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Auf der Grundlage von elektrophysiologischen Messungen und konfokalen Schichtbildern einer neocorticalen Pyramidenzelle der Ratte wurde ein Computermodell dieser Zelle erstellt, das es erlaubt, elektrophysiologische Eigenschaften des Neurons zu simulieren. Mithilfe der Patch Clamp-Technik in der Ganzzell-Konfiguration wurden die intrinsischen elektrophysiologischen Eigenschaften des Neurons in vitro bestimmt. Hierzu gehörten: Membranpotential, Eingangswiderstand, somatische Membran¬zeitkonstante und das Strom-Spannungs-Verhalten. Während der Messung wurde in das Neuron der Marker Biocytin injiziert und danach zur mikroskopischen Darstellung mit einem fluoreszierenden Antikörper sichtbar gemacht. Die Schichtbilder der Zelle wurden mit einem konfokalen Lasermikroskop aufgenommen. Das Hintergrundrauschen der Aufnahmen wurde mit einer im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Software reduziert und so das Signal-Rausch-Verhältnis um den Faktor 20 verbessert. Aus den Bildern wurde im Computer mithilfe der Software NeuronStudio (Wearne et al. 2005) ein morphometrisches 3 D-Modell erstellt. Das 3 D-Modell wurde als Kompartimentmodell nach Rall (1977) in die Simulationssoftware NEURON (Hines und Carnevale 1997) übernommen, wo die Patch Clamp-Versuche in einer Computersimulation nachgestellt wurden. Durch Einfügen von geeigneten Ionenleitfähigkeiten in unterschiedliche Kompartimente des Modellneurons konn-ten mit diesem Programm die elektrophysiologischen Eigenschaften der Pyramidenzelle vor allem im unterschwelligen Bereich gut simuliert werden. Das Modell ermöglicht somit überprüfbare Aussagen über die Eigenschaften der Ionenleitfähigkeiten, die zum unterschwelligen elektrophysiologischen Verhalten der Zelle beitragen. Zudem können Hypothesen zum Einfluss verschiedener Ionenleitfähigkeiten auf das Gesamtzellverhalten erstellt und durch Experimente verifiziert oder falsifiziert werden.

Durch Einführung moderner therapeutischer Standards konnte die Überlebenszeit und Lebensqualität von Patienten mit Akromegalie bedeutend verbessert werden. Einer der zentralen Punkte dieser Vorgehensweise ist die Behandlung mit Somatostatinanaloga, für deren Wirksamkeit in der Literatur eine überwältigende Evidenz festzustellen ist. In der vorliegenden Arbeit wird die Wirksamkeit und Sicherheit einer neuen galenischen Zubereitung des Somatostatinanalogons Lanreotid (Lanreotid Autogel®) in der Behandlung von Patienten mit Akromegalie untersucht. Vorteile des Lanreotid Autogel gegenüber anderen retardierten Somatostatinanaloga sind die durch die Fertigspritze eliminierten Fehlermöglichkeiten bei der Zubereitung, die tief subkutane Injektion sowie günstigere pharmakokinetische Eigenschaften mit einer gleichmäßigeren Wirkstofffreisetzung. Die Untersuchung erfolgte an 8 Patienten, die im Rahmen einer multizentrischen Phase-II-Studie an der Medizinischen Klinik Innenstadt der Ludwig-Maximilians-Universität München behandelt wurden. 14 Patienten wurden gescreent, 8 konnten in die Untersuchung aufgenommen werden. Es wurde im Rahmen eines doppelblinden Studiendesigns die Wirksamkeit und Verträglichkeit einer tiefsubkutanen Gabe von Lanreotid Autogel® (60, 90 oder 120 mg) versus Plazebo bei Patienten mit Akromegalie untersucht, gefolgt von einem einfachblinden Abschnitt mit konstanter Dosierung, um Pharmakokinetik, Pharmakodynamik, Wirksamkeit und Sicherheit von wiederholten tiefsubkutanen Gaben von Lanreotid Autogel (60, 90 und 120 mg) zu ermitteln, sowie einem abschließenden, offenen Dosisanpassungs-Abschnitt. In der vorliegenden Studie wurden nach einer Dosisanpassungsphase 5 Pati-enten Einzeldosen von 120 mg/Monat und 3 Patienten 60 mg/Monat verabreicht. Insgesamt konnte ein Rückgang der klinischen Symptomatik der Akromegalie bei allen Patienten festgestellt werden. Statistisch signifikant nach-weisbar war ein Rückgang der Gelenkschmerzen, der Weichteilschwellungen im Bereich der Extremitäten, der Kopfschmerzen, der Müdigkeit und der Leistungsminderung, nicht jedoch des Nachtschweißes. Die Pulsfrequenz war bei Abschluss der Studie statistisch signifikant niedriger, Blutdruck und Gewicht blieben unverändert. Die Tumorgröße war bei Abschluss der Studie nach einem Jahr Medikation mit Lanreotid Autogel bei 3 der 8 Patienten (37,5%) rückläufig. Bei den übrigen 5 Patienten (62,5%) blieb der Tumor in der Größe unverändert. Der Spiegel des zirkulierenden GH sank signifikant ab, der Median reduzierte sich von 7,9 auf 3,3 ng/ml. Es gelang allerdings nur bei 2 Patienten, das GH auf unter 1 ng/ml zu reduzieren; 4 weitere Patienten lagen nach Dosisanpas-sung zwischen 1 und 3 ng/ml, und lediglich 2 Patienten wiesen anhaltend höhere GH-Werte auf (5,8 bzw. 10,8 ng/ml bei der letzten Untersuchung). 75% der Patienten erfüllten am Ende der Beobachtungsperiode das Erfolgskriterium „GH

