Podcasts about lysosomen

Morbus Fabry wird X-chromosomal vererbt und führt durch einen Defekt des lysosomalen Enzyms α-Galaktosidase A zu einer Störung im Glykosphingolipid-Katabolismus. Neutrale Glykosphingolipide, v.a. Gb3 (Globotriaosylceramid), akkumulieren in Lysosomen verschiedenster Gewebe. Mit zunehmender Ablagerung dieser Stoffe im Gefäßendothel und in den Organen kommt es zur Ausprägung der Krankheitssymptome. In der Kindheit beginnt die Erkrankung häufig mit Akroparästhesien und Angiokeratomen. Im weiteren Verlauf treten dann die lebenslimitierenden Manifestationen dieser Erkrankung auf, wie terminale Niereninsuffizienz und, durch Ischämie- und Infarktereignisse, Myokardinfarkt und zerebrale Ischämie. Im Gegensatz zur überwiegenden Mehrzahl anderer X-gebundener Erkrankungen zeigen bei Morbus Fabry nahezu alle heterozygoten Mutationsträgerinnen im Laufe der Zeit klinische Manifestationen dieser Erkrankung, teils in gleich schwerer Form wie männliche Patienten. Da bisherige Hypothesen davon ausgingen, dass eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des mutierten GLA-Allels am Auftreten von Symptomen bei heterozygoten Fabry-Mutationsträgerinnen beteiligt sei, wurden die X-Inaktivierungsmuster von durch Mutationsanalyse gesicherten Morbus Fabry-Patientinnen mit Hilfe des Androgenrezeptor-Tests untersucht. Bei diesem Assay wird genomische DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen inkubiert. Diese verdauen nur die unmethylierte DNA des aktiven X-Chromosoms, so dass in der anschließenden PCR-Amplifikation eines hochpolymorphen CAG-Repeats im Exon 1 des Androgenrezeptor-Gens lediglich Allele des inaktiven X-Chromosoms amplifiziert werden. Nach der automatisierten Auswertung mittels Fragmentanalyse, ermöglicht durch einen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten PCR-Primer, zeigt das Verhältnis der zwei Androgenrezeptor-Allele zueinander die relative Häufigkeit eines jeden Allels auf dem aktiven oder inaktiven X-Chromosom in den Zellen des untersuchten Materials. Erstmals wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die X-Inaktivierungsmuster heterozygoter Mutationsträgerinnen von Morbus Fabry im Vergleich zu einem nichtverwandten Kontrollkollektiv untersucht. 13 (46%) der 28 Fabry-Mutationsträgerinnen zeigten eine random X-Inaktivierung, 10 (36%) eine moderate Verschiebung der X-Inaktivierung und 5 (18%) eine ausgeprägte Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten eines Allels. Es zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied zu den Inaktivierungsmustern gleichaltriger Kontrollen (p = 0,669). Segregationsanalysen konnten anhand der Familien von sechs Frauen mit ausgeprägter oder moderater Verschiebung der X-Inaktivierung durchgeführt werden. Hier zeigte sich bei vier dieser Frauen eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des Wildtyp GLA-Allels, während bei zwei weiteren eine Verschiebung zugunsten des mutierten Allels in Leukozyten erkennbar war. Bei jeder der Fabry-Patientinnen war sowohl der klinische Schweregrad der Erkrankung mittels MSSI (Mainz Severity Score Index), einem detaillierten Scoring-System für Morbus Fabry, als auch die Enzymaktivität der α-Galaktosidase A bestimmt worden. Eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der X-Inaktivierung in Leukozyten heterozygoter Fabry-Mutationsträgerinnen und deren klinischen oder biochemischen Krankheitsparametern konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass heterozygote Fabry-Patientinnen random X-Inaktivierungsmuster ähnlich denen gesunder Frauen aufweisen. Anhand unserer Daten konnte nicht belegt werden, dass das Auftreten und der Schweregrad der Erkrankung bei der Mehrzahl der heterozygoten Fabry-Patientinnen auf eine Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten des mutierten Allels als Pathomechanismus zurückzuführen ist. X-Inaktivierungsstudien können jedoch dazu beitragen, jene Frauen frühzeitig herauszufiltern, welche aufgrund einer bei ihnen möglicherweise rascher progredient verlaufenden Erkrankung von einer sehr teuren Enzymersatztherapie am meisten profitieren könnten.

