Podcasts about f aktin

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.

Zielsetzung und Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) exprimieren eine Vielzahl verschiede-ner Antigene. Dennoch ist es nicht möglich eine eindeutige Phänotypisierung dieses Zelltyps vorzunehmen, da keiner der bekannten Zellmarker spezifisch ist. Daher war es Ziel dieser Studie, durch die Etablierung einer 7-Farben Fluoreszenz hMSC auf Einzelzellebene durch ein geeignetes Markerprofil zu charakterisieren und sie ge-genüber Osteoblasten und Fibroblasten abgrenzen zu können. Material und Methoden: Kommerziell erhältliche HMSC, humane Osteoblasten und Fibroblasten wurden als adhärente Zellen auf Einzelzellniveau einer simultanen Mehrfach-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Antigene CD105, CD106, CD44, Kollagen IV, Fibronektin und F-Aktin unterzogen. Anschließend wurde mittels eines Sagnac Inter-ferometers eine spectrale Bildanalyse mit Dekomposition der einzelnen Farbstoffe durchgeführt. Ergebnisse: Hinsichtlich aller untersuchten Zellmarker zeigten hMSC ein positives Färbeergebnis, während in humanen Osteoblasten und Fibroblasten CD105 und CD106 nicht nach-gewiesen werden konnte. Eine Unterscheidung zwischen letzteren Zelltypen konnte durch CD44 gewährleistet werden, welches nur in Osteoblasten ein positives Ergeb-nis zeigte. Alle verwendeten Farbstoffe konnten eindeutig in der Spectralanalyse bis zu einem Wellenlängenabstand von 10nm voneinander getrennt werden. Schlussfolgerungen: Es ist in dieser Studie gelungen, ein geeignetes Markerprofil zu definieren, um hMSC von anderen Zellen des Binde- und Stützgewebes abzugrenzen. Besonders die Spectralanalyse eines simultan angewandten Phänotypisierungsprofils auf Einzel-zellniveau erscheint bei der großen Heterogenität dieser Stammzellen als potentes Werkzeug zur Untersuchung gegenüber anderen Zelllinien. Besonders die Oberflä-chenproteine CD105, CD106 und CD44 erscheinen als äußerst geeignete Kandida-ten zur Charakterisierung von hMSC.

Der Hauptregulator der vaskulären Homöostase ist das Endothel, welches eine Vielzahl an vasoprotektiven Effekten ausübt. Die Integrität und Regulation des endothelialen Zellayers der Blutgefäße ist von großer Bedeutung bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die Basis dieser Phänomene ist in der dynamischen und exakt kontrollierten Regulation des Zytoskeletts begründet. Die wichtigsten Regulatoren des Zytoskeletts stellen die GTPasen der Rho-Familie und deren Effektoren dar. Im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten wir in primären humanen Nabelschnurendothelzellen, eine neu in Erscheinung tretende Zytoskelettstruktur, der wir in Anlehnung an ähnliche Proteingruppierungen in monozytären Zellen den Namen HUVEC-Podosomen gaben. HUVEC-Podosomen sind aufgrund ihrer Komponenten mit klassischen Podosomen vergleichbar. Allerdings gibt es zwischen beiden Strukturen auch Unterschiede, denn während klassische Podosomen aus Ring und Kern bestehen, zeigen HUVEC-Podosomen eine zweischichtige Architektur. Wie wir weiterhin nachweisen konnten liegen Podosomen der Endothelzellen an der ventralen Plasmamembran und haben engen Kontakt mit der extrazellulären Matrix.. Somit fungieren sie, wie auch die klassischen Podosomen, als Adhäsionsstrukturen. Sie dienen aber nicht nur der Adhäsion, denn wie bei FITC-markierten Monolayer-Versuchen gezeigt werden konnte, haben sie auch eine proteolytische Aktivität, die insbesondere beim Matrixverdau und der daran anschließenden Migration von Bedeutung ist. Ferner können wir zeigen, daß HUVEC-Podosomen in ruhenden, konfluenten Zellayern nicht beobachtet werden können. Sie lassen sich aber in migratorischen (subkonfluent oder nach Verwundung) HUVEC, in hoher Anzahl und diversen ringförmigen Formationen, vorwiegend in Bereichen nahe dem Leitsaum nachweisen. Wie wir mit Hilfe von live cell imaging-Experimenten zeigen konnten, sind