Podcasts about vesikel

In diesem Podcast spreche ich mit Professor Peter Wehling. Prof. Wehling hat bereits Therapien entwickelt, die Exosomen nutzen. Er ist Facharzt für Orthopädie und leitet eine Schwerpunktpraxis für regenerative Therapien in der Orthopädie, Schmerztherapie und Sportmedizin. Er ist Professor an der Duke University in North Carolina und er ist Gründer und CEO der Orthogen AG, die regenerative Therapien entwickelt.   In dieser Folge sprechen wir u.a. über folgende Themen: Kommunikation zwischen Zellen: Exosomen, als extrazelluläre Vesikel, übermitteln RNA und Proteine, die für Reparatur- und Heilprozesse wichtig sind. Patentierte Therapiemethoden: Prof. Wehling hat spezielle Verfahren zur Nutzung von Exosomen entwickelt, die zur Regeneration von Gewebe beitragen. Peripheres Blut als Quelle: Die Exosomen werden aus peripherem Blut gewonnen, was die Gewinnung vereinfacht und kostengünstiger macht als die Gewinnung aus Stammzellen. Regenerative und entzündungshemmende Wirkung: Der Fokus liegt auf Exosomen, die Heilung und Entzündungshemmung fördern, um Altersprozesse und degenerative Erkrankungen zu bekämpfen. Systemische Effekte: Die Wirkung der Exosomen beschränkt sich nicht nur auf den Injektionsort; sie können im gesamten Körper positive Effekte haben. Zulassung und Studien: Die Therapie ist in Europa zugelassen und in den USA in Phase-3-Studien. Die FDA sieht kein Sicherheitsrisiko in der Methode. Effekte auf das Gehirn: Exosomen können durch die Blut-Hirn-Schranke gelangen und durch gezielte Stimulation im Gehirn heilende Effekte entfalten. Verjüngungspotenzial: Exosomen haben das Potenzial, Alterungsprozesse zu verlangsamen und die Lebensqualität zu verbessern, was auch durch Tierversuche unterstützt wird. Zukunftsperspektiven: Exosomen könnten zukünftig breiter eingesetzt werden, um verschiedene Alters- und degenerative Erkrankungen zu behandeln, von Arthrose bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen.   Weitere Informationen zu Prof. Dr. Peter Wehling findest du hier: https://doctor-wehling.com/   Du interessierst dich für Gesunde Langlebigkeit (Longevity) und möchtest ein Leben lang gesund und fit bleiben, dann folge mir auch auf den sozialen Kanälen bei Instagram, TikTok, Facebook oder Youtube. https://www.instagram.com/nina.ruge.official https://www.tiktok.com/@nina.ruge.official https://www.facebook.com/NinaRugeOffiziell https://www.youtube.com/channel/UCOe2d1hLARB60z2hg039l9g Disclaimer: Ich bin keine Ärztin und meine Inhalte ersetzen keine medizinische Beratung. Bei gesundheitlichen Fragen wende dich bitte an deinen Arzt/deine Ärztin.   STY-12

Gehören Mitochondrien zum Endomembransystem? Das Endomembransystem ist das Postnetzwerk der Zelle. Über dieses System stehen die verschiedenen Zellbestandteile miteinander in Kontakt und senden und empfangen Proteine, Fettsäuren und Stoffwechselprodukte. Der Austausch gelingt über sogenannte Transportvesikel, kleine kugelförmige Strukturen, die wie Pakete innerhalb der Zelle verschickt werden. Mitochondrien, die Kraftwerke unserer Zellen, zählen klassischerweise nicht zum Endomembransystem. Diese Ansicht wurde durch die Beobachtung mitochondrialer Vesikel jedoch in Frage gestellt. Mittlerweile werden die mitochondrialen Vesikel mit schweren Krankheiten wie Parkinson und Alzheimer in Verbindung gebracht. Manche Forschungsgruppen sehen in den mitochondrialen Vesikeln sogar den Ursprung des Endomembransystems unserer Zellen.

HIER geht es zum ergänzenden Skript:) Du erfährst: 1) Was Botenstoffe sind... 2) wie sie an einer Synapse wirken... 3) wie Koffein und Adrenalin ein second messenger-System beeinflussen Schreibe gerne Fragen/Feedback/Wünsche an biologopodcast@googlemail.com oder ... @biologopodcast auf Instagram Fachbegriffe der Folge: Transmitter, Hormone, Serotonin, Dopamin, Glutamat, Acetylcholin, Aktionspotential, Endknöpfchen, Calciumkanäle, Transmitter, synaptische Vesikel, präsynaptische und postsynaptische Membran,  Acetylcholinesterase, Diffusion, cAMP, ATP, G-Protein, Adenosin, Adrenalin, Koffein, Adenylatcyclase. Viel Erfolg beim Lernen!

Dermatitis atopik atau biasa disebut eksim atopik merupakan salah satu bentuk peradangan pada kulit. Gambaran awalnya pada kulit berupa vesikel atau plenting (gelembung kecil berisi cairan jernih) dengan dasar yang kemerahan. Vesikel atau plenting ini dapat pecah sehingga cairan yang berada di dalamnya keluar dan mengering di permukaan kulit.