Die Stoffwechselkrankheit Morbus Pompe ist eine seltene autosomal-rezessiv vererbte, multisystemische lysosomale Speichererkrankung. Ursächlich für die Krankheit sind Mutationen im Gen GAA (Chromosom 17), das für das Enzym saure α-Glukosidase kodiert. Dieses Enzym setzt normalerweise Glukose aus Glykogen in Lysosomen frei. Ein Mangel dieses Enzyms, das bei Gesunden in allen Geweben aktiv ist, führt zu Strukturveränderungen in Muskulatur, Leber, Herzmuskel, Gefäßsystem und Nervensystem und damit zu einem breiten und heterogenen Spektrum an klinischen Symptomen. Die schwere juvenile Verlaufsform mit hypertropher Kardiomyopathie und ausgeprägter Muskelschwäche führt in den ersten beiden Lebensjahren zum Tod, die mildere adulte Form beginnt erst im Erwachsenenalter und führt zu progredienter Muskelschwäche und respiratorischer Insuffizienz. Die verschiedenen Verläufe sind abhängig von der verbleibenden Enzymaktivität. Unbehandelt verläuft die Erkrankung progredient in unterschiedlicher Schnelligkeit und Ausprägung. Seit 2006 kann der Morbus Pompe durch eine Enzymersatztherapie mit Alglucosidase-alfa behandelt werden. In einer offenen klinischen nicht-verblindeten Beobachtungsstudie wurde an 7 deutschen Zentren die Wirksamkeit und Verträglichkeit dieser Enzymersatztherapie über einen Zeitraum von drei Jahren untersucht. An der Studie teilgenommen haben 38 adulte gesichterte Morbus Pompe Patienten mit variabler Ausprägung der Krankheit. Zur Verifizierung der Therapieauswirkung wurden die Patienten vor und nach jeweils 12 Monaten Enzymersatztherapie je 11 Untersuchungen unterzogen, die aus Muskelfunktions- und Kraftmessungen sowie Lungenfunktion, Serum-Kreatininkinase-Messung, einem Fragebogen zur Erfassung der Lebensqualität, einem Schmerzfragebogen und einer Bestimmung der Antikörpertiter bestanden. Bei den meisten Tests zeigten sich keine signifikanten Veränderungen im Verlauf der drei Jahre. Ausnahmen waren der 6-Minuten Geh-Test, der SF36 und die Serum-Kreatinkinase. Mit länger dauernder Therapie entwickeln nahezu alle Patienten Antikörper gegen das therapeutische Enzym, trotzdem zeigen die wenigsten anaphylaktische Reaktionen. Die klinischen Testergebnisse aus dieser 3-Jahres-Studie sowie auch die Ergebnisse anderer Studien deuten insgesamt auf eine Stabilisierung der neuromuskulären Funktion mit milden funktionellen Verbesserungen hin. Da der natürliche Verlauf progredient ist, ist eine Stabilisierung mit teilweiser Tendenz zur Verbesserung für die Patienten ein Therapieerfolg. Da diese Therapie lebenslang durchgeführt werden muss, sind weitere Studien über einen längeren Verlaufszeitraum nötig.