diese Strukturen hochdynamisch und breiten sich wellenartig mit einem weiten Radius innerhalb einer Zelle aus. Scheinbar dispergieren diese Formationen oder fusionieren mit der Zellplasma, wodurch sie die enthaltenen Proteine für viele andere zytoplasmatische oder membranöse Prozesse freigeben könnten. Durch Experimente, in denen Zytokine wie VEGF, bzw. Zytokin-produzierende Zellen wie Monozyten den HUVEC-Kulturen zugegeben wurden, konnten wir zeigen, daß diese die Bildung von Podosomen induzieren und sogar erheblich steigern. Unsere Arbeiten mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GTPase-Mutanten zeigten weiterhin, daß diese bei der Organisation und Entstehung der HUVEC-Podosomen von entscheidender Bedeutung sind. Ferner konnte mit Hilfe von Mikroinjektionsversuchen von einer Teildomäne (A) des N-WASP-Proteins verifiziert werden, daß der Mechanismus zur Bildung der HUVEC-Podosomen eine Arp2/3-abhängige Aktinnukleation beinhaltet. Weiterhin ist die Bildung dieser Adhäsionsstrukturen auch von Src Tyrosinkinasen und PI3-Kinase abhängig. Eine der Komponenten von HUVEC-Podosomen ist das Markerprotein Drebrin. Drebrin kann nur in diesen Strukturen und an Zell-Zell-Kontakten in HUVEC detektiert werden. Mikroinjektionsversuche von diversen Konstrukten der unterschiedlichen Regionen von Drebrin zeigen, daß dieses Protein von großer Bedeutung für die Bildung und Struktur der HUVEC-Podosomen ist. Die einzelnen Protein-Protein-Interaktionen von podosomalen Komponenten untereinander und mit Drebrin wurden mit Hilfe von Immunpräzipitation getestet. Es ist uns jedoch nicht gelungen einen Drebrin-Interaktionspartner zu finden. Eine Interaktion von Drebrin konnten wir nur mit Drebrin selbst in Form einer Dimerisierung bzw. mit F-Aktin nachgeweisen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß es sich bei HUVEC-Podosomen um ein multifunktionelles Organell handelt. Wie wir in dieser Arbeit darstellen, sind HUVEC-Podosomen Adhäsionsstrukturen. Sie können am häufigsten am Leitsaum detektiert werden, wobei ihre Generierung nur in Zellen mit migratorischen Phänotyp (in Zellen am Wundrand oder in subkonfluenten layern) detektiert werden kann. Beide Tatsachen sprechen dafür, daß HUVEC-Podosomen den Prozeß der Migration unterstützen. Zudem können diese Adhäsionsstrukturen die Matrix degradieren, wodurch sie so wiederum zur Migration aber auch invasiven Prozessen beitragen könnten. HUVEC-Podosomen könnten auch eine Funktion als Speicherform ihrer Komponenten ausüben. Sie fusionieren mit der Zellmembran und liefern so möglicherweise notwendige Proteine und Signale, die die Induktion von Protrusionen ermöglichen und so migratorische Prozesse unterstützen könnten. Durch die Involvierung u. a. von Drebrin, das an Zell-Grenzen detektiert werden kann, können HUVEC-Podosomen möglicherweise einen Einfluß auf Zell-Zell-Kontakte und Vorgänge wie Angiogenese ausüben. Dies bestätigt auch die Tatsache, daß Zytokine die Anzahl an Zellen erhöhen, die HUVEC-Podosomen generieren können und Vorgänge wie Wundheilung beschleunigt ablaufen lassen und so u. U. eine klinische Relevanz haben könnten.

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion, Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden, sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B. focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw. induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig. Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids, welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42 können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1- und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen. Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw. einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1 im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade. Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2, ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.