Für die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle ist die Calcium-regulierte Akrosomreaktion des Spermiums eine essentielle Voraussetzung. Sie bewirkt nicht nur die seit langem bekannte Freisetzung hydrolytischer Enzyme aus dem akrosomalen Vesikel zur Penetration der Eihülle (Zona pellucida), sondern legt auch das für die Spermien-Oozyten-Erkennung notwendige Izumo-Protein auf der Spermienoberfläche frei. Erst durch die nach Eizellkontakt induzierte großflächige Verschmelzung von äußerer akrosomaler Membran und der darüber liegenden Plasmamembran an hunderten von Fusionsstellen wird genügend Izumo-Protein auf der inneren akrosomalen Membran exponiert, um eine stabile Verbindung mit dem kürzlich auf der Eizelloberfläche identifizierten Interaktionspartner Juno zu gewährleisten. Welche Regulationsmechanismen der Koordination dieser multiplen Einzelfusionsereignisse bei der Akrosomreaktion zugrunde liegen, ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt. In Neuronen wird die Präzision der Calcium-regulierten Neurotransmitter-Exozytose durch die cytomatrix of the active zone (CAZ), einem Netzwerk aus SNARE-regulierenden Gerüstproteinen, koordiniert. Aufgrund der funktionellen Parallelen zwischen den Exozytoseprozessen in Neuronen und Spermien sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob in Spermien ein analoges, CAZ-ähnliches Proteinnetzwerk die sich Reißverschluss-artig ausbreitende, multiple Fusionsporenbildung der Akrosomreaktion kontrolliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das RIM2α-Protein die Hauptisoform der RIM-Proteinfamilie in Säugerspermien darstellt, deren Vertreter seit einiger Zeit als molekulare Knotenpunkte des CAZ-Proteinnetzwerkes an der Präsynapse gelten. Neben RIM2 wurde auch für ubMunc13-2, das in dieser Arbeit als prädominanter Subtyp der Munc13-CAZ-Proteinfamilie in Spermien identifiziert wurde, sowie für die beiden riesigen Gerüstproteine Piccolo/Aczonin und Bassoon eine distinkte Lokalisation in der akrosomalen Region von Nagerspermien nachgewiesen. Des Weiteren konnte belegt werden, dass RIM2 und ubMunc13-2 an Detergens-resistente Membranmikrodomänen in Spermien assoziiert sind, die seit einiger Zeit für die Rekrutierung der SNARE-Fusionsmaschinerie in Spermien bekannt sind. Eine potentielle Netzwerk-bildende Funktion von RIM2 wurde in in vitro Bindungsstudien, die u. a. mit massenspektrometrischen Analysen kombiniert wurden, bestätigt. Dabei zeigte sich, dass RIM2α sowohl testikuläres ubMunc13-2 als auch die CAZ-Proteine RIM-BP3 und das erstmals in Reproduktionsgewebe nachgewiesene ELKS/ERC2 sowie einige Zytoskelett-assoziierte Proteine bindet. Die funktionelle Bedeutung eines CAZ-ähnlichen Netzwerkes für die Akrosomreaktion wurde in quantitativen Exozytose-Analysen an epididymalen Spermien verifiziert. Eine selektive Blockierung einzelner Domänen von RIM2, aber auch von ubMunc13-2 und Piccolo/Aczonin reduzierte die Calcium-induzierte akrosomale Exozytoserate um mindestens 45 %. Die Funktion der α Isoform des RIM2-Proteins konnte durch funktionelle Exozytosestudien an RIM2α-defizienten Spermien einer entsprechenden Gen-defizienten Mauslinie verifiziert werden. Interessanterweise führte eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Calcium-Ionophor A23187 zu keinem signifikanten Unterschied der Akrosomreaktion von RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien. Dieser Befund könnte möglicherweise auf eine kompensatorische Wirkung anderer, ebenfalls in Spermien exprimierter RIM1- und RIM2-Isoformen zurückzuführen sein. Allerdings wurde für die Akrosomreaktion nach Stimulation mit isolierter und solublisierter Zona pellucida in RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien eine signifikante Reduzierung der akrosomalen Exozytose-Induktion festgestellt. Da die Applikation eines Calcium-Ionophors die Signalkaskade umgeht, die unter physiologischen Bedingungen zum Calcium-Influx und damit zur Membranfusion führt, scheint das RIM2α-Protein Komponenten der Signalkaskade und/oder die Calcium-Kanäle für die Akrosomreaktion zu rekrutieren. Somit könnte es dazu beitragen die gerichtete, großflächige Fusionsporenbildung nach Zona pellucida-Stimulation zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte Untersuchungen deuten außerdem an, dass RIM2α eine Interaktion mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein 1 (MUPP1) eingehen könnte. MUPP1 ist im Komplex mit der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II daran beteiligt, eine spontane, durch die sekundäre Reifung der Spermien im weiblichen Genitaltrakt begünstigte Akrosomreaktion zu verhindern. Als molekularer Knotenpunkt könnte RIM2 demnach sowohl eine spontane Exozytose verhindern als auch durch die Rekrutierung weiterer CAZ-Proteine und des Zytoskeletts die großflächige, multiple Fusionsporenbildung zur Freilegung von ausreichend Izumo-Molekülen auf der Spermienoberfläche sicherstellen. Eine Lokalisation in Detergens-resistenten Membranplattformen, wie sie auch für MUPP1 und die SNARE-Proteine in Spermien gezeigt wurde, könnte diese integrierende Funktion von RIM2 für die akrosomale Exozytose unterstützen.

