Podcasts about fluoreszenz

„Die meisten wissen intuitiv, was Lichtdynamik bedeutet“, sagt Paul Fiechter. Denn bei der Farbnahme am Patienten mache man die Erfahrung, dass das Umgebungslicht die Farbwahrnehmung beeinflusst. Der Zahntechnikermeister aus der Schweiz hat sich intensiv mit den lichtoptischen Eigenschaften von natürlichen Zähnen beschäftigt. Er prägte den Begriff Lichtdynamik und entwickelte zusammen mit der Industrie Materialien, mit denen sich diese Eigenschaften nachahmen lassen. Sein Wissen gibt er international in Kursen und Vorträgen weiter. Warum viele Materialien nur eine Momentaufnahme wiedergeben können, wie man sich Opaleszenz und Fluoreszenz vorstellen kann und weshalb die Funktion in der Zahntechnik dabei grundlegend ist, darüber spricht er im Podcast.

★ _Hier für meinen Newsletter anmelden: https://simonrilling.com/newsletter_ ★ Dr. Michaela Dane ist Biochemikerin, Autorin, Dozentin, befasst sich intensiv mit Alchemie & den Hermetischen Prinzipien und ist u.a. Mitgründerin des “Institutes für Alchemistische Medizin” sowie der "Schweizer Akademie für moderne Paracelsusmedizin". In diesem Gespräch geht's um:

Die Themen in den Wissensnachrichten: +++ Siedlungen in Hochwassergebieten wachsen schneller +++ Auch Säugetiere leuchten +++ Suchmaschinen können Meinungsbildung beeinflussen +++**********Weiterführende Quellen zu dieser Folge:Global evidence of rapid urban growth in flood zones since 1985, Nature, 4.10. 2023All-a-glow: spectral characteristics confirm widespread fluorescence for mammals, Royal Society, 4.10. 2023Auditing Search Query Suggestion Bias Through Recursive Algorithm Interrogation, 14th ACM Web Science Conference 2022, Juni 2022The evolution of same-sex sexual behaviour in mammals, Nature Communications, 3.10. 2023Wie zufrieden ist die Bevölkerung in Deutschland?, Bundesinstitut für Bevölkerungsforschung, Oktober 2023Masculinity and veganism: the effect of linking vegan dishes with masculinity on men's attitudes toward vegan food, Frontiers in Communication, 5.10. 2023**********Ihr könnt uns auch auf diesen Kanälen folgen: Tiktok und Instagram.

Wir stecken in der Plastikkrise, sagt die Organisation Oceancare. Was tun mit dem Plastik, bevor er in den Seen und dem Meer endet? Die Forschung zeigt Lösungen – mit fluoreszierendem Kunststoff für besseres Recycling, plastikfressenden Würmern und einem Superenzym dank künstlicher Evolution. Das Plastik-Experiment Sie fressen sich durch Styropor und können davon leben. Schwarzkäferlarven, sogenannte Superwürmer. Chris Rinke von der University of Queensland in Australien hat zusammen mit seinem Team Schwarzkäferlarven und ihr Potenzial im Kampf gegen die Plastik-Berge untersucht. Doch funktioniert das wirklich? Grösseres Plastik-Problem als gedacht Weitaus mehr Plastik landet in der Umwelt als bisher angenommen, das bestätigt die Forschung von Roman Lehner, Wissenschaftlicher Projektleiter der Sail & Explore Association. Er untersucht den Plastikgehalt in Ozeanen und in Schweizer Seen. Schätzungsweise schwimmen sogar aus den Flüssen 20 Tonnen Mikroplastik pro Jahr in die Meere. Das unzerstörbare Material Plastik besteht aus langen Polymerketten. Meistens wird der Kunststoff aus Erdöl hergestellt. Dazu wird Erdöl in seine Einzelteile zerlegt und neu angeordnet. Synthetische Polymere lassen sich kaum aufbrechen und werden darum nur sehr langsam abgebaut. Teilweise braucht es 500 bis 1000 Jahre, bis sie sich zersetzen. Markierter Kunststoff Will man Plastik wiederverwenden, muss der Plastik gut sortiert und sortenrein sein. Denn Plastik ist nicht gleich Plastik. PVC, PET, PE, PTA – die unterschiedlichen Plastiksorten finden wir alle in unserem Alltag. Jochen Moesslein hat mit Polysecure eine fluoreszierende Markierung erfunden, die es ihnen ermöglicht, eine 99-prozentige Sortierquote zu erreichen. Dabei wird die Fluoreszenz in den Kunststoff oder das Etikett eingearbeitet und von einem Laser erkannt. Plastikfressender Pilz Pilz 943. Das ist der verheissungsvolle Kandidat aus den Schweizer Bergen, der Bio-Plastik frisst. Forschende der eidgenössischen Forschungsanstalt Wald, Schnee und Land (WSL) haben aus Bodenproben im Engadin über 800 Pilze und Bakterien isoliert mit dem Ziel: Mikroorganismen finden, die Bio-Plastik wie Kompostsäcke oder landwirtschaftliche Mulch-Folie abbauen. Der Pilz 943 hat sich hervorgetan. Er baut während zwei Monaten 50 Prozent eines Stücks Plastik ab. Superenzym gegen Plastik dank künstlicher Evolution Auf dem Friedhof in Leipizg haben Forschende ein Enzym gefunden, das bei 60-70° Celsius PET-Verpackungen innert einer Stunde in seine Einzelteile zerlegt. Das Team von Christian Sonnendecker und Wolfgang Zimmermann will nun die DNS des Enzyms modifizieren. Dank künstlicher Evolution zum Superenzym, das noch schneller Plastik zersetzen kann. Sie entwickeln eine Methode, wie sie Tausende Proben schnellstmöglich analysieren und dank künstlicher Intelligenz auswerten können. Chemisches Recycling Ein geheimer Cocktail aus Chemikalien erlaubt es Samantha Anderson und ihrem Team von Depoly, Plastikabfall zu recyclen. Dank des chemischen Recyclings können sie alle PET-Teile bei Zimmertemperatur aus dem Plastik-Abfall separieren. Dabei wird der Plastik-Grundstoff TPA rausgefiltert, ein weisses Pulver. Normalerweise wird dieses Pulver aus Erdöl hergestellt.

Wir stecken in der Plastikkrise, sagt die Organisation Oceancare. Was tun mit dem Plastik, bevor er in den Seen und dem Meer endet? Die Forschung zeigt Lösungen – mit fluoreszierendem Kunststoff für besseres Recycling, plastikfressenden Würmern und einem Superenzym dank künstlicher Evolution. Das Plastik-Experiment Sie fressen sich durch Styropor und können davon leben. Schwarzkäferlarven, sogenannte Superwürmer. Chris Rinke von der University of Queensland in Australien hat zusammen mit seinem Team Schwarzkäferlarven und ihr Potenzial im Kampf gegen die Plastik-Berge untersucht. Doch funktioniert das wirklich? Grösseres Plastik-Problem als gedacht Weitaus mehr Plastik landet in der Umwelt als bisher angenommen, das bestätigt die Forschung von Roman Lehner, Wissenschaftlicher Projektleiter der Sail & Explore Association. Er untersucht den Plastikgehalt in Ozeanen und in Schweizer Seen. Schätzungsweise schwimmen sogar aus den Flüssen 20 Tonnen Mikroplastik pro Jahr in die Meere. Das unzerstörbare Material Plastik besteht aus langen Polymerketten. Meistens wird der Kunststoff aus Erdöl hergestellt. Dazu wird Erdöl in seine Einzelteile zerlegt und neu angeordnet. Synthetische Polymere lassen sich kaum aufbrechen und werden darum nur sehr langsam abgebaut. Teilweise braucht es 500 bis 1000 Jahre, bis sie sich zersetzen. Markierter Kunststoff Will man Plastik wiederverwenden, muss der Plastik gut sortiert und sortenrein sein. Denn Plastik ist nicht gleich Plastik. PVC, PET, PE, PTA – die unterschiedlichen Plastiksorten finden wir alle in unserem Alltag. Jochen Moesslein hat mit Polysecure eine fluoreszierende Markierung erfunden, die es ihnen ermöglicht, eine 99-prozentige Sortierquote zu erreichen. Dabei wird die Fluoreszenz in den Kunststoff oder das Etikett eingearbeitet und von einem Laser erkannt. Plastikfressender Pilz Pilz 943. Das ist der verheissungsvolle Kandidat aus den Schweizer Bergen, der Bio-Plastik frisst. Forschende der eidgenössischen Forschungsanstalt Wald, Schnee und Land (WSL) haben aus Bodenproben im Engadin über 800 Pilze und Bakterien isoliert mit dem Ziel: Mikroorganismen finden, die Bio-Plastik wie Kompostsäcke oder landwirtschaftliche Mulch-Folie abbauen. Der Pilz 943 hat sich hervorgetan. Er baut während zwei Monaten 50 Prozent eines Stücks Plastik ab. Superenzym gegen Plastik dank künstlicher Evolution Auf dem Friedhof in Leipizg haben Forschende ein Enzym gefunden, das bei 60-70° Celsius PET-Verpackungen innert einer Stunde in seine Einzelteile zerlegt. Das Team von Christian Sonnendecker und Wolfgang Zimmermann will nun die DNS des Enzyms modifizieren. Dank künstlicher Evolution zum Superenzym, das noch schneller Plastik zersetzen kann. Sie entwickeln eine Methode, wie sie Tausende Proben schnellstmöglich analysieren und dank künstlicher Intelligenz auswerten können. Chemisches Recycling Ein geheimer Cocktail aus Chemikalien erlaubt es Samantha Anderson und ihrem Team von Depoly, Plastikabfall zu recyclen. Dank des chemischen Recyclings können sie alle PET-Teile bei Zimmertemperatur aus dem Plastik-Abfall separieren. Dabei wird der Plastik-Grundstoff TPA rausgefiltert, ein weisses Pulver. Normalerweise wird dieses Pulver aus Erdöl hergestellt.

In Folge 24 des The Natural Gem Podcasts sprechen Mag. Patrick-Noël Herold-Gregor seines Zeichens COO bei The Natural Gem, und unser Host Emanuel Stadler erneut über den Diamanten, den wohl bekanntesten und verbreiteten Edelstein.   In Folge 24 beantworten wir Fragen wie: Was genau sind die 4C? Wie beeinflussen die 4C meine Kaufentscheidung? Welcher Stein eignet sich als Investment, welche als Schmuckstein? Wie werden Synthtische Dimanten den Markt beeinflussen? Welche berühmten Diamanten gibt es? Was ist Fluoreszenz im Diamanten? und vieles mehr...! Kontakt: podcast@thenaturalgem.com Patrick-Noël Herold-Gregor | LinkedIn Emanuel Stadler, MA | LinkedIn TNG Website & Online Shop   Referenzierte Episoden/Ressourcen: Investieren in Edelsteine | Amazon Portfolio Design | TNG Podcast Synthetische Edelsteine | TNG Podcast Inflation und Krisenzeiten | TNG Podcast Investment Strategie | TNG Podcast   Abboniere unseren Podcast und hinterlasse uns eine gute Bewertung! Spotify | Apple Podcasts | Podbean      

Forscher*innen in den USA haben Smartphones mit Hilfe einer Makrolinse und Material aus dem Baumarkt für um die 50 Euro in recht brauchbare Fluoreszenz-Mikroskope verwandelt. Mit dem „Glowscope“ kann man z.B. farbig leuchtende Gewebe sichtbar machen.

Was haben Post its und Fische gemeinsam? In dieser Folge wird's etwas Naturwissenschaftlicher, aber wir hoffen euch interessiert das Thema genauso wie uns. Lasst uns gerne Feedback auf Instagram da!

In dieser Folge reden wir über das Phänomen der Lumineszenz. Dabei begegnen wir unter anderem einem alten Bekannten, dem Chinin (KtT027: Gin and Tonic), aber auch leuchtenden Skorpionen. Des Weiteren erklärt Timm wie man einen Tatort zum Leuchten bringt und wie Licht in die Tiefsee kommt.

Heute: Mandelbrot Talks' Folge 23 mit einem einem Interview zu Nanochemie. In Göttingen hat das Semester wieder angefangen, während in Helsinki schon die erste Unterrichtsphase vorbei ist. Mitten in den Vorbereitungen, in Jeanettes Fall, zu Ausflügen in der freien Woche und, in Christophs Fall, Vorlesungen und Übungen, sind wir durch Vermittlung des juFORUM  zu einem spannenden Interview mit Zunhao gekommen. Er studiert im Master an der Leibniz-Universität in Hannover im Studiengang Material- und Nanochemie. Mit ihm sprechen wir über seine Masterarbeit, die sich mit der Herstellung und Charakterisierung von Nanopartikeln und mit der Floureszenzverstärkung beschäftigt.  Dafür stellt er Metallnanopartikel (Platin oder Silber) und Halbleiternanopartikel (Calciumselenid) her, deren Dicke ca. ein Tausendstel derer eines Haares entspricht. Cadmiumselenid ist ein Halbleiter, also ein Kristall, in den periodisch Fehlstellen platziert werden, deren physikalische Eigenschaften viele technische Anwendungen nutzen. Nachdem die Partikel zufriedenstellend hergestellt sind, werden diese "vermischt". In der bisher verwendeten Technik werden die Metall- und die Halbleiterpartikel durch eine Silicaschicht getrennt. Zunhao will im Laufe seiner Arbeit diese Technik so abändern, dass die Partikel in Lösung vorliegen, also die einzelnen Partikel von einer Silicaschicht umgeben sind, an die sich die Halbleitepartikel anheften. Wenn dann die Proben fertiggestellt sind, werden die Halbleiterparikel durch eine UV-Lampe zum Leuchten angeregt (Fluoreszenz), dabei findet auch eine plasmonische Anregung der Metallpartikel statt, wodurch dann auch die Anregung der Halbleiterpartikel verstärkt wird. Zuletzt noch etwas in eigener Sache: Unsere Seite gibt es jetzt auch auf Englisch, ihr könnt uns jetzt also weltweit bewerben bei Euren Wissenschaftskontakten, Freunden und allen, die ihr kennt! Wir suchen für unsere Liveshow am 26.01.2019 noch interessierte Biophysikerinnen und -physiker, die mit uns 60 min über ihr Forschungsgebiet reden möchten. Viel Spaß beim Hören und bis in zwei Wochen, Eure Jeanette und Christoph