Die Organisation und Dynamik des Mikrotubuli-Cytoskeletts wird von großen Proteinkomplexen an den plus- und minus-Enden der Mikrotubuli reguliert. Am minus-Ende befindet sich das Centrosom, das als Mikrotubuli-organisierendes Zentrum dient. Am plus-Ende der Mikrotubuli findet sich ein Komplex von Proteinen, der die Dynamik der Mikrotubuli reguliert sowie ihre Verankerung am Zellcortex vermittelt. DdCP224 ist ein centrosomales und Mikrotubuli-assoziiertes Protein bei Dictyostelium discoideum, das zur ubiquitären XMAP215-Familie gehört und eine wichtige Rolle bei der Dynamik des Centrosoms und des Mikrotubuli-Cytoskeletts spielt. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung zuvor unbekannter Dictyostelium-Proteine, die mit DdCP224 bei diesen dynamischen Vorgängen zusammenwirken. Mit DdEB1, DdMoe1 und DdLIS1 konnten drei neue Mikrotubuli-assoziierte Proteine bei Dictyostelium identifiziert und charakterisiert werden. Alle drei Proteine konnten gleichzeitig auch als echte centrosomale Bestandteile nachgewiesen werden, da ihre Lokalisation am Centrosom unabhängig von Mikrotubuli ist. DdEB1 ist aufgrund seines Molekulargewichts, das größte Mitglied der ubiquitären EB1-Proteinfamilie. DdEB1 zeigte eine cytosolische Interaktion mit DdCP224 und Dynein. Am Beispiel von DdEB1 und DdCP224 konnte in dieser Arbeit nicht nur erstmals die Interaktion von Proteinen aus der EB1- und XMAP215-Familie, sondern auch ihre lange vermutete Colokalisation an Mikrotubuli-plus-Enden nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Expression von GFP-DdEB1-Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, dass die DdEB1 Bindung an Mikrotubuli von einer Homo-Oligomerisierung des Proteins abhängt, die durch eine „coiled-coil“-Domäne vermittelt wird. DdEB1-Nullmutanten zeigen in erster Linie mitotische Defekte, d.h. Störungen der Centrosomenduplikation, Spindelbildung und Chromosomensegregation. Die mikroskopische Analyse lebender Zellen ergab, dass DdEB1 für die Spindelbildung, nicht aber für die Spindelelongation oder die Mikrotubuli/Zellcortex-Interaktion benötigt wird. Bei der Suche nach möglichen DdEB1-Interaktoren wurde mit DdMoe1 das Dictyostelium-Homologe von Schizosaccharomyces pombe Moe1 isoliert, das dort ein Interaktionspartner des entsprechenden EB1-Proteins ist. Eine solche Interaktion ist den durchgeführten Untersuchungen zufolge bei Dictyostelium jedoch unwahrscheinlich. Dafür konnte hier zum ersten mal ein Moe1-homologes Protein als echte Centrosomenkomponente identifiziert werden und die Mikrotubuli-Bindung eines solche Proteins in vivo nachgewiesen werden. Wie EB1 ist auch das humane LIS1-Protein ein Mikrotubuli-plus-End und Dynein-assoziiertes Protein. Mutationen in diesem Gen führen zu einer schweren Entwicklungsstörung des Gehirns (Lissenzephalie), aufgrund eines neuronalen Migrationsdefekts. Dictyostelium LIS1 (DdLIS1) bindet nicht nur an Dynein, sondern auch an DdCP224, womit auch erstmals die Interaktion mit einem Protein der XMAP215-Familie nachgewiesen werden konnte. DdLIS1 spielt gemeinsam mit Dynein eine Rolle bei der Mikrotubuli/Zellcortex Verankerung, was in DdLIS1-Überexpressionsmutanten deutlich wurde. Die Überexpression von DdLIS1 führte außerdem zur Centrosomenamplifikation, Defekten bei der Organisation der Mitosespindel, schweren Cytokinesedefekten und einer drastisch eingeschränkten Zellmotilität. Letztere steht im Einklang mit dramatischen Veränderungen der Aktindynamik, bei der charakteristische wandernde Aktin-Polymerisationswellen am Zellcortex auftreten. Da derselbe Aktin-Phänotyp auch durch Behandlung von Kontrollzellen mit der F-Aktin depolymerisierenden Droge Latrunculin A simuliert werden konnte wurde angenommen, dass die DdLIS1-Überexpression den Aktin-Gehalt beeinflusst. Tatsächlich konnte in mikroskopischen und biochemischen Nachweisen bestätigt werden, dass die Überexpression von DdLIS1 den F-Aktin Gehalt der Zellen vermindert. Das Mikrotubuli-assoziierte Protein DdLIS1 ist also ein mögliches Bindeglied zwischen dem Mikrotubuli- und Aktin-Cytoskelettsystem.