Die Behandlung solider Tumoren beruht auf deren chirurgischen Resektion sowie häufig einer begleitenden Strahlentherapie und gegebenenfalls auch einer zusätzlichen systemischen Chemotherapie. Letztere wird eingesetzt, wenn bereits eine Fernmetastasierung vorliegt oder wenn von einem hohen Rezidivrisiko trotz Operation ausgegangen werden muss beziehungsweise der Tumor als nicht resektabel eingestuft wird (=neoadjuvante Chemotherapie). Limitierender Faktor der Chemotherapie ist die dosisabhängige Nebenwirkungsrate. Die Arbeitsgruppe Liposomen der KKG Hyperthermie (Leiter: PD Dr. med L.H. Lindner) beschäftigt sich mit dem Einschluss von Zytostatika in thermosensitive Liposomen. Es handelt sich dabei um Vesikel in einer Größe von 100 bis 200 nm mit einer Phospholipidaußenmembran, die ihren Inhalt durch Erwärmung auf Temperaturen von 40°C bis 42°C freisetzen. Bei einer selektiven Erwärmung des Tumors, z. B. im Rahmen einer Tiefenhyperthermiebehandlung (Issels et al. 2008) kommt es so zu einer hohen Wirkstofffreisetzung und Anreicherung in Tumoren (Lindner et al. 2004). Durch dieses Prinzip soll der Antitumoreffekt verbessert und gleichzeitig das Risiko systemischer Nebenwirkungen verringert werden. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Einschluss des Pyrimidinanalogons Gemcitabin in thermosensitive Liposomen. Durch verschiedene Testverfahren soll untersucht werden, ob sich der Wirkstoff für die liposomale Applikation eignet. Es soll eine chemische Charakterisierung sowie die Etablierung einer geeigneten Zellkultur für die Folgeversuche erfolgen. Hauptaugenmerk wird hier vor allem auf die Pankreaskarzinomzelllinien gelegt.

Das Zytoskelett durchzieht als dicht verästeltes Netzwerk die Zelle und bestimmt deren Form und mechanische Festigkeit. Mit seiner Hilfe können sich Zellen teilen, Material aufnehmen und auf externe Einflüsse reagieren. Darüber hinaus dient es zum Transport von zellulären Strukturen wie Vesikeln und Mitochondrien. An der LMU forschen über dieses Zellskelett die Labore von Professor Michael Schleicher und Professor Manfred Schliwa, beide vom Adolf-Butenandt-Institut. Sie sind Teil des interdisziplinären Sonderforschungsbereichs „Dynamik und Regulation Zytoskelettabhängiger Bewegungsvorgänge“.

Unter in vivo Bedingungen kann es in Zellen, die shear stress ausgesetzt sind (wie z.B. Endothel und Epithelzellen) ständig zu Rupturen der Plasmamembran kommen. Das sogenannte Membrane Resealing stellt die Fähigkeit von Zellen dar, auf eine solche Schädigung zu reagieren und die Membranintegrität durch schnelle Fusionsprozesse intrazellulärer Vesikel an Verletzungsstellen wiederherzustellen. Vielfach belegt ist hierbei die Beteiligung lysosomaler Vesikel sowie Enlargeosomen. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals eine Beteiligung ER-generierter Vesikel an diesen Reparaturprozessen der Zellmembran nachgewiesen werden. In verschiedenen experimentellen Ansätzen wurde eine Translokation von ER-Membranen an die geschädigten Areale der Zellmembran gezeigt. Eine Fusion der ER-Membranen mit der Zellmembran wurde durch den Nachweis luminaler Domänen transmembranöser ER-Proteine (CNX) sowie luminaler (löslicher) ER-Proteine (ERp57) an den Verletzungsstellen von Axonen des Rückenmarkes in vivo bestätigt. Durch die Blockade der am ERES freigesetzten COPII-Vesikel (Sar1) wurde der frühe sekretorische Transportweg vom ER zum Cis-Golgi-Netzwerk unterbunden. Damit einhergehend kam es zu einem verminderten Resealing der geschädigten Areale in der Zellmembran. Die Ergebnisse zeigen, dass die schnelle Freisetzung von ER-Vesikeln nach mechanischer Verletzung bzw. Schädigung der Plasmamembran durch bakterielle Toxine entscheidend an der Reparatur und Regenerierung geschädigter Zellen beteiligt ist. Nach mechanischer Schädigung kommt es auch zur Freisetzung von exozytotischen Vesikeln, sogenannten Mikropartikeln (MP), in den extrazellulären Raum. Bisher ist weitgehend unbekannt, wie die Homöostase der externalisierten MP koordiniert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde unter in vitro- und in vivo-Bedingungen gezeigt, dass die extrazelluläre Konzentration der MP über die Clearance mittels verschiedener Endozytose-/Phagozytoseprozesse reguliert wird. An der Internalisierung dieser Vesikel ist der Class B Scavenger-Rezeptor CD36 beteiligt. Eine Blockade dieses Rezeptors in vitro zeigte eine deutliche Reduktion der Aufnahme von MP in phagozytosefähige Zellen. In vivo konnte eine CD36-abhängige Reduktion der MP-Aufnahme in verschiedenen Organen (vor allem Niere, Milz) in CD36-defizienten Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden unter in vitro-Bedingungen Unterschiede bei der Internalisierung normaler und karzinomatöser MP nachgewiesen. Im Gegensatz zur zellulären Aufnahme von MP aus nicht-transformierten Zellen, wurden MP aus karzinomatösen Zellen nicht über Endozytose/Phagozytose internalisiert. Hingegen kam es hierbei zu einer Fusion von karzinomatösen MP mit der Membran der Akzeptorzelle, einem Mechanismus, der an der Transformation normaler Zellen in karzinomatöse Zellen beteiligt sein könnte. Insgesamt gesehen wurde hierdurch gezeigt, dass MP über Endozytose/Phagozytose in Zellen internalisiert werden, und dass dies organspezifisch über den Scavenger Rezeptor CD36 vermittelt wird.

