfC zeigten keine Ähnlichkeiten zu in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen. Am 3'-Ende des klonierten DNA-Abschnittes war ein partieller ORF (orfD) vorhanden, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz große Ähnlichkeiten zu dNTP-Zucker modifizierenden Enzymen aufwies. 3. Aus Sphäroplasten von A. woodii wurden durch Solubilisierung, differentielle Zentrifugation und eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation ganze Flagellen inklusive des Haken-Basalkörper- Komplexes gereinigt. Durch die Analyse der Präparation in der SDS-PAGE wurden neben dem Flagellin sechs weitere Proteine als Bestandteil der Flagellen identifiziert. 4. Durch die elektronenmikroskopische Analyse der Haken-Basalkörper-Komplexe der Na + -abhängigen Flagellen von A. woodii konnte gezeigt werden, daß diese aus einem Haken, Stab und einem MS-Ring aufgebaut sind. Unterhalb des MS-Rings waren weitere Strukturen vorhanden. Diese Struktur entspricht den aus den H + -abhängigen Flagellen der Gram-positiven Organismen bekannten Strukturen. Durch die Gefrierbruchmethode konnten in der Cytoplasmamembran von A. woodii im elektronenmikroskopischen Bild Partikelringe nachgewiesen werden. Diese entsprechen in Struktur und Größe den Mot-Komplexen der H + -abhängigen Flagellen aus E. coli.5. Zur Analyse der Untereinheitenzusammensetzung der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurden Antiseren gegen die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und β generiert. Hierzu wurden die Untereinheiten a, b, c  und β als MalE-Fusionen in E. coli produziert und gereinigt. Die Untereinheit c2/c3 wurde durch Chloroform:Methanol-Extraktion aus der Cytoplasmamembran von A. woodii angereichert und durch Elektroelution aus einer SDS-PAGE gereinigt. 6. Durch die Analyse der Cytoplasma- und Membranfraktion mit den fünf Antiseren ließen sich die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und ˜ in der Cytoplasmamembran nachweisen. 7. Die Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurde durch Blue-Native-PAGE aus der Membranfraktion isoliert. Durch die Auftrennung der ATPase in ihre Untereinheiten und deren aminoterminale Sequenzierung wurden die Untereinheiten a, b, c2/c3, α , β γ,δ und ε identifiziert. 8. Durch immunologische Methoden wurde die Untereinheit c1, das in F1FO-ATPasen einmalige 16-kDa-Proteolipid, als Untereinheit der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii erkannt. Die Na + -F1FO- ATPase von A. woodii ist die erste F1FO-ATPase mit einem Heterooligomer aus 8- und 16-kDa-Proteolipiden. 9. Die Untereinheit c1 wurde in A. woodii unabhängig vom Substrat und der Na + -Konzentration produziert. Allerdings wurden Hinweise auf eine erhöhte Expression des gesamten atp-Operons in Methanol-gezogenen-Zellen erhalten. 10. Ein Verfahren zur Reinigung der Na + -F1FO-ATPase unter Erhalt ihrer Untereinheitenstruktur wurde entwickelt. Die Na + -F1FO-ATPase wurde aus der Membranfraktion von A. woodii solubilisiert und durch Gelfiltration über Sephacryl S-400 und eine Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Das gereinigte Enzym besaß alle neun Untereinheiten. Die spezifische Aktivität der gereinigten ATPase betrug 7 U mg Protein -1 und seine molekulare Masse 600 kDa.