Diese Dissertation berichtet über ein neuartiges Quantengasmikroskop, mit dem Vielteilchensysteme von fermionischen Atomen in optischen Gittern untersucht werden. Die einzelplatzaufgelöste Abbildung ultrakalter Gase im Gitter hat mächtige Experimente an bosonischen Vielteilchensystemen ermöglicht. Die Erweiterung dieser Fähigkeit auf Fermigase bietet neue Aussichten, komplexe Phänomene stark korrelierter Systeme zu erforschen, für die numerische Simulationen oft nicht möglich sind. Mit Standardtechniken der Laserkühlung, optischen Fallen und Verdampfungskühlung werden ultrakalte Fermigase von 6Li präpariert und in ein 2D optisches Gitter mit flexibler Geometrie geladen. Die Atomverteilung wird mithilfe eines zweiten, kurzskaligen Gitters eingefroren. Durch Raman-Seitenbandkühlung wird an jedem Atom Fluoreszenz induziert, während seine Position festgehalten wird. Zusammen mit hochauflösender Abbildung erlaubt die Fluoreszenz die Rekonstruktion der ursprünglichen Verteilung mit Einzelplatzauflösung und hoher Genauigkeit. Mithilfe von magnetisch angetriebener Verdampfungskühlung produzieren wir entartete Fermigase mit fast einheitlicher Füllung im ersten Gitter. Dies ermöglicht die ersten mikroskopischen Untersuchungen an einem ultrakalten Gas mit klaren Anzeichen von Fermi-Statistik. Durch die Präparation eines Ensembles spinpolarisierter Fermigase detektieren wir eine Abflachung im Dichteprofil im Zentrum der Wolke, ein Charakteristikum bandisolierender Zustände. In einem Satz von Experimenten weisen wir nach, dass Verluste von Atompaaren an einem Gitterplatz, bedingt durch lichtinduzierte Stöße, umgangen werden. Die Überabtastung des zweiten Gitters erlaubt eine deterministische Trennung der Atompaare in unterschiedliche Gitterplätze. Die Kompression einer dichten Wolke in der Falle vor dem Laden ins Gitter führt zu vielen Doppelbesetzungen von Atomen in unterschiedlichen Bändern, die wir ohne Anzeichen von paarweisen Verlusten abbilden können. Somit erhalten wir die wahre Besetzungsstatistik an jedem Gitterplatz. Mithilfe dieser Besonderheit werten wir die lokale Besetzungsstatistik an einem Ensemble bandisolierenderWolken aus. Im Zentrum bei hoher Füllung sind die Atomzahlfluktuationen um eine Größenordnung unterdrückt, verglichen mit klassischen Gasen, eine Manifestation des Pauliverbots. Die Besetzungswahrscheinlichkeiten werden verwendet, um die lokale Entropie an jedem Gitterplatz zu messen. Eine niedrige Entropie pro Atom bis 0.34kB wird im Zentrum des Bandisolators gefunden. Die Erweiterung der Quantengasmikroskopie auf entartete Fermigase eröffnet neue Möglichkeiten der Quantensimulation stark korrelierter Vielteilchensysteme und kann einzigartige Erkenntnisse über fermionische Systeme im und außerhalb vom Gleichgewicht, Quantenmagnetismus und verschiedene Phasen des Fermi-Hubbard-Modells ergeben.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für die Zwei-Photonen-Endomikroskopie untersucht. Die Herausforderung liegt in der Miniaturisierung der Technik der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um auch endoskopisch in vivo hochauflösende Bilder von Gewebestrukturen und Zellen zu erhalten. Im Gegensatz zur Gewebeentnahme bei einer Biopsie ist dieses optische Verfahren minimal-invasiv. Damit ist eine Vorab Untersuchung des Gewebes möglich, die die Diagnostik unteranderem von bösartigen Gewebestrukturen präzisieren könnte. Die konfokale Endoskopie bietet bereits mit einem vergleichbaren Verfahren die Möglichkeit einer optischen Biopsie an der Oberfläche, z.B. an verschiedenen Schleimhäuten. Aufgrund der Gewebestreuung ist die Eindringtiefe des Lichts dabei aber auf wenige Mikrometer begrenzt. Diese Einschränkung könnte durch die bereits in der Zwei-Photonen-Mikroskopie gezeigte größere optische Eindringtiefe durch die Zwei-Photonen-Endomikroskopie verbessert werden. In dieser Arbeit wurde ein Femtosekundenlaser durch Glasfasern geleitet und am distalen Ende mit Hilfe einer Mikrooptik fokussiert. Dazu wurde ein Aufbau basierend auf Faserbündeln gewählt. Die einzelnen Faserkerne des Glasfaserbündels wurden mit einem Galvanometer-Scanner abgerastert und die dazugehörige detektierte Fluoreszenz punktweise zu einem Bild zusammengesetzt. Zur Kompensation der zeitlichen Verbreiterung der Pulse wurde ein Gitterkompressor aufgebaut. Mit diesem Aufbau wurden Zwei-Photonen-Fluoreszenz Aufnahmen von fluoreszenzstarken Proben durch ein Faserbündel ermöglicht. Diese Arbeit zeigt die Machbarkeit der Zwei-Photonen-Endoskopie und zeigt Möglichkeiten zur Optimierung, um zukünftig auch einen klinischen Einsatz zu ermöglichen. Mit der verwendeten Mikrooptik wurde eine zelluläre Auflösung von (3,5 ± 0,3) μm lateral und (5,3 ± 0,1) μm axial erreicht. Durch die Verwendung eines Referenzsystem aus Mikroskopobjektiven im Austausch der Mikrooptik konnte gezeigt werden, dass vor allem die laterale Auflösung noch verbessert werden konnte. Entscheidend ist hierfür eine hohe distale numerische Apertur. Der zukünftige Einsatz von verbesserten Mikrooptiken kann somit die Auflösung noch erhöhen. Aktuelle Forschungsergebnisse legen nahe, dass diese zukünftig auch kommerziell erhältlich sein könnten. Zusätzlich wurde eine variable Fokussiereinheit auf Basis eines Drahts aus einer Formgedächtnislegierung (Nitinol) realisiert. Damit konnte der Abstand zwischen Mikrooptik und Gewebeoberfläche verstellt werden. Durch Applikation eines maximalen Stromes bis zu 385mA kontrahiert der Nitinoldraht um ca. 1,8%. Ab dem minimalen Aktivierungsstrom von 330 mA konnte ein linearer Zusammenhang zwischen der Stromstärke und der Verschiebung beobachtet werden. Eine Änderung der Stromstärke in Schritten von 16–12 mA. ermöglicht eine Verschiebung von 20–10 μm. Eine Herausforderung ist die Erzeugung und Detektion der Fluoreszenzsignale aus dem Gewebe zur Erzeugung von aussagekräftigen Zwei-Photonen-Bildern. Die Leistungsverluste der Laserenergie im Anregungsweg und die Verluste des Fluoreszenzsignals im Detektionsweg müssen hierfür möglichst gering gehalten werden. Die größten Verluste im Anregungsweg gibt es durch den Gitterkompressor, durch die Fasereinkopplung und durch die Mikrooptik. Trotzdem ist die hier erreichte Gesamttransmission von 18% (λ0 = 800 nm) ohne Gitterkompressor vergleichbar mit der erster Zwei-Photonen-Mikroskope. Durch Optimierung einzelner Komponenten, vor allem des Gitterkompressors und der Mikrooptik, ist zukünftig eine bessere Transmission möglich. Die Erzeugung von Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignalen wird auch durch die Pulsverbreiterung innerhalb des Faserbündels verringert. Sowohl lineare als auch nichtlineare Effekte verbreitern spektral und zeitlich die Pulse. Die Untersuchung dieser Effekte konnte zeigen, dass mit Hilfe eines Gitterkompressors die zeitliche Pulsdauer am Faserausgang bis auf ca. 10 fs wiederhergestellt werden konnte und damit die Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung verbessert werden konnte. Trotzdem konnten bereits bei den hier verwendeten Leistungen (5–65 mW) auch nichtlineare Effekte beobachtet werden. Dazu kommt, dass bei höheren Laserintensitäten keine Transmission mehr möglich ist und die Eigenfluoreszenz der einzelnen Fasern des Faserbündels die Fluoreszenzsignale aus dem Gewebe überlagert. Zur Beseitigung der hier gezeigten Limitierungen durch die Mikrooptik und durch das Faserbündel sind weitere Optimierungen nötig um den Einsatz eines Zwei-Photonen-Endoskops in vivo zu ermöglichen. Durch den nichtlinearen Zusammenhang zwischen der Photonenintensität und der Fluoreszenzanregung sind diese Limitierungen gravierender als bei einer normalen Fluoreszenzanregung. Eine Reduzierung der Spitzenintensitäten der Laserpulse bei einem gleichzeitigen Erhöhen der Laserrepetitionsrate könnte zukünftig die nichtlinearen Effekte reduzieren und die effektive Laserleistung am Faserausgang erhöhen.

Thu, 27 Mar 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16842/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16842/7/Hennig_Georg.pdf Hennig, Georg ddc:610, ddc:600, Medizinisch

Die Myotone Dystrophie Typ 2 (DM2) gehört, zusammen mit der Myotonen Dystrophie Typ 1 (DM1), zu den häufigsten erblichen Muskelerkrankungen des Erwachsenenalters. Sie wird autosomal dominant vererbt, ihre Inzidenz liegt bei 1:10.000 - 1:20.000. Die genetische Ursache der Myotonen Dystrophie Typ 2 ist ein abnorm expandiertes Tetranukleotid-CCTG-Repeat im Intron 1 des Zinkfinger-9-Gens (ZNF-9) auf Chromosom 3q21.3. Das kleinste, bisher in der Literatur beschriebene, Krankheitsallel zeigte eine Expansion von 75 CCTGs. Im Regelfall haben DM2-Patienten ein expandiertes Allel mit mehr als 5000 CCTG-Repeats. Die CCTG-Repeats akkumulieren in sog. ribonukleären Foci im Zellkern und im Zytoplasma. Dadurch kommt es zu Störungen in RNA-Prozessierungs- und Metabolisierungsvorgängen, wie dem alternativen Spleißen oder der Proteintranslation. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal eine Phänotyp-Genotyp-Analyse von DM2-Patienten mit einem Repeat, kürzer als 75 CCTGs, sowie die Evaluation der Pathogenität dieser kurzen Repeats. Die Evaluation der Pathogenität geschah mithilfe verschiedener Nachweismethoden in Mus-kelbioptaten und in der genomischen DNA. Der Repeat-Nachweis im Muskelbioptat wurde einerseits immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern gegen das CUG Bindungspro-tein 1 (CUGBP1) und gegen die Muscleblind-like Proteine 1-3 (MBNL1-3) geführt, anderer-seits mittels der Fluoreszenz in situ Hybridisierungstechnik unter Verwendung einer DNA-Sonde. Zur spezifischeren Detektion, der für die DM2-Erkankung typischen Repeat-Expansion, wurde eine PCR und eine Triplet-Repeat-Primed PCR angeschlossen. Des Weite-ren fand eine Sequenzierung der Blutproben der Patienten statt, zur möglichst genauen Analy-se der Repeat-Größe. In der vorliegenden Arbeit konnte der Repeat-Nachweis in den Muskelbioptaten mit den be-schriebenen Methoden bei allen untersuchten Patienten erfolgreich geführt werden. In den PCRs waren erhöhte Produkte nachweisbar. Die angeschlossene TP-PCR zeigte eindeutige Prämutationsmuster und die Sequenzierung der genomischen DNA ergab eine reproduzierbare Repeatlänge zwischen 32 und 36 CCTGs. In der Zusammenschau mit dem erhobenen Phä-notyp sind somit bereits CCTG-Repeat-Expansionen unter 75 CCTGs pathogen. Zur funktio-nellen Absicherung der Pathogenität wurde ergänzend eine Repeat-Untersuchung im Muskel durchgeführt und das für den Pathogenitätsnachweis etablierte CLCN1 splicing assay. Auch hier bestätigte sich die funktionale Relevanz dieser Mini-Repeat-Expansionen. Somit kann aufgrund der Untersuchungen dieser Arbeit die untere Grenze der als pathogen anzusehenden Repeat-Expansion bei der Myotonen Dystrophie Typ 2 auf eine Repeat-Anzahl von 35 CCTGs festgesetzt werden, die sich mit der von Normalallelen nahezu überlappt. Daraus ergeben sich bedeutende diagnostische und klinische Konsequenzen für Patienten mit neuromuskulären Erkrankungen und dem Verdacht auf eine Myotone Dystrophie Typ 2.

Einleitung: Viele operative Eingriffe werden unter Blutsperre durchgeführt. Postoperativ kommt es gehäuft zu Komplikationen an Muskeln und Knochen, als Post-Tourniquet-Syndrom zusammengefasst. In ihrer Pathogenese spielen wahrscheinlich hämodynamische Veränderungen während der Reperfusion eine bedeutende Rolle. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Dynamik der Reperfusion der langen Röhrenknochen und Muskeln nach Ischämie zu klären. Die Blutflussmessung wurde mittels fluoreszierender Mikrosphären durchgeführt. Methodik: 13 Kaninchen wurde eine Blutsperre angelegt und für 60 bzw. 120 Minuten belassen. Die Tiere erhielten in Narkose linksventrikuläre Injektionen von fluoreszierenden Mikrosphären 1, 5, 15, 30, 60 und 90 Minuten nach Lösen der Blutsperre. Beide Femora, Tibiae und Tali sowie Mm. gastrocnemicae und tibialis anteriores wurden nach einem festgelegten Dissektionsschema in Proben aufgeteilt und die Fluoreszenz automatisiert gemessen. Hiermit konnte der Blutfluss errechnet werden. Ergebnisse: Im Knochen und in der Muskulatur trat nach Entfernen der Blutsperre eine sofortige Hyperämie auf. Nach 120 Minuten Ischämiezeit war die Mehrdurchblutung höher und hielt länger an als nach 60 Minuten Ischämiezeit. Im Knochen war der maximale Blutfluss auf das 1,4 fache, im Muskel sogar auf das 6 fache erhöht. Nach einer Stunde Ischämiezeit war der Blutfluss 15 Minuten erhöht und nach 2 Stunden 90 Minuten. Regionale Unterschiede in der Knochendurchblutung nach Ischämie fanden sich nicht. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse belegen die Abhängigkeit der Knochen- und Muskeldurchblutung während der Reperfusion von der Ischämiezeit. Es ergeben sich Unterschiede in der Dynamik und im Ausmaß der Durchblutungsänderung. Dieser Zusammenhang kann zur Klärung der Pathogenese postoperativer Komplikationen nach Blutsperre beitragen.

Die automatische Fokussierung ist ein grundlegender Arbeitsschritt für die Bildaufnahme und Auswertung mit motorgetriebenen Mikroskopen. Auch wenn die Forschungs- und Entwicklungsarbeit auf dem Gebiet des kontrastbasierten Autofokus nunmehr auf eine viele Dekaden lange Geschichte zurückblicken kann, fehlt es selbst aktuellen Methoden an Robustheit gegenüber Bildstörungen und der Handhabung komplexerer Präparatstrukturen. Diese Dissertation stellt einen neuen Autofokusansatz vor, der grundsätzlich mit jeder Mikroskopieart wie unter anderem Fluoreszenz-, Hellfeld- oder auch Phasenkontrast-Mikroskopie verwendet werden kann. Die Neuheit der Methode besteht in einer inhaltsbasierten Fokussuche, die für eine gezieltere Autofokussierung Vorwissen über das zu untersuchende Präparat verwendet. Dabei stellen die von den Trainingsdaten extrahierten und per Boosting selektierten lokalen Haar-Merkmale die Wissensbasis. Die im folgenden als Inhaltsbasierte Autofokus (IB-AF) bezeichnete Methode verfährt in drei Schritten: Zuerst werden an beliebiger z-Koordinate innerhalb des Präparats Regions-of-Interest (ROI) ermittelt, die starke Objekthypothesen enthalten. Danach wird nur auf diesen Regionen eine Kontrastmessung zur Fokuslagenndung der jeweiligen Region entlang der z-Achse durchgeführt. Im letzten Schritt werden die Regionen in ihrer Fokuslage einer genaueren Verikation unterzogen, um ergänzend etwaige uninteressante Objekte auszuschließen. Mit dieser Herangehensweise wendet sich der IB-AF von traditionellen Methoden ab, welche den gesamten Bildbereich einer Fokusmessung unterziehen. Dadurch ist es möglich, sowohl Artefakte aus der Schärfemessung auszuschließen, als auch gezielt spezische Objekte in den Fokus zu bringen. Die vorgestellte Methode wurde auf Präparaten mit unterschiedlichen Herausforderungen getestet und erzielte ein erfolgreiches Fokussieren, wo andere Methoden bisher scheiterten.