Podosomen sind aktinreiche Adhäsionsstrukturen, die vor allem in monozytären Zellen, aber auch in dendritischen Zellen, Osteoklasten, Endothelzellen oder glatten Muskelzel-len vorkommen. In primären humanen Makrophagen gibt es zwei Subpopulationen von Podosomen: größere, hochdynamische Precursor in der Peripherie sowie kleinere, sta-bilere Podosomen im Zellzentrum. Die Regulation der Podosomendynamik in der Zell-peripherie erfolgt durch das Mikrotubuli-basierte Motorprotein KIF1C, wahrscheinlich durch den Transport von Regulationsfaktoren. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Ar-beit lag daher in der Identifizierung dieser Regulatoren. • Die Aufreinigung KIF1C-GFP positiver Vesikel mittels FACS ist grundsätzlich funk-tionell. Die Analyse zahlreicher Vesikel-assoziierter Proteine spricht weiter für die Hypothese, dass es sich bei der von KIF1C transportierten Fracht um vesikuläre Struk-turen handelt. Die Detektion zahlreicher unspezifischer Proteine zeigt jedoch auch, dass die Methode der Aufreinigung zukünftig noch verbessert werden muss. • RabGTPasen, die auch am Transport von Vesikeln beteiligt sind, haben oftmals eine ähnliche subzelluläre Lokalisation wie KIF1C. Vor allem zwischen Rab6a und KIF1C war ein häufiger und länger dauernder Kontakt in der Zellperipherie zu beobachten. Mittels GFP-Immunpräzipitation konnte eine Interaktion bestätigt werden. • Auf der Suche nach weiteren potentiellen Interaktionspartnern von KIF1C wurde das Protein HAX1 identifiziert. Sowohl in fixierten als auch in lebenden primären humanen Makrophagen konnte eine eindeutige Kolokalisation der Proteine in der Zellperipherie beobachtet werden. Bei Einsatz der Rigormutante von KIF1C (KIF1C-K103A) akku-mulierten beide Proteine am MTOC. Diese Ergebnisse lassen auf eine Interaktion zwi-schen KIF1C und HAX1 schließen. Das Motorprotein KIF9 lokalisiert vor allem an den stabileren Podosomen im Zentrum der Zelle. Bei der Ermittlung der Rolle von KIF9 hinsichtlich der Regulation dieser Po-dosomensubpopulation wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: • Knock-down von KIF9 reduziert die Anzahl der Podosomen und inhibiert bei noch bestehenden Podosomen den Abbau extrazellulärer Matrix. Für KIF9 konnte demnach nicht nur eine Beteiligung an der Podosomenregulation sondern auch eine Rolle im Matrixabbau zugewiesen werden. • KIF9-GFP positive Vesikel assoziieren mit Mikrotubuli und kontaktieren mehrere Podosomen nacheinander. Dies spricht für eine direkte Verbindung von KIF9-vermitteltem, mikrotubuli-basiertem Transport mit Podosomen, die durch KIF9 regu-liert werden. • Durch Immunpräzipitationsversuche wurden Hinweise gefunden, dass KIF9 mögli-cherweise in unterschiedlichen Spleißvarianten oder verschieden phosphorylierten Zu-ständen existiert. • Als Interaktionspartner für KIF9 konnte Reggie-1 identifiziert werden. Durch knock-down von Reggie-1 und auch Reggie-2 konnte diesen Proteinen eine Beteiligung am Abbau extrazellulärer Matrix zugeschrieben werden. Die Teilung der Podosomen-Precursor sowie Auflösung der regulären Podosomen sind grundlegende Vorgänge. Unterschiede in der molekularen Zusammensetzung der Podo-somen-Subpopulationen waren bisher allerdings unbekannt. • Supervillin konnte als erstes Protein identifiziert werden, das differentiell an die unter-schiedlichen Subpopulationen lokalisiert. Dies zeigt zum ersten Mal eine unterschiedli-che molekulare Zusammensetzung der Podosomen-Subpopulationen. • Podosomen reichern Supervillin an, bevor diese sich auflösen. Überexpression von GFP-Supervillin führte außerdem zu einem Verlust von Podosomen, wohingegen shRNA-basierter knock-down die Lebensdauer verlängerte. Supervillin scheint somit eine Rolle in der Regulation von Podosomen zu spielen. • Die Myosin IIA-Bindedomäne ist sowohl für die Anzahl der Podosomen als auch für die differentielle Rekrutierung an die unterschiedlichen Subpopulationen essentiell. • Supervillin steht mit Myosin IIA und der phosphorylierten leichten Kette von Myosin in Verbindung und koppelt kontraktiles Myosin an Podosomen, was deren Auflösung auslöst. • Durch siRNA-basierten knock-down konnte gezeigt werden, dass Supervillin erst zu-sammen mit Myosin IIA und/oder Gelsolin die Effektivität der Podosomen hinsichtlich Matrixabbau beeinflusst. Die Podosomenanzahl hingegen war nicht verändert.