Die vorliegende Arbeit stellt eine Charakterisierung der im Jahr 1995 von Wissenschaftlern der Firma Abbott Diagnostics (North Chicago, USA) entdeckten flaviähnlichen, im Tamarinen vorkommenden GB-Viren, GBV-A und GBV-B, sowie des humanen GB-Virus-C dar. GBV-A und GBV-B sind beide im sogenannten “GB-Agens H205”, das als Referenzmaterial dient, vorhanden. GBV-A und GBV-B wurden isoliert und charakterisiert. Da GBV-A im Gehirngewebe in höheren Konzentrationen als GBV-B vorhanden war, gelang die Isolierung von GBV-A durch eine Tamarinpassage mit verdünntem inokuliertem Gehirnmaterial. GBV-B wurde durch Tamarinpassage des Serums eines Affen, der nach Ausheilen der GBV-A-Infektion noch GBV-B-RNA positiv war, in reiner Form gewonnen. In Re- und Kreuzinfektionsstudien mit Tamarinen konnte eine homologe Immunität gegen den gleichen Erreger, aber das Fehlen einer Kreuzimmunität gegen den anderen Erreger gezeigt werden. Die Untersuchung von histologischen Schnitten der Organe infizierter Krallenaffen mit Hilfe der in situ-Hybridisierung gab Aufschluß über den Ort der Replikation dieser Viren. GBV-B ist der Erreger einer Hepatitis bei Krallenaffen und war mit einer für dieses Virus spezifischen Sonde durch Hybridisierung im Zytoplasma von Hepatozyten nachzuweisen. Mit einer für GBV-A spezifischen Sonde wurde dieses Virus nur in Gehirngewebe nachgewiesen. Für das humane GBV-C wurde der Lymphknoten, genauer das Zytoplasma der Lymphozyten, als Replikationsort ermittelt. Eine Leberpathogenität dieses Virus konnte nicht gefunden werden. Klinische Studien könnten eine Assoziation von GBV-C mit Erkrankungen des lymphatischen Systems untersuchen. Entsprechend der Lokalisation des Hybridisierungssignals im Bereich der Lymphknotenrinde (überwiegend B-Lymphozyten) konnten, nach Auftrennung von PBMCs mit Hilfe des MACS-Systems in einzelne Zellfraktionen, die B-Lymphozyten als hauptsächlicher Replikationsort wahrscheinlich gemacht werden. Weitere Hinweise auf die Replikation von GBV-C in Lymphozyten lieferte die in vitro-Infektion von PBMCs durch GBV-C mit einem anschließend beobachteten Anstieg der GBV-C-Konzentration im Kulturüberstand. In knochenmarktransplantierten Patienten wurde durch weitgehende Zerstörung des Knochenmarks ein Absinken der GBV-C-Konzentration gezeigt. Nach der Regeneration des lymphatischen Systems wurde häufig die ursprüngliche GBV-C-Konzentration wieder erreicht. Auch dieses Ergebnis läßt sich durch die Replikation von GBV-C in Zellen des lymphatischen Systems erklären. Zur Bestimmung der Prävalenz von GBV-C wurde ein Enzymimmuntest zum Nachweis von E2-Antikörpern mit rekombinanten Virusproteinen und monoklonalen Antikörpern gegen dieses Virus entwickelt. Ein 39 As langes Peptid im C-Terminus eines C-terminal verkürzten E2-Proteins war die antikörperbindende Domäne des monoklonalen Antikörpers. Für GBV-C hatten Hämophile, Homosexuelle und Prostituierte ein erhöhtes Infektionsrisiko. Deshalb ist neben dem parenteralen Übertragungsweg auch die sexuelle Übertragung des Virus bedeutend. Für eine sexuelle Übertragung des Virus spricht, daß bei Homosexuellen das Vorhandensein von Antikörpern gegen GBV-C mit der Anamnese einer durchgemachten Syphilis oder Gonorrhoe korreliert. Normalerweise führt die Produktion von E2-Antikörpern zu einer Elimination von GBV-C und einem Ausheilen der Infektion.

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Charakterisierung der Photoinstabilität von Arzneistoffen und verschiedenen Darreichungsformen sowie der Photo-stabilisierung von Infusionslösungen mit transparenten Kunststofffolien. Die Qualifizierung des eingesetzten Belichtungsgerätes wurde anhand von Radio- und Spektroradiometeruntersuchungen sowie speziellen Testlösungen durchgeführt. Für das hochphotoinstabile Chinolonderivat SB-265805-S wurde eine Charakterisierung der Photoinstabilität als Feststoff und in Lösung unter Berücksichtigung kinetischer Aspekte und der Wellenlängenabhängigkeit der Photolyse durchgeführt. Zudem wurde der Einfluss von parenteral einsetzbaren Hilfsstoffen auf die Photostabilität von SB-265805-S Lösungen im Hinblick auf eine geeignete Formulierung untersucht. Die bisher unbekannte Lichtempfindlichkeit von Wirkstoffen in Lyophilisaten wurde anhand des Gyrasehemmers