Die Polymerisation von monomerem G-Aktin zu filamentösem F-Aktin, die Organisation von Aktin-Filamenten zu spezifischen Zytoskelettstrukturen, sowie die F-Aktin Depolymerisation stellen in ihrem dynamischen Zusammenspiel die Triebkraft vieler zellulärer Bewegungsvorgänge dar. Dies sind u.a. Zell-Polarisation, Zell-Migration, Zell-Teilung, Zell-Zell-Interaktionen, Phagozytose und intrazellulärer Vesikeltransport. Das Verständnis der molekularen Grundlagen der Aktin Organisation hat 1999 einen entscheidenden Fortschritt gemacht: damals wurde entdeckt, dass der sieben Untereinheiten umfassende Arp2/3 Komplex nach Aktivierung durch Proteine der Wiskott-Aldrich Syndrom Protein- (WASp-) Familie Aktin-Filamente de novo polymerisieren kann. Die Experimente für diese Dissertationsarbeit hatten zum Ziel, den Mechanismus der WASp-abhängigen Aktin Nukleation in vitro und in humanen Makrophagen genauer zu untersuchen. Einerseits sollten die Regionen von WASp genauer charakterisiert werden, die für die Aktivierung des Arp2/3 Komplexes verantwortlich sind. Andererseits sollte die Bedeutung von WASp und Arp2/3 Komplex bei der Aktin Nukleation in spezialisierten Adhäsionsstrukturen von Makrophagen, sogenannten Podosomen, geklärt werden. Podosomen sind essentiell für Adhäsion, Migration und vermutlich auch Gewebeinvasion von Makrophagen und ihnen verwandten Zellarten, aber sie finden sich auch in einer Vielzahl weiterer Zelltypen einschließlich metastasierender Tumorzellen. Die Bedeutung von Podosomen wird dadurch verdeutlicht, dass ihr Fehlen bei unter Wiskott-Aldrich Syndrom leidenden Patienten mit klinisch relevanten Immundefekten assoziiert ist. Zur Identifizierung der für die Aktin Nukleation minimal notwendigen WASp Regionen wurden verschiedene GST-Fusionskonstrukte der konstitutiv aktiven VCA (“Verprolin-like“, “Central“, “Acidic“) Domäne hergestellt. Durch Anisotropie Messungen und in GST-“Pulldown“ Versuchen wurde die Bindung von Arp2/3 Komplex und G-Aktin an die verschiedenen Konstrukte in vitro bestimmt. In einem zweiten Schritt wurde getestet, welche Regionen für die Arp2/3 Komplex Aktivierung notwendig sind. Dabei wurde GST-VC als die minimal notwendige Region für die Aktivierung der Aktin Nukleation identifiziert. Durch mikroskopische Analyse von in vitro nukleierten Aktin-Filamenten stellten wir fest, dass der durch GST-VC aktivierte Arp2/3 Komplex auch zur Ausbildung von Aktin-Filament Verzweigungen fähig ist. Die zellulären Effekte der VCA Konstrukte wurden mittels Mikroinjektion in primäre humane Makrophagen untersucht. Aktive Konstrukte führten zum Auftreten von prominenten Aktin-Aggregaten im Zytoplasma und zur Zerstörung von Podosomen. Auch hierbei war GST-VC das kürzeste Konstrukt, das vermutlich durch Aktivierung von zellulärem Arp2/3 Komplex, zur Zunahme des Gehaltes an intrazellulärem polymerisiertem Aktin führte. Obwohl die WASp-A Region als hochaffine Arp2/3 Komplex Bindungsstelle beschrieben worden war (Machesky und Insall, 1998), ist sie für die Arp2/3 Komplex Aktivierung nicht essentiell. Durch Koinjektion von WASp-A oder N-WASP-A mit aktiven GTPasen konnte ein erster experimenteller Hinweise für eine “Priming“- (Sensibilisierungs-) Funktion der A Region am Arp2/3 Komplex gefunden werden. Bei der Untersuchung der Aktin Nukleation und Organisation in Podosomen zeigte sich ein enger funktioneller Zusammenhang zwischen Aktin- und Tubulin-Zytoskelett. So konnte durch Depolymerisierung der Mikrotubuli in adhärierenden Monozyten die Ausbildung von Podosomen verhindert werden. Da bekannt war, dass WASp über seine Polyprolin Domäne an CIP4 (“CDC42 Interacting Protein“) bindet und dieses wiederum mit Mikrotubuli assoziiert, wurde der Einfluss der isolierten WASp-Polyprolin Domäne, aber auch von CIP4 Deletions-Konstrukten, denen entweder die Mikrotubuli oder WASp Bindungsstelle fehlten, auf die Podosomen-Ausbildung untersucht. Einem auf den so erhaltenen Ergebnissen basierendem Modell zufolge könnte WASp durch CIP4 an Mikrotubuli rekrutiert und anschließend via Mikrotubuli an Orte der Podosomen-Bildung transportiert werden. Dort könnte WASp dann zur Aktivierung von Arp2/3 Komplex und zur Nukleation von neuen Aktin-Filamenten führen.