Die vorliegende Arbeit untersuchte im ersten Teil tierart-vergleichend das Vorkommen von PrPC bei Hauswiederkäuern in Eutergewebe und in den verschiedenen Milchfraktionen. Dies erfolgte mittels EIA und Western-Blot sowie für das Eutergewebe auch mittels Immunhistochemie (IHC). Für die Aufarbeitung von Rahm wurde dabei ein neues Verfahren etabliert, durch das die Proteinfraktion des Rahms als Pellet gewonnen werden konnte. Es fand seinen Einsatz auch im zweiten Teil bei der Untersuchung von Milch und Kolostrum BSE- bzw. Scrapie-infizierter Schafe mittels PrionScreen® und Western-Blot. Auch das Eutergewebe und die Milchfraktionen von drei BSE-Kühen wurden untersucht. Im Eutergewebe vom Rind war PrPC-Expression mittels EIA und IHC mit individuellen Unterschieden nachweisbar, nicht jedoch mittels Western-Blot. Bei den kleinen Wiederkäuern hingegen ließ sich PrPC mit allen drei verwendeten Methoden darstellen. In der IHC zeigte sich, dass die Expression das gesamte Zytoplasma der Laktozyten umfasste und PrPC-haltige Vesikel ins Alveolarlumen abgeschnürt wurden. Beim Rind dagegen beschränkte sich die PrPC Expression auf basolaterale Abschnitte der Laktozyten. In Kuhmilch konnte - im Gegensatz zu kürzlich erschienenen Publikationen - kein PrPC detektiert werden. Die kleinen Wiederkäuer zeigten jedoch eine individuelle und - wie anhand des Laktationszyklus eines Schafes nachvollziehbar - laktationsphasen-abhängige PrPC-Expression in den Milchfraktionen Magermilch, Molke und somatische Zellen. Neben den vom Hirngewebe bekannten drei Isoformen (zweifach-, einfach- und unglykosyliert) waren im Western-Blot mit mAk P4 zwei trunkierte Formen auf Höhe von ca. 8 und 14 kDa darstellbar. Dabei handelt sich vermutlich um N-terminale Fragmente. In Kasein war nur bei einigen Schafen PrPC im EIA nachweisbar. Rahm konnte aufgrund seiner Aufarbeitung mittels Detergentien nur im Western-Blot untersucht werden. Es zeigten sich bei Schaf und Ziege dieselben PrPC- Banden wie in den bereits beschriebenen Milchfraktionen. Bei den Proben TSE-infizierter Schafe zeigte sich sowohl bei Rahm aus Milch als auch bei Rahm und Molke aus fettreichem Kolostrum, die eine ähnliche Aufarbeitung erfuhren, PK-resistente Banden. Diese Banden zeigten sich auf Höhe der drei Volllängen-Isoformen sowie der 8-kDa-Form. Eine Abklärung erfolgte im PrionScreen®-EIA durch Einsatz der aus Rahm gewonnenen Proteinpellets. Darin reagierten sieben von 13 Milchproben der Scrapie-Tiere und acht von 108 der BSE-Schafe positiv. Dabei handelte es sich durchweg um Kolostrumproben (etwa 26 % der untersuchten Kolostrumproben). Auch im anschließenden Western-Blot mit einem Aliquot aus der Digestionsplatte des PrionScreen® zeigten sich bei einem Teil der positiven EIA-Reagenten Banden auf PrPC-Höhe. Durch die Kontrolle mit einem unspezifischen Primärantikörper konnte nicht eindeutig gezeigt werden, ob die Banden PrP-spezifisch sind. Ein ähnliches Phänomen bei somatischen Zellen aus Schaf-Kolostrum ist von EVEREST et al. (2006) bekannt. Man muss daher davon ausgehen, dass es sich um eine unspezifische Reaktion des Kolostrums handelt. Rahm aus Milch reagierte im PrionScreen® eindeutig negativ, ebenso Molke aus Milch im Western-Blot. Die Eutergewebeproben der drei BSE-Kühe reagierten negativ in EIA, Western-Blot und IHC. Auch in ihrer Magermilch war kein PrPres detektierbar. Die Kaseinfraktion reagierte positiv im PrionScreen®, wobei eine unspezifische Reaktion jedoch nicht ausgeschlossen werden konnte. Obwohl die Untersuchungen an klinisch gesunden Tieren gezeigt haben, dass PrPC als Replikationsmatrix für die Bildung von PrPSc im Euter und der Milch vorhanden ist, brachten die Analysen der TSE-infizierten Tiere letztlich keinen Beweis für das Vorkommen von PrPres in Milch. Lediglich im Kolostrum von TSE-infizierten Schafen zeigten sich untypische PK-resistente Formen. Eine Gefährdung des Verbrauchers durch Milch und Milchprodukte ist daher mit größter Wahrscheinlichkeit nicht gegeben.