In der vorliegenden Studie wurden 245 metastasierte Primärtumoren der Mamma mithilfe der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung untersucht. Es standen Immunohistochemie-Daten von 160 Fällen zur Verfügung. Es wurden in der Mehrzahl nicht amplifizierte Fälle gefunden. Es fanden sich 9 koamplifizierte Fälle, 3 Fälle zeigten Amplifikation für Topoisomerase-II-a ohne Her-2/neu-Amplifikation, 48 Fälle zeigten Amplifikation für Her-2/neu ohne Top-II-a-Amplifikation. Die IHC zeigte sowohl falsch negative als auch falsch positive Ergebnisse im Vergleich mit der FISH. Amplifizierte Fälle zeigten eine schlechtere mittlere Überlebenszeit als das Gesamtkollektiv im Bezug auf Top-II-a, für Her-2/neu amplifizierte Fälle lagen geringfügig über dem mittleren Überleben, was am ehesten mit der Therapie mit einem monokonalen Antikörper assoziiert ist. Koamplifizierte Fälle zeigten schlechtere Überlebenszeiten als das Gesamtkollektiv. Die Amplifikation, insbesondere von Topoisomerase-II-a und bei Koamplifikation, scheint mit einem schlechteren Überleben einherzugehen, dennoch ist die Bestimmung des Amplifikationsgrades für die Bereitstellung einer massgeschneiderten Therapie wichtig.

Thu, 10 Feb 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12679/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12679/1/Will_Armin.pdf Will, Armin ddc:6

Sat, 24 Jul 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12736/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12736/1/Gey_Annerose.pdf Gey, Annerose Cordula d

In der hier durchgeführten Studie „Untersuchungen zur mikrobiellen Besiedlung der Nasenhöhle von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis unter besonderer Berücksichtigung von Staphylococcus aureus und Staphylococcus aureus Small Colony Varianten“ sollte das Keimspektrum der chronischen Rhinosinusitis (CRS) beim Menschen, mit Schwerpunkt auf Staphylococcus aureus (Sa) und seinem Small Colony Variant (SCV) -Phänotyp, untersucht werden. Die chronische Rhinosinusitis (CRS) ist eine häufig vorkommende Erkrankung die bei etwa 5-15 % der Bevölkerung westlicher Industrienationen auftritt. Ihre Ätiologie ist noch unbekannt, allerdings wird als mögliche Ursache eine Infektion mit Bakterien diskutiert. Unter den Bakterien wird dem grampositiven Keim Staphylococcus aureus eine große Bedeutung bei dieser Erkrankung zugeschrieben. In dieser Studie wurden Nasenschleimhautbiopsien und Nasenspülproben von 31 Patienten mit CRS und nasalen Polypen (CRSNP+), 13 Patienten mit CRS ohne nasale Polypen (CRSNP-) und 21 Kontrollpatienten mit verschiedenen mikrobiologischen Methoden untersucht. Die Ergebnisse der hier vorliegenden Studie stellen eine bakteriologische Ursache für die chronische Rhinosinusitis in Frage. Es wird deutlich, dass der normale Phänotyp von Sa keine wesentliche Rolle bei der CRS spielt, da dieser Keim sowohl bei erkrankten als auch bei gesunden Probanden etwa gleich häufig auftrat, bei CRSNP- Patienten sogar in noch geringerer Menge als bei den anderen beiden Gruppen. In keiner der untersuchten Proben konnten SASCV nachgewiesen werden, so dass deren Rolle bei der CRS untergeordnet erscheint. Auf Grund der kleinen Fallzahlen kann von dieser Studie zwar nicht auf die Gesamtbevölkerung geschlossen werden, aber die Ergebnisse geben dennoch Hinweise auf die tatsächliche Situation. Auch bei der Untersuchung der übrigen in den Proben vorkommenden gram-positiven und gram-negativen, aeroben und anaeroben Bakterien konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Beim Vergleich der hier angewandten mikrobiologischen Nachweismethoden, stellte sich heraus, dass die Bakterienkultur im Vergleich zur Real-time PCR und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung die sensitivste Methode war. Die PCR hat allerdings den Vorteil dass auch DNA toter Bakterien nachgewiesen werden kann, und dass sie erheblich schneller durchzuführen ist als die Bakterienkultur. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung an Paraffingewebsschnitten scheint nach den hier vorliegenden Ergebnissen nicht geeignet zu sein, Sa im Gewebe nachzuweisen. Auf diesem Gebiet besteht also noch Bedarf an weiterer Optimierung der Methode an Paraffinschnitten. Neben bakteriologischen Untersuchungen von Patientenproben sollten Auswirkungen des Sa und SASCV- Nachweises auf nasale immunologische Parameter erfasst werden. Hierzu sollte das nasale Zytokinmuster erhoben werden und mögliche Unterschiede der Genexpression bei CRSNP+ Patienten mit Sa- Nachweis untersucht werden. Wie eine Infektion mit Sa bzw. SASCV zelluläre Reaktionen auf Proteinebene beeinflusst und ob Unterschiede zwischen Sa und SASCV in der induzierten Zellantwort bestehen, wurde zusätzlich an humanen monozytären MonoMac-6 Zellen (MM6) und an humanen Atemwegsepithelzellen der Zelllinie BEAS-2B (B2B) untersucht. Eine in vitro Infektion dieser beiden Zelltypen mit verschiedenen Sa- Stämmen führte zu einer unspezifischen Stimulierung der Sekretion aller untersuchten Proteine. Eine Polarisation in Richtung TH1 bzw. TH2, also in Richtung CRSNP- bzw. CRSNP+ konnte nicht festgestellt werden. Auch die Microarrayanalysen von Sa-positiven und Sa-negativen Biopsien von CRSNP+ Patienten zeigen keine vermehrte Expression von Genen für Zytokine die für TH1 oder TH2 polarisieren. Ebenso wurde die Konzentration der in der nasalen Lavage gemessenen Zytokine durch eine Infektion mit Sa nicht beeinflusst und ein TH2 Shift war nicht erkennbar. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass bei der CRS vermutlich zunächst eine Entzündung vorliegt, die dann ggf. die bakterielle Besiedlung fördert, als dass diese Entzündung initial durch eine bakterielle Infektion induziert wird. Es sei aber nochmals darauf hingewiesen, dass hier nur kleine Fallzahlen untersucht wurden. Klarheit könnte eine groß angelegte Studie mit möglichst hohen Patientenzahlen und einer gut charakterisierten Patientenpopulation sowie ggf. die Verwendung molekularer Verfahren zum Nachweis bakterieller Erreger bringen. Diese Studie zeigt, dass eine bakterielle Ursache der CRS unwahrscheinlich ist.

Die Ermittlung von molekularbiologischen Faktoren, die mit dem Ovarialkarzinom assoziiert sind, kann für die Beurteilung der Prognose und die Wahl der optimalen Therapie der Patientinnen sehr hilfreich sein. In dieser Arbeit wurde die prognostische Bedeutung der Disseminierung von Tumorzellen ins Knochenmark und der HER-2/neu (Human Epidermal Growth factor receptor-2) Proteinüberexpressions- und Genamplifikationsrate in Ovarialkarzinomzellen mittels Immunhistochemie und Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung untersucht.

Das Tollwutvirus (Rabies Virus (RV)) ist ein neurotropes Virus aus der Familie der Rhabdoviridae innerhalb der Ordnung Mononegavirales. RV Partikel werden an der Zelloberfläche durch Membran-Budding gebildet. Dabei wird der virale Ribonukleoproteinkomplex (RNP) durch das Matrixprotein (M) in eine Membranhülle verpackt in der Trimere des Transmembran-Glykoproteins (G) selektiv inkorporiert werden. Die G Spikes vermitteln die Bindung der Virionen an zelluläre Rezeptoren und die Fusion der viralen und zellulären Membran. Auch in Abwesenheit des G werden Viren freigesetzt, da der Budding-Prozess hauptsächlich durch das M Protein vermittelt wird. Das G-unabhängige Budding der Rhabdoviren erlaubt den Austausch der Oberflächenproteine (Envelope-Switching), wodurch es zu einem veränderten Tropismus (Re-targeting) der RV kommt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die G Proteine der Lyssaviren Mokola, Bat Hamburg und Lagos Bat, aber auch des RV-Stammes Challenge Virus Strain (CVS) für den spezifischen Neurotropismus dieser Viren verantwortlich sind. Der für die Inkorporation von Fremdproteinen in die Virushülle essentielle Bereich des RV G (tm) wurde verwendet, um chimäre Typ I Transmembranproteine aus dem rot-fluoreszierenden Protein (RFP) und RV G (tm-RFP) zu konstruieren und in die Virushülle G-defizienter und Wildtyp Tollwutviren zu inkorporieren. Fusionsproteine aus tm und zellulärem Prionprotein (tm-PrPC) wurden nicht an die Bereiche der Zellmembran transportiert, an denen Tollwutvirus-Budding stattfindet. Diese Konstrukte könnten daher verwendet werden, um den Ort des RV-Budding näher zu bestimmen, während die Inkorporation fluoreszierender Proteine in die Virushülle die direkte Visualisierung von einzelnen Stadien des Tollwutvirus-Lebenszyklus wie z.B. Virustransport oder Entry in lebenden Zellen ermöglicht. Aufgrund der G-vermittelten transsynaptischen Ausbreitung der Rhabdoviren in neuronalen Netzwerken, wurden die Fluoreszenz-markierten RV Partikel auch als neuronale Marker zur Untersuchung der Physiologie und Morphologie neuronaler Netzwerke verwendet. Der retrograde, axonale Transport der RV zum Zentralen Nervensystem ist eine essentielle Voraussetzung für die letale RV-Erkrankung. Durch die Verwendung von RV Partikeln mit tm-RFP-markierter Virushülle und eGFP-markiertem RNP konnte gezeigt werden, dass zweifarbige, also umhüllte Virionen entlang der neuronalen Ausläufer von in vitro differenzierten und primären Neuronen transportiert wurden, wobei der retrograde Transport in den in vitro differenzierten Neuronen mit einer konstanten Durchschnittsgeschwindigkeit von 0,1 µm/sek und einer durchschnittlichen Transportlänge von 25 µm erfolgte.

Mon, 1 Dec 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12399/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12399/1/Obermeier_Andreas.pdf Obermeier, Andreas ddc:5

Das Mammakarzinom ist eine Tumorerkrankung mit einem sehr heterogenen Krankheitsverlauf. Um den individuellen Krankheitsverlauf einer Patientin besser vorhersagen zu können und um individuelle Therapieentscheidungen treffen zu können, bedarf es prognostischer und prädiktiver Faktoren. Neben den etablierten Prognosefaktoren Tumorgröße, Lymphknotenstatus, Metastasierung und Grading werden momentan verschiedene biologische Faktoren untersucht. Darüber hinaus wird in letzter Zeit insbesondere die prognostische Bedeutung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark diskutiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die prognostische Relevanz von den biologischen Faktoren HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 sowie deren Korrelation mit dem Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark bei Patientinnen mit Mamma-CA zu evaluieren. Insgesamt wurden Gewebeproben von 256 primären Mammakarzinomen mit bekanntem Knochenmarkstatus untersucht. Zunächst wurden aus den archivierten Gewebeblöcken sogenannte Tissue-Micro-Arrays (TMAs) hergestellt. An diesen TMAs wurde die Expression von HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen analysiert. Zusätzlich wurde das Tumorgewebe auf eine potentielle Genamplifikation von HER2 und Topoisomerase-IIalpha mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hin untersucht. Es stellte sich heraus, dass die meisten dieser biologischen Faktoren untereinander korrelieren. Darüber hinaus konnte eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression von HER2 und einem kürzerem krankheitsfreien Überleben der Patientinnen nachgewiesen werden. Weitere Korrelationen zwischen den einzelnen Faktoren und dem Krankheitsverlauf wurden nur in einigen Subgruppen gefunden. Keiner der untersuchten Faktoren stellte sich jedoch als unabhängiger prognostischer Faktor bezüglich eines kürzeren krankheitsfreien bzw. metastasenfreien Verlaufs oder eines kürzeren Gesamtüberlebens heraus. Diese Ergebnisse deuten daher lediglich auf einen kausalen Zusammenhang zwischen den von mir untersuchten Tumorsuppressormolekülen, Proliferationsmarkern und Wachstumsfaktorrezeptoren hin. Die Expression von HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 auf dem Primärtumor korrelierte nicht mit dem Vorhandensein von Tumorzellen im Knochenmark. Die Dissemination von Tumorzellen ins Knochenmark scheint daher ein von den untersuchten Faktoren unabhängiger Prozess zu sein. Allerdings korrelierte der Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark mit einem kürzeren Gesamtüberleben der Patientinnen. Bisher gehört die Knochenmarkspunktion zwar nicht zur Routinediagnostik beim primären Mammakarzinom. Allerdings wird diese Untersuchung in einigen Zentren empfohlen. Die weitere Charakterisierung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark sowie die Evaluation von zirkulierenden Tumorzellen im peripheren Blut sind Gegenstand der aktuellen Forschung.