Um die Therapiemöglichkeiten bei depressiven Störungen zu verbessern, ist die Kenntnis der molekularen Grundlagen dieser Erkrankungen notwendig. Die erhöhten basalen Cortisolwerte im Serum von depressiven Patienten und die gestörte negative Rückkopplung der HPA-Achse sind Hinweise darauf, daß die Funktionsweise der Rezeptoren für Corticoide wie Cortisol eingeschränkt ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Cochaperonen für die Corticoid-Signaltransduktion, insbesondere den Immunophiline FKBP51 und FKBP52, sowie p23. Für die Immunophiline wurde entdeckt, daß für ihren Beitrag zu einer effizienten Aktivierung Corticoid-abhängiger Promotoren drei Eigenschaften von Bedeutung sind: 1. Interaktion mit Hsp90, um überhaupt den Zugang zum Heterokomplex zu erhalten, 2. Wechselwirkung mit Dynein, um den nukleären Transport der Rezeptoren zu begünstigen und 3. die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität. Diese Postulate gründen sich auf die folgenden experimentellen Befunde: Das Immunophilin FKBP51 reduziert als Bestandteil des Heterokomplexes mit Hsp90 und den Corticoidrezeptoren sowohl die Bindungsaffinität (Denny et al., 2000) als auch die nukleäre Translokation des Glucocorticoidrezeptors (GRs) und des Mineralocorticoidrezeptors (MRs). Im Gegensatz zu seinem Homologen FKBP52 zeigt FKBP51 nur eine geringe Interaktion mit dem Motorprotein Dynein, welches für den retrograden Transport verantwortlich ist. Durch Einführung einer Punktmutation, die die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität inaktiviert, konnte gezeigt werden, daß FKBP51 diese Aktivität nicht für seine inhibierende Wirkung benötigt. Im Gegensatz dazu liefert die PPIase-Aktivität von FKBP52 einen aktiven Beitrag für die Funktionalität der Corticoidrezeptoren, weil die analoge Mutation in FKBP52 zur einer Hemmung der Transaktivierung und nukleären Translokation des GRs und des MRs führt. Da diese Mutante immer noch mit Dynein interagiert, ist allein die Wechselwirkung mit diesem Motorprotein offensichtlich nicht ausreichend für die volle GR-Aktivität. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß Polymorphismen im FKBP51-Gen nicht nur mit dem Erfolg einer Antidepressivabehandlung korrelieren, sondern auch mit den Proteinmengen von FKPB51 in Lymphozyten. Schließlich wurde die Bedeutung von p23 analysiert, einem kleinen Cochaperon von Hsp90, dem aber auch eigene Chaperonaktivität zugeschrieben wurde. Durch gezielte Mutationen im p23-Protein war es möglich, seine Chaperonaktivität getrennt von seiner Cochaperon-Funktion zu untersuchen. Dabei stellte sich heraus, daß p23 für die Hemmung der GR-abhängigen Transkription nur als Hsp90-Cochaperon fungiert, weil zwar seine Interaktion mit Hsp90 für diesen Effekt notwendig war, nicht aber seine Chaperonaktivität. Um die beschriebene nukleäre Rolle von p23, die zum Zerfall von GR-Transkriptionskomplexen führt, zu untersuchen, wurde ein konstitutiv nukleärer GR verwendet. Auch hier benötigt p23 für die Hemmung des Rezeptors seine Hsp90-Interaktion, nicht aber seine Chaperonaktivität. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Chaperonen in der Steroid-Signaltransduktion. Darüber hinaus wurden starke Hinweise für eine mögliche Rolle von FKBP51 bei der Depression entdeckt.