Cathepsine sind lysosomale Cysteinproteasen, die neben der allgemeinen Proteindegradation in Lysosomen auch spezifische Funktionen ausüben, die eine limitierte Proteolyse erfordern. Zudem werden Cathepsine sezerniert, weshalb man sie auch im Extrazellulärraum findet, wo sie ebenfalls an verschiedenen biologischen Vorgängen, wie etwa der Zellmigration/Invasion, teilnehmen. Über Cathepsin X, einen relativ neu entdeckten Vertreter dieser Proteinklasse, war zu Beginn der Promotionsarbeit noch wenig bekannt. Die Struktur und das Aktivitätsprofil konnten zwar bereits gelöst werden, über mögliche (patho-)physiologische Funktionen gab es jedoch noch keine Erkenntnisse. Das Hauptziel meiner Untersuchungen war daher, mittels geeigneter Methoden nähere Aufschlüsse über die Rolle von Cathepsin X oder seiner Proform innerhalb und außerhalb der Zelle zu erlangen. Dies sollte vorwiegend durch die Analyse der Expression und Sekretion dieser Protease, sowie durch das Auffinden von Interaktionspartnern erfolgen. Wie sich in Vorversuchen zeigte, wird Cathepsin X in humanen Leukozyten unterschiedlich stark exprimiert. Da eine hohe Expression insbesondere in Monozyten vorlag, wurde für weitere Analysen das Zellmodell THP-1 eingesetzt, das auch für die Differenzierung zu Makrophagen-ähnlichen Zellen durch Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) oder all-trans Retinsäure (ATRA) verwendet werden kann. Interessanterweise zeigten diese Agenzien unterschiedliche Auswirkungen auf die Expression und Sekretion von Cathepsin X. So wurde mit PMA eine starke intra- und extrazelluläre Erhöhung der Protease verzeichnet, während mit ATRA das Gegenteil der Fall war. Da eine differenzielle Expression von Cathepsin X in Leukozyten auf eine mögliche Funktion in der Entzündungsantwort hindeutet, schien eine Untersuchung der Wirkung von proinflammatorischen Zytokinen und extrazellulären Matrix (EZM)-Proteinen sinnvoll, weil diese Faktoren ebenfalls die Sekretion von Proteasen beeinflussen können. Die untersuchten Zytokine hatten allerdings keinen Effekt auf die Sekretion von Cathepsin X aus THP-1-Zellen, wohingegen mit dem EZM-Protein Vitronektin eine Verdopplung der Cathepsin-X-Konzentration im Medium beobachtet wurde. In diesem Kontext konnte nachgewiesen werden, dass Vitronektin durch die Interaktion mit dem Zelloberflächenrezeptor Integrin avb3 den Sekretionsapparat der Zelle beeinflusst, wobei offensichtlich das Sequenzmotiv Arginin-Glyzin-Aspartat (RGD), welches in Vitronektin enthalten ist, für diesen Vorgang entscheidend ist. Neben Cathepsin X wurde auch für die Cathepsine B und L eine erhöhte Freisetzung nach Inkubation mit Vitronektin gemessen, was zeigt, dass dieser durch das EZM-Protein ausgelöste Mechanismus nicht auf Cathepsin X beschränkt ist. Umgekehrt ließ sich in einem weiteren Zellmodell (HUVEC) durch den Einsatz von „small-interfering RNA“ (siRNA) die Expression von Cathepsin X erniedrigen, was zu einer verminderten Migration der HUVEC in einem Invasionsversuch führte. Dies deutet auf eine Funktion von Cathepsin X in der Zellmotilität hin. Weil Cathepsin X, ähnlich wie Vitronektin, ein exponiertes RGD-Motiv in seiner Proregion aufweist, sollte nun eine mögliche Interaktion mit Integrinen untersucht werden. Tatsächlich ließ sich eine RGD-abhängige Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 zeigen. Somit werden in dieser Arbeit zwei wesentliche neue Aspekte in der Regulation der Sekretion und seiner Beteiligung an Migrationsvorgängen gezeigt, wobei die Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 eine besondere Rolle zu spielen scheint. Ob diese beiden Vorgänge miteinander gekoppelt sind, konnte mit den bisherigen Ergebnissen noch nicht bewiesen werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse jedoch darauf hin, dass extrazelluläres (Pro)Cathepsin X neben seiner Rolle als Protease auch nicht-proteolytische Funktionen, beispielsweise als Ligand bestimmter Zelloberflächenstrukturen ausüben kann. Dieser Aspekt könnte im Hinblick auf eine therapeutische Inhibition von Angiogenese und Metastasierung von Tumorzellen durch Antikörper gegen Cathepsin X und/oder Integrine von großem Nutzen sein.

