Podcasts about signalsequenz

In dieser Folge stellt Nicole Stein die "Anfang-Pause-Ende" Signalsequenz vor. Diese Abfolge von Signalen verhilft dem Menschen und dem Hund strukturiert und erfolgreich zu trainieren. Wie das funktioniert erklärt Nicole sehr anschaulich in dieser Folge. Mehr über Nicole erfahrt ihr hier. https://www.tierarztpraxis-stein.de/ https://medicaltraining24.de/ --- Send in a voice message: https://podcasters.spotify.com/pod/show/anja14/message

Verschiedene Neuropeptidhormone, welche einerseits sehr klein sind oder als intrinsisch unstrukturiert vorhergesagt werden, werden als größere Vorläufer-Proteine synthetisiert. Diese enthalten neben der N-terminalen Signalsequenz eine Prodomäne, welche später im sekretorischen Biosyntheseweg abgespalten wird und nicht Teil des aktiven Hormons ist. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle der Prodomänen in der Biogenese der intrinsisch unstrukturiert vorhergesagten Neuropeptidhormone Thyrotropin-Releasing Hormon (TRH), Somatostatin (Som) und Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH) untersucht. Die hier dargelegten Ergebnisse zeigen erstmals, dass die Prodomänen dieser Proteine für eine effiziente Translokation der intrinsisch unstrukturierten Hormondomänen in das ER-Lumen verantwortlich sind. Bisher wurde eine Funktion der Prodomäne von Peptidhormonen erst nach der Translokation bei der Proteinfaltung, Prozessierung und Sortierung der Proteine im ER-Golgi-Kompartment beschrieben. Zudem deuten die durchgeführten Domänen-Austausch-Experimente daraufhin, dass für die beschriebene translokationsfördernde Aktivität der Prodomäne ihre alpha-helikale Struktur entscheidend ist. Durch die in vitro durchgeführten Zielsteuerungsexperimente konnte gezeigt werden, dass ein Fehlen der Prodomäne bzw. von alpha-helikalen Domänen im Allgemeinen die Translokation in das ER-Lumen und nicht die kotranslationale Zielsteuerung der naszierenden Polypeptidkette an die ER-Membran negativ beeinflusst. Durch die Analyse des weiteren Schicksals der nicht-translozierten, intrinsisch unstrukturierten Proteine konnte ein neuartiger, dualer Zielsteuerungsmechanismus charakterisiert werden, wobei die ER-Signalsequenzen von Somatostatin (Som), Shadoo (Sho) und APP (Amyloid-Vorläuferprotein) eine Weiterleitung der Proteine zum Mitochondrium vermitteln. Es zeigte sich, dass die Zielsteuerungsrichtung der genannten bivalenten Signalsequenzen von der Sekundärstruktur der Polypeptidkette abhängt, wobei intrinsisch unstrukturierte Domänen eine mitochondriale Lokalisation und α-helikale Domänen präferentiell eine ER-Translokation vermittelten. Die Erkenntnisse dieser Arbeit bekräftigen eine Regulation der ER-Translokation durch die Sekundärstruktur der maturen Domäne des Proteins. Die hier gewonnenen Daten zeigen zudem, dass eine duale Zielsteuerung von Proteinen zwischen ER und Mitochondrium durch die Sekundärstruktur der maturen Domäne koordiniert werden kann. Diese Erkenntnisse können möglicherweise in Zukunft zu einem tieferen Verständnis von einigen Erkrankungen beitragen, welche auf einer Mislokalisation von sekretorischen Proteinen beruhen.