Das Auffinden von forensischen Spuren verschiedenster Größe ist sowohl in der Rechtsmedizin als auch bei der polizeilichen Tatortarbeit von essentieller Bedeutung. Nur konzentrierte bzw. unverdünnte Blut - oder Sekretspuren einer gewissen Größe sind durch ihr charakteristisches Aussehen ohne Hilfsmittel zu erkennen. In der Vergangenheit wurde versucht, kleinste, nicht mit dem bloßen Auge sichtbare Sekretspuren mit UV Licht sichtbar zu machen. Dies führte meist zu unbefriedigenden Ergebnissen. Diese Arbeit beschreibt die Untersuchungen unterschiedlicher Trägermaterialien auf forensisch relevante Spuren mit Hilfe der neuen Tatortlampe Superlite 400. Diese Lampe wurde in Zusammenarbeit mit der bayrischen Polizei entwickelt und optimiert. Ziel dieser Arbeit war, herauszufinden, ob mit dieser Methode eine leichtere, schnellere, exaktere und vor allem spezifische Spurenerkennung möglich ist. Die bekannten und in der forensischen Praxis heute verwendeten chemischen Vortests wurden vergleichend auf ihre Sensitivität ebenso untersucht, wie auch die Auswirkung der Bestrahlung durch die Lampe auf die Qualität der DNA-Profile. Die Ergebnisse wurden mit zwei weiteren, weltweit häufig verwendeten, Tatortlampen, der Polilight und der Projectina SL 350, verglichen. Die Untersuchungen der Spuren auf den unterschiedlichen Trägermaterialien ergaben für Sperma eine spezifische Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 440 - 470nm. Bei den Blutspuren wurde die, aus früheren Studien bekannte, Wellenlänge von 415nm bestätigt. Diese zeigte jedoch deutliche Schwächen in der Kontrastierung und Fluoreszenz bei dunklen Spurenträgern. Speichelspuren konnten mit dem, bei der allgemeinen Suche verwendeten, unspezifischen UVA (320-400nm) sichtbar gemacht werden. Bei der Vergleichsuntersuchung von Blutspuren konnten mit Luminol deutlich höhere Verdünnungen detektiert werden als mit der Tatortlampe. Die chemische Vortests lieferten unterschiedliche Ergebnisse, so dass weiterführenden Tests empfohlen werden. Es wurde herausgefunden, dass die Bestrahlung der Spuren mit der Tatortlampe keinen Einfluss auf die Qualität der DNA-Profile hat. Bei der Arbeit mit reellen Tatortspuren konnten mit dem bloßen Auge nicht sichtbare Spuren detektiert werden und DNA-Profile erstellt werden. Die abschließenden Vergleiche mit anderen Tatortlampen zeigten deutliche Vorteile der Superlite 400 in der Lichtausgangsleistung und der Filtergenauigkeit. Dadurch war eine genauere und bessere Spurenerkennung durch die beschriebenen Detektionswellenlängen möglich. Aufgrund der Ergebnisse konnte festgehalten werden, dass die Kombination der Lampe mit anderen Vortests deutlich Zeit spart und das Übersehen von wichtigen Beweisen minimiert.

Thu, 17 Apr 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8459/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8459/1/Horvath_Christina.pdf Horvath, Christina

Die Mukoviszidose (engl: cystic fibrosis, CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung der kaukasischen Bevölkerung. Der Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, einem membranständigen Chloridionenkanal, manifestiert sich an diversen Organsystemen, wobei Infektionen des Respirationstraktes im Vordergrund stehen. CF-Patienten produzieren ein viskoses Tracheobronchialsekret, welches die mukoziliäre Clearance behindert. In der Folge etablieren sich chronisch verlaufende Lungeninfektionen mit einem CF-typischen Erregerspektrum (v.a. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia-Komplex, Haemophilus influenzae und Stenotrophomonas maltophilia), die letztendlich lebenslimitierend sind. Durch die frühzeitige und regelmäßige Gabe von Antibiotika wird versucht, die inflammatorische und erregerassoziierte Schädigung des Lungengewebes zu kontrollieren. Dabei ist eine mikrobiologische Diagnostik, die die Erreger schnell und mit hoher Sensitivität und Spezifität identifiziert, von großer Bedeutung. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit markierten Oliginukleotidsonden zum Nachweis ribosomaler RNS ist eine spezifische und sensitive Methode zum Erregernachweis. Sie benötigt im Vergleich zum mindestens 48h in Anspruch nehmenden kulturellen Nachweis nur wenige Stunden und erfasst auch bereits nicht mehr kultivierbare Erreger, z.B. nach erfolgter Antibiotikatherapie. Das relativ begrenzte Erregerspektrum der Lungeninfektionen bei CF bietet gute Voraussetzungen für den Einsatz der FISH-Diagnostik. Als problematisch hat sich hierbei das viskose und inhomogene CF-Sputum erwiesen, das aufgrund seiner Zusammensetzung bei der Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Sonden eine ausgeprägte Hintergrundfluoreszenz zeigt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einsatz der FISH-Technik zum Nachweis CF relevanter Erreger weiter zu optimieren. Zum einen sollte der Einfluss, den die Probenlagerung bis zur Weiterverarbeitung auf den Erregernachweis hat, untersucht werden. Dabei erwies sich 4ºC als geeignete Lagerungstemperatur, da die Mikroorganismen trotz Verringerung der Ribosomenzahl und damit etwas abgeschwächtem Fluoreszenzsignal bis zu 72h nach Probenentnahme mit FISH unverändert sensitiv nachweisbar sind, ohne dass eine Überwucherung langsamer wachsender Keime eintritt. Zum anderen sollte eine Minimierung der Hintergrundfluoreszenz erreicht werden. Verschiedene Modifikationen des Hybridisierungsprotokolls wurden miteinander verglichen. Durch die Absättigung unspezifischer Bindungsstellen der Oligonukleotidsonden mittels einer 30minütigen Vorinkubation mit freiem Biotin wurde die Hintergrundfluoreszenz erfolgreich vermindert, wobei die markierten Bakterien unverändert gut nachweisbar waren. Um die quantitative Auswertung der Sputumproben zu vereinfachen, wurde weiter ein Protokoll zur Analyse der FISH-Proben im Durchflusszytometer entwickelt. Durch diese schnelle, automatisierte Technik entfällt die zeitraubende manuelle Auswertung der Proben. Eine Integration dieser neu entwickelten Ergänzungen in bestehende Protokolle vereinfacht und beschleunigt die mikrobielle Diagnostik CF-typischer Erreger und eröffnet die Möglichkeit eines größeren Probendurchsatzes ohne zusätzliche Kosten.

Thu, 11 Oct 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7541/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7541/1/Manowski_Tassilo_von.pdf Manowski von, Tassilo Christoph

Eine zuverlässige, effiziente und kostengünstige Einzelphotonenquelle ist eine wichtige Komponente in vielen Anwendungen der Quanteninformationsverarbeitung und Quantenkommunikation. Einzelphotonenquellen wurden schon in Experimente der Quantenkryptographie eingesetzt und haben Vorteile gegenüber abgeschwächten Laserpulsen gezeigt. Eine Einzelphotonenquelle ist auch eine der notwendigen Voraussetzungen für einen optischen Quantencomputer nach Vorschlag von Knill, Laflamme und Milburn. Darüber hinaus sind einzelne Photonen der ideale Kandidat um das Grundprinzip der Quantenmechanik zu demonstrieren. Deshalb ist eine Einzelphotonenquelle auch wünschenswert für bildungszweck. Das in dieser Arbeit untersuchte Konzept für eine Einzelphotonenquelle basiert auf den Farbzentren im Diamant. Farbzentren sind eine attraktive Wahl für die praktischen Anwendungen wegen des relativ geringen experimentellen Aufwands. In dieser Arbeit wurde das SiV (silicon vacancy) Zentrum ausführlich untersucht, weil es mehrere vorteilhafte Eigenschaften hat, z.B. das schmales Spektrum und die kurze Lumineszenzlebensdauer. Die SiV-Zentren wurden durch Silizium-Ionenimplantation im IIa-Diamant erzeugt. Einzelne SiV-Zentren wurden durch ein konfokales Mikroskop optisch adressiert. Die Emission einzelner Photonen wurde durch die Messung der Intensitätskorrelationsfunktion nachgewiesen. Allerdings zeigt ein einzelnes SiV-Zentrum eine weiter niedrigere Photonenemissionsrate als erwartet. Es liegt auf einer Seite an einer schlechten Quantenausbeute wegen nicht-strahlender Übergänge. Andererseits existiert ein zusätzliches metastabiles Niveau im Energieschema des SiV-Zentrums. Das metastabile Niveau wurde als der positive Ladungszustand identifiziert. Durch Manipulation des Fermi-Niveaus im Diamant mit Stickstoff-Ionenimplantation kann die Population des positiven Ladungszustands eliminiert werden. Außer dem SiV-Zentrum wurden mehrere unbekannte einzelne Farbzentren gefunden und charakterisiert. Eine andere wichtige Angelegenheit ist das effiziente Aufsammeln der Fluoreszenz einzelner Quantenemitter. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden untersucht. Mit einer direkt auf Probe gesetzten Diamant Halbkugellinse wurde eine Erhöhung von der Aufsammeleffizienz um einen Faktor 5 erreicht. Wenn die Größe der Kristalle deutlich kleiner als die Wellenlänge der Fluoreszenz, tritt keine Brechung auf dem Übergang zwischen Diamant und Luft auf. Deswegen wurden einzelne SiV-Zentren in Diamantnanokristallen auch untersucht. Dabei wurde stärkere Fluoreszenzintensität observiert.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.

Die vorgelegte Arbeit beschäftigt sich mit der Her-2/neu Genamplifikation und der Her-2/neu Rezeptorüberexpression in verschiedenen Tumoren des Ovars. Untersucht wurden diese Veränderungen mit der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung und der Immunhistochemie. Die Ergebnisse bei den Ovarialkarzinomen exklusive Borderline-Tumoren lagen mit 6,8% (10/146) Amplifikation in der FISH und 6,7% (11/163) Überexpression in der Immunhistochemie im Vergleich zu Literaturdaten im unteren Bereich. Es fand sich kein Zusammenhang mit einem klinischen oder pathologischen Parameter (Tumorstadium, Tumorgrad, Tumortyp, Überleben). Die Literaturdaten zu diesen Fragestellungen sind kontrovers. Aufgrund der Tatsache, dass auch ein einzelner ovarieller Borderline-Tumor eine Genamplifikation aufwies, ist offensichtlich, dass diese Veränderung kein Phänomen darstellt, das vor allem für aggressive Tumoren oder fortgeschrittener Tumorstadien charakteristisch ist. Her-2/neu scheint somit für das Ovarialkarzinom sowohl prognostisch wie therapeutisch eine untergeordnete Rolle zu spielen. Die malignen Müller`schen Mischtumoren zeigten in Bezug auf die untersuchten Veränderungen ein überaus heterogenes Bild. Dabei ergab sich keine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp. Die geringe Frequenz echter Genamplifikationen macht eine prognostische Relevanz dieser Veränderung auch in dieser Tumorgruppe unwahrscheinlich. Granulosazelltumoren zeigten keinerlei Auffälligkeiten des Her-2/neu Gens und Rezeptors, somit scheidet diese Veränderung zur früheren Abschätzung des Wachstumsverhaltens aus. Die Ergebnisse von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie zeigten zueinander eine hohe Übereinstimmung (p

Der obere Aerodigestivtakt ist das primäre Kontaktorgan für viele inhalative Karzinogene. Dies spielt insbesondere bei der tabak-assoziierten Karzinogenese eine entscheidende Rolle. Polyzyklische Kohlenwasserstoffe und der Metabolit des Benzo[a]pyrens, das Benz[a]pyren-7,8-diol-epoxid (BPDE) sind hierbei von herausragender Bedeutung. Mutationen an der DNA sind dabei nicht gleichmäßig über die gesamte DNA verteilt, sondern auf speziellen Chromosomen bzw. Genen lokalisiert. Zur Erstellung eines individuellen Risikoprofils wurde in dieser Arbeit die alkalische Einzellzell-Mikrogelelektrophorese (Comet Assay), eine etablierte Methode zur Quantifizierung von DNA-Schäden, erstmals mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) an Mucosazellen des oberen Aerodigestivtraktes kombiniert. Nach Inkubation mit BPDE konnte so eine Bestimmung der DNA-Schädigung an den Chromosomen 3,5,8 und dem Vergleichschromosom 1 durchgeführt werden. Dabei wurden frisch entnommene, makroskopisch gesunde Mukosaproben von Patienten mit Oropharynxkarzinom und tumorfreien Patienten verglichen. Es stellte sich heraus, dass Tumorpatienten eine höhere Schädigung der Chromosomen 5 und 8 im Vergleich zu Chromosom 1 aufwiesen. Bei tumorfreien Patienten konnten keine Unterschiede der einzelnen Chromosomen untereinander und im Vergleich zur Gesamt-DNA nachgewiesen werden. Neben einer quantitativen Bestimmung der DNA-Schädigung an Interphasezellen sollte in der vorliegenden Arbeit auch strukturelle DNA-Schädigungen an Metaphasechromosomen untersucht werden. Zur Einschätzung der Mutagensensitivität bei der Karzinogenese im Oropharynx wurden in multiplen Vorarbeiten Lymphozyten als Kontrollzellen herangezogen. Deshalb wurden auch in der vorliegenden Arbeit Metaphasechromosomen aus Lymphozyten präpariert und mit FISH untersucht. Zusätzlich wurde auch eine neue Methodik zur Präparation von Metaphasechromosomen aus Mukosazellen des oberen Aerodigestivtraktes etabliert. Es konnte jedoch an keinem der untersuchten Chromosomen ein statistisch signifikanter Unterschied in der Schädigung zwischen tumorfreien- und Tumorpatienten ausgemacht werden. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Modell zur Präparation von Chromosomen aus Mukosazellen bietet zur weiterführenden Erfassung des Risikoprofils für die Entstehung von Karzinomen des oberen Aerodigestivtraktes einen geeigneteten Ansatz. Unter Umständen lassen sich zusätzliche Gene lokalisieren, die für die Tumorentstehung im Kopf-Hals-Bereich von Bedeutung sind. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass einige dieser Veränderungen bereits in makroskopisch gesunder Schleimhaut des oberen Aerodigestivtrakts auftreten. Weitere Untersuchungen müssen ergeben, ob spezifische Veränderungen am Genom nicht schon vor Entstehung des Tumors nachweisbar sind. Aus solchen Veränderungen ließe sich eine umfangreiche Frühdiagnostik zur Einschätzung der individuellen Mutagensensitivität entwickeln. Dies eröffnet die Möglichkeit für künftige präventive und therapeutische Strategien für die Karzinogenese des oberen Aerodigestivtraktes.