untersucht. Dabei wurden auch Einflüsse von unterschiedlichen Hilfsstoffen und ihren Eigenschaften berücksichtigt. Zur Photostabilisierung von Infusionslösungen wurden transparente Polymerfilme in Form von unterschiedlichen sekundären Packmitteln hergestellt und die photo-protektiven Eigenschaften anhand verschiedener Infusionslösungen ermittelt. Unter Berücksichtigung der Befunde wurden Anforderungen an UV-Schutzfilme abgeleitet. Fragen der Photoinstabilität von Arzneistoffen wurden bei den bisher wenig untersuchten Gruppen der Vasodilatatoren und Antiarrhythmika bearbeitet. Neben der Zersetzungsgeschwindigkeit und der Ermittlung des photodestruktiven Wellenlängenbereiches waren auch Hilfsstoffeinflüsse und entstehende Photolyse-produkte von Interesse. Dabei kamen chromatographische und spektroskopische Verfahren zur Untersuchung der Abbauprodukte zum Einsatz. Besonders photostabilitätsgefährdete Handelspräparate, wie parenterale und topische Lösungen, wurden einbezogen, um auch die praktische Auswirkung der Photoinstabilität zu erfassen. Im wesentlichen ergaben sich folgende Befunde: 1. Für die Durchführung von reproduzierbaren Photostabilitätsprüfungen spielt die Qualifizierung des Belichtungsgerätes eine entscheidende Rolle. Die Untersuchung des zur Verfügung stehenden Gerätes zeigt, das eine Kombination aus Radiometer, zur Ermittlung der Gesamtbestrahlungsdosis, Spektroradiometer, zur Untersuchung von spektralen Veränderungen und Testlösungen, zur Untersuchung der praktischen Relevanz von gemessenen Abweichungen, sowie Mapping der Probenebene, geeignet ist. 2. Eine Verkürzung der Belichtungszeit durch Erhöhung der Bestrahlungsstärke zum Erreichen der in der ICH-Richtlinie geforderten Bestrahlungsdosis ist bei Lösungen aufgrund direkter Proportionalität von Bestrahlungsdosis und Grad der Zersetzung anwendbar. 3. Die bei höheren Bestrahlungsstärken im Suntest CPS + ermittelten Photolyse-geschwindigkeiten sind nur eingeschränkt mit unter natürlichen Bedingungen (Raumlicht) ermittelten vergleichbar. Mit zunehmender Entfernung zum Fenster sinkt die Lichtintensität und damit die Photolysegeschwindigkeit stark ab. 4. Der Wirkstoff SB-265805-S stellt ein hochlichtempfindliches Chinolonderivat dar. Als Ursache der vergleichsweise außerordentlichen Photoinstabilität wurde die Oximetherstruktur des Substituenten in Position 7 des Chinolin-carbonsäureringes in Betracht gezogen. Die Photozersetzung des Gyrasehemmers wird durch Licht mit Wellenlängen bis 385 nm hervorgerufen. Mit steigender Wirkstoffkonzentration sinkt die Photolysegeschwindigkeit in Wirkstofflösungen.5. Bei der Formulierung von photoinstabilen Wirkstofflösungen muss mit Einflüssen von eingesetzten Hilfsstoffen wie Puffersubstanzen und Lösungs-vermittler gerechnet werden. Bei basischen oder sauren beziehungsweise zwitterionischen Substanzen wie dem Chinolon SB-265805-S spielt der pH-Wert der Lösung eine besonders große Rolle. Antioxidantien führen auch bei Photooxidationen nicht immer zu einer Photostabilisierung. Bei komplexen Abbauwegen kann ihr Effekt nivelliert werden. 6. Lyophilisate zeigen als hochporöse feste Darreichungsformen eine deutlich erhöhte Lichtempfindlichkeit im Vergleich zum Feststoff. Ein hoher Rest-wassergehalt ist für wasserlösliche Wirkstoffe wie SB-265805-S zu vermeiden, da dieser die Photostabilität des Lyophilisates herabsetzt. 7. Bei der Auswahl des Gerüstbildners ist bei lichtempfindlichen Wirkstoffen mit Beeinflussung der Photostabilität zu rechnen. Das Chinolon zeigte sich in Saccharose- und Lactosekuchen deutlich stabiler als in Mannitol enthaltenden Lyophilisaten. Ein Einfluss der Kuchenstruktur, amorph oder kristallin, wurde diskutiert. 8. Die Eindringtiefe von Licht erwies sich in Lyophilisatkuchen deutlich höher als in Tabletten. Wie anhand von Chinolonlyophilisaten gezeigt werden konnte, besteht ein Zusammenhang von Art und Konzentration des Gerüstbildners und der Eindringtiefe von Licht, und damit dem Ausmaß der zersetzten Wirkstoffmenge. 9. Farblos-transparente Polyethylenfolien sind als Sekundärpackmittel zur Photostabilisierung von UV-sensiblen Infusionslösungen einsetzbar. Das Aufschrumpfen der Folien hat keinen nachteiligen Einfluss auf die Transmission und den stabilisierenden Effekt. 