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Die Familie der Sorting Nexine (SNX) umfasst 33 bekannte Mitglieder, jedoch ist der Funktionsmechanismus vieler Sorting Nexine bislang nicht aufgeklärt. Auf der Suche neuer Modulatoren der βAPP-Proteolyse konnte im Rahmen eines Expressionsklonierungs-Screens (Schobel et al., 2006) ein bislang nicht beschriebenes Protein, Sorting Nexin 33 (SNX33), als Aktivator der βAPP-Proteolyse identifiziert werden. SNX33 ist ein phosphoryliertes Protein, das ubiquitär exprimiert wird und zudem eine hohe Homologie zu den Proteinen SNX9 und SNX18 aufweist. SNX33 ist im Zytosol lokalisiert, kann jedoch auch Membran-assoziiert vorliegen. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression von SNX33 zu einer Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose und in Folge dessen zu einer etwa 50% -igen Reduktion der βAPP-Endozytose führt. Die von SNX33 induzierte Endozytosehemmung wird durch die SH3-Domäne des Proteins vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführte Koimmunpräzipitationsstudien zeigten, dass SNX33 mittels seiner SH3-Domäne mit Dynamin interagiert und auf diese Weise möglicherweise dessen Funktion moduliert. In Übereinstimmung mit den durchgeführten Zellkultur-Experimenten führte eine Überexpression von SNX33 im Modellorganismus Caenorhabditis elegans ebenfalls zu einem Dynamin-Funktionsverlust. Da SNX33 Expression zu einer generellen Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose führt, handelt es sich dabei nicht um einen spezifischen βAPP-Modulator. Konsequenz einer reduzierten βAPP-Internalisierung ist eine starke Zunahme der neurotrophen sAPPα-Bildung sowie - je nach verwendeter Zelllinie - ein leichter Anstieg bzw. eine geringe Reduktion der pathogenen sAPPβ-Generierung. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression der homologen Proteine SNX9 und SNX18 ebenfalls zu einer Zunahme der βAPP-Spaltung führt. Es handelt sich also um einen Effekt, der von der ganzen Sorting Nexin-Subgruppe (SNX33/SNX9/SNX18) vermittelt wird. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass diese Funktion innerhalb dieser Subgruppe konserviert ist. Transfektion von SNX1 führte zu keiner Änderung der βAPP-Proteolyse, was bedeutet, dass dieser Effekt nicht von der gesamten Sorting Nexin-Familie vermittelt wird. Interessanterweise ist die Spaltung von βAPP besonders sensitiv bezüglich einer veränderten Endozytose-Rate, da die Proteolyse der Transmembranproteine L-Selektin und des Tumornekrosisfaktor-Rezeptors 2 (TNFR2) unter SNX33 Überexpressionsbedingungen nicht signifikant verändert war. Ein siRNA-vermittelter Knock-Down von SNX33 führte zu keiner generellen Endozytoseinhibition in HEK293 Zellen, es konnte keine veränderte βAPP-Endozytoserate beobachtet werden. Die Bildung von sAPPα- und sAPPβ war in Folge dessen unverändert. Auch ein lst-4/SNX33-Knock-Down in C. elegans führte überraschenderweise zu keiner Inhibition der Dynamin-Funktion, äußerte sich jedoch in einer Fehlfunktion der Insulin-Signaltransduktion. SNX33-Knock-Down in humanen Zellen brachte keine nachweisbare Beeinträchtigung des Insulinsignalweges mit sich, jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Homologen SNX9 und SNX18 einen Verlust von SNX33 kompensieren können. Dabei gilt zu beachten, dass eine Funktionsübernahme durch homologe Proteine in C. elegans nicht möglich ist, da dieser Organismus nur ein einziges homologes Protein der SNX33/SNX9/SNX18-Subgruppe besitzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit präsentierten sowie diskutierten Daten zeigen, dass SNX33 in unterschiedliche zellulärer Prozesse involviert ist. SNX33 ist ein neu identifizierter Modulator der Zelle, der für zentrale Signalwege und Vorgänge, wie zum Beispiel der Insulinrezeptor-Signaltransduktion und Endozytose, von Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Modellorganismus C. elegans kann im humanen Zellkultursystem ein durch siRNA induzierter Funktionsverlust von SNX33 durch die homologen Proteine SNX9 und SNX18 kompensiert werden.

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert. Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten, wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt, wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog. fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend, zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden. WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln. Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog. mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al., 1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden: Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac. Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1 erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich Lysosomen zur Degradierung zugeführt.

