Podcasts about mutationstr

Morbus Fabry wird X-chromosomal vererbt und führt durch einen Defekt des lysosomalen Enzyms α-Galaktosidase A zu einer Störung im Glykosphingolipid-Katabolismus. Neutrale Glykosphingolipide, v.a. Gb3 (Globotriaosylceramid), akkumulieren in Lysosomen verschiedenster Gewebe. Mit zunehmender Ablagerung dieser Stoffe im Gefäßendothel und in den Organen kommt es zur Ausprägung der Krankheitssymptome. In der Kindheit beginnt die Erkrankung häufig mit Akroparästhesien und Angiokeratomen. Im weiteren Verlauf treten dann die lebenslimitierenden Manifestationen dieser Erkrankung auf, wie terminale Niereninsuffizienz und, durch Ischämie- und Infarktereignisse, Myokardinfarkt und zerebrale Ischämie. Im Gegensatz zur überwiegenden Mehrzahl anderer X-gebundener Erkrankungen zeigen bei Morbus Fabry nahezu alle heterozygoten Mutationsträgerinnen im Laufe der Zeit klinische Manifestationen dieser Erkrankung, teils in gleich schwerer Form wie männliche Patienten. Da bisherige Hypothesen davon ausgingen, dass eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des mutierten GLA-Allels am Auftreten von Symptomen bei heterozygoten Fabry-Mutationsträgerinnen beteiligt sei, wurden die X-Inaktivierungsmuster von durch Mutationsanalyse gesicherten Morbus Fabry-Patientinnen mit Hilfe des Androgenrezeptor-Tests untersucht. Bei diesem Assay wird genomische DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen inkubiert. Diese verdauen nur die unmethylierte DNA des aktiven X-Chromosoms, so dass in der anschließenden PCR-Amplifikation eines hochpolymorphen CAG-Repeats im Exon 1 des Androgenrezeptor-Gens lediglich Allele des inaktiven X-Chromosoms amplifiziert werden. Nach der automatisierten Auswertung mittels Fragmentanalyse, ermöglicht durch einen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten PCR-Primer, zeigt das Verhältnis der zwei Androgenrezeptor-Allele zueinander die relative Häufigkeit eines jeden Allels auf dem aktiven oder inaktiven X-Chromosom in den Zellen des untersuchten Materials. Erstmals wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die X-Inaktivierungsmuster heterozygoter Mutationsträgerinnen von Morbus Fabry im Vergleich zu einem nichtverwandten Kontrollkollektiv untersucht. 13 (46%) der 28 Fabry-Mutationsträgerinnen zeigten eine random X-Inaktivierung, 10 (36%) eine moderate Verschiebung der X-Inaktivierung und 5 (18%) eine ausgeprägte Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten eines Allels. Es zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied zu den Inaktivierungsmustern gleichaltriger Kontrollen (p = 0,669). Segregationsanalysen konnten anhand der Familien von sechs Frauen mit ausgeprägter oder moderater Verschiebung der X-Inaktivierung durchgeführt werden. Hier zeigte sich bei vier dieser Frauen eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des Wildtyp GLA-Allels, während bei zwei weiteren eine Verschiebung zugunsten des mutierten Allels in Leukozyten erkennbar war. Bei jeder der Fabry-Patientinnen war sowohl der klinische Schweregrad der Erkrankung mittels MSSI (Mainz Severity Score Index), einem detaillierten Scoring-System für Morbus Fabry, als auch die Enzymaktivität der α-Galaktosidase A bestimmt worden. Eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der X-Inaktivierung in Leukozyten heterozygoter Fabry-Mutationsträgerinnen und deren klinischen oder biochemischen Krankheitsparametern konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass heterozygote Fabry-Patientinnen random X-Inaktivierungsmuster ähnlich denen gesunder Frauen aufweisen. Anhand unserer Daten konnte nicht belegt werden, dass das Auftreten und der Schweregrad der Erkrankung bei der Mehrzahl der heterozygoten Fabry-Patientinnen auf eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des mutierten Allels als Pathomechanismus zurückzuführen ist. X-Inaktivierungsstudien können jedoch dazu beitragen, jene Frauen frühzeitig herauszufiltern, welche aufgrund einer bei ihnen möglicherweise rascher progredient verlaufenden Erkrankung von einer sehr teuren Enzymersatztherapie am meisten profitieren könnten.