Vor Beginn dieser Arbeit war ein A. fumigatus-Protein (Chp: CipC homologes Protein) mit unbekannter Funktion und hoher Homologie zum CipC-Protein aus A. nidulans als prominentes hyphenspezifisches Protein identifiziert worden (Schwienbacher, 2005). Weiterhin gab es zu diesem Zeitpunkt Hinweise, dass ein zu CipC homologes Protein in C. neoformans eine wichtige Rolle während der Virulenz spielt (Steen et al., 2003). In dieser Arbeit sollte die biologische Funktion des pilzspezifischen Proteins genauer untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper gegen Chp, mehrere Reporterstämme sowie eine Deletionsmutante hergestellt. Die erhobenen Daten zeigen, dass Chp als Monomer im Cytosol der Hyphen vorliegt. Dabei zeigte sich eine gleichmäßige Verteilung eines GFP-Fusionsproteins innerhalb der Hyphen; nur die Vakuolen schienen ausgespart. Die Identifikation des Proteins auf der Sporenoberfläche von A. fumigatus (Asif et al., 2006) wurde wiederlegt und die differentielle Expression des Proteins bestätigt. Anders als in A. nidulans (Melin et al., 2002) wirkt das Antibiotikum Concanamycin A auf die Bildung von Chp in A. fumigatus nicht induzierend. Da diese Tatsache sowohl für die Na-mensgebung von CipC, als auch für die Namensgebung von Chp verantwortlich war, sollte das A. fumigatus-Protein umbenannt werden. Die Wahl des Namens fiel auf NrpA (Nitrogen regulated protein A), da die Bildung des Proteins von der N-Quelle abhängig ist. Die N-abhängige Regulation war für ein homologes F. fujikuroi Gen auf RNA-Ebene bereits bekannt (Teichert et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte sie in A. fumigatus und erstmals auf Proteinebene bestätigt werden. Desweiteren wurden auch neue N-Quellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass NrpA in Anwesenheit der N-Quellen Glutamat, Nitrat oder Harnstoff nicht gebildet wird, wohin-gegen Komplexmedien sowie die N-Quellen Ammonium, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Valin und Tryptophan zur Bildung des Proteins führen. In Kombination einer induzierenden und einer unterdrückenden N-Quelle dominiert stets die induzierende. In Reporterstämmen (gfp; lacZ) fand diese negative Regulation der Bildung von NrpA nicht statt. Das Protein wurde sowohl in Anwesenheit einer normalerweise unterdrückenden N-Quelle, als auch in den Sporen gebildet. Weiterhin nimmt die gebildete Menge von NrpA sowohl bei längeren Inkubationszeiten, als auch bei Verwendung höherer Animpfdichten zu. Wird der Pilz zunächst mit einer die NrpA-Bildung unterdrückenden N-Quelle angezogen und dann in Medium mit einer induzierenden N-Quelle umgesetzt, dauert es 6 h bis eine Bildung von NrpA verzeichnet werden kann. Diese Zeitspanne blieb auch in einem inversen Experiment gleich. Als nächstes wurde untersucht, ob NrpA in A. fumigatus unter Stressbedingungen von Bedeutung ist. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl osmotischer Stress, als auch oxidativer Stress, der durch Menadion verursacht wird, kei-ne Auswirkung auf die gebildete NrpA-Menge hat. Dagegen führt durch H2O2 verursachter Stress zu einem veränderten Laufverhalten von NrpA in SDS-Gelen. Das Protein scheint unter diesen Umständen ein höheres Molekulargewicht zu haben. Mithilfe eines A. fumigatus-Reporterstammes, der ein NrpA-GFP-Fusionsprotein bildet, konnte gezeigt werden, dass H2O2 auch zu einer veränderten Lokalisation von NrpA führt. Das sonst gleichmäßig in den Hyphen verteilte Protein formierte sich in punktförmigen Strukturen. Auch unter Mangelbedingungen spielt NrpA keine wichtige Rolle, denn weder ein C- noch ein N-Mangel verändert die gebildete Menge des Proteins. Dient die normalerweise die NrpA-Bildung induzierende N-Quelle Glutamin als C- und N-Quelle wird NrpA nicht gebildet. Ebenso wie in F. fujikuroi (Teichert et al., 2002) wird die Bildung des NrpA-Proteins durch MSX, einem Inhibitor der Glutaminsynthetase, fast