Der eukaryontische Zellzyklus wird durch die Aktivität verschiedener Cyclinabhängiger Kinasen (CDKs) reguliert. Die zelluläre Menge des CDK-Inhibitorproteins p27Kip1 spielt eine entscheidende Rolle beim Übergang der Zelle von der G1- zur SPhase. Die Menge von p27Kip1 steigt während der G0- oder der G1-Phase an und nimmt zu Beginn der S-Phase rasch wieder ab. Die Bindung von p27Kip1 an die CDKKomplexe der G1-Phase inaktiviert diese und verhindert dadurch die Initiation der SPhase. Eine verminderte Menge von p27Kip1 am G1/S-Phaseübergang findet man dagegen häufig in verschiedenen Tumorgeweben. Die geringere zelluläre Menge des Inhibitors ist dabei mit einer hohen Patientensterblichkeit und einem aggressiven Verlauf der Erkrankung verbunden. Die zelluläre Aktivität und Menge von p27Kip1 wird entscheidend durch Proteine reguliert, die mit p27Kip1 interagieren. In dieser Arbeit wurden deshalb mit Hilfe von rekombinantem p27Kip1 Interaktionspartner des Inhibitors in HeLa-Zellextrakt identifiziert. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 an die CDK-Proteine und an Grb2 bindet. Grb2 ist ein Adapterprotein der Signaltransduktion. Die Interaktion zwischen p27Kip1 und Grb2 könnte damit, nach Stimulation der Zelle durch verschiedene Mitogene, die Signalweitergabe mit der Zellzyklusmaschinerie verbinden. Die zu dieser Interaktion notwendige Domäne in p27Kip1 konnte in weiteren Analysen auf eine acht Aminosäuren lange Prolin-reiche Region eingegrenzt werden. Auf der anderen Seite interagiert Grb2 vornehmlich über seine C-terminale SH3-Domäne mit p27Kip1. Die beiden mit p27Kip1 nah verwandten Inhibitorproteine p21Cip1 und p57Kip2 interagieren dagegen nicht mit Grb2. In einer erweiterten Analyse wurden 41 verschiedene rekombinante SH3-Domänen auf eine Interaktion mit p27Kip1 hin getestet. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 nur mit der C-terminalen SH3-Domäne von Grf40/Mona und der SH3-Domäne der Tyrosinkinase Lyn wechselwirkt. Die Interaktion der Tyrosinkinase Lyn in vivo führte zur Hypothese, daß p27Kip1 durch Lyn phosphoryliert werden könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde deshalb die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 untersucht. In Phosphoaminosäureanalysen mit metabolisch markierten Zellen konnte gezeigt werden, daß p27K i p 1 in vivo an Tyrosinresten phosphoryliert wird. Diese Zusammenfassung 13 Phosphorylierung konnte durch rekombinant hergestellte Tyrosinkinasen und verschiedene Tyrosin/Phenylalanin-Austausche in p27Kip1 auf Tyrosin 88 und 89 eingegrenzt werden. Nach Kristallstrukturdaten des trimeren Komplexes aus p27Kip1, CDK2 und Cyclin A kommt der Tyrosinrest 88 von p27Kip1 in der ATP-Bindetasche der Kinase zu liegen und blockiert diese. Es wurde deshalb untersucht, inwieweit eine Phosphorylierung von p27Kip1 an Tyrosin 88 oder 89 Einfluß auf die Aktivität des Inhibitors hat. Die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 verhindert nicht die Bindung an den CDK-Komplex. Allerdings konnte mit in vitro-phosphoryliertem p27Kip1 gezeigt werden, daß eine Tyrosinphosphorylierung zu einer etwa 40%-igen Reduktion der Aktivität des Inhibitors führt. Diese Ergebnis konnte in vivo bestätigt werden. Interessanterweise verstärkt die Tyrosinphosphorylierung des Inhibitors die Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 durch den gebundenen CDK-Komplex. Die Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 ist in der Zelle ein initiales Signal zum Abbau von p27Kip1 durch das 26S-Proteasom. Das so markierte p27Kip1 wird von einem E3-Ligase-Komplex erkannt und ubiquitiniert. Es wurde deshalb untersucht, welchen Einfluß die Tyrosinphosphorylierung auf den Abbau von p27Kip1 besitzt. In Halbwertszeitbestimmungen mit einer SH3-bindedefizienten Form von p27Kip1 und einer Tyrosin/Phenylalanin-Austauschform von p27Kip1 konnte zeigten werden, daß beide Formen, im Vergleich zu unverändertem p27Kip1, eine höhere Stabilität aufweisen. Die Interaktion von p27Kip1 mit der Tyrosinkinase Lyn und die Inaktivierung des Inhibitors durch die Phosphorylierung von Tyrosinresten zeigt eine Möglichkeit auf wie p27Kip1, in Abhängigkeit von mitogenen Stimuli, reguliert werden kann. Die in dieser Arbeit gefundene Interaktion von Grb2, Grf40 und Lyn mit p27Kip1 verbindet damit die Signaltransduktion mit der Zellzykluskontrolle.