Die postmortale Alterung von Knochen (Diagenese) besteht aus einer sehr komplexen Serie von Prozessen, welche auf allen Ebenen seiner Organisation (makromorphologisch, mikro- und ultrastrukturell, molekular) erfolgt und entscheidend von Umweltfaktoren geprägt wird. In der vorliegenden Untersuchung wurde der Diagenesestatus von 127 archäologischem Knochen mit unterschiedlichen Liegezeiten (ca. 11500 bis 400 Jahren), auf mehreren Ebenen (Mikrostruktur, Biomoleküle, mineralische Matrix) festgestellt und diskutiert. Durch die Untersuchung von experimentell gealtertem Knochenmaterial konnten zusätzlich rein chemische Diageneseprozesse auf den untersuchten Ebenen nachvollzogen werden. Weiterhin wurde eine kleine Stichprobe von zehn modernen kremierten Knochen analysiert. Es ließen sich drei verschiedene Typen des diagenetischen Knochenstatus aufstellen (Diagenesetypen). Die histologische Knochenebene wurde als die Ebene erkannt, welche die meisten Informationen über den Erhaltungsstatus der anderen Merkmale liefern kann. Mit ihr hängt die Ausprägung der Fluoreszenz von Knochenquerschnitten bei Betrachtung unter UV-Licht zusammen. Folglich können diese beiden Merkmale als Indikatoren für den Diagenesetyp einer Knochenprobe dienen. Die Erfolgsaussichten der in der biologischen Spurenkunde angewandten Methoden hängen wesentlich von dem Ausmaß der postmortalen Knochenalterung ab. So ist es für die Analyse von größter Bedeutung, die Auswirkung der verschiedenen Einflussfaktoren auf die unterschiedlichen Ebenen der Knochenalterung zu erkennen und zu verstehen, um das biologische Signal von Dekompositionsartefakten trennen zu können. Durch die Erkenntnisse zu diagenetischen Abbauprozessen und Erhaltungszuständen des Knochens konnten in der vorliegenden Untersuchung die Möglichkeiten und Grenzen verschiedener spurenkundlicher Analysemethoden überprüft (DNA-Analysen, Analysen stabiler Isotope leichter Elemente) werden. Insbesondere wurden die Kriterien für die Validisierung stabiler Isotopendaten aus Kollagen betrachtet: Die Analysen zeigten, dass weder Kollagengehalt, noch C% und N% oder molare C/N-Verhältnis ausreichen, um diagenetisch veränderte Isotopenverhältnisse auszuschließen. Die Veränderung von Isotopenverhältnissen beruht mehrheitlich auf einer Veränderung der Aminosäurekomposition des Kollagens. Die Erstellung eines Aminosäureprofils ist daher unerlässlich für die Prüfung der Validität der Ergebnisse stabiler Isotopenanalysen. Die Prüfung der Zusammenhänge verschiedener Merkmale ermöglichte die Entwicklung und Überprüfung von Screeningmethoden für Kollagen- und DNA-Gehalt.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Manipulation der Primärreaktion von Bakteriorhodopsin (BR). Dazu wurde die Primärreaktion mittels Ultrakurzzeitspektroskopie im Femto- und Pikosekundenbereich eingehend untersucht und erste kohärente Kontrollexperimente an einem Modellsystem durchgeführt. Zuerst wurde der Einfluss der Proteinumgebung, den das Gegenion zur Schiffschen Base des Retinals (Aspartat (D) Position 85) auf die Primärreaktion von BR ausübt, untersucht. Dabei wurde BR mit Halorhodopsin (HR) (fehlendes Gegenion, Threonin (T)) und der BR-Mutante D85T verglichen. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass nur in dem Fall, wenn ein Anion exakt in einem eingeschränkten Bereich um die Position 85 lokalisiert ist, eine BR-ähnliche stationäre Absorption und eine schnelle Primärreaktion mit der BR-typischen Zeitkonstante von 0.5 ps hervorgerufen wird. Fehlt dagegen das Anion oder befindet es sich außerhalb dieses eingeschränkten Bereichs, tritt eine Primärreaktion analog zur Primärreaktion von HR mit einer biexponentiellen Kinetik von 1 bis 10 ps auf. Da in der Literatur widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der initialen Bewegungen im angeregten Zustand von BR vorliegen, wurde die Auswirkung der Anregungsdichten auf die Fluoreszenzdynamik analysiert: Bei hohen Anregungsdichten treten spektrale und dynamische Änderungen in der Fluoreszenz auf, die Mehrphotonenprozessen zugeordnet werden können. Diese Mehrphotoneneffekte erklären bestehende Diskrepanzen in der Literatur. Nur für niedrige Anregungsdichten sind lineare und native Anregungsbedingungen gewährleistet, unter denen sich ein biexponentielles Verhalten ergibt. Dabei wurde zum ersten Mal ein dynamischer Stokesshift beobachtet, der auf einen schnellen Umordnungsprozess auf der reaktiven Potentialfläche hindeutet. Ferner wurde der erste schnelle Prozess (

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wertigkeit der 5-ALA-induzierten Fluoreszenz-Zytologie (AFZ) zur Erkennung von bösartigen Veränderungen der Harnblase überprüft und durch Anwendung von spektralen Messtechniken quantifiziert und automatisiert. Schließlich wurde die Wertigkeit mit der Standard-Zytologie verglichen werden. Als Bewertungskriterien wurden hierfür einerseits die Standard-Diagnostikmethoden verwendet, und andererseits die Sensitivität und Spezifität der AFZ und der AFE mit denen einer spektralen Quantifizierung der AFZ verglichen.

Die Arbeit befasst sich mit der Analyse von Invasion, Dissemination und Vermehrung von Y.enterocolitica und S.Typhimurium im Mausinfektionsmodell unter Verwendung von Fluoreszenzproteinen und mit der Yersiniabaktinkreuzfütterung im Mausinfektionsmodell. Es wurden mittels grün-fluoreszierendem und rot-fluoreszierndem Protein Bakterien hergestellt, die sich nur anhand ihrer Fluoreszenz unterscheiden ließen. Damit konnte in Koinfektionsexperimenten von Mäusen mit Yersinien unter dem Lasermikroskop gezeigt werden, dass nur sehr wenige Bakterien über die Mukosabarriere invadieren und sowohl in Peyerschen Plaques als auch in Milz und Leber nur klonale Mikrokolonien von Bakterien einer Farbe gebildet werden. Im Unterschied dazu scheinen viele Salmonellen die Barriere zu überwinden, da sich zahlreiche grüne und rote S.Thyphimurium gemischt weitverstreut über die Organe verteilen. Weiterhin konnte durch Koinfektionsversuche mit Wildtyp Yersinie und Yersiniabaktinsynthese-defekter Mutante nachgewiesen werden, dass in vivo eine Yersiniabaktinfütterung stattfindet.

Die Intention dieser retrospektiven Analyse war die Beschreibung und Charakterisierung von Patientinnen mit einer HER2/neu- Überexpression bei metastasiertem Brustkrebs unter einer auf Trastuzumab- (Herceptin®) basierenden Therapie. Ein spezielles Augenmerk galt dem Auftreten von Hirnmetastasen in Relation zur Remission der viszeralen Metastasierung unter der Trastuzumab- Therapie. Es wurden von März 2000 bis zum Mai 2004 insgesamt 136 Patientinnen in drei onkologischen Zentren, wie der Medizinischen Klinik III und der Gynäkologischen Klinik der Universitätsklinik Großhadern und der Praxis Dr. Heinrich in Augsburg in die Analyse einbezogen. Die HER2/neu- Überexpression wurde durch die Immunhistochemie (IHC) bestimmt. Dazu wurden zwei gängige Methoden angewandt, die Fluoreszenz- in- situ- Hybridisierung (FISH) und der HercepTest® mittels Immunhistochemie (IHC). Unter den 136 in dieser Analyse untersuchten Patientinnen mit HER2/neu- Überexpression und einem DAKO- Score von +3 wurden bei 42 Patientinnen in Nachuntersuchungen eine Metastasierung im zentralen Nervensystem festgestellt, dies entspricht 30,9% aller untersuchten Fälle. In Bezug auf den Hormonrezeptorstatus, wie dem Östrogenrezeptor und dem Progesteronrezeptor fiel eine starke Korrelation zum Auftreten einer Hirnmetastasierung auf. Unter den Hirnmetastasierten hatten 42,8% und in der Gruppe ohne Hirnmetastasierung nur lediglich 23,4% einen negativen Hormonrezeptorstatus (p=0,01). Bei der Gruppe der hirnmetastasierten Patientinnen lag das mediane Intervall zwischen der Diagnose von peripheren Metastasen und dem Auftreten von Hirnmetastasen bei 14 Monaten bei einer Bandbreite von 0 bis 69 Monaten. Zum Zeitpunkt der Diagnose der Hirnmetastasierung schlug bei 14 der 42 Patientinnen die auf Trastuzumab- basierende Therapie an (CR+PR: 33,3%; 95% CI: 18,5- 48,2%). Die Patientinnen hatten ab der Diagnose der Hirnmetastasierung eine mediane Überlebenszeit von 13 Monaten bei einer Bandbreite von 0 bis 60 Monaten. Die mediane Gesamtüberlebenszeit, berechnet ab der Diagnose einer peripheren Metastasierung, unterschied sich jedoch in beiden Patientinnengruppen nicht signifikant voneinander (37 Monate gegenüber 47 Monaten; p=0,07 log rank). Als zweiter wichtiger Punkt unserer Analyse war die Effektivität der Trastuzumab- Therapie über den Zeitpunkt der Progression und im Zusammenhang zwischen Erst- und Zweilinientherapie festzustellen. Unter den 136 untersuchten Patientinnen hatten 66 Patientinnen Trastuzumab als Erstlinientherapie erhalten und 47 als Zweitlinientherapie. 23 Patientinnen erhielten Trastuzumab über den Zeitpunkt der Progression hinaus. Es gab keinen Unterschied bezüglich der Dauer der auf Trastuzumab- basierenden Therapie. Bei der Erstlinientherapie 29,5 Wochen gegenüber 25 Wochen bei der Zweit- oder Mehrlinientherapie. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Ansprechrate zwischen Erst- und Zweitlinientherapie (37,9% gegenüber 35,7%) und dem jeweiligen medianen Überleben der Patientinnen (p=0,47 log rank). Die Patientinnen, die zwei oder mehr auf Trastuzumab- basierende Therapieregime erhielten, überlebten signifikant länger als jene, die lediglich ein Trastuzumab- Therapieregime verabreicht bekamen (62,4 Monate gegenüber 38,5 Monaten; p=0,01 log rank). Trastuzumab ist sehr effektiv bei der Behandlung einer Leber- und Lungenmetastasierung HER2/neu- überexprimierter Patientinnen, aber es scheint eine Hirnmetastasierung nicht verhindern zu können. Auch eine Progression der ZNS- Filiae kann durch Trastuzumab nicht aufgehalten werden. Das Gesamtüberleben aber wird durch eine Kombination aus mehreren Therapieregimen mit Trastuzumab und Kombinationspartnern entscheidend verlängert, speziell bei Patientinnen, welche Trastuzumab über den Zeitpunkt der Progression hinaus erhalten hatten. Da etwa ein Drittel der HER2/neu- überexprimierten Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs trotz effektiver Behandlung der peripheren Metastasen mit Trastuzumab eine Hirnmetastasierung entwickelten, sollten neue Screeningmethoden und engere Überwachungszeiträume eingeführt, sowie andere Behandlungsstrategien entwickelt werden, um diesem Teil der Brustkrebs- Patientinnen besser helfen zu können.

Zum Nachweis von PrPc und PrPsc wurde eine Kapillarelektrophorese-Immunofluoreszenz-Methode (CE-LIF) etabliert und mit konventionellen Verfahren (ELISA, Westernblot, Dot-EIA) verglichen. Zur CE-LIF wurde der monoklonale Antikörper F89 und ein Fluoreszenz-markiertes Peptid (FITC-P3) eingesetzt. Die Nachweisgrenze für rekombinantes bovines PrPc liegt bei 1 pg/Test. Zur Anreicherung von PrPsc aus Hirn und Liquor wurden (Ultra-) Zentrifugations-, Extraktions- (HFIP) und Chromatographieverfahren (HPLC, Festphasenextraktion) einzeln oder in Kom-binationen geprüft; darüber hinaus wurden Anreicherungsversuche mit Affinität- bzw. Immu-nomagnetischer Separation vorgenommen. Die Überprüfung des PrPsc-Gehaltes ausgewählter Extrakte im Vergleich zum Ausgangsma-terial mittels ELISA ergab deutliche Substanzverluste. Eine selektive Bindung von PrPsc an Dynabeads® gekoppeltem Plasminogen konnte nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde eine Anlagerung an Antikörper-beschichteten Beads festgestellt. Allerdings war die Bin-dungskapazität der Beads bei Versuchen in mit in PBS gelöstem PrPc oder PrPsc höher als bei vergleichbaren Versuchen mit Liquor. Bei der kapillarelektrophoretischen Analyse erwiesen sich alle mittels einfacher Probenauf-bereitung hergestellten Extrakte als ungeeignet. Sie führten entweder zu technischen Prob-lemen (Verstopfung der Kapillare; Durchbrennen) oder zu Interferenzen im Elektrophe-rogramm, die eine Auswertung nicht ermöglichten. Die Aufbereitung mittels HPLC ergab zwar verwendbare Präparationen, allerdings variierte die Retentionszeit von PrPsc derart stark, dass dieses Verfahren nicht weiter eingesetzt wurde. Bezüglich der Verwertbarkeit von CE-LIF wurden die besten Resultate mit Hilfe einer Aufreinigung nach Bio-Rad® mit an-schließender Festphasenextraktion erzielt. Während der Nachweis von PrPsc mittels CE-LIF aus Hirngewebe eindeutig gelang, führte die Untersuchung des Liquors eines bekannt BSE-positiven Tieres zu keinem eindeutigen Ergebnis. Prinzipiell ist die CE-LIF zum Nachweis von PrPsc geeignet. Allerdings handelt es sich dabei um ein sehr störanfälliges Verfahren. Die Sensitivität kann deutlich erhöht werden, wenn die Konzentration von PrPsc in kleine Volumina noch besser gelingt.

Mit Hilfe von spektroskopischen Messmethoden (Absorption, Circulardichroismus, Fluoreszenz) wurde die Entfaltung von Phycocyanin untersucht. Dabei diente der Chromophor als natürliche Sonde, zusätzlich wurde die Sekundärstruktur gemessen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die Bedingungen der Untersuchungen festgelegt. Anschließend erfolgte die Entfaltung in steady-state Messungen mittels Harnstofftitration. Als drittes wurde die Kinetik der Entfaltung in 8 M Harnstoff untersucht. Daraus entwickelete sich eine Entfaltungsmodell, sowohl für das integrale Phycocyanin, wie auch für die Untereinheiten.