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert. Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten, wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt, wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog. fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend, zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden. WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln. Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog. mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al., 1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden: Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac. Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1 erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich Lysosomen zur Degradierung zugeführt.

Das 1914 als erstes durch Albert Niemann beschriebene, später als Niemann-Pick-Erkrankung bezeichnete Krankheitsbild, wird zu den Sphingomyelolipidosen gerechnet und umfasst eine seltene heterogene Gruppe von autosomal rezessiv vererbten Erkrankungen. Beim Typ A und B handelt es sich um eine familiär gehäufte, insbesondere in der jüdischen Bevölkerung auftretende Erkrankung, die durch einen auf Chromosom 11 liegenden Gendefekt, der eine vermin-derte ASMase-Aktivität zur Folge hat, bedingt ist. Die ASMase katalysiert den Abbau des Sphingomyelins zu Ceramid und Phosphocholin. Bei einem Mangel dieses Enzyms ist die Speicherung von Sphingomyelin im mononukleären Makrophagensytem vor allem im ZNS, der Milz, Leber und im Knochenmark charakteristisch. Beim Typ C und D dagegen liegt eine intrazelluläre Cholesterintransportstörung vor, die durch ein Fehlen des NPC1- bzw. NPC2-Proteins in den Endo- bzw. Lysosomen verursacht wird. Der Gendefekt, der zu einer NPC1-Erkrankung führt, ist auf Chromosom 18 lokalisiert. Da die ursächliche Störung des Typ D auch auf dem gleichen Chromosom liegt, handelt es sich beim Typ D um eine allelische Variante des NPC1. Der Gendefekt, der eine NPC2-Erkrankung bedingt, ist auf Chromosom 14 zu finden. Alle Subtypen sind durch die pathologische Anhäufung von Cholesterin und Sphingomyelin in den Lysosomen des ZNS, der Milz und der Leber, die in den meisten Fällen mit einer sekundär verminderten ASMase-Aktivität einhergeht, gekenn-zeichnet. Bei der Untersuchung von Patienten-Gewebezellen mit Verdacht auf Morbus Niemann-Pick sind wir in mehreren Schritten vorgegangen. Im ersten Schritt bestimmten wir die ASMase-Aktivität. Dazu verbesserten wir die in unserem Labor schon mit dem künstlichen Substrat HNP durchgeführte Aktivitätsbestimmung und führten zusätzlich eine radioisotopische Methode mit 14C-Sphingomyelin als Substrat ein. Mit beiden Methoden wurden die kinetischen Eigenschaften des Enzyms und der Aktivitätsbereich in verschiedenen Geweben und Zellen erarbeitet. Ein Vergleich der so ermittelten Aktivitäten in Patientenfibroblasten zeigte bei einem Typ-B-Patienten radioisotopisch eine Restaktivität von weniger als 10 % und spektrophoto-metrisch eine im Normbereich liegende Aktivität. Obwohl beide Methoden einfach und schnell durchführbar sind, ist die radioisotopische Methode der spektrophotometrischen vorzuziehen, um das Auftreten falsch negativer Resultate zu vermeiden. Dies ist durch das bei bestimmten Mutationen entstehende defekte Enzymprotein mit höherer Substrataffinität zum künstlichen Substrat und damit falsch hoher Enzymaktivität zu erklären. Von den in fünf NP-C-Patienten-fibroblasten bestimmten ASMase-Aktivitäten hatten vier eine partiell verminderte Aktivität. Eine sichere Diagnose der fünf NPC-Verdachtsfälle wurde durch eine Reihe von Verfahren, die wir erstmals in unserem Labor etablieren konnten, ermöglicht. Zunächst erfolgte der Nachweis einer Cholesterin-Akkumulation in den Lysosomen durch eine Immunfluoreszenzfärbung mit Filipin, einem Makrolid-Antibiotikum, das spezifisch 3β-Hydroxysterole bindet. Bei einem positiven Färberergebnis bestimmten wir die in vitro ASMase-Aktivität. Dazu wurde durch Kultivierung der Fibroblasten in cholesterinentzogenem (LPDS = - FBS) bzw. reichem (+ FBS) Medium eine Cholesterin-Akkumulation simuliert. Mit dieser Methode ist aufgrund der charakteristischen sekundär verminderten ASMase-Aktivtät in NP-C-Zellen nach Bebrütung in cholesterinreichem Medium eine sehr sensitive und spezifische Diagnose pathologischer Zellen möglich. Eine phänotypische Klassifikation der NP-C-Zellen erforderte die Durchführung der Oleat-Inkorporationsmethode. Es gelang uns drei Patienten mit klassischem und zwei mit einem varianten Phänotyp zu diagnostizieren. Als Letztes bestimmten wir die zytoplasmatische CEHase-Aktivität in NPD- und Kontrollfibroblasten im leicht alkalischen Bereich. Erstaunlicherweise lieferte diese Messung eine verminderte Aktivität in drei NP-C-Fibroblasten, die bisher in der Literatur nicht beschrieben wurde. Es ist auch keine Erkrankung mit diesem Enzymmangel bekannt. Deshalb nehmen wir an, dass zusätzlich zu den Mutationen der NPC-Proteine bei manchen Patienten eine weitere Mutation entweder auf Chromosom 18 bzw. 14 oder in einem bisher noch nicht identifizierten Gen liegen muss. Durch die Etablierung dieser empfindlichen Methoden zur Bestimmung der ASMase-Aktivität und zum Nachweis einer intrazellulären Cholesterintransportstörung war es uns möglich, erstmals in unserem Labor zehn Patienten mit Niemann-Pick Erkrankung, davon zwei Typ A, drei Typ B und fünf Typ C, mit großer Sicherheit zu diagnostizieren. Unsere Untersuchungsverfah-ren erwiesen sich als mit verhältnismäßig geringem Aufwand durchführbar und günstiger als die bisher durchgeführten Methoden. Zur Diagnosestellung reicht eine Hautbiopsie in den meisten Fällen aus, so dass den kleinen Patienten eine invasive Diagnostik erspart werden kann.

Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf MHC-Klasse-II-Molekülen ist von zentraler Bedeutung für eine Reihe immunologischer Prozesse. Die diesem Präsentationsweg zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum Verständnis der molekularen Abläufe zu leisten, die an diesem endogenen MHC-Klasse-II-Präsentationsweg beteiligt sind. Am Beispiel des zytoplasmatischen/nukleären Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase (NeoR) und eines Modellantigen-spezifischen, MHC-Klasse-II-restringierten CD4+ T-Zell Klons wurde der endogene Präsentationsweg in nicht-professionellen und professionellen antigenpräsentierenden Zellen untersucht. Eine Beteiligung von Schlüsselkomponenten des MHC-Klasse-I-Präsentationsweges konnte durch die Verwendung chemischer und biologischer Inhibitoren ebenso ausgeschlossen werden, wie eine vorzeitige Beladung von neu-synthetisierten MHC-Klasse-II-Molekülen im endoplasmatischen Retikulum. Dagegen erwies sich die endogene Präsentation des Modellantigens abhängig von endosomaler/lysosomaler Prozessierung. Durch biochemische und zellbiologische Methoden konnte nachgewiesen werden, daß das Antigen als intaktes Protein in Endosomen/Lysosomen gelangt. Eine mögliche Sekretion des Antigens und anschließende Wiederaufnahme in endosomale Kompartimente konnte durch Zellkulturüberstand- Transferexperimente als Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Durch Inhibitor-Studien und der Beschreibung der Endosomen als Eintrittsort des Antigens in das endosomale/lysosomale System konnte gezeigt werden, daß ein Signalsequenz-vermittelter Import in Lysosomen durch Hitzeschockproteine nicht als Mechanismus in Frage kommt. Dagegen wies die Expression Autophagie-assoziierter Proteine in den verwendeten Zellinien auf eine mögliche Beteiligung dieses zytoplasmatischen Abbauvorganges an der Präsentation des Antigens hin. Eine Inhibition der Autophagie führte zu einer Stabilisierung und Anreicherung des Proteins im Zytoplasma sowie zu einer verminderten Aufnahme des Antigens in das endosomale/lysosomale Kompartiment. Die verminderte Aufnahme korrelierte mit einer starken Abnahme der MHC-Klasse-II-restringierten Präsentation des Antigens. Diese Ergebnisse identifizieren Autophagie am Beispiel des Modellantigens NeoR als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentation.