Das Amyloid Precursor Protein (APP) spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung. Seine physiologische Funktion in Neuronen, in denen es sich hauptsächlich in den Synapsen befindet, ist immer noch weitestgehend ungeklärt. Mit Hilfe autaptischer, hippocampaler Neurone von APP-Knockout-Mäusen, konnte gezeigt werden, dass Knockout-Neurone signifikant erhöhte Amplituden stimulierter AMPA- und NMDA-Rezeptor vermittelter exzitatorischer postsynaptischer Ströme (EPSC) aufweisen. Des Weiteren ergab die Analyse spontaner exzitatorischer postsynaptischer Ströme (mEPSC) eine erhöhte Frequenz in APP-Knockout-Neuronen, bei gleich bleibender Amplitude der spontanen synaptischen Ströme. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der Verlust des APP-Gens zu einer Erhöhung der Anzahl funktioneller Synapsen führt. Diese Hypothese konnte durch immunhistochemische Untersuchungen weiter bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass APP-Knockout-Neurone tatsächlich mehr Synapsen pro kultivierten Neuron ausbilden als Wildtyp-Neurone. Demzufolge beeinflusst der Verlust des APP-Gens die Synapsenausbildung und dementsprechend auch die synaptische Übertragung in kultivierten hippocampalen Neuronen. Zusätzlich wurden autaptische Neurone von Mäusen mit Mutationen im APP und/oder Präsenilin1 (PS1), welche bei der vererbbaren Form der Alzheimer-Erkrankung auftreten, untersucht. Dabei zeigte sich, dass Mäuse, die entweder humanes PS1 mit der A246E Mutation allein, oder humanes PS1 mit der L166P Mutation zusätzlich zur K670N/M671L Doppelmutation im humanen APP exprimieren, eine verringerte AMPA-und NMDA-EPSC Amplitude gegenüber den jeweiligen Kontrollen aufweisen. Ebenso war der Pool freisetzungsbereiter synaptischer Vesikel bei beiden transgenen Linien gegenüber den Kontrollen verringert. Die Analyse spontaner synaptischer Ströme ergab bei der Linie mit der PS1(A246E) Mutation eine signifikant verringerte Frequenz bei gleich bleibender Amplitude der spontanen Ereignisse. Die immunhistochemische Auswertung zeigte eine Reduktion der Synapsenanzahl pro 10 µm Dendritenlänge, was die elektrophysiologischen Untersuchungen bestätigte. Die Daten deuten somit an, dass Mutationen im PS1 die synaptische Übertragung durch eine Reduktion funktioneller Synapsen beeinträchtigen. Damit verhalten sich die Ergebnisse aus der Untersuchung von Neuronen mit der PS1-Mutation genau entgegengesetzt zu den Daten der APP-Knockout-Neurone, was die wichtige Rolle von Aβ bei der Modulation der Synapsendichte verdeutlicht. Weiterführende Versuche, die der Identifizierung der verantwortlichen Aβ-Spezies (Mono-, Oligomere, Fibrillen) dienten, zeigten keine akute Beeinflussung der synaptischen Übertragung. Somit scheint die an PS1mut- und APPPS1-Neuronen beobachtete reduzierte synaptische Übertragung und Synapsenanzahl nicht sofort, sondern erst nach einiger Zeit in Kultur aufzutreten. Die vorliegende Untersuchung stellt die klassische Ansicht, der zufolge Aβ nur eine pathologische Funktion besitzt, in Frage. Die angenommene physiologische Funktion von Aβ könnte Therapieansätze, die auf einer kompletten Blockade der Aβ-Bildung beruhen, entscheidend beeinflussen.

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert. Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten, wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt, wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog. fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend, zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden. WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln. Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog. mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al., 1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden: Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac. Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1 erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich Lysosomen zur Degradierung zugeführt.

Der programmierte Zelltod, oder Apoptose, ist ein physiologischer Vorgang mit zentraler Bedeutung für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Die Auslösung der Apoptose führt zur Aktivierung von Caspasen. Dies sind Cysteinproteasen, die gezielte Substratproteine spalten und so die koordinierte Zerstörung der Zelle herbeiführen. Apoptose wird durch pro- und antiapoptotische Proteine reguliert, die die Aktivierung von Caspasen stimulieren bzw. unterdrücken. Da diese Proteine sich gegenseitig beeinflussen, wird das Schicksal einer Zelle durch die relative Aktivität pro- und antiapoptotischer Faktoren bestimmt. BRUCE (BIR repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) ist ein konserviertes, 528 kDa großes, peripheres Membranprotein des trans-Golgi Netzwerks. Seine charakteristischen Merkmale sind eine N-terminale BIR-Domäne und eine C-terminale UBC-Domäne, die dem Molekül Ubiquitin-Konjugationsaktivität verleiht. Diese Arbeit demonstriert, dass BRUCE Zellen vor der Apoptose schützt und als ein inhibitor of apoptosis protein (IAP) wirkt, indem es an aktive Caspasen bindet und diese inhibiert. Die Verwendung von Wildtyp und Mutanten des BRUCE Proteins zeigt, dass diese Aktivitäten von der BIR-Domäne abhängen. Während der Apoptose wird BRUCE durch unterschiedliche Mechanismen blockiert. Zum einen wird BRUCE durch Caspasen und HtrA2 proteolytisch gespalten und dadurch inaktiviert. Zum anderen bindet der mitochondriale IAP-Antagonist Smac an die BIR-Domäne von BRUCE und unterdrückt dessen Caspase-inhibitorische Aktivität, indem es die Bindung von BRUCE an Caspasen verhindert. Aufgrund seiner Lokalisierung an Membranen des trans-Golgi Netzwerks könnte BRUCE ein spezialisiertes, antiapoptotisches Protein mit räumlich begrenzter Aktivität sein. Wie die stark negative Regulation verdeutlicht, scheint außerdem die Entfernung von BRUCE aus der Zelle während der Apoptose wichtig zu sein. Räumlich und zeitlich begrenzte Inhibition von Caspasen während der Apoptose könnte daher für einen geordneten Ablauf apoptotischer Prozesse, wie zum Beispiel den Abbau des Golgi-Apparates und seine Verpackung in apoptotische Vesikel, notwendig sein.