Der Aufbau des Zellkerns und die höheren Organisationsmuster von Chromosomen gehorchen Regeln, die bisher in menschlichen Zellen und Zellen einiger Primaten bestätigt werden konnten. In dieser Arbeit sollte an einem anderen Säuger, der Maus, untersucht werden, in wie weit sich die bisher gewonnenen Erkenntnisse auch auf den molekularbiologisch intensiv studierten Modellorganismus der modernen Genomforschung übertragen lassen. Besonders interessant ist die Frage, weil der Karyotyp der Maus nur akrozentrische Chromosomen enthält und viel homogener in Bezug auf Chromosomengröße und Gendichte ist, als der Karyotyp des Menschen oder verschiedener Primaten. Die letzten gemeinsamen Vorfahren von Mäusen und Menschen lebten vor über 80 Mio. Jahren, in dieser Zeitspanne fanden die zahlreichen Veränderungen am Genom der Maus statt. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob Gemeinsamkeiten in Bezug auf die Organisation des Chromatins nachzuweisen sind und ob evolutionär konservierte Organisationsmuster zu finden sind. Die quantitative Untersuchung der Topologie von Chromosomenterritorien und Zentromerregionen erfolgte mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf Zellkernen von vier Zelltypen der Maus. Auf Kerne von Lymphozyten, Fibroblasten, ES-Zellen und Makrophagen wurden die Territorien von sechs Chromosomen mittels Chromosomen-Paint-Sonden hybridisiert. Das ausgewählte Chromosomenset enthielt genreiche, genarme, große und kleine Chromosomen in verschiedenen Kombinationen. Bilddaten wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen und einer digitalen quantitativen Bildanalyse unterzogen. In allen Mauszelltypen zeigten sich klare Korrelationen zwischen sowohl Gengehalt als auch Größe und radialer Verteilung von Chromosomenterritorien. Bei kugeligen Lymphozytenkernen korreliert die Gendichte stärker mit der radialen Verteilung als es die Chromosomengrößen tun. In Fibroblasten sind beide Korrelationen schwächer, aber nachweisbar, in ES-Zellen sind die Korrelationskoeffizienten wieder etwas höher und für beide Verteilungsmodelle gleich, in Makrophagen überwiegt die größenabhängige Verteilung der Chromosomenterritorien. Das genreichste Chromosom MMU 11 zeigt in den Lymphozyten die meisten Unterschiede zu anderen Chromosomenterritorien, während sich das genarme MMU X in den untersuchten männlichen ES Zellen durch seine extreme Randlage von den anderen unterscheidet. Innerhalb der Fibroblasten und Makrophagen gibt es vergleichsweise wenig signifikante Unterschiede zwischen den radialen Positionen der untersuchten Chromosomenterritorien. Zelltypspezifische Verlagerungen von Chromosomenterritorien zeigten sich auch nach einem Differenzierungsschritt von ES-Zellen zu Makrophagen. Die Lage der Chromozentren ist zelltypspezifisch. Im Gegensatz zu den untersuchten Chromosomenterritorien liegen die Chromozentren in Fibroblasten und Makrophagen in relativ zentralen Positionen. In Lymphozyten sind die Chromozentren am weitesten nach außen zum Zellkernrand gelangt, gefolgt von den ES-Zellen. Die Anzahl der Chromozentren ist ebenfalls zelltypspezifisch. Ausgehend von der Chromozentrenzahl in ES Zellen nimmt die Zahl der Chromozentren in differenzierteren Zellen zu (Lymphozyten, Fibroblasten) oder bleibt gleich (Makrophagen). Aufgrund der Ergebnisse lässt sich ausschließen, dass die äußere Form des Zellkerns alleine für die beobachteten Verteilungsunterschiede verantwortlich ist. Allerdings waren die beobachteten Unterschiede kleiner als bei vergleichbaren menschlichen Zelltypen. Mit ein Grund dafür ist sicher die geringere Variabilität der Chromosomengröße und Gendichte im Genom der Maus. Zellkernvolumina lagen zwischen 470 und 650 µm3. Lymphozyten besitzen im Durchschnitt die kleinsten Kerne der zyklierenden Zelltypen, ES-Zellen die größten. Makrophagen befanden sich in der G0-Phase, ihre Zellkerne waren am kleinsten und wiesen die geringste Standardabweichung auf. Die Analyse der Winkel und Abstände innerhalb der Chromosomenterritorien zeigte eine sehr flexible Positionierung innerhalb der Grenzen radialer Ordnungsprinzipien. Diese Resultate sind unvereinbar mit einem früher vorgeschlagenen Modell der Trennung des parentalen Genoms. Es gibt keine Hinweise für eine Abweichung von einer zufälligen Verteilung, von einer Häufung nahe beieinanderliegender MMU 1 Homologen in Makrophagen abgesehen. Zur Untersuchung der Struktur von Chromosomenterritorien wurden Programme angewandt, bei denen steigende Schwellwerte zu Zerfällen von Objekten führten, die analysiert wurden. Zwei unabgängige Methoden zur Berechnung von Objektzahlen in Bildstapeln führten zu gleichen Ergebnissen. Mit dem Programm OC-2 konnten Unterschiede in der Textur von Chromosomenterritorien bei der Maus innerhalb eines Zelltyps, als auch zwischen Zelltypen festgestellt werden. Dabei wurden die individuellen Chromosomengrößen mit berücksichtigt. Es konnte kein allgemeiner Zusammenhang zwischen den durchschnittlichen maximalen Objektzahlen und dem Gengehalt der entsprechenden Chromosomen festgestellt werden, vielmehr scheint die Textur des Chromatins von noch unbekannten, zelltypspezifischen Faktoren beeinflusst zu sein. Die Analyse der Chromatinstruktur in normalen menschlichen Zelltypen und in Tumorzelllinien mit dem Objektzählprogramm OC-2 ergab allgemein erhöhte Objektzahlen in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zelltypen. Davon unabhängig waren auch immer die genreichen HSA 19 durch höhere Objektzahlen charakterisiert als die etwas größeren genarmen HSA 18 in den selben Zell-typen. Vergleiche zwischen den Objektzahlen eines Chromosoms in normalen Zelltypen und Tumorzelllinien ergaben mehr Unterschiede, als Vergleiche nur innerhalb der normalen Zelltypen. Die hier untersuchten Tumorzelllinien weisen eine objektreichere Chromatinstruktur auf, als die ihnen gegenübergestellten normalen Zelltypen.

In dieser Arbeit entwickelten und synthetisierten wir ein Tetramer des Kernsignales des großen T-Antigens des SV40 Viruses (PKKKRKV). Dadurch erhielten wir einen neuen nicht-viralen Vektor (NLSV404). Diese 4,4 kDA großen Peptide enthalten hauptsächlich die positiv geladene Aminosäure Lysin und komplexieren DNS durch elektrostatische Anziehungskräfte. Durch die Komplexierung wird die DNS vor dem Abbau durch DNasen geschützt. NLSV404 zeigt Eigenschaften eines Kerntransportsignals, welches wir durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung bestätigen konnten. Des Weiteren transfizierten Komplexe aus DNS und NLSV404 viele verschiedene Zelllinien, wie z.B. 16HBE14o-, HeLA S6 und Cos7 Zellen. Vergleiche der Transfektionseffizienz von NLSV404 Komplexen mit Komplexen, die aus der Mutante der Kernlokalisierungssequenz des T-Antigens gebildet wurden (cNLS, fungiert nicht mehr als Kernlokalisierungssignal), resultierten in einer mindestens 20-fach höheren Transfektionsrate. Hingegen waren NLSV404 Komplexe mindestens 100-mal effizienter als cNLS Komplexe, wenn man die Versuche mit Zellen durchführte, die in ihrer Zellteilung gehindert wurden. Die Inkubation von Zellen mit freiem NLSV404 vor der Transfektion der Zellen mit NLSV404 Polyplexen hatte einen dramatischen Einbruch in der Transfektionseffizienz zur Folge, welches Rückschlüsse auf einen kompetitiven Hemmungsmechanismus zulassen. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass NLSV404 ein viel versprechender nicht-viraler Genvektor ist.

Der Gehalt an bindegewebseiweißfreiem Fleischeiweiß (BEFFE) bildet für die Le-bensmittelüberwachung im Rahmen des Verbraucherschutzes nach § 15 LFGB die entscheidende Beurteilungsgrundlage für die substantielle Qualität von Fleisch und Fleischerzeugnissen. Die chemische Vollanalyse nach Vorschrift der Amtli-chen Sammlung stellt dabei die anerkannte Grundlage zur Berechnung des BEFFE- Gehaltes dar. Für die Hersteller von Fleischwaren spielt neben dem BEFFE auch der Wasser-, Fett- und Rohproteingehalt eine Rolle bei der Rezep-turberechnung und Standardisierung von Fleischprodukten. Für eine optimale Re-zeptursteuerung und Qualitätssicherung ist es notwendig, die erwünschten Para-meter bereits im Verarbeitungsfleisch erfassen zu können. Die chemische Analyse ist mit einem entsprechenden Zeitaufwand verbunden, so dass die Vollanalyse für eine synchron zu den Verarbeitungsschritten erfolgende Bestimmung der ent-scheidenden Parameter nicht geeignet ist. Ziel dieser Arbeit war, die Leistungsfähigkeit eines sich in der Entwicklung befindli-chen optischen Sensormoduls zur Detektion von Wasser, Fett, Rohprotein und Bindegewebe zu beurteilen. Das Funktionsprinzip des optischen Verfahrens ba-siert auf VIS-, NIR- sowie Fluoreszenz-spektroskopischen Messungen und soll im Durchflussverfahren die simultane in-line-Analyse von Verarbeitungsfleisch ermög-lichen. Daneben wurden Verfahren der NIR-Spektroskopie und der niedrig auflö-senden NMR-Spektroskopie in die Untersuchungen miteinbezogen, um die Mess-genauigkeit dieser Schnellmethoden in der Bestimmung von Fett und Wasser (NIR- und NMR-Spektroskopie) sowie von Rohprotein und BEFFE (NIR-Spektroskopie) zu bewerten. Aus ihrer grundsätzlichen Bewertung sollte die mög-liche Eignung der spektroskopischen Schnellverfahren zur präzisen und vertrau-enswürdigen Kalibration des neuartigen Sensormoduls abgeleitet werden. Als Re-ferenzanalytik wurde für alle Methoden die nasschemische Vollanalyse herange-zogen. Insgesamt wurden 54 Proben (Rind, Schwein, Halb/Halb) am optischen Sensor-modul vermessen. Alle Proben wurden anschließend NIR-spektroskopisch und nasschemisch analysiert. Eine Teilmenge von 30 Proben wurde zusätzlich der NMR-spektroskopischen Untersuchung zugeführt. Der Vergleich der spektralen Messgrößen des neuartigen Verfahrens mit der nasschemischen Referenzanalytik ergab für alle Probenmaterialien (Rind, Schwein, Halb/Halb) eine in Abstufungen zufriedenstellende Korrelation der Was-ser-, Asche-, Fett- und Rohproteingehalte, jedoch nur eine unzureichende Vorher-sagesicherheit für Bindegewebe. Aus dem Vergleich von NIR-Spektroskopie zur Nasschemie liessen sich hohe bis sehr hohe Korrelationen für die Parameter Wasser, Fett, Rohprotein und BEFFE ermitteln. Die durch die NMR-Spektroskopie erstellten Wasser- und Fettgehalte bewegten sich für alle 30 untersuchten Proben in sehr hoher Korrelation zu den nasschemischen Ergebnissen. Die NIR-Spektroskopie kann mit Einschränkungen als ausreichend zuverlässige Schnellmethode zur simultanen Bestimmung substantieller Fleischparameter an-gesehen werden. NMR-spektroskopische Messungen erzielen für Wasser und Fett genauere Ergebnisse als die NIR-Spektroskopie. Sofern nur die Bestimmung von Wasser und Fett benötigt wird, ist in der Routineanalytik die NMR-Spektroskopie als genauere Methode angebracht. Ist daneben auch die Bestimmung von Roh-protein und BEFFE angestrebt, muss auf die NIR-Spektroskopie zurückgegriffen werden. Besteht die Erforderlichkeit einer forensisch gesicherten Aussage, so stellt die Nasschemie nach wie vor die Methode der Wahl dar. Eine abschließende Bewertung des optischen Sensormoduls konnte im Rahmen dieses Dissertationsvorhabens nicht getroffen werden. Der Datensatz von 54 ver-arbeiteten Fällen hat sich in der statistischen Auswertung als zu gering erwiesen, um eine Kalibration des Systems für die unterschiedlichen Probenmaterialien und Aufbereitungsformen zu ermöglichen.

The aim of this in-vitro study was to investigate the extent of autofluorescence in carious human dentine in comparison to the established caries diagnostic methods of microhardness testing, microradiography and histology. For this, 21 extracted, permanent human teeth with dentine lesions were chosen and embedded in methylmethacrylate. Then they were sectioned through the centre of the lesion, and approximately 150 µm thin slices were prepared parallel to the cut surface. The microhardness was tested on the block surfaces; the slices of the teeth were used to test the other investigative techniques. The fluorescence analysis was performed at an emission of over 515 nm due to 450 nm – 490 nm excitation and an emission of over 615 nm due to 530 nm – 585 nm excitation. The fluorescence scans corresponded to the mineral loss profiles as well as to the microhardness profiles and the carious expansion seen in the histological analysis. The differences between the two tested fluorescence filter systems were very small. The correlation between lesion depth, derived from microhardness testing and microradiography, and fluorescence plots were between 0.85 and 0.90. The results for histopathology were even better. It can be concluded from these outcomes that fluorescence can be used as a marker for carious dentine.

Für die stabile, regulierte Expression eines therapeutischen Gens in Zielzellen stellen künstliche menschliche Chromosomen (HACs) derzeit das einzige Konzept dar, das hohe Sicherheit und technische Realisierbarkeit bietet. Künstliche Chromosomen (HACs) mit dem CFTR-Gen sollen sich durch den Transfer definierter HAC-Konstrukte effizient formieren, ohne dabei die Zielzellen zu stören. Im Augenblick werden künstliche Chromosomen zur Klärung vieler grundlegender Fragen auf dem Gebiet der Chromosomenstruktur und -funktion sowie der Genregulation konstruiert. In der vorliegenden Arbeit sollte die zugrundeliegende de novo HAC-Technologie der Arbeitsgruppe, die sich auf die Konstruktion und den intakten Transfer von PACs mit den funktionellen Komponenten menschlicher Chromosomen (zentromerische, telomerische und genomische Sequenzen mit oris und Gene) konzentriert, weiterentwickelt werden. Die Verwendung von PACs als Kloniervektoren erlaubt die stabile Klonierung langer, genomischer DNA, die biochemische Verknüpfung über lox/Cre vermittelte Rekombination, sowie die Darstellung grosser Mengen intakter, supercoiled PAC DNA durch Anwendung einer in der Arbeitsgruppe entwickelten Technik (Reinigung der supercoiled DNA Fraktion in Agaroseplugs von gebrochener und genickter DNA im elektrischen Feld). Eine Verbesserung der Vektoren ist nötig, da die Effizienz der HAC Formierung bisheriger Vektoren für eine klinische Anwendung nicht ausreicht. Dafür wurden zunächst Marker benötigt, die Anzeigen können wieviele Zellen mit wievielen Vektormolekülen transfiziert wurden und wieviele der physikalisch erfolgreich transfizierten Zellen stabile HACs bilden (genetische Funktion). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Expressionsmarker entwickelt, die eine Formierung stabiler HAC-Linien durch grüne Fluoreszenz anzeigen können. So wurde ein tetratelomerischer PAC-Vektor „pTT“ konstruiert, der stabil eine EGFP-Kassette exprimiert, ein funktionelles Zentromer trägt (TTE1), und für die Klonierung weiterer genomischer Komponenten eine weiss/blau selektionierbare Sal I Stelle enthält. Ausserdem wurde ein CFTR-Gen-basierender „genomischer“ Marker (159 kb) vorgestellt, der den intakten Transfer langer, genomischer DNA und die Expression vom CFTR Promoter anzeigen kann. Besonders hervorzuhebende Ergebnisse aus der Arbeit sind: 1) Kopiezahlabhängigkeit bei der transienten Expression. Einzelne Markergen-Kopien genügen nicht, um Anwesenheit der transfizierten DNA mittels transienter Expression nachzuweisen. 2) Sichtbar transient exprimierende HAC Konstrukte (große Zahl) führen nicht zu stabilen Linien, was nahelegt, dass ein „low copy“ HAC Transfer benötigt wird. Für eine Optimierung und besseres „low copy“ HAC-Monitoring wurden multimere Marker (EGFP Array) und DNA-tags (Gal4-BD, Lac-Operator) entwickelt und stehen nun für einen Einsatz bereit. 3) Für den „low copy“ Transfer wurden neben Lipofektionsassays und der Mikroinjektion insbesondere eine neue Methode, die Baktofektion, eingesetzt, bei der die DNA nicht aus Bakterien isoliert werden muss: Modifizierte Transferbakterien dringen in die Zelle ein und geben die DNA-Konstrukte nach Autolyse frei („suicidal transfer“). Dabei wurde ein funktioneller Transfer genomischer DNA nachgewiesen. Es konnte zum einen gezeigt werden, dass Zentromer tragende Konstrukte effizient de novo HACs bildeten, und zum anderen, dass das lange genomische CFTR Expressionskonstrukt CGT21 stabil vom CFTR Promoter exprimiert wird. Damit steht nun die Baktofektion als effizienteste Methode zur HAC Optimierung zur Verfügung. 4) Durch Auszählung der stabilen Klone, Isolierung von Stichproben klonaler Linien und einem HAC-Formierungsassay mittels FISH Analyse, wurden folgende grundlegende Beobachtungen gemacht: Die Rate der Formierung stabiler Klone mit HAC Konstrukten hängt nicht von a) der Zahl der im einzelnen Konstrukt vorhandenen, oder cotransfizierten Zahl der BS Marker, b) nicht von der Orientierung der alpha-sat DNA relativ zum BS-Gen oder dem entgegengesetzt gerichteten EGFP-Gen, und c) nicht absolut von der Verwendung unterschiedlicher alpha-sat Sequenzen der zwei homogenen Array Typen auf Chr.5 ab, wobei der Vektor pTT mit dem Zentromer E1 die besten Ergebnisse der HAC Bildung erzielte und die höchsten Klonzahlen in Cotransfektionen mit einem telomerisierten Genkonstrukt erhalten wurden, nicht aber in Cotransfektionen mit dem Telomervektor ohne einklonierte genomische DNA. Diese Erkenntnisse haben direkte Relevanz für die Weiterentwicklung CFTR exprimierender HAC Vektoren. Mit den Konstrukten pTTE1 und CGT21, und den zukünftig erweiterten Konstrukten mit multimeren Markern bzw. Tags und einem kompletten CFTR Gen, kann nun auch der physikalische Transfer der HAC Konstrukte in Zielzellen, sowie deren Funktion effizient untersucht werden. Damit konnten wichtige Voraussetzungen für die Weiterentwicklung einer stabilen CFTR Gentherapie geschaffen werden.

