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Die bullöse Dermatose Pemphigoid gestationis ist eine äußerst seltene schwangerschaftsassoziierte Autoimmunerkrankung, bei der Antikörper gegen Strukturen der Plazenta produziert werden, die mit dem BP180 der mütterlichen Haut kreuzreagieren und schließlich zur Blasenbildung führen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Assoziation der Erkrankung mit sämtlichen klassischen Humanen Leukozyten-Antigenen (HLA) zu überprüfen. Dafür wurden HLA-Kompletttypisierungen (HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1, -DPB1) bei 18 betroffenen Patientinnen und falls vorhanden von Partnern und Kindern der Betroffenen vorgenommen. Von Kindern und Partnern standen insgesamt 27 DNA-Proben zur Verfügung. Diverse Studien wiesen eine Assoziation der Erkrankung mit den HLA-Klasse II-Allelen HLA-DRB1*03 und *04 nach. Eine pathogenetische Rolle paternaler HLA-Moleküle bei der Erkrankung wird aufgrund der Häufung des HLA-DRB1*02-Phänotyps im Kollektiv der Partner vermutet. Die statistischen Berechnungen der Typisierungsergebnisse dieser Arbeit zeigten im Kollektiv der PG-Patientinnen eine signifikante Häufung der HLA-Allele B*08 (p=0,0019), B*18 (p=0,0455), DRB1*03 (p=0,001), DQB1*02 (p=0,0283) und DPB1*0101 (p=0,0011). In Übereinstimmung mit Daten aus der Literatur trat im PG-Patientinnen-Kollektiv der DRB1*03/*04-Phänotyp und im Kollektiv der Partner der HLA-DR02-Phänotyp signifikant gehäuft auf. Untersuchungen auf Aminosäureebene zeigten Gemeinsamkeiten der HLA-DRB1-Allele, die in dem Kollektiv der Mütter vertreten waren auf. Bei der Betrachtung der Genkonstellationen kompletter Stammbäume war ersichtlich, dass im Fall von 3 der 6 aufgeführten Stammbäume die Vererbung des väterlichen DRB1*02-Alleles mit der Krankheitsentwicklung in der entsprechenden Schwangerschaft zusammenfiel. Es wurden keine Hinweise gefunden, dass die Interaktion von HLA-C bzw. HLA-B mit KIR (killer cell immunglobulin-like receptors) für das Auftreten der Krankheit eine Rolle spielen. Die Ergebnisse legen einerseits nahe, dass aufgrund der Häufung von Allelen verschiedener HLA-Loci mehrere Gene eine ätiopathogenetische Rolle spielen, andererseits die Häufung mehrerer Gene verschiedener Loci auf einer Kopplung beruhen könnte. Desweiteren liefern die Untersuchungen der Aminosäurensequenzen Hinweise darauf, dass sich bestimmte Aminosäurensubstitutionen in der Bindungsgrube der HLA-Klasse II-Moleküle als protektiv 72 oder als erhöhtes Risiko auswirken könnten. Die Rolle des väterlichen HLA-DR bleibt weiterhin ungeklärt. Die Konstellation der HLA-DR-Vererbung innerhalb kompletter Familien suggeriert, dass die Vererbung des HLA-DRB1*02 an das Kind als zusätzlicher Risikofaktor zu bewerten ist, aber nicht als ursächlich für die Erkrankung betrachtet werden kann. Zur weiteren Klärung der paternalen Rolle wäre die Überprüfung der HLA-Klasse II-Expression in PG-Plazenten mit modernen molekularbiologischen Methoden von großem Interesse.

Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse tragen aus dem Blickwinkel der Evolutionsbiologie zu unserem Verständnis der Regulation von Genexpression bei. Ich verwende einen bestens bekannten Modellorganismus, die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, nicht nur als Objekt der Beobachtung, sondern auch als ein genetisches Manipulationswerkzeug, und untersuche drei verschiedene Aspekte des Prozesses, durch den die in der DNA gespeicherte Information förmlich „entfesselt“ oder umgesetzt wird zu biologischem Sinn, letztlich also zu Form und Funktion. In Kapitel 1 zeige ich zunächst, dass eine Inaktivierung des X-Chromosomes (und somit Genregulation auf chromosomaler Ebene) in der männlichen Keimbahn von D. melanogaster stattfindet. Im Gegensatz zur X-Inaktivierung in weiblichen Säugetieren, wo dies in den somatischen Zellen als Mechanismus zur Dosiskompensation auftritt, ist diese Art der Inaktivierung auf die Spermatogenese beschränkt und wurde wahrscheinlich während der Genomevolution als eine Möglichkeit etabliert, schädliche Auswirkungen in Zusammenhang mit Sexualantagonismus zu umgehen. Durch P-Element-vermittelte Keimbahntransformation erhielt ich fast 50 unabhängige Insertionen eines testisspezifischen Reportergenkonstrukts und untersuchte die dazugehörigen Reportergenaktivitäten durch Messung der Enzymaktivität und durch quantitative RT-PCR. Autosomale Insertionen dieses Konstrukts zeigten das erwartete Muster hoher männchen- und testisspezifischer Expression. Insertionen auf dem X-Chromosom zeigten dagegen wenig bzw. gar keine Expression des Transgens. Da die X-chromosomalen Insertionen die euchromatischen Abschnitte des Chromosoms abdeckten (bestimmt durch inverse PCR), konnte eine systematische Bevorzugung bestimmter Regionen bei Insertionen, die ein Fehlen von Expression auf dem X-Chromosom hätte erklären können, ausgeschlossen werden. Der Effekt scheint eine globale Eigenschaft des X-Chromosomes zu sein. Lediglich die Testisspezifität des transgenen Konstrukts ist für das Erscheinen des Effekts erforderlich, was somit eine Selektionshypothese für die X-Inaktivierung erhärtet sowie einige Beobachtungen erklären könnte, die im Zusammenhang mit der Verteilung von im Männchen und Testis exprimierten Genen im Drosophila-Genom gemacht wurden. In Kapitel 2 untersuche ich dann mutmaßliche cis-regulatorische Sequenzen und ihr Vermögen, allelspezifische Genexpression zu steuern. Nachdem Microarray-Studien umfangreiche Variabilität im Primärmerkmal Genexpression in unterschiedlichsten Taxa aufgedeckt haben, ist eine naheliegende Frage, mit der sich Evolutionsbiologen konfrontiert sehen, die nach der dieser Variabilität zugrunde liegenden genetischen Quelle. Neben epigenetischen Mechanismen gibt es einen Disput darüber, ob regulatorische Sequenzen nahe des exprimierten Gens (cis-Faktoren) und anderswo im Genom kodierte Faktoren (trans-Faktoren) einen qualitativ und quantitativ unterschiedlichen Beitrag zur Variabilität der Genexpression liefern. Hierzu wählte ich ein Gen von D. melanogaster, das nachweislich konsistente Expressionsunterschiede zwischen afrikanischen und nicht-afrikanischen („kosmopolitischen“) Stämmen zeigt, und klonierte die entsprechenden stromaufwärts flankierend gelegenen Teile jeweils in ein bakterielles Reportergenkonstrukt, um – nach erfolgreicher Integration ins Fruchtfliegengenom – direkt die von ihnen gesteuerte Auswirkung auf die Genexpression zu vergleichen. Der beobachtete Effekt war klein, jedoch signifikant, und zeigte sich nur in transgenen Fliegen, die ein X-Chromosom des afrikanischen Ausgangsstammes besaßen. Dies legt den Schluss nahe, dass zusätzlich zu den cis-regulatorischen Faktoren auch noch trans-Faktoren (vor allem auf dem X-Chromosom) zu dem zwischen den Stämmen beobachteten Expressionsunterschied beitragen. Letztendlich untersuche ich in Kapitel 3 das Phänomen des Codon bias durch seinen Zusammenhang mit Genexpression. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes werden viele der proteinogenen Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert. Dies ermöglicht es, synonyme Codons in einer kodierenden Gensequenz auszutauschen, ohne dabei die Aminosäurensequenz des kodierten Polypeptids zu verändern. Ob dies Konsequenzen für die produzierte Proteinmenge hat (Translationseffizienz) ist Gegenstand dieses Kapitels. Ich verglich dabei die von zwei Allelen des Gens Alkoholdehydogenase (Adh) (von D. melanogaster) vermittelte Enzymaktivität direkt miteinander, welche sich in sieben Leucin-Codons unterschieden. Es ergab sich nahezu kein Unterschied in der ADH-Enzymaktivität, obwohl eines der Allele aus gänzlich optimalen Leucin-Codons bestand und das andere sieben suboptimale Leucin-Codons enthielt. Da Letzteres die Wildtypform von Adh war, legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass das Adh-Gen in seiner Leucin-Codonzusammensetzung (und vielleicht auch in seiner Codonzusammensetzung allgemein) bereits ausreichend optimiert ist. Weitere Versuche, die Zahl der optimalen Leucin-Codons zu erhöhen, können sogar einen Negativeffekt hinsichtlich der Enzymproduktion haben; dies möglicherweise aufgrund einer Sättigung des tRNA-Pools und/oder der Konsequenzen veränderter mRNA-Sekundärstrukturen.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Vektor (pGrec) zur Messung der homologen Rekombination (HR) in mitotischen Säugerzellen kloniert und etabliert. pGrec enthält eine HR-Kassette mit zwei Allelen des GFP (green fluorescent protein)-Gens, die durch differentielle Mutagenese inaktiviert wurden. Diese Allele können nur durch HR zu einem Wildtyp-Allel rekonstituiert werden, dessen zelluläre Expression mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachweisbar ist. Die Detektion mittels Durchflusszytometer erlaubt es, seltene GFP+-Zellen zu isolieren und als rekombinante Subklone zur weiteren molekularbiologischen, biochemischen und zellulären Analyse zu etablieren. Das pGrec-HR-Meßsystem wurde an zwei isogenen Zellpärchen angewendet. Nach chromosomaler Integration in die Nager-Zelllinien V79B und deren mutierte Variante CL-V4B (Rad51C(-/-) (Godthelp et al., 2002)) konnte die vermutete Störung der HR in den Rad51C-defizienten CL-V4B-Zellen (Masson et al., 2001; Takata et al., 2001; French et al., 2002; Godthelp et al., 2002) eindeutig nachgewiesen werden: Im Vergleich zur Wildtyp-Zelllinie V79B ist die intrachromosomale Rekombinationsfrequenz der HR-Kassette in der Rad51C-Mutante statistisch signifikant erniedrigt (6-fach). Ebenso scheint die Rate der homologen Rekombination in Fluktuations-Analysen reduziert zu sein (2,7-fach). Somit konnte erstmalig direkt eine Beteiligung von Rad51C an HR gezeigt werden, deren Störung mit der Mutagenüberempfindlichkeit (MMS) und chromosomalen Instabilität von CL-V4B-Zellen korreliert. Kultivierte Zellen von A-T-Patienten sind charakterisiert durch chromosomale Hyper-Rekombination (Meyn, 1993; Luo et al., 1996). Das pGrec-System wurde in AT-Zellen auf seine Anwendbarkeit zur Messung extrachromosomaler Rekombination getestet, um ungleiche Einflüsse der Chromatinstruktur an einem spezifischen Integrationsort zu umgehen. Das Zellpärchen AT-pEBS (Atm(-/-), transfiziert mit leerem Kontroll-Vektor) und AT-YZ (Atm(-/-), ATM ektopisch komplementiert (Ziv et al., 1997)) wurde mit der für humane Zellen episomalen Version des pGrec-Vektors transfiziert. Die Rekombinationsrate in zwei untersuchten Subklonen der AT-pEBS-Zelllinie war im Vergleich zu zwei AT-YZ-Subklonen statistisch signifikant erhöht (34 - 43-fach). Somit wäre erstmals eine Hyperrekombination von AT-Zellen auch in episomalen Loci gezeigt. Die Bestimmung der Rekombinationsfrequenz ergab jedoch, dass diese in der Gesamtpopulation ATM-komplementierter AT-Zellen erhöht zu sein scheint (6-fach). Mögliche Gründe für die unterschiedlichen Ergebnisse, die mit verschiedenen experimentellen Ansätzen in den AT-Zelllinien erhalten wurden, werden diskutiert. Das pGrec-System ist als leicht modifizierbarer Vektor konzipiert und somit prinzipiell in allen Säugerzellen anwendbar. Insgesamt stellt pGrec also ein sehr sensitives und nützliches Werkzeug zur Charakterisierung von HR auf molekular-biologischer, biochemischer und zellulärer Ebene dar.