vollständig inhibiert. Anders als in F. fujikuroi (Teichert et al., 2006) verursachte die Inhibierung der TOR-Kinase durch Rapamycin keinen Effekt auf die Bildung von NrpA. Auch durch eine her-gestellte Deletionsmutante konnte die biologische Funktion von NrpA nicht geklärt werden. In zahlreichen vergleichenden Untersuchungen verhielt sich die Mutante ebenso wie der Wildtyp. Der einzige dokumentierte Unterschied zwischen Mutante und Wildtyp ist eine verstärkte Bil-dung der Katalase 1 in der Deletionsmutante. Anders als angenommen spielt NrpA während der Virulenz von A. fumigatus keine Rolle. In einem Virulenzmodell in embryonierten Hühnereiern verhielten sich Deletionsmutante und Wildtyp gleich. Auch in murinen Makrophagen führten die Deletionsmutante und der Wildtyp etwa zu vergleichbaren Mengen an ausgeschüttetem IL-10 und TNFα. Ein potentieller Nutzen von NrpA bei der Diagnose der allergischen bronchoalveolaren Aspergillose (ABPA) konnte ebenso ausgeschlossen werden. Neben NrpA waren im Vergleich der Proteinmuster der verschiedenen A. fumigatus-Morphotypen auch weitere differentiell exprimierte Proteine aufgefallen. Eines davon war eine MnSOD (Aspf6), die bis dahin auch als mitochondriale MnSOD bezeichnet wurde (Rementeria et al., 2007). Da im Genom von A. fumigatus aber eine weitere MnSOD kodiert ist, die über eine putative Mitochondriensignalsequenz verfügt, sollte in einem zweiten Teil der Arbeit die tat-sächliche Lokalisation dieses Proteins gezeigt werden. Dafür wurden zunächst monoklonale Antikörper gegen das Protein hergestellt. Eine mitochondriale Lokalisation der MnSOD mit puta-tiver Signalsequenz konnte gezeigt werden. Dabei wurden sowohl Western-Blots als auch ein A. fumigatus-GFP-Reporterstamm verwendet. Weiterhin konnte das Protein genauer charakteri-siert werden. Im Gegensatz zu Aspf6, das nur in den Hyphen des Pilzes zu finden ist, wurde die mitochondriale MnSOD sowohl in den Sporen, als auch in den Hyphen nachgewiesen. Die gebil-dete Menge des Proteins verändert sich im Zeitverlauf nicht. Lediglich zu sehr späten Wachs-tumszeitpunkten in der späten stationären Phase war ein leichter Anstieg zu beobachten. Die gebildete Menge des Proteins hing auch nicht von der Animpfdichte der Kultur ab. Anders als Aspf6, das bekannterweise ein Homotetramer bildet (Flückiger et al., 2002), scheint die mitochondriale MnSOD als Dimer vorzuliegen. Auch in Antwort auf oxidativen Stress verhielten sich die beiden MnSODs unterschiedlich. Menadion, das innerhalb der Zelle die Bildung von Su-peroxidanionen bewirkt, führte zu einem leichten Anstieg der Proteinmenge der mitochondrialen MnSOD, während Aspf6 unverändert blieb. Als Folge von oxidativem Stress, der durch H2O2 verursacht wird, zeigte Aspf6 eine leichte Verringerung, während die mitochondriale MnSOD schnell abgebaut wird. In einem dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der Atmung während der Auskeimung von A. fumigatus genauer untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteinbiosynthese für den Auskeimungsprozess unbedingt notwendig ist. Desweiteren wurde mit Hilfe unterschiedli-cher Methoden eine sehr frühe Aktivierung der Atmungskette während des Auskeimungspro-zesses nachgewiesen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Sauerstoff für das Wachstum von A. fumigatus unbedingt erforderlich ist. Im anaeroben Milieu konnten die Konidien weder anschwellen noch auskeimen. Auch bereits vorhandene Hyphen konnten unter Abwesenheit von Sauerstoff nicht weiterwachsen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass A. fu-migatus anders als A. nidulans (Takasaki et al., 2004) nicht über die Fähigkeit verfügt, im Anae-roben durch eine Fermentation von Ammonium zu überleben. In dieser Arbeit wurde ebenso wie in anderen aktuellen Arbeiten (Williger et al., 2008) die Fähigkeit von A. fumigatus, in hypoxischen Umgebungen zu wachsen, nachgewiesen.