Die endoskopische Fluoreszenzdiagnostik (FD) hat sich in den letzten Jahren zu einer vielversprechenden Alternative und Ergänzung bei der Erkennung und Behandlungunterstützung neoplastischer Veränderungen entwickelt. Die derzeit auf dem Markt verfügbaren Systeme zur endoskopischen FD besitzen jedoch noch Optimierungspotentiale, welche die klinische Durchführung der Methode weiter verbessern könnten. Ausgehend von einer Fluoreszenzanregungslichtquelle für den sichtbaren Bereich (D-light-System) ist daher ein System zur Ultraviolett (UV)-Anregung konzipiert und entwickelt worden, mit dem entscheidende Verbesserungen erzielt werden konnten. Dieses inkohärente UV-Lichtsystem beinhaltet ein optimiertes Kondensorsystems, das aus einem speziellen Filtersatz sowie einer neuen leistungsstarken UV-A emittierenden Lampe besteht. Die hohe Ausgangsleistung des UV-Lichtsystems resultiert in einer effizienten Anregung des Photosensibilisa-tors (PS) und führt somit zu einer optimalen Fluoreszenzdarstellung des Tumorgewebes. Komplettiert wird das UV-Lichtsystem durch ein spezielles Endoskop mit einem UV-transmittierenden Lichtzuführungssystem. Eine Risikobetrachtung ergab, dass unter der Berücksichtigung der geltenden Grenzwerte keine schädigende Wirkung für den Patienten durch die mit dem UV-Lichtsystem erzeugte Strahlung, bei einer Systemkonfiguration mit maximaler Lichttransmission, auftritt. Die klinisch relevanten Untersuchungsergebnisse wurden an einem Gewebephantom, in vitro an Glioblastomgewebeproben und in vivo am Tier sowie in vivo in der menschlichen Mundhöhle und Harnblase erzielt. Für eine quantitative Beurteilung des UV-Lichtsystems erfolgte der Vergleich mit dem etablierten D-light-System. Das sichtbare blaue Anregungslicht des D-light-Systems induziert auf feuchten Gewebeoberflächen störende Reflexionen, die eine Beurteilung des zu betrachtenden Areals maßgeblich erschweren können. Besonders gravierend wirkt sich dieser Nachteil bei der Visualisierung von Hirntumoren wie dem Glioblastom aus. Unter Verwendung des UV-Lichtsystems konnte erstmalig die reflexfreie Darstellung der 5-Aminolävulinsäure (5-ALS)-induzierten Protoporphyrin IX (PPIX)-Fluoreszenz in Glioblastomgewebe und der Hypericin (HYP)-induzierten Fluoreszenz in der Mundhöhle erfolgen. Eine weitere Besonderheit des UV-Lichtsystems liegt in der speziellen Art der Farbkontrastbildgebung der Fluoreszenz. Das UV-Lichtsystem erzeugt die gewebeeigene Fluoreszenz (Autofluoreszenz) im blauen und grünen Wellenlängenbereich mit deutlich höherer Effizienz als das D-Light-System. Im Gegensatz zum D-light-System, das eine vom rückgestreuten blauen Anregungslicht (Remission) dominierte Darstellung aufweist, tritt bei der Anregung durch UV-Licht keine Remission im sichtbaren Bereich auf. Daher basiert die Bilddarstellung bei der UV-Anregung auf der Erzeugung der Fluoreszenz im blauen, grünen und roten Wellenlängenbereich. Somit wird durch das UV-Anregungslicht eine Gewebedarstellung erreicht, die in der Farbgebung an ein Weißlichtbild erinnert und auch eine vergleichbare strukturelle Detailinformation liefert. Beide in dieser Arbeit untersuchten PS sind durch UV-Licht anregbar und führen zu einer kontrastreichen RotfluoreszenzDarstellung von Arealen, die diese PS selektiv eingelagert haben. Erstmalig wurde durch das UV-Lichtsystem im Tierversuch die spezifische Anreicherung von HYP im Glioblastomgewebe visualisiert bzw. bildgebend nachgewiesen. Die Verwendung des neuartigen UV-Lichtsystems in der Neurochirurgie hat signifikante Verbesserungen im Vergleich zu den derzeit auf dem Markt verfügbaren Systemen aufgezeigt und lässt somit auf einen zukünftigen klinischen Einsatz erwarten. Die klinische Praxis hat gezeigt, dass eine erfolgreiche Behandlung des oberflächlichen Harnblasenkarzinoms eine integrale Therapie der gesamten Harnblasenschleimhaut erfordert. Bei Patienten, bei denen alle konventionellen Verfahren einschließlich intravesikaler Chemotherapie und Immuntherapie mittels Bacillus Calmette-Guérin versagt haben, besteht in der Regel die Indikation zur radikalen, operativen Entfernung der Harnblase. Wird jedoch dieser Eingriff vom Patienten verweigert oder kann wegen schwerer internistische Begleiterkran-kungen keine offene Operation durchgeführt werden, so bietet derzeit die integrale Photodynamische Therapie (PDT) des oberflächlichen Harnblasenkarzinoms mittels der 5-ALS eine vielversprechende Alternative. Für dieses Verfahren wurde eine inkohärente Lichtquelle (T-light) auf der Basis einer Hochleistungs-Xenon-Kurzbogenlampe entwickelt und aufgebaut. Das Licht dieser Lampe wird über einen speziellen Einkoppelmechanismus auf die Eingangsfläche eines Quarzglaslichtleiters fokussiert und durch diesen übertragen. Am distalen Ende des Lichtleiters befindet sich ein zylinderförmiger Lichtapplikator aus Silikon, der mit Streupartikeln durchsetzt ist und so eine homogene Ausleuchtung der Harnblase gewährleistet. Lichtleiter und Lichtapplikator sind integrale Bestandteile eines eigens angepassten, flexiblen PDT-Applikationskatheters. Eine Kernkomponente der Entwicklung stellt der spezielle Einkoppelmechanismus dar, der die folgenden Funktionen aufweist. Eine manuelle Justage mit einer hohen Genauigkeit (1/100 mm) in allen drei Raumachsen gewährleistet eine effiziente Einkopplung des von der Xenon-Kurzbogenlampe erzeugten Lichts in die Quarzglasfaser. Licht, welches nicht in den Lichtleiter eingekoppelt werden kann, wird über spezielle Keramikelemente absorbiert. Die Wärmeabfuhr erfolgt über ein angepasstes Kühlsystem. Der Einsatz des inkohärenten PDT-Systems ermöglicht im Gegensatz zu kohärenten Lasersystemen die gleichzeitige Anregung aller Absorptionsbanden des PS PPIX. Die breitbandige Anregung bei der 5-ALS-PDT kann außerdem zu einem verstärkten Therapieeffekt bedingt durch zusätzlich entstehende Photoprodukte führen. Einige dieser Photoprodukte stellen selbst sehr effektive PS mit unterschiedlichen Absorptionsbanden dar. Im Rahmen einer klinischen Pilotstudie mit 12 Patienten bewies das T-light-System, dokumentiert durch histomorphologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen sowie klinische Kurzzeitbeobachtungen, seine Effektivität in erster Linie bei der selektiven Zerstörung hochmaligner, flacher urothelialer Neoplasien, wie dem CIS ohne Schädigung des Normalurothels, der stromalen oder muskulären Schichten der Harnblase. Im Frühjahr 2005 soll mit dem T-light-System eine Studie starten, die in Verbindung mit der Substanz Hexvix die Sicherheit und Effektivität dieses neuen Verfahrens bei der Behandlung des oberflächlichen Harnblasenkarzinoms bestätigen soll. Nach positivem Verlauf der Studie soll das T-light-System produziert und auf breiter Basis klinisch eingesetzt werden.

Komplexchemische Umsetzungen von Übergangsmetall(I)- und (II)-Komplexen mit symmetrischen Fluoreszenz-Farbstoffen vom DPP-Typ. Darstellung eines monoalkylierten unsymmetrischen DPP-Farbstoffs und dessen komplexchemischen Umsetzungen mit Gold(I)-Verbindungen. Synthese von Perylen-Komplexen aus dem Farbstoff S13NH und Gold(I)-, Palladium(II)- und Platin(II)-Komplexen.

Thu, 17 Feb 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3460/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3460/1/Klein_Susanne.pdf Klein, Susanne

Die zeitaufgel"oste Fluoreszenzspektroskopie stellt einen Zugang zur Dynamik von Molek"ulen dar. Da schnelle molekulare Vorg"ange, wie z.B. Isomerisierungen, innerhalb weniger 100 fs oder sogar darunter ablaufen k"onnen, erfordert ihre Untersuchung Techniken, die Zeitaufl"osungen in diesem Bereich erlauben. Elektronische Me"sverfahren erreichen derartige Zeitaufl"osungen jedoch nicht. Daher wird bei zeitaufgel"osten Fluoreszenzmessungen auf optische Methoden zur"uckgegriffen. In dieser Arbeit wird der Aufbau und die Weiterentwicklung eines Me"ssystems f"ur die zeitaufgel"oste Beobachtung von Fluoreszenzspektren molekularer Proben auf der Basis des Kerr-Effekts vorgestellt. Nach Anregung der Proben mit Laserimpulsen im ultravioletten oder sichtbaren Spektralbereich kann bei einer Zeitaufl"osung von ca. 100 fs gleichzeitig eine Messung "uber einen sehr breiten Spektralbereich vom nahen Ultravioletten bis ins nahe Infrarote durchgef"uhrt werden. Auf dieser Grundlage wird die Fluoreszenz einer Reihe von Proben untersucht, die nach optischer Anregung isomerisieren. Es handelt sich hierbei um die Molek"ule 4-Nitro-4'-(Dimethylamino)-Azobenzol, Bakteriorhodopsin und Proteorhodopsin. Das Push-Pull substituierte Azobenzolderivat 4-Nitro-4'-(Dimethylamino)-Azobenzol (NA) isomerisiert nach Photoanregung ebenso wie das unsubstituierte Azobenzol. Trotz stark unterschiedlicher elektronischer Struktur offenbart sich eine erstaunliche "Ahnlichkeit in der Dynamik beider Molek"ule. Beide Systeme besitzen in der Emission ein "ahnliches biphasisches Verhalten. F"ur NA wurden Zeitkonstanten von 0.08 ps und 0.8 ps und ein verz"ogerter Anstieg der Fluoreszenz im langwelligen Teil der Spektren bestimmt. Ein Unterschied zu unsubstituiertem Azobenzol besteht in den um etwa den Faktor drei k"urzeren Zeitkonstanten von NA. Der prim"are Schritt im Photozyklus von Bakteriorhodopsin (BR) besteht in der Isomerisierung des Retinalmolek"uls, welches als Chromophor dient. W"ahrend die Zeitskalen dieser Isomerisierung aus transienten Absorptionsexperimenten bereits bekannt sind, unterliegen die damit assoziierten molekularen Prozesse weiterhin einer kontroversen Diskussion. In den hier durchgef"uhrten Emissionsmessungen wurde neben den bereits bekannten Zeitkonstanten von < 0.15 ps und 0.45 ps f"ur den Fall niedriger Anregungsdichten das erste Mal ein dynamischer Stokes-Shift auf der Zeitskala von 0.2 ps entdeckt. Im Falle hoher Anregungsdichten k"onnen die deutlichen "Anderungen der zeitaufgel"osten Spektren Mehrphotonenabsorptionen zugeordnet werden. Erst vor kurzer Zeit wurde das Proteorhodopsin (PR) als neues Mitglied der Familie der rhodopsinartigen Proteine entdeckt. Ebenso wie bei BR ist der prim"are Schritt des Photozyklus die Isomerisierung seines Retinalmolek"uls. Hier wurden zum ersten Mal zeitaufgel"oste Fluoreszenzmessungen an PR durchgef"uhrt. Es wurde, wie auch bei BR, ein dynamischer Stokes-Shift gefunden. Im Gegensatz zu BR besitzt PR in der Emission jedoch drei Zeitkonstanten von < 0.15 ps, 0.45 ps und 4 ps. Die dritte Zeitkonstante kann mit einem spektral dunklen Zwischenzustand assoziiert werden.