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum ersten Mal systematisch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Peptiden an anionischen Lipidmembranen untersucht. Mit dieser Methode konnten Einzelmolekül-Messungen zur Bindung von myristoyliertem Alanin-reichen C Kinase Substrat, MARCKS (151-175), an unilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von 100 nm durchgeführt werden. Die Vesikel bestanden aus dem neutralen Lipid Phosphatidylcholine (PC) und den negativ geladenen Lipiden Phosphatidylserine (PS) oder Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Eine Signal/Rausch-Analyse ermöglichte die Bestimmung der Sensitivität und des linearen Messbereichs der Methode. Auf Grund der unterschiedlichen Korrelationszeiten der freien und gebundenen Peptide folgte aus den gemessenen Autokorrelationskurven der prozentuale Anteil des gebundenen Pepids. Die Bindung von MARCKS(151-175) an die anionischen Vesikel wurde für verschiedene prozentuale Anteile von PS und PIP2 gemessen. Sie war umso stärker, je höher der Anteil anionischer Lipide in der Membran und damit die attraktive elekrostatische Wechselwirkung war. Die ermittelten Bindungskonstanten stimmten gut mit den Resultaten überein, die mit etablierten konventionellen Techniken wie NMR, ITC oder Spinmarkierung gewonnen wurden. Die Experimente konnten zeigen, dass mit FCS direkte Messungen von nanomolaren Peptidkonzentrationen möglich sind. FCS stellt eine präzise Methode zur Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmembranen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Selbstorganisation und das Aggregationsverhalten von verschiedenen synthetischen Gentransfer-Komplexen studiert. Mit der Methode der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie wurde die Größenverteilung bestimmt und die Zahl der Plasmide pro Gentransfer-Komplex berechnet. Die Polyplexe stellen im Unterschied zu den Lipoplexen unter den experimentellen Bedingungen ein polydisperses kolloidales System dar. Unter dem Einfluss eines natürlichen Surfactants (Alveofact) war ein umgekehrtes Verhalten zu beobachten. Die Messungen zur Kinetik des kolloidalen Systems erfolgten mit der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Mit dieser Methode wurde der Einfluss der Ionenkonzentration und von Alveofact auf die Aggregationskinetik von verschiedenen positiv geladenen Gentransfer-Komplexen untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Geschwindigkeit der kolloidalen Aggregation mit der Ionenkonzentration drastisch zunimmt und die mittlere Zahl der Plasmide pro Komplex als Funktion der Zeit linear ansteigt. Nach der Inkubation mit Alveofact stellten die Polyplexe auch unter physiologischen Bedingungen ein stabiles kolloidales System dar und bestanden im Mittel aus 3-5 Plasmiden. Auch in diesem Fall wurde bei den DNA/Lipofectamine-Komplexen ein anderes Aggregationsverhalten beobachtet. Sie bildeten ohne die Einwirkung von Alveofact unabhängig von der Ionenkonzentration ein stabiles Kolloid und bestanden im Mittel aus nur zwei kondensierten Plasmiden. Dagegen führte die Inkubation mit Alveofact zu einer langsamen kolloidalen Aggregation. Die Lipoplexe erreichten in diesem Fall nach 60 min eine Größe von ~3-4 Plasmiden pro Komplex. Mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie wurde das Transportverhalten verschiedener Vesikel und Gentransfer-Komplexe in einem negativ geladenen Polymer-Netzwerk (Mucin) untersucht. Die Größe und die Ladung der Partikel bestimmten die Diffusion durch das Polymer-Netzwerk. Kleinere Durchmesser und höhere negative Ladungen der Vesikel trugen zu einem effektiveren Transport durch das Netzwerk bei. Aus der Diffusionskonstante und der makroskopischen Viskosität der Polymerlösung wurden die Abweichungen von der Stokes-Einstein-Relation berechnet. Das Diffusionsverhalten anionischer Vesikel wurde zum Vergleich auch in einem positiv geladenen Kollagen-Netzwerk studiert. Bei den synthetischen Gentransfer-Komplexen mit positiver Überschussladung wurde auf Grund der Bindung zum Netzwerk ein deutlicher Abfall der Diffusionskonstante als Funktion der Polymer-Konzentration beobachtet. Im Unterschied dazu zeichneten sich die negativ geladenen Komplexe wegen der repulsiven elektrostatischen Wechselwirkung durch einen effektiveren Transport im Mucin-Netzwerk aus. Unter dem Einfluss von Alveofact zeigten die positiv geladenen Komplexe ein ähnliches Transportverhalten wie die negativ geladenen Komplexe. Eine gezielte Beschichtung der Komplexe ermöglichte also einen verbesserten Transport durch das Polymer-Netzwerk, was im Zusammenhang mit einem effizienten Gentransfer von Interesse ist.