Etwa 10.000 verschiedene Proteine enthält eine typische Säugetierzelle – und die meisten davon können ihre spezifischen Funktionen nur an ganz bestimmten Orten in oder außerhalb der Zelle erfüllen. Professor Roland Beckmann, Genzentrum der LMU, untersucht den dafür nötigen und hoch komplexen Vorgang der Sortierung von Proteinen, wenn diese mit Hilfe einer molekularen Signalsequenz über eine Reihe von Schritten zu ihrem Einsatzort gebracht werden.

Einfluss der F1FO-ATP Synthase-Oligomerisierung auf den bioener-getischen Zustand von Mitochondrien Eine wichtige Funktion der Mitochondrien besteht in der Bereitstellung von ATP, dessen Synthese durch die OXPHOS-Komplexe der Innenmembran bewerkstelligt wird. Zusätzlich besitzt die F1FO-ATP Synthase eine strukturgebende Aufgabe. Dazu bildet diese Oligomere aus, die für die Ausbildung von Cristaestrukturen essentiell sind. Insbesondere die oligomer-spezifischen Untereinheiten Su e und Su g sind dafür, nicht jedoch für die enzymatische Aktivität der F1FO-ATP Synthase, notwendig. Der Einfluss der F1FO-ATP Synthase Assemblierung auf den bioenergetischen Zustand von Mitochondrien wurde in dieser Arbeit untersucht. Teildeletionen der C-terminalen ‚coiled-coil’-Domänen von Su e weisen eine verringerte Stabilität der Oligomere auf. Diese Destabilisierung geht mit einer Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und der Wachstumsrate einher, ist jedoch für die Ausbildung von Cristaestrukturen hinreichend. Des Weiteren sind die enzymatischen Aktivitäten der Atmungskettenkomplexe, die Integrität der Innenmembran sowie die Verlustrate der mtDNA in diesen Mutanten nicht beeinträchtigt. Der beobachtete Phänotyp ist daher nicht auf Sekundäreffekte zurückzuführen. Diese Arbeit unterstützt ein Modell, nach dem die Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu Oligomeren für die räumliche Anordnung auch von anderen Proteinkomplexen in Form von Mikrodomänen für einen effizienten Substratumsatz während der oxidativen Phosphorylierung oder für deren Regulation notwendig ist. Somit hat die Stabilität der F1FO-ATP Synthase-Oligomere einen Einfluss auf die bioenergetische Leistungsfähigkeit von Mitochondrien. Charakterisierung der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 Das Dynamin-ähnliche mitochondriale Protein Mgm1 kommt in zwei Isoformen vor, die möglicherweise an der Ausbildung von Cristaestrukturen beteiligt sind. Die kurze Isoform, s-Mgm1, entsteht in Abhängigkeit von der hochkonservierten Intramembran-Rhomboidprotease Pcp1. Zur genaueren Aufklärung dieser Prozessierung wurde die Topologie und Biogenese von Pcp1 ermittelt. Pcp1 durchspannt die mitochondriale Innenmembran mit sieben Transmembrandomänen und besitzt eine Nin-Cout-Topologie. Untersuchungen zum Import von Pcp1 zeigen, dass dessen Import in die innere Membran von der TIM23-Translokase vermittelt und die mitochondriale Signalsequenz schrittweise durch die zwei Proteasen MPP und MIP entfernt wird. Außerdem wird möglicherweise die C-terminale Transmembrandomäne von Pcp1, entsprechend einem ‚Stop-Transfer’-Mechanismus, in der TIM23-Translokase arretiert und anschließend lateral in die Innenmembran inseriert. Alternativ wird Pcp1 zunächst vollständig in die Matrix importiert und anschließend über den konservativen Sortierungsweg in die Innenmembran inseriert. Die bisherigen Ergebnisse lassen eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Möglichkeiten nicht zu. Aufgrund von Sequenzvergleichen verschiedener Rhomboidproteasen wurden wie in anderen Serinproteasen drei konservierte Aminosäurereste als mögliche katalytische Triade postuliert. Um dies zu untersuchen, wurden diese Aminosäurereste jeweils gegen Alanin ausgetauscht. Zwei dieser Punktmutationen, in Serin-256 oder Histidin-313, führen zur vollständigen Inaktivierung von Pcp1, während die Aminosäure Asparagin-202 für die Aktivität nur partiell notwendig ist. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die mitochondriale Rhomboidprotease Pcp1 mit einer katalytischen Diade eine besondere Stellung unter den Serinproteasen einnimmt.