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion ausgesuchter Aminosäuren in der archaealen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) bei der Entstehung der zweidimensional kristallinen Purpurmembran (PM) in Halobacterium salinarum untersucht. Mittels gerichteter Mutagenese wurden aromatische Gruppen (W12, Y64, W80) gegen andere Reste ausgetauscht und die mutierten Gene homolog exprimiert. Die Tryptophanmutationen hatten dabei eine drastische Störung der PM-Bildung zur Folge, was auf wichtige Wechselwirkungen mit Lipidmolekülen schließen ließ. Insbesondere der Tryptophanrest W80, der mit dem Phythanylrest eines Glykolipids im Zentrum des Trimers wechselwirkt, zeigte seine essentielle Bedeutung für die PM-Bildung. Eine Abhängigkeit der PM-Bildung von der vorhandenen BR-Menge und Wachstumsphase konnte beim Wildtyp (WT) ausgeschlossen werden. Gefrierbruchelektronenmikroskopische Aufnahmen von ganzen Zellen zeigten bei der Mutante BR-W12I zahlreiche kleinere kristalline Bereiche auf der Oberfläche, während die Zellen mit BR-W80I nahezu keine geordneten Flächen aufwiesen. Mit Hilfe von Rotationsdiffusionsmessungen in Vesikeln und Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie von spinmarkierten Cysteinmutanten wurde eine Zunahme der Mobilität der markierten Seitenketten und des mittleren Abstands der BR-Moleküle nachgewiesen. Lichtinduzierte Proteinvernetzung zeigte eine deutliche Auflockerung der kristallinen Struktur der mutierten BR-Moleküle in der Zellmembran, vor allem bei BR-W80I. Die Funktion von BR als Protonenpumpe wurde durch die Mutationen nicht beeinträchtigt, ebenso wurde keine durch die PM bewirkte höhere Photophosphorylierungsrate in den Zellen nachgewiesen, weshalb eine Begünstigung dieser Prozesse als Erklärung für die in vivo- Kristallisation ausgeschlossen wurde. Der Einfluß der Mutationen auf die spektroskopischen Eigenschaften war vergleichsweise gering. Jedoch bot die Abnahme der Lichtadaptationsfähigkeit und Zunahme des Anteils an inaktiven 9- und 11-cis-Retinalisomeren in lichtadaptierten Proben eine plausible Erklärung für die Bildung der kristallinen PM. Die Bildung des 9-cis-Isomeren führt zur Spaltung der Bindung zwischen Retinal und dem Protein. Dies wurde durch Belichtung von Zellen mit BR-W80I nachgewiesen, die innerhalb weniger Stunden ihren aktiven Chromophor in BR verloren. Demnach wird durch die kristalline Anordnung von BR die thermoreversible Isomerisierung von all-trans- zu 13-cis-Retinal so stark bevorzugt, dass die funktionelle Stabilität des Proteins gewährleistet ist. Dies erklärt den evolutionären Vorteil des kristallinen Form des BR als Purpurmembran. Das Vorkommen von zweidimensionalen Kristallen von Halorhodopsin (HR) mit hexagonaler Ordnung im Überexpressionsstamm D2 wurde mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Anordnung wurde in 3D-Kristallen gefunden, die im Rahmen dieser Arbeit durch Aufreinigung des Proteins und Kristallisation in kubischen Lipidphasen erhalten wurden (Kolbe et al., 2000). Damit wurde gezeigt, dass in den 3D-Kristallen von HR die gleiche Anordnung wie in der Zellmembran auftreten kann. Dies ließ auch auf eine physiologische Relevanz des Palmitatmoleküls schließen, das im Innern des HR-Trimers in der Kristallstruktur gefunden wurde. Die Affinität dieser Fettsäure zu HR wurde durch Markierung der Zellen mit 3H-Palmitat untersucht. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass die Affinität der Palmitinsäure zu HR im Vergleich zu BR nicht höher ist. Eine BR-Mutante, die in einer nichtkristallinen Anordnung vorlag, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Klonierung und homologe Expression von Genen für lösliche Proteine als Fusionsprotein am C-terminus von BR ermöglicht. Dies wurde mit dem Gen für das Ferredoxin von H. salinarum erfolgreich durchgeführt. Die rasche Aufreinigung der entstandenen PM mittels Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten führte zu einer einfachen Abtrennung von einem Großteil anderer Proteine. Durch Einführung spezifischer Proteaseschnittstellen wurde auch eine Spaltung des Fusionsproteins ermöglicht. Die Koexpression löslicher Proteine mit BR in der PM bietet enorme Vorteile aufgrund der hohen Expressionsrate des Bacterioopsingens (bop), der Induzierbarkeit des bop-Promoters, die einfache Aufreinigung und der Möglichkeit zur Expression von Mutanten von essentiellen Genen ohne deren vorherige Deletion. Die Eignung dieses Systems für die einfache Isolierung von löslichen Proteinen als Fusionsprotein mit BR wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt.

Die Synthese von 3,6-Diaryl-2,5-dihydropyrrolo[3,4-c]pyrrol-1,4-dionen 1a-d und 3,6-Diaryl-2,5-dihydro-2,5-dimethylpyrrolo[3,4-c]pyrrol-1,4-dionen e-h wird beschrieben. Durch Einführen von tert-Butylgruppen in die Arylreste werden leichtlösliche Fluoreszenzfarbstoffe erhalten. Über den Mechanismus einer konformativen Umwandlung nach der Anregung werden Stokes-Shifts bis zu 70 nm bei Fluoreszenzquantenausbeuten von bis zu 95% erzielt.