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Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.12.31.522373v1?rss=1 Authors: Coly, P.-M., Chatterjee, S., Mezine, F., El Jekmek, C., Devue, C., Nipoti, T., Lara Corona, M., Dingli, F., Loew, D., van Niel, G., Boulanger, C. M. Abstract: Atherosclerotic lesions mainly form in arterial areas exposed to low shear stress (LSS), where endothelial cells express a senescent and inflammatory phenotype. Conversely, high shear stress (HSS) has atheroprotective effects on the endothelium. Endothelial cell-derived extracellular vesicles have been shown to regulate inflammation, senescence and angiogenesis and therefore play a crucial role in vascular homeostasis and disease. While previous studies have shown links between hemodynamic forces and extracellular vesicle release, the exact consequences of shear stress on the release and uptake of endothelial EVs remains elusive. Our aim is therefore to decipher the interplay between these processes in endothelial cells exposed to atheroprone or atheroprotective shear stress. Confluent human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were exposed to either LSS or HSS for 24 hours. Large and small EVs were isolated from conditioned medium by sequential centrifugation and size exclusion chromatography. They were characterized by TEM, Western blot analysis of EV markers, tunable resistive pulse sensing, flow cytometry and proteomics. Uptake experiments were performed using fluorescently-labeled EVs and differences between groups were assessed by flow cytometry and confocal microscopy. We found that levels of large and small EVs in HUVEC conditioned media were fifty and five times higher in HSS than in LSS conditions, respectively. In vivo and in vitro uptake experiments revealed greater EV incorporation by cells exposed to LSS conditions compared to HSS. Additionally, endothelial LSS-EVs appeared to have a greater affinity for HUVECs than HSS-EVs or EVs derived from platelets, red blood cells, granulocytes and peripheral blood mononuclear cells. Proteomic analysis revealed that LSS-EVs were enriched in adhesion proteins such as PECAM1, MCAM, which were involved in EV uptake by endothelial cells. LSS-EVs also carried mitochondrial material, which may be involved in elevating reactive oxygen species levels in recipient cells. These findings suggest that endothelial shear stress has a significant impact during EV biogenesis and uptake. Given the major role of EVs and shear stress in vascular health, deciphering the relation between these processes may yield innovative strategies for the early detection and treatment of endothelial dysfunction. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.10.27.513735v1?rss=1 Authors: Petersen, J. D., Mekhedov, E., Kaur, S., Roberts, D. D., Zimmerberg, J. Abstract: Extracellular vesicles (EVs) released by resting endothelial cells support vascular homeostasis. To better understand endothelial cell EV biogenesis, we examined cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) prepared by rapid freezing, freeze-substitution, and serial thin section electron microscopy. Thin sections of HUVECs revealed clusters of membrane protrusions on the otherwise smooth cell surface. The protrusions contained membrane-bound organelles, including multivesicular bodies (MVBs), and appeared to be on the verge of pinching off to form microvesicles. Beyond cell peripheries, membrane-bound vesicles with internal MVBs were observed, and serial sections confirmed that they were not connected to cells. These observations are consistent with the notion that these multi-compartmented microvesicles (MCMVs) pinch-off from protrusions. Remarkably, omega figures formed by fusion of MVBs with the MCMV limiting membrane were directly observed, apparently caught in the act of releasing exosomes from the MCMV. In summary, MCMVs are a novel form of EV that bud from membrane protrusions on the HUVEC surface, contain MVBs and release exosomes. These observations suggest that exosomes can be harbored within and released from transiting microvesicles after departure from the parent cell, constituting a new site of exosome biogenesis occurring from endothelial and potentially additional cell types. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

HEALTH NEWS Walking for 150 minutes per week associated with improved wellbeing in over-50  Trinity College Dublin, January 17, 2022  New research using data from The Irish Longitudinal Study on Ageing (TILDA) at Trinity College Dublin shows that being physically active, for example by walking for at least 150 minutes per week, is associated with more social participation and better mental health and wellbeing.  The findings show that: Two-thirds of the Irish population aged 50 years and older report low or moderate levels of physical activity while only one-third report high levels of activity, based on the International Physical Activity Questionnaire. Middle-aged and older Irish adults with high levels of physical activity report greater participation in social activities, less anxiety, better quality of life, and less loneliness compared to those with low physical activity levels. Middle-aged and older adults with low levels of physical activity are over twice as likely to have clinically relevant depressive symptoms as those with high levels of physical activity (14% versus 6%). Interventions should specifically target women, older adults, those in employment, those who are not engaged in non-church related social activities and those living in built-up areas such as apartments.     Study finds hydroxychloroquine delays disability for least treatable form of multiple sclerosis University of Calgary (Canada), January 17, 2022 A University of Calgary study has found promising results for the generic drug hydroxychloroquine when used to treat the evolution of disability of primary progressive multiple sclerosis (MS), the least treatable form of the autoimmune disease