Der isolierte 3-Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase (MCC)-Mangel ist eine angeborene Störung im Abbau der Aminosäure Leucin. Die Erweiterung des Neugeborenen-Screenings (NGS) führte zu der Erkenntnis, dass der MCC-Mangel eine der häufigsten organischen Azidämien darstellt. Das klinische Bild ist sehr heterogen und eine Genotyp-Phänotyp Korrelation ist nicht möglich. Über die Prognose der im NGS identifizierten und bisher asymptomatischen Mutationsträger kann bisher keine Aussage gemacht werden. Das mitochondriale Enzym besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit. In dieser Arbeit wurden die mitochondrialen Signalpeptide beider Untereinheiten identifiziert. Hierzu wurden Fusionsproteine aus Fragmenten der Untereinheiten mit dem fluoreszierenden Protein YFP generiert. Nach Expression in humanen Hautfibroblasten wurden Kolokalisationsstudien durchgeführt. Zunächst wurde experimentell bestätigt, dass jede Untereinheit ein mitochondriales aminoterminal lokalisiertes Signalpeptid besitzt. Für MCCα befindet sich dieses in den Aminosäuren 1-39, für MCCβ in den Aminosäuren 1-20. Beide Untereinheiten haben keine weiteren Importsignale. Somit sind die aminoterminalen Targetingsequenzen ausreichend und gleichzeitig notwendig, um einen mitochondrialen Import zu ermöglichen. In einer Western Blot Analyse konnte die Abspaltung der Signalpeptide beider Untereinheiten gezeigt werden. Durch Veränderung der positiv geladenen Aminosäuren wurden die strukturellen Erfordernisse der identifizierten Signalpeptide näher charakterisiert. Es wurden Argininreste gegen Glutamin in verschiedenen Kombinationen ausgetauscht. Eine Mutation der aminoterminalen vier Argininreste im Signalpeptid von MCCα führte zum Importverlust. Bei einer Mutation der in der Targetingsequenz vom Aminoterminus weiter entfernt liegenden zwei Argininreste fand ein Import statt. Bei Mutationen der Argininreste im Signalpeptid von MCCβ kam es regelhaft zu einem Importverlust. Damit wurde die Relevanz der positiv geladenen Aminosäuren für den Import der MCC-Untereinheiten belegt. Die Identifizierung der Signalpeptide stellt die Grundlage weiterer Funktionsuntersuchungen dar, da nur reife Proteine ohne Signalsequenz für prokaryontische Expressionsstudien verwendet werden können. Durch solche Untersuchungen könnten die Auswirkungen von Mutationen auf die Enzymfunktion besser verstanden werden. In diesem Zusammenhang können möglicherweise diejenigen Veränderungen in der Funktionsweise des Enzyms aufgeklärt werden, die eine klinische Symptomatik nach sich ziehen. Hierdurch könnte die bisher schwierige Beratungssituation betroffener Familien hinsichtlich Prognose und Therapie erheblich verbessert werden.