Cytomegaloviren, die, wie alle Herpesviren, persistente Infektionen in ihren Wirten etablieren, haben Mechanismen entwickelt, um einer Elimination durch das Immunsystem zu entgehen. Alle bisher untersuchten Herpesviren interferieren mit der MHC-Klasse-I-restringierten Antigenpräsentation. Murines Cytomegalovirus verfügt neben der m152-vermittelten Retention von MHC-Klasse-I-Molekülen im ERGIC/cis-Golgi über weitere Mechanismen, den Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen an die Plasmamembran zu verhindern (Thäle et al., 1995; Ziegler et al., 1997). In der vorliegenden Arbeit konnte das MCMV Glykoprotein gp48, welches durch das in der early Phase der Infektion exprimierte Gen m06 kodiert wird, als weiteres MHC-Klasse-I-reaktives Protein identifiziert werden. Zellen, die das Gen m06 stabil exprimieren, weisen eine stark verminderte Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Molekülen auf, und sind dadurch in ihrer Fähigkeit, Peptide gegenüber CD8+ cytotoxischen T-Zellen zu präsentieren, beschränkt. Das Typ I Transmembranprotein gp48 bindet im Endoplasmatischen Retikulum (ER) an neu-synthetisierte b2-Mikroglobulin-assoziierte MHC-Klasse-I-Moleküle, wobei eine Peptidbeladung der Komplexe nicht erforderlich ist. Die gp48/MHC-Klasse-I-Komplexe verlassen das ER und werden durch den Golgi-Apparat in ein Lamp-1+ Kompartment, höchst wahrscheinlich in die Lysosomen, transportiert und dort rasch abgebaut. Die Degradation ist sensitiv gegenüber verschiedenen endosomalen/lysosomalen Inhibitoren. Eine Hemmung führt zur Akkumulation von komplex glykosylierten MHC-Klasse-I- und gp48 Molekülen, die sich resistent gegenüber Endoglykosidase H verhalten. Gp48 Moleküle, welche nicht mit MHC-Klasse-I-Komplexen assoziiert sind, werden nicht in die Lysosomen transportiert, sondern durch das Proteasom abgebaut. Das virale Glykoprotein gp48 kann in eine MHC-Klasse-I-bindende Domäne und eine Transportdomäne unterteilt werden. Der gerichtete Transport der MHC-Klasse-I/gp48- Komplexe in die Lysosomen wird durch ein di-Leucin-Motiv im cytoplasmatischen Anteil von gp48 vermittelt. Eine Deletion des gesamten cytoplasmatischen Anteils bzw. eine Mutation des Membran-proximalen di-Leucin-Motivs führt zur Wiederherstellung der MHC-Klasse-I Oberflächenexpression, ohne die gp48/MHC-Klasse-I-Assoziation zu beeinflussen. Für die Bindung von gp48 an MHC-Klasse-I-Moleküle ist die luminale Domäne ausreichend, sofern diese in membranverankerter Form vorliegt. Die direkte Bindung an MHC-Klasse-I-Moleküle über die luminale Domäne von MCMV gp48 und der gerichtete Transport, vermittelt über ein di-Leucin-Motiv im cytoplasmatischen Anteil von gp48, stellt einen neuartigen viralen Immunevasionsmechanismus dar, die MHC-Klasse-Irestringierte Antigenpräsentation zu verhindern.

Mon, 1 Jan 1973 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/7129/1/7129.pdf Remmer, Herbert; Gratzl, Manfred; Betz, Heinrich ddc:610, Medizin