10. Mit 1 % UV-Absorber und 100 µm Folienstärke wird eine zur Photo-stabilisierung ausreichende Transmissionsreduktion im Wellenlängenbereich bis 380 nm erreicht. Eine Mischung (1:1) der eingesetzten Absorber führt dabei zu einer kontinuierlich niedrigen Transmission in diesem Bereich. Diese Filme zeigten daher auch den besten stabilisierenden Effekt und breite Einsetzbarkeit. Mit Tauchfilmen überzogene Flaschen sind ebenfalls als Lichtschutz-verpackungen einsetzbar. 11. Intransparenz von Kunststofffolien ist keine Garantie für ausreichenden Lichtschutz. Pigmentdichte und Folienstärke sind für eine optimale Photoprotektion entscheidend. 12. Quartäre HPLC-Pumpen erwiesen sich zur Auftrennung besonders komplexer Gemische als vorteilhaft. Zur Untersuchung und Detektion der Photo-zersetzungsprodukte sind On-line-Verfahren wie Diodenarray- und Massen-kopplung besonders geeignet. 13. Alpha1-Rezeptorantagonisten lassen sich strukturell in zwei Gruppen einteilen, die sich auch deutlich in ihrer Photoinstabilität unterscheiden. Die einen 2-Aminochinazolinring enthaltenden Wirkstoffe Prazosinhydrochlorid, Terazosin-hydrochlorid, Bunazosinhydrochlorid und Doxazosinmesilat zeigten eine, in obiger Reihenfolge abnehmende, jedoch deutlich höhere Lichtempfindlichkeit als das 6-Aminouracilderivat Urapidilhydrochlorid. Für die erstgenannte Gruppe konnten zahlreiche Photolyseprodukte nachgewiesen werden. Eine erhöhte Photoinstabilität der Furancarbonsäure- beziehungsweise Tetrahydro-furancarbonsäurestruktur des Substituenten in Position 2 wurde diskutiert. 14. Die Photozersetzung der Alpha1-Rezeptorantagonisten verläuft stark lösungs-mittelabhängig. Neben Unterschieden in der Zersetzungsgeschwindigkeit konnte das Auftreten abweichender Zersetzungsprodukte nachgewiesen werden. Die Wirkstoffe werden durch Licht mit Wellenlängen bis etwa 355 nm zersetzt. In festen Darreichungsformen können Alpha1-Blocker als photostabil angesehen werden. 15. In der Gruppe der Vasodilatatoren sind Dipyridamol und Budralazin besonders photoinstabil. Die Feststoffe sind deutlich photostabiler als die Wirkstoff-lösungen. Beide Wirkstoffe zeigen Lichtempfindlichkeit bis zu einer Wellenlänge von etwa 445 nm. Dipyridamol zersetzt sich in wässrig-saurer Lösung um den Faktor 6 schneller als in ethanolischer Lösung und zusätzliche Zersetzungsprodukte konnten nachgewiesen werden. Eine mehrfache Oxidation unter Lichteinfluss wurde diskutiert. Lichtschutz für die Infusionslösung während der Applikation ist zu fordern. Budralazin zeigt eine auffällige Zersetzungskinetik. Für das einzige Photo-zersetzungsprodukt wurde das Cis-Isomer vorgeschlagen. Minoxidil ist in Wasser-Ethanol-Propylenglykol-Mischungen zur topischen Anwendung photostabiler als in rein wässrigen Lösungen. Der Feststoff zeigt keine Photozersetzung. Trapidil-, Diltiazem-, und Verapamilhydrochlorid sind trotz der Lichtschutz-forderungen in den Arzneibüchern oder Gebrauchsanweisungen auch in Lösung als weitgehend photostabil einzustufen. 16. Antiarrhythmika sind strukturell sowie bezüglich ihrer Lichtempfindlichkeit eine sehr heterogene Gruppe. Unter den gleichen Bedingungen liegt für Amiodaronhydrochlorid die t90% bei 30 Sekunden, für Chinidinhydrogensulfat bei 140 Minuten und für Arotinolol-, Mexiletin- und Soltalolhydrochlorid bei etwa 300 Minuten. Amiodaronhydrochlorid bildet in Wasser und Ethanol zahlreiche Abbauprodukte. Die bei Belichtung generell auftretende gelbbraune Verfärbung weist auf durch Photodeiodierung entstehendes Iod hin. Der Feststoff, Tabletten, Injektions- und Infusionslösungen zersetzen sich durch Lichteinwirkung und sind schutzbedürftig. Deutliche organoleptische Veränderungen treten auch bei der Feststoff-belichtung von Arotinololhydrochlorid und Chinidinhydrogensulfat auf. 17. Die Bewertung der Lichtschutzbedürftigkeit von Wirkstoffen ist in offiziellen Pharmacopoen zum Teil widersprüchlich. Hier ist daher eine Überprüfung und Vereinheitlichung der Lichtschutzangaben zu fordern. Aufgrund der beträchtlichen Unterschiede der Lichtempfindlichkeit von Wikstoffen in Lösung und als Fesstoff ist in diesem Zusammenhang auch eine Präzisierung der Lichtschutzforderung, wie es in der USP für unterschiedliche Darreichungsformen teilweise der Fall ist, wünschenswert.