Die mitochondriale Außenmembran beherbergt eine Vielzahl an Proteinen, die anhand ihrer Topologie in unterschiedliche Klassen eingeteilt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biogenese von zwei Klassen untersucht. Die erste besitzt eine hydrophile cytosolische Domäne und ist über eine Transmembrandomäne im N-terminalen Bereich in der Membran verankert. Dieser N-terminale Bereich enthält die Signalsequenz dieser Proteine und dient gleichzeitig als Membrananker, weshalb er als Signal-Anker-Domäne bezeichnet wird. Zu dieser Proteinklasse gehören die beiden Rezeptorkomponenten des TOM-Komplexes, Tom20 und Tom70, und in S. cerevisiae das Protein OM45 mit bisher unbekannter Funktion. Zur Bestimmung der Bedeutung der Signal-Anker-Domäne für die Funktion des jeweiligen Proteins bzw. zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung dieses Sequenzabschnittes wurde ein Komplementationsansatz benutzt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Signal-Anker-Domänen mitochondrialer Außenmembranproteine funktionell austauschbar sind. Folglich spielen sie für die spezifische Funktion des Proteins nur eine untergeordnete Rolle, sind allerdings für den Transport zu den Mitochondrien und für die Verankerung in der Außenmembran von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren konnte ich die strukturellen Elemente bestimmen, die zusammen mit der Ankerdomäne das topogene Signal bilden. Eine moderate Hydrophobizität der Transmembrandomäne scheint am wichtigsten zu sein, um diese Proteine zu Mitochondrien zu dirigieren. Eine positive Nettoladung in beiden flankierenden Regionen der Transmembrandomäne erhöht die Effizienz des Transports zu den Mitochondrien und die Membraneinbaurate, ist aber keine essenzielle strukturelle Eigenschaft dieses Signals. Zusätzlich zur Charakterisierung der Signal-Anker-Domänen wurde der Importmechanismus dieser Proteinklasse untersucht. Dieser ist gemäß unserer Ergebnisse nicht von den bekannten Importrezeptoren, Tom20 und Tom70, abhängig, benötigt aber sehr wohl die zentrale Tom-Komponente Tom40. Im Gegensatz zu Vorstufen von Proteinen interner mitochondrialer Kompartimente und von beta-Barrel-Proteinen der Außenmembran scheinen die Vorstufen von Proteinen mit einer Signal-Anker-Domäne nicht über den von Tom40 gebildeten Kanal importiert zu werden. Höchstwahrscheinlich werden diese Proteine durch andere Teile von Tom40 erkannt und anschließend an der Protein-Lipid-Interphase in die Membran eingebaut. Die zweite untersuchte Proteinklasse der mitochondrialen Außenmembran sind die beta-Barrel-Proteine, welche über mehrere antiparallele beta-Faltblätter in der Membran verankert sind. Diese Proteine sind neben Mitochondrien in der Außenmembran von Chloroplasten und gram-negativen Bakterien zu finden. Zu Beginn dieser Arbeit war wenig über die Biogenese mitochondrialer beta-Barrel-Proteine bekannt. Wir konnten zeigen, dass diese Proteinklasse über einen evolutionär konservierten Weg in Mitochondrien importiert wird. Beta-Barrel-Proteine werden zunächst mit Hilfe des TOM-Komplexes zur Intermembranraumseite transportiert. Von dort werden sie durch einen zweiten oligomeren Proteinkomplex, den TOB-Komplex, in die Außenmembran eingebaut. Als erste Tob-Komponente konnten wir das essenzielle Protein Tob55 identifizieren und charakterisieren. Es kann eine Pore in Lipidmembranen bilden und könnte folglich für die Insertion der beta-Barrel-Vorstufen in die Außenmembran verantwortlich sein. Mas37 wurde ebenfalls als Bestandteil dieses Komplexes beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Komponenten