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, (i) die regulatorische Funktion bestimmter integraler Membranproteine im Dictyostelium Zytoskelett und (ii) die biochemische Interaktion einer Kinase eines infektiösen Bakteriums mit Aktin aus der Wirtszelle genauer zu analysieren. (i) Die ubiquitären Mitglieder der CD36/LIMPII-Familie sind integrale Membranproteine, die als Lipidrezeptoren und Zelladhäsionsproteine in der Plasmamembran oder - mit bisher unbekannter Funktion - in Membranen endosomaler Vesikel vorkommen. In Dictyostelium discoideum führte die Inaktivierung eines lysosomalen Membranproteins aus dieser Gruppe zur Suppression des Phänotyps einer Profilin-minus Mutante. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des D. discoideum-Genoms konnte festgestellt werden, daß es neben diesem DdLmpA noch die beiden weiteren homologen Proteine DdLmpB und DdLmpC gibt. Da der Mechanismus der Suppression des Profilin-minus Phänotyps ungeklärt ist, wurden die beiden Isoformen im Rahmen der vorliegenden Arbeit genauer charakterisiert. Sowohl für DdLmpB wie auch für DdLmpC konnte die familientypische Membran-Topologie einer Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Dabei weist die zentrale, lumenale Domäne beider Proteine zahlreiche Glykosylierungen auf. Durch Immunofluoreszenz und Saccharosegradienten wurde die Lokalisation der drei Isoformen an endolysosomalen Vesikeln nachgewiesen. Es stellte sich dabei heraus, daß die drei DdLmp-Proteine in unterschiedlichen Vesikelpopulationen auftraten. Auch “pulse-chase“-Experimente mit TRITC-Dextran und nachfolgender Markierung der Vesikel mit DdLmp-spezifischen Antikörpern ergaben unterscheidbare Zeitmuster für die Rekrutierung der Membranproteine in Vesikeln. Die für DdLmpA oft beobachtete Kolokalisation mit Makropinosomen konnte z.B. für DdLmpB und DdLmpC nur selten festgestellt werden. Nach zahlreichen Versuchen und der Konstruktion von verschiedenen Vektoren konnte am Ende der praktischen Arbeiten eine DdLmpB-minus Mutante im Wildtyp-Hintergrund isoliert werden. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Aktin und der Kinase YopO, die durch Yersinia enterocolitica als Effektorprotein in die Wirtszelle transloziert wird, biochemisch genauer untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß G-Aktin und nicht F-Aktin für die Aktiverung der YopO-Kinase verantwortlich ist. Dabei tritt Nichtmuskel-Aktin im Vergleich zum Muskel-Aktin als ein deutlich besserer Aktivator von YopO auf. Obwohl die aktivierte Kinase in vivo das Aktin-Zytoskelett beeinflußt, ist Aktin offensichtlich kein Substrat von YopO. Mittels Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß sowohl die native Kinase YopO als auch das durch Punktmutation inaktivierte YopO K269A die Polymerisierungskinetik von Aktin behindern. Für eine mutmaßliche Aktin-Binderegion von 20 Aminosäuren aus dem C-terminalen Ende konnte hingegen kein Effekt beobachtet werden. Der Einfluß von aktinbindenden Proteinen, aktinmodifizierenden Substanzen und YopO-bindenden GTPasen auf die Aktivierung der Kinase durch Aktin deutet darauf hin, dass die Aktivität der Kinase in der Wirtszelle nicht nur durch Aktin alleine, sondern auch durch weitere Zytoskelett-Komponenten reguliert wird.