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, (i) die regulatorische Funktion bestimmter integraler Membranproteine im Dictyostelium Zytoskelett und (ii) die biochemische Interaktion einer Kinase eines infektiösen Bakteriums mit Aktin aus der Wirtszelle genauer zu analysieren. (i) Die ubiquitären Mitglieder der CD36/LIMPII-Familie sind integrale Membranproteine, die als Lipidrezeptoren und Zelladhäsionsproteine in der Plasmamembran oder - mit bisher unbekannter Funktion - in Membranen endosomaler Vesikel vorkommen. In Dictyostelium discoideum führte die Inaktivierung eines lysosomalen Membranproteins aus dieser Gruppe zur Suppression des Phänotyps einer Profilin-minus Mutante. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des D. discoideum-Genoms konnte festgestellt werden, daß es neben diesem DdLmpA noch die beiden weiteren homologen Proteine DdLmpB und DdLmpC gibt. Da der Mechanismus der Suppression des Profilin-minus Phänotyps ungeklärt ist, wurden die beiden Isoformen im Rahmen der vorliegenden Arbeit genauer charakterisiert. Sowohl für DdLmpB wie auch für DdLmpC konnte die familientypische Membran-Topologie einer Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Dabei weist die zentrale, lumenale Domäne beider Proteine zahlreiche Glykosylierungen auf. Durch Immunofluoreszenz und Saccharosegradienten wurde die Lokalisation der drei Isoformen an endolysosomalen Vesikeln nachgewiesen. Es stellte sich dabei heraus, daß die drei DdLmp-Proteine in unterschiedlichen Vesikelpopulationen auftraten. Auch “pulse-chase“-Experimente mit TRITC-Dextran und nachfolgender Markierung der Vesikel mit DdLmp-spezifischen Antikörpern ergaben unterscheidbare Zeitmuster für die Rekrutierung der Membranproteine in Vesikeln. Die für DdLmpA oft beobachtete Kolokalisation mit Makropinosomen konnte z.B. für DdLmpB und DdLmpC nur selten festgestellt werden. Nach zahlreichen Versuchen und der Konstruktion von verschiedenen Vektoren konnte am Ende der praktischen Arbeiten eine DdLmpB-minus Mutante im Wildtyp-Hintergrund isoliert werden. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Aktin und der Kinase YopO, die durch Yersinia enterocolitica als Effektorprotein in die Wirtszelle transloziert wird, biochemisch genauer untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß G-Aktin und nicht F-Aktin für die Aktiverung der YopO-Kinase verantwortlich ist. Dabei tritt Nichtmuskel-Aktin im Vergleich zum Muskel-Aktin als ein deutlich besserer Aktivator von YopO auf. Obwohl die aktivierte Kinase in vivo das Aktin-Zytoskelett beeinflußt, ist Aktin offensichtlich kein Substrat von YopO. Mittels Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß sowohl die native Kinase YopO als auch das durch Punktmutation inaktivierte YopO K269A die Polymerisierungskinetik von Aktin behindern. Für eine mutmaßliche Aktin-Binderegion von 20 Aminosäuren aus dem C-terminalen Ende konnte hingegen kein Effekt beobachtet werden. Der Einfluß von aktinbindenden Proteinen, aktinmodifizierenden Substanzen und YopO-bindenden GTPasen auf die Aktivierung der Kinase durch Aktin deutet darauf hin, dass die Aktivität der Kinase in der Wirtszelle nicht nur durch Aktin alleine, sondern auch durch weitere Zytoskelett-Komponenten reguliert wird.

Ziel der Arbeit war es, flexible kationische Lipidvesikel zu entwickeln, die für den transdermalen Transport von DNS geeignet ist. Um positiv geladene Lipidvesikel herzustellen, wurde in einem Ansatz SPC und CTAB verwendet, in einem anderen SPC, Polysorbat und DC-Chol. Nach der Herstellung dieser beiden Formulierungen fand eine in vitro und eine in vivo Untersuchung der beiden Trägersysteme sowie deren Wechselwirkung mit DNS statt. Dabei ergab sich, daß die DNS-Adsorption an die polysorbat-freien Vesikel grundlegend anders erfolgt als an die polysorbat-haltigen Vesikel. Die Flexibilität der beiden Formulierungen nahm durch die Beladung mit DNS deutlich ab, der Durchmesser der DNS-haltigen Vesikel im Vergleich zu den DNS-freien For-mulie-rungen zu. Beide Eigenschaften änderten sich bei den gewählten Formulierungen jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Grundsätzlich waren die polysorbathaltigen Formulierungen in der sich anschließenden in vitro Charakterisierung fähig, Zellen zu transfizieren, wenn auch nicht sehr effizient. Zur Überprüfung des in vivo Verhaltens der mit DNS beladenen Polysorbat-DC-Chol – Vesikel wurden die Vesikel schließlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, die DNS mit einem weiteren Farbstoff; die verwendete DNS codierte ebenfalls für einen Fluoreszenzfarbstoff. Die so markierten Formulierungen wurden NMRI – Mäusen intra- bzw. epicutan appliziert; einige Zeit später wurden Biopsien der behandelten Hautareale entnommen und mittels CLSM untersucht. Dabei waren DNS und kationische Vesikel bis in eine gewisse Hauttiefe nachweisbar, wobei sich unbeladene und mit DNS beladene Vesikel nicht signifikant in der Penetrationstiefe unterschieden. Eine Transfektion der Hautzellen wurde bislang jedoch nicht beobachtet. Zusammenfassend ist zu sagen, daß die Anwesenheit von Polysorbat in der Membran nicht nur für die Flexibilität der Vesikel zwingend notwendig ist, sondern v.a. für die Stabilität der Vesikel nach der Anlagerung von DNS. Da die Flexibilität des Trägersystems durch Anlagerung der DNS deutlich abnimmt, ist es für weitere Ansätze wohl notwendig, den unbeladenen Vesikel eine extrem hohe Flexibilität zu verleihen, um selbst nach der Bindung der DNS an diese Träger noch eine ausreichende Flexibilität für die Permeation durch die Haut zu erhalten.