konnte ich Tob38 mit Tob55 zusammen reinigen. Tob38 ist wie Tob55 essenziell für das Wachstum von Hefezellen und für die Funktion des TOB-Komplexes. Es ist auf der Oberfläche der mitochondrialen Außenmembran lokalisiert. Tob38 interagiert mit Mas37 und Tob55 und ist auch in Abwesenheit von Mas37 mit Tob55 assoziiert. Der Tob38-Tob55 Kernkomplex bindet Vorstufen von beta-Barrel-Proteinen und ermöglicht deren Einbau in die Außenmembran. Die Depletion von Tob38 führt zu stark verringerten Mengen an Tob55 und Mas37 und die verbleibenden Proteine bilden keinen Komplex mehr. Der Import von beta-Barrel-Vorstufenproteinen in Tob38-depletierte Mitochondrien ist stark beeinträchtigt, wohingegen andere Außenmembranproteine oder Proteine anderer mitochondrialer Subkompartimente mit gleicher Effizienz wie in Wildtyp-Organellen importiert werden. Demnach besitzt Tob38 eine äußerst wichtige und spezifische Funktion bei der Biogenese von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen. Es könnte für die Stabilität und Assemblierung des TOB-Komplexes notwendig sein oder an der Ausbildung einer transienten Assoziation zwischen dem TOM- und dem TOB-Komplex beteiligt sein und dabei den Transfer von Vorstufenproteinen erleichtern. Andererseits könnte Tob38 auch als Regulator der von Tob55 gebildeten Pore fungieren. Mim1 konnte im Rahmen dieser Arbeit als eine weitere am Import bzw. der Assemblierung des beta-Barrel-Proteins Tom40 beteiligte Komponente charakterisiert werden. Die Depletion von Mim1 führt zu stark verringerten Mengen an assembliertem TOM-Komplex und zur Akkumulation von Tom40 als niedermolekulare Spezies. Wie alle mitochondrialen beta-Barrel-Proteine werden die Vorstufen von Tom40 durch den TOB-Komplex in die Außenmembran eingebaut. Mim1 wird höchstwahrscheinlich nach diesem TOB-abhängigen Schritt benötigt. Aufgrund der starken Konservierung im Bereich des Transmembransegments von Mim1 beim Vergleich der Proteinsequenzen verschiedener Pilze könnte das Protein als eine Art Membran-Chaperon fungieren. Dabei könnte Mim1 notwendig sein, um nicht oder teilweise assembliertes Tom40 in einer kompetenten Form für die Assemblierung mit den kleinen Tom-Proteinen und mit Tom22 zu halten. Mim1 ist weder eine Komponente des TOM-Komplexes noch des TOB-Komplexes, sondern scheint vielmehr Bestandteil eines weiteren, bisher nicht charakterisierten Komplexes zu sein. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Mim1 eine spezifische und unverzichtbare Rolle bei der Assemblierung des TOM-Komplexes spielt.

Im Unterschied zu den HLA-Klasse-Ia-Molekülen ist das nicht-polymorphe Klasse-Ib-Molekül HLA-G v.a. in der Plazenta exprimiert. Es wird postuliert, daß HLA-G die Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegen den „semiallogenen“ Fetus mitreguliert. In allen anderen Zellen und Geweben, in denen es gefunden wurde, ist die Menge im Vergleich zu klassischen Klasse-I-Molekülen um Größenordnungen geringer. Auch in der Genexpression unterscheidet sich HLA-G drastisch von allen übrigen Klasse-I-Molekülen. Am auffallendsten ist dabei das Auftreten verschiedener alternativer Spleißformen. Neben dem Volle-Länge-Transkript G1m gibt es eine Reihe verkürzter Isoformen: G2 (G2m, Da2-Domäne), G3 (Da2/Da3-Domäne), G4 (Da3-Domäne) sowie zwei Formen, die für lösliche Proteine kodieren, da die nicht-entfernte Intron-4-Sequenz zu einem vorzeitigen Translationsstop führt, G5 (G1s), G6 (G2s, Da2-Domäne, + In4). Die schwache Expression von HLA-G bestätigte sich auch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Haut- und Muskelbiopsien sowie