Der isolierte 3-Methylcrotonyl-CoA: Carboxylase (MCC) Mangel ist eine angeborene Störung im Abbau der Aminosäure Leucin. Es sind sowohl bis ins Erwachsenenalter asymptomatische als auch frühe letale Verläufe beschrieben. Die Ursachen des variablen Phänotyps sind nicht verstanden. Das Enzym ist zusammengesetzt aus α- und β - Untereinheiten. Die kodierenden humanen Gene MCCA und MCCB wurden kürzlich in unserer Arbeitsgruppe kloniert. Die Erweiterung des Neugeborenen-Screenings mittels Tandem-Massenspektrometrie in Bayern erbrachte die überraschende Erkenntnis, daß der MCC Mangel wahrscheinlich die häufigste organische Azidämie (etwa 1 : 40 000) darstellt und asymptomatische Mutationsträger existieren. Über Risiko und Prognose dieser metabolischen Störung ist derzeit noch keine Aussage möglich. In dieser Arbeit sollte daher eine Methode zur molekulargenetischen Charakterisierung von Patienten mit MCC Mangel etabliert werden, um den prognostischen Wert des Genotyps studieren und damit die Beratung und Betreuung der betroffenen Familien verbessern zu können. Es wurden 3 asymptomatische Patienten aus dem Neugeborenenscreening sowie ein Patient, der mit cerebralen Krampfanfällen aufgefallen war, untersucht. Die Diagnose war bei allen Patienten durch Bestimmung der typischen Metabolite in Urin (3-Hydroxyisovaleriansäure und 3- Methylcrotonylglycin) und Blut (3-Hydroxyisovaleryl-Carnitin) gestellt worden. Für die molekulargenetische Diagnostik des MCC Mangels wurde die Mutationsanalyse auf genomischer und cDNA Ebene für MCCA und MCCB etabliert. Es wurden zwei Patienten mit veränderten Allelen im MCCA- und zwei Patienten mit Mutationen im MCCB-Gen identifiziert. Ein Patient war compound-heterozygot für die Missense-Mutation S535F (1604C>T) und die Nonsense-Mutation V694X (2079delA) im MCCA Gen. Bei einem zweiten Patienten wurde S535F (1604C>T) heterozygot nachgewiesen. Ein Patient mit konsanguinen Eltern war homozygot für die Missense-Mutation S535F (1604C>T). Ein weiterer wies die Missense-Mutation E99Q (295G>C, cDNA: homozygot; gDNA: heterozygot) mit einen Allelverlust auf. In zwei Fällen werden zusätzliche Mutationen in der Promotorregion bzw. in einem Intron angenommen. Für alle gefundenen Mutationen kann von phänotypischer Relevanz ausgegangen werden. Drei davon waren bisher unbekannt und wurden von uns erstbeschrieben. Unsere Ergebnisse bestätigen die Rolle von MCCA und MCCB azielführende Methode zur molekulargenetischen Charkterisierung von Patienten mit MCC Mangel dar und bildet damit die Grundlage für Expressionsstudien und Studien zur Untersuchung der Genotyp-Phänotypkorrelation.ls humane Krankheitsgene. Die hier etablierte Mutationsanalyse stellt eine