Der isolierte 3-Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase (MCC)-Mangel ist eine angeborene Störung im Abbau der Aminosäure Leucin. Die Erweiterung des Neugeborenen-Screenings (NGS) führte zu der Erkenntnis, dass der MCC-Mangel eine der häufigsten organischen Azidämien darstellt. Das klinische Bild ist sehr heterogen und eine Genotyp-Phänotyp Korrelation ist nicht möglich. Über die Prognose der im NGS identifizierten und bisher asymptomatischen Mutationsträger kann bisher keine Aussage gemacht werden. Das mitochondriale Enzym besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit. In dieser Arbeit wurden die mitochondrialen Signalpeptide beider Untereinheiten identifiziert. Hierzu wurden Fusionsproteine aus Fragmenten der Untereinheiten mit dem fluoreszierenden Protein YFP generiert. Nach Expression in humanen Hautfibroblasten wurden Kolokalisationsstudien durchgeführt. Zunächst wurde experimentell bestätigt, dass jede Untereinheit ein mitochondriales aminoterminal lokalisiertes Signalpeptid besitzt. Für MCCα befindet sich dieses in den Aminosäuren 1-39, für MCCβ in den Aminosäuren 1-20. Beide Untereinheiten haben keine weiteren Importsignale. Somit sind die aminoterminalen Targetingsequenzen ausreichend und gleichzeitig notwendig, um einen mitochondrialen Import zu ermöglichen. In einer Western Blot Analyse konnte die Abspaltung der Signalpeptide beider Untereinheiten gezeigt werden. Durch Veränderung der positiv geladenen Aminosäuren wurden die strukturellen Erfordernisse der identifizierten Signalpeptide näher charakterisiert. Es wurden Argininreste gegen Glutamin in verschiedenen Kombinationen ausgetauscht. Eine Mutation der aminoterminalen vier Argininreste im Signalpeptid von MCCα führte zum Importverlust. Bei einer Mutation der in der Targetingsequenz vom Aminoterminus weiter entfernt liegenden zwei Argininreste fand ein Import statt. Bei Mutationen der Argininreste im Signalpeptid von MCCβ kam es regelhaft zu einem Importverlust. Damit wurde die Relevanz der positiv geladenen Aminosäuren für den Import der MCC-Untereinheiten belegt. Die Identifizierung der Signalpeptide stellt die Grundlage weiterer Funktionsuntersuchungen dar, da nur reife Proteine ohne Signalsequenz für prokaryontische Expressionsstudien verwendet werden können. Durch solche Untersuchungen könnten die Auswirkungen von Mutationen auf die Enzymfunktion besser verstanden werden. In diesem Zusammenhang können möglicherweise diejenigen Veränderungen in der Funktionsweise des Enzyms aufgeklärt werden, die eine klinische Symptomatik nach sich ziehen. Hierdurch könnte die bisher schwierige Beratungssituation betroffener Familien hinsichtlich Prognose und Therapie erheblich verbessert werden.

Der isolierte 3-Methylcrotonyl-CoA: Carboxylase (MCC) Mangel ist eine angeborene Störung im Abbau der Aminosäure Leucin. Es sind sowohl bis ins Erwachsenenalter asymptomatische als auch frühe letale Verläufe beschrieben. Die Ursachen des variablen Phänotyps sind nicht verstanden. Das Enzym ist zusammengesetzt aus α- und β - Untereinheiten. Die kodierenden humanen Gene MCCA und MCCB wurden kürzlich in unserer Arbeitsgruppe kloniert. Die Erweiterung des Neugeborenen-Screenings mittels Tandem-Massenspektrometrie in Bayern erbrachte die überraschende Erkenntnis, daß der MCC Mangel wahrscheinlich die häufigste organische Azidämie (etwa 1 : 40 000) darstellt und asymptomatische Mutationsträger existieren. Über Risiko und Prognose dieser metabolischen Störung ist derzeit noch keine Aussage möglich. In dieser Arbeit sollte daher eine Methode zur molekulargenetischen Charakterisierung von Patienten mit MCC Mangel etabliert werden, um den prognostischen Wert des Genotyps studieren und damit die Beratung und Betreuung der betroffenen Familien verbessern zu können. Es wurden 3 asymptomatische Patienten aus dem Neugeborenenscreening sowie ein Patient, der mit cerebralen Krampfanfällen aufgefallen war, untersucht. Die Diagnose war bei allen Patienten durch Bestimmung der typischen Metabolite in Urin (3-Hydroxyisovaleriansäure und 3- Methylcrotonylglycin) und Blut (3-Hydroxyisovaleryl-Carnitin) gestellt worden. Für die molekulargenetische Diagnostik des MCC Mangels wurde die Mutationsanalyse auf genomischer und cDNA Ebene für MCCA und MCCB etabliert. Es wurden zwei Patienten mit veränderten Allelen im MCCA- und zwei Patienten mit Mutationen im MCCB-Gen identifiziert. Ein Patient war compound-heterozygot für die Missense-Mutation S535F (1604C>T) und die Nonsense-Mutation V694X (2079delA) im MCCA Gen. Bei einem zweiten Patienten wurde S535F (1604C>T) heterozygot nachgewiesen. Ein Patient mit konsanguinen Eltern war homozygot für die Missense-Mutation S535F (1604C>T). Ein weiterer wies die Missense-Mutation E99Q (295G>C, cDNA: homozygot; gDNA: heterozygot) mit einen Allelverlust auf. In zwei Fällen werden zusätzliche Mutationen in der Promotorregion bzw. in einem Intron angenommen. Für alle gefundenen Mutationen kann von phänotypischer Relevanz ausgegangen werden. Drei davon waren bisher unbekannt und wurden von uns erstbeschrieben. Unsere Ergebnisse bestätigen die Rolle von MCCA und MCCB azielführende Methode zur molekulargenetischen Charkterisierung von Patienten mit MCC Mangel dar und bildet damit die Grundlage für Expressionsstudien und Studien zur Untersuchung der Genotyp-Phänotypkorrelation.ls humane Krankheitsgene. Die hier etablierte Mutationsanalyse stellt eine