Gehirnproben. Transkripte für HLA-G und die verkürzten Isoformen waren in fast allen Proben nachweisbar, wobei das Volle-Länge-Transkript die dominante Form war. Bei den nach Krankheitsgruppen eingeteilten Hautbiopsien und den Muskelbiopsien mit definierten Diagnosen konnte keine Korrelation eines bestimmten Expressionsmusters mit einer bestimmten Krankheitsgruppe bzw. Diagnose festgestellt werden. Diese Heterogenität des Expressionsmusters sowie die selektive Hochregulation der Volle-Länge-Isoform G1m auf Transkriptions- und Proteinebene in Glioblastomzellinien und Myoblasten, die nur eine äußerst schwache konstitutive Expression von HLA-G aufweisen, nach Behandlung mit IFNg deutet auf eine differentielle Regulation hin. Um die einzelnen Isoformen getrennt voneinander untersuchen zu können, wurden Transfektanten für jede Form in der Klasse-I-negativen B-Zellinie 721.221 etabliert. Nur die Volle-Länge-Isoform G1m sowie deren lösliche Variante G1s konnten auf der Zelloberfläche bzw. im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Von den übrigen Isoformen konnten nur EndoH-sensitive Polypeptide gefunden werden, und auch Immunofluoreszenzfärbung mit einer Reihe von Klasse-I-Ak zeigte keine Zelloberflächenexpression. Es muß daraus geschlossen werden, daß die verkürzten Isoformen in der Zelle zurückgehalten werden. HLA-G kann auf zwei Wegen die Aktivität von Immuneffektorzellen regulieren: direkt über ILT2 und indirekt über HLA-E. Das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-E wird durch Bindung eines Nonamers (P3-11) aus dem Signalpeptid verschiedener Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen stabilisiert. Aus der Interaktion dieses funktionellen HLA-E/Peptid-Komplexes mit dem inhibitorischen Rezeptorkomplex CD94/NKG2A auf NK-Zellen resultiert ein Schutz dieser Zellen vor der NK-Lyse. Auch das entsprechende Peptid aus der Signalsequenz von HLA-G ist ein Ligand für HLA-E. Allerdings wurde gezeigt, daß die Stabilisierung von HLA-E auf der Zelloberfläche durch das Peptid G3﷓11 schwächer als mit anderen Klasse-I-Peptiden und auch weniger stabil ist. Effektive Inhibition der Lyse der NK-Zellinie NKL über diese Interaktion von HLA-E mit CD94/NKG2A findet man nur bei HLA-G1m-Transfektanten. Diese werden auch durch die direkte Interaktion von HLA-G1m mit einem weiteren inhibitorischen Rezeptor auf NKL - ILT2 - geschützt. In den 721.221-Transfektanten der verkürzten HLA-G-Isoformen war eine unphysiologisch hohe Konzentrationen an HLA-G-Polypetid notwendig, um die kritische Menge an HLA-E-Ligand für den Schutz dieser Zellen vor der Lyse durch NK-Zellen liefern zu können. Das war nur für eine äußerst stark exprimierende G3-Transfektante der Fall. Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in einer ineffizienteren Prozessierung des Signalpeptids von HLA-G und einer im Vergleich mit anderen HLA-E-Liganden geringeren Bindungsaffinität des Peptids G3-11 für HLA-E. Eine Funktion der verkürzten HLA-G-Isoformen durch die direkte Interaktion mit Rezeptoren auf NK-Zellen konnte nicht nachgewiesen werden und ist wegen ihrer intrazellulären Expression auch unwahrscheinlich. Vielmehr deuten erste Daten, die zeigen, daß die Isoformen, direkt oder indirekt, mit dem TAP-Komplex assoziiert sind, auf eine mögliche Funktion im Rahmen der Antigenpräsentation hin. Worin diese besteht, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Daher ist anzunehmen, daß HLA-G in vivo hauptsächlich über HLA-G-bindende KIR immunregulatorische Funktionen wahrnimmt und durch indirekte Wirkung über HLA-E-CD94/NKG2A modulierend eingreift.