Podcasts about rho gtpasen

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert. Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten, wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt, wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog. fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend, zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden. WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln. Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog. mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al., 1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden: Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac. Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1 erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich Lysosomen zur Degradierung zugeführt.

Pathogene Yersinien injizieren während einer Infektion über ihr TypIII-Sekretionssystem bakterielle Moduline, sogenannte Yops, in Immunzellen, um das Immunsystem zu stören. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass die injizierten Yersinia enterocolitica-Moduline YopE und YopT das Aktinzytoskelett angreifen. Mit dem Ziel der näheren Charakterisierung der zugrunde liegenden Mechanismen wurde insbesondere der Effekt von Y. enterocolitica-YopE auf aktinregulierende Signaltransduktionswege in menschlichen Endothelzellen (HUVEC) untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Yersinia-Stamm hergestellt, welcher YopE als einzigen Effektor transloziert. Mit diesem Stamm infizierte ruhende HUVEC zeigten eine Veränderung des Aktinzytoskeletts ähnlich wie nach Mikroinjektion von dominant negativem N17Rac, was auf eine Inaktivierung von Rac hindeutete. Zur weiteren Untersuchung wurden in infizierten Endothelzellen durch extrazelluläre Stimuli einzelne Rho-GTPasen aktiviert und die dabei ausgebildeten Aktinstrukturen beobachtet. Dabei ergab sich keine Beeinträchtigung der Neubildung CDC42- und Rho-vermittelter Aktinstrukturen (Filopodien und Stressfasern) durch YopE, jedoch eine spezifische Hemmung Rac-induzierter Lamellipodien. Frühere Untersuchungen hatten demonstriert, dass es sich bei YopE um ein sogenanntes GAP („GTPase activating protein“) handelt, welches in vitro die Proteine Rho, Rac und CDC42 hemmt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass in Endothelzellen transloziertes YopE höchst selektiv auf die Ras-ähnliche GTPase Rac wirkt, jedoch keinen Effekt auf CDC42 oder Rho ausübt. Diese Ergebnisse zeigen, dass YopE von Yersinia Rho- GTPase-abhängige Signaltransduktionswege mit einer bemerkenswerten Spezifität in primären Zielzellen beeinflussen kann. Überdies wurde die genannte Spezifität auch in primären Makrophagen nachgewiesen. Weiterhin zeigte sich im HUVEC-Infektionsversuch, dass die Hemmung der typischerweise Rho-vermittelten Aktin-Stressfasern YopT-abhängig ist. Morphologische Veränderungen von Aktinstrukturen, wie sie typischerweise bei der Unterbrechung von CDC42- oder Racvermittelten Signalen vorkommen, wurden nicht beobachtet. In Zusammenhang damit konnte gezeigt werden, dass genannter Effekt auf eine chemische Modifikation und folgliche Inaktivierung von RhoA zurückzuführen ist (Zumbihl et al., 1999). Damit unterscheiden sich YopT und YopE in ihrem Wirkmechanismus und spezifischen Zielmolekül, greifen andererseits jedoch beide direkt an Rho-GTPasen an. Sie könnten deshalb synergistisch bei der Pathogenität von Y. enterocolitica wirken. Darüber hinaus könnten YopE und YopT aufgrund ihrer Spezifität zukünftig als wertvolle Hilfsmittel zur Untersuchung zellulärer Regulationsvorgänge dienen

Podosomen sind aktinreiche Strukturen des Zytoskeletts primärer humaner Makrophagen. Für Adhäsion, Polarisation und Chemotaxis sind diese Strukturen von essentieller Bedeutung. Ihr ständiger Umbau und ihre Regulation unterliegt einer fein abgestimmten Balance der Rho GTPasen Rho, Rac und Cdc42. Pathogene Yersinien spp. haben Aktinzytoskelett von Wirtszellen durch Modulation von Rho GTPasen als Angriffsobjekt gewählt. Mit ihrem plasmidkodierten Typ III Sekretions- und Translokationsapparat werden wichtige Immunfunktionen paralysiert. In dieser Arbeit wurde in primären humanen Makrophagen der Einfluss von Yersinien-Effektoren auf Podosomen untersucht. Konkret interessierte die Frage, welchen Effekt YopE auf diese Strukturen hat. Hierzu wurden in einem standardisierten Verfahren gewonnene und gereinigte Makrophagen gesunder Spender mit unterschiedlichen Mutanten der Spezies Yersinia enterocolitica für verschiedene Zeiten infiziert. Nach Färbung der Zellen mit Rhodamin-Phalloidin wurde die Anzahl der verbliebenen Zellen mit Podosomen im konfokalen Mikroskop ermittelt und statistisch ausgewertet. Es konnte erstens gezeigt werden, daß ein voll virulenter Yersinien Stamm in der Lage ist, nach einer Infektion von bereits 30 min die podosomalen Strukturen der Makrophagen vollkommen zu zerstören. Zweitens sind an diesem Effekt verschiedene Yersinien-Effektoren und zusätzlich der Typ III Sekretions- und Translokationsapparat beteiligt. Drittens reicht YopE für die Zerstörung von Podosomen alleine aus. Viertens ist die GAP-Aktivität von YopE für die Destruktion von Podosomen nicht notwendig und lässt auf GAP-unabhängige Mechanismen von YopE schliessen. Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten, daß YopE ein wichtiger aber nicht der alleinige Effektor der Yersinien bei der Paralyse von menschlichen Makrophagen und insbesondere der Zerstörung podosomaler Adhäsionsstrukturen ist.