Das Zytomegalievirus der Maus (MCMV) zählt zur Familie der Herpesviridae und hat verschiedene Strategien entwickelt, um dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Einer dieser Mechanismen beeinflusst die Antigenpräsentation durch MHC-Klasse-I-Moleküle und wird durch das virale Genprodukt von m152 vermittelt. Dieses kodiert für ein Glykoprotein von 40 kDa Größe und wird in dieser Arbeit m152/gp40 genannt. M152/gp40 blockiert den Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen zur Zelloberfläche und erkennt nur Moleküle der Maus, nicht aber des Menschen. Diese speziesspezifische Erkennung von MHC-Klasse-IMolekülen ist bisher nur für m152/gp40 bekannt und es wurden daher in der vorliegenden Arbeit Eigenschaften von MHC-Klasse-I-Molekülen untersucht, welche diese Speziesspezifität begründen. Es konnte gezeigt werden, dass die Spezies des gebundenen ß2- Mikroglobulins, sowie die Anzahl der Glykosylierungen der schweren Kette keinen Einfluss auf die Erkennung von MHC-Klasse-I-Antigenen durch m152/gp40 haben. Die Eigenschaft von m152/gp40, MHC-Klasse-I-Moleküle des Menschen nicht zurückzuhalten, wurde genutzt, um mit Hilfe chimärer MHC-Klasse-I-Moleküle den Bereich, der von m152/gp40 erkannt wird, einzugrenzen. Dieser liegt hauptsächlich in der a1-Domäne, weil die a2- Domäne nur eine schwache Retention bewirkt. Zwar können MHC-Klasse-I-Moleküle, die nur den luminalen Bereich umfassen, von m152/gp40 zurückgehalten werden, doch akkumulieren diese im ER und nicht im „ER-Golgi intermediate compartment“ (ERGIC) / cis-Golgi, wie Wildtyp-H-2Kb. Es wird diskutiert, ob dies ein Hinweis auf einen aktiven Transportmechanismus von MHC-Klasse-I-Molekülen aus dem ER ins ERGIC ist. Neben der Untersuchung der Funktion von m152/gp40 aufgrund der Expression des Gens allein, wurde der Einfluss der drei viralen Genprodukte von m04, m06 und m152 auf die MHC-Klasse-I-Oberflächenexpression mit Hilfe von MCMV-Deletionsmutanten untersucht. Anhand der Analyse der Oberflächenexpression verschiedener MHC-Klasse-I-Allele nach Infektion mit Wildtyp-MCMV oder MCMV-Mutanten konnte gezeigt werden, dass in MCMV nur m06/gp48 und m152/gp40 die Oberflächenexpression von MHC-Klasse-IMolekülen reduzieren. Von den untersuchten Allelen werden H-2Kb und H-2Kk nur schwach zurückgehalten. Es wurde gezeigt, dass dies auf die Funktion von m04/gp34 zurückzuführen ist, wobei m04/gp34 generell die Funktion von m152/gp40 und kaum die Funktion von m06/gp48 behindert. Für weitere Allele konnte gezeigt werden, dass diese unterschiedlich stark von den einzelnen viralen Proteinen zurückgehalten werden. So wird H-2Dd nur von m06/gp48 und m152/gp40 gemeinsam gut zurückgehalten, wohingegen H-2Db von m152/gp40 alleine gut zurückgehalten wird. Eine mögliche Rolle der unterschiedlichen Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Allelen nach MCMV-Infektion für die Inhibition von NK-Zellen wird diskutiert.