10-15% der de novo akuten myeloischen Leukämie (AML) zeigen einen komplex aberranten Karyotyp, der definitionsgemäß mindesten 3 numerische und/oder strukturelle Veränderungen pro Karyotyp beinhaltet. Patienten mit diesem Karyotyp weisen eine besonders ungünstige Prognose auf. Über die Pathogenese bei dieser Subgruppe ist bisher nur wenig bekannt. Ziel dieser Studie war das Aberrationsmuster bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp detaillierter zu charakterisieren. Hierzu wurden 44 AML-Patienten, die in der Routinediagnostik nach der klassischen Zytogenetik (G-Banden Analyse), der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und der 24-Farben-FISH (M-FISH) einen komplex aberranten Karyotyp zeigten, zusätzlich mit der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH) untersucht. Diese auf der in situ Hybridisierung basierende Methode ermöglicht es, einen Überblick über Verluste und Vermehrungen des genetischen Materials in einem Versuchsansatz zu erhalten und diese den einzelnen Chromosomen auf Bandenebene zu zuordnen. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten zeigen, dass bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp besonders Verluste, die durch strukturelle Aberrationen entstanden, häufiger auftreten wie Zugewinne von genetischem Material. Deletionen lagen besonders häufig in den Bereichen 5q (91%), 7q (59%) und 17p (61%), während nur 2% der Patienten keine Veränderung in mindestens einer dieser drei Regionen zeigte. Weiterhin konnten Verluste den Chromsomen 12p, 13q, 16q, 18q zugeordnet werden. Zugewinne lagen besonders in den Chromosomen 8q und 11q. Mit CGH war es zusätzlich möglich bei 6 Patienten Amplifikationen in 11q zu detektieren. Das Aberrationsmuster der AML mit komplex aberrantem Karyotyp konnte mittels CGH genauer beschrieben werden. Die erhobenen Daten lassen eine genauere Definition der AML mit komplex aberranten Karyotyp als eigene Entität sinnvoll erscheinen. Diese beinhaltet das Fehlen einer spezifischen, primär balancierte Aberration, das Vorkommen von mindesten 5 Aberrationen pro Karyotyp und das Vorhandensein einer Deletion in mindestens einer der chromosomalen Banden 5q31, 7q31 und 17p13. Insgesamt konnten Verluste 7 bestimmten Chromosomenbereichen und Zugewinne 2 bestimmten Chromosomenregionen genauer zugeordnet werden. Diese Eingrenzung der involvierten Chromosomenbereiche bei dieser AML-Subgruppe dient der Suche nach relevanten Tumorsuppressor- und Onkogenen. Als weiterer Pathomechanismus scheint der Gendosiseffekt eine besondere Rolle bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp zu spielen, da Amplifikationen nur in dieser Subgruppe nachgewiesen wurden. Insgesamt scheint besonders die Komplexität unterschiedlicher Rearrangements und weniger eine spezifische Aberration für die so ungünstige Prognose verantwortlich zu sein.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Fluoreszenz von Hybridsystemen aus Gold Nanopartikeln und Farbstoffen zeitlich und spektral aufgelöst untersucht. Neben einer ultraschnellen Fluoreszenzemission, welche direkt von den Gold Nanopartikeln stammt, wurde insbesondere die dipolinduzierte Auslöschung der Fluoreszenz von Farbstoffen, welche auf der Partikeloberfläche chemisch gebunden sind, als Funktion der Partikelgröße und des Molekülabstandes untersucht. Hierzu wurden für drei verschiedene Farbstoffe Serien von Hybridsystemen hergestellt, in denen stets nur ein Parameter, nämlich die Nanopartikelgröße oder der Abstand des Farbstoffes, systematisch über eine Größenordnung geändert wird. Die experimentell bestimmten Transienten der Hybridsysteme zeigen, dass bereits die kleinsten Nanopartikel mit einem Radius von nur 1 nm die Quanteneffizienz bei einem Farbstoffabstand von 1 nm um 99,8 % verringern können. Des Weiteren wird nachgewiesen, dass die Quanteneffizienz der Farbstoffe sogar bis zu Abständen von 16 nm noch um über 50 % gesenkt ist. Eine derart hohe Auslöschungseffizienz wird in Energie-Transfer Systemen, welche nur aus organischen Farbstoffen bestehen, nicht erreicht. Gold Nanopartikel sind damit in der Tat viel versprechende Energieakzeptoren für eine zukünftige Generation von Nanosensoren. In dieser Arbeit kann zum ersten Mal die Ursache der effizienten Fluoreszenzauslöschung durch Gold Nanopartikel anhand der experimentellen Bestimmung der strahlenden und nichtstrahlenden Zerfallskanäle des Hybridsystems nachgewiesen werden. Sie resultiert aus einem strahlungslosen Energie-Transfer zum Partikel und einer gleichzeitigen Absenkung der strahlenden Rate des Farbstoffs. Die experimentell ermittelten strahlenden und nichtstrahlenden Raten der Hybridsysteme werden mit Modellrechnungen nach Gersten und Nitzan verglichen. Es zeigt sich, dass bei konstantem Molekülabstand, aber unterschiedlichen Partikelgrößen, eine qualitative Übereinstimmung der Messergebnisse mit den Modellvorhersagen vorliegt, die absoluten Energie-Transfer Raten sich jedoch um zwei Größenordnungen unterscheiden. Die Abweichung von den experimentellen Ergebnissen wird auf das Vorhandensein nichtlokaler Effekte zurückgeführt, welche im Modell nicht berücksichtigt, aber von aufwendigeren Modellierungen vorhergesagt werden. Bereits ohne oberflächengebundene Farbstoffe zeigen die experimentellen Ergebnisse eine Photonenemission aus Gold Nanopartikeln. Die Emission ist in ihrer spektralen Form der Plasmonresonanz sehr ähnlich und weist ebenfalls eine mit zunehmender Partikelgröße charakteristische Rotverschiebung auf. Gold Nanopartikel mit Radien von 1 – 30 nm zeigen, dass die Quanteneffizienz der Emission unabhängig von der Partikelgröße ist. Die quantitative sehr gute Übereinstimmung der Messergebnisse mit Modellrechnungen nach Shabhazyan et al. erlaubt zum ersten Mal eine mikroskopische Erklärung der verantwortlichen physikalischen Prozesse für die beobachtete Fluoreszenz. Sie wird als der strahlende Zerfall eines Partikelplasmons identifiziert: In den Gold Nanopartikeln rekombinieren optisch generierte d-Bandlöcher strahlungslos mit sp-Bandelektronen und emittieren dabei ein Partikelplasmon. Die Rate der Plasmonemission sinkt mit dem Volumen des Nanopartikels. Die Wahrscheinlichkeit dieser generierten Plasmonoszillation, strahlend via Photonenemission zu zerfallen, steigt wiederum mit dem Partikelvolumen. Die Quanteneffizienz des gesamten Prozesses ist daher unabhängig von der Partikelgröße. Sie ist um vier Größenordnungen über derjenigen einer direkten Aussendung eines Photons durch Rekombination von d-Bandlöchern mit sp-Bandelektronen an Goldfilmen. Der Grund liegt in der weitaus stärkeren Polarisierbarkeit und entsprechend höheren strahlenden Rate des Partikelplasmons gegenüber einzelnen Elektron-Loch Paaren.

Die Dynamik von Makromolekülen spielt bei Transportprozessen in weicher Materie eine wichtige Rolle. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) kann die Dynamik spezifisch fluoreszenzmarkierter Moleküle in Lösung verfolgen. Das Prinzip der Methode basiert auf der Analyse von Intensitätsfluktuationen innerhalb eines Volumens in der Größenordnung eines Femtoliters (1 fl = 1 Kubikmikrometer). In dieser Arbeit wurde mit FCS die Dynamik von DNA, Aktin und Hyaluronsäure untersucht. Die Schwerpunktsdiffusion in Lösung, die intramolekulare Kettendynamik und das Verhalten von Polymerlösungen im Scherfluss wurden studiert. Die Möglichkeit für Messungen der Dynamik an Grenzflächen wurde geschaffen. Die Autokorrelation fluoreszenzmarkierter DNA in Lösung zeigt auf verschiedenen Zeitskalen charakteristische Abfälle, die ihre Ursache in unterschiedlichen dynamischen Prozessen haben. Mit den in dieser Arbeit entwickelten Modellfunktionen für die Autokorrelation lassen sich die charakteristischen Größen der verschiedenen Prozesse durch Anpassung an die experimentellen Daten gewinnen. Bei kurzen Zeiten im Mikrosekundenbereich fällt die Korrelationsfunktion auf Grund photochemischer Prozesse der Fluoreszenzfarbstoffe exponentiell ab. Im Bereich von 10-100 Mikrosekunden zeigen die Daten einen weiteren Abfall, der stark von der Anzahl der Farbstoffe auf der Polymerkette abhängt. Die On-Off-Kinetik eines Ensembles von Fluorophoren wurde in ein Modell für die Korrelationsfunktion umgesetzt. Intensitätsfluktuationen im Bereich von 1 - 100 Millisekunden stammen von der Diffusion und den internen Relaxationsmoden der Polymerketten. Ein Modell für die Korrelationsfunktion der Schwerpunktsdiffusion für Polymerketten mit kontinuierlicher Farbstoffverteilung entlang der Kontur wurde entwickelt und mit experimentellen Daten von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge (1019 bp bis 7250 bp) bestätigt. Ausgehend von den dynamischen Strukturfaktoren der Modelle von Rouse, Zimm und semiflexibler Ketten in Lösung wurden Korrelationsfunktionen für interne Relaxationen berechnet und an Messdaten mit Lambda-DNA (48502 bp) angepasst. Über den Abstand der Farbstoffe entlang der Polymerkontur werden Moden selektiert, deren Relaxationsdynamik sich in die Autokorrelationsfunktion überträgt. Bei Abständen, die viel größer als die Persistenzlänge der DNA sind, liefert das angepasste Modell die erwarteten Werte für die Zimm-Dynamik. Aktinfilamente mit Längen im Bereich von 100 Nanometern bis 50 Mikrometer wurden als Modellsysteme semiflexibler Polymere untersucht. Für Filamentlängen, die kleiner als das Beobachtungsvolumen sind, ist die Korrelationsfunktion bestimmt durch die Schwerpunktsdiffusion. Für längere Filamente dominieren die Biegemoden. Charakteristisch für diese Form der internen Relaxation ist das zeitliche Skalenverhalten mit dem Exponenten 3/4. Theoretische Korrelationsfunktionen, die in Zusammenarbeit mit Roland Winkler vom Forschungszentrum Jülich entstanden sind, zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Erstmals wurden Korrelationsfunktionen einzelner Aktinfilamente im halbverdünnten Bereich gemessen. Die charakteristische Abfallzeit der Korrelationsfunktion als Maß für die Dynamik der Biegemoden sinkt mit steigender Aktinkonzentration. Für Aktinkonzentrationen von 0,01 mg/ml bis 1 mg/ml folgt die Abfallzeit einem Skalengesetz tau ~ c^(-0,48 +- 0,03). Neben der Diffusion wurde in dieser Arbeit die Dynamik in Strömungen untersucht. Zur Verfolgung von gerichteten Transportprozessen wurden zwei Foki mit einem lateralen Abstand von 5 Mikrometern erzeugt. Durch eine Kreuzkorrelation der beiden getrennten Intensitätssignale lässt sich die Zeit bestimmen, die die Teilchen zum Durchlaufen des Abstandes der beiden Foki benötigen. Mit dieser mikroskopischen "Lichtschranke" wurden Flussgeschwindigkeiten in einem 100 Mikrometer hohen Kanal mit mikrometergenauer Ortsauflösung gemessen. Die Scherverdünnung einer Hyaluronsäurelösung konnte anhand des Geschwindigkeitsprofils nachgewiesen und eine kritische Scherrate von 285 +- 30 s^(-1) bei einer Polymerkonzentration von 2,5 mg/ml bestimmt werden.

Tue, 14 Sep 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6341/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6341/1/Fuchs_Kerstin.pdf Fuchs, Kerstin ddc:500, ddc:540, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Aufgrund fehlender Methoden wurde bis zum heutigen Zeitpunkt nur selten eine molekulargenetische Analyse von Einzelzellen durchgeführt. In vielen Bereichen aber, wie beispielsweise den Tumoren, ist sie von entscheidender Bedeutung. Das Auftreten eines genetisch heterogenen Musters in einem Tumor könnte die Suche nach krankheitsauslösenden oder -fördernden Veränderungen erschweren. Auch bei der Untersuchung von seltenen Zellen (so genannte „rare cell events“), z.B. bei einer minimalen residualen Tumorerkrankung sind geeignete Methoden zur Einzelzellanalyse notwendig, da nur wenig Material zur Verfügung steht. Ziel dieser Doktorarbeit war es, zwei molekulargenetische Analysemethoden zu etablieren, weiterzuentwickeln und in einer geeigneten Strategie bei der Untersuchung von disseminierten Tumorzellen bei fünf Mammakarzinomen einzusetzen. Im ersten Teil der Doktorarbeit erfolgte die Auswahl eines geeigneten Markierungssystems für die Identifizierung disseminierter Tumorzellen im Knochenmark. Die Benutzung des pan-Zytokeratin Antikörpers A45 B/B3 direkt konjugiert mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 oder FluorX zeigte in verschiedenen Testsystemen die besten Ergebnisse. Sowohl seine Spezifität als auch die Durchführbarkeit einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) war möglich. Anhand disseminierter Tumorzellen von Nierentumoren wurde die Möglichkeit einer Untersuchung mittels zweier Interphase FISH Ansätze überprüft. Die Hybridisierung der Zentromernahen YAC Sonden konnte auf dem Knochenmarksgewebe bei pan-Zytokeratin positiven Zellen nach Erproben mehrerer Protokolle nicht durchgeführt werden, allerdings war die Hybridisierung von Zentromersonden erfolgreich. Die Optimierung des veröffentlichten Protokolls zur Einzelzell CGH (C. Klein et al. 1999; N. Stöcklein et al.2002) war das zweite Ziel der Arbeit. Diese Optimierung war notwendig, weil sich das ursprünglich publizierte Protokoll als Artefakt anfällig herausstellte. Durch die in dieser Arbeit beschriebenen Protokollveränderungen konnte die für Einzelzell Analysen notwendige Reproduzierbarkeit erreicht werden. Als Testsystem wurde eine molekulargenetisch ausreichend charakterisierte und in ihren Veränderungen stabile Zelllinie gewählt (RCC-26). Die ersten Versuche zur Einzelzellanalyse zeigten Veränderungen in der Zelllinie, die in allen vorangegangenen Analysen mit etablierten Techniken (M-FISH und CGH) nicht gezeigt werden konnten. Eine Optimierung des Protokolls führte zu übereinstimmenden Ergebnissen von Einzelzell CGH, CGH und M-FISH. Anschließend konnte die Reproduzierbarkeit dieser Methode anhand der Zelllinie RCC-26 gezeigt werden. Die Anwendung beider Methoden zur Analyse von seltenen Zellen wurde mit der Untersuchung von fünf Mammakarzinomen dargelegt. Der Vergleich von Primärtumor und kultivierten disseminierten Tumorzellen ins Knochenmark zeigte im Rahmen der untersuchten Fälle gemeinsame molekulargenetische Veränderungen beider Tumorentitäten. Mit der Anwendung dieser neuen Methoden ist es möglich detaillierte Informationen über seltene Zellen zu erhalten und diese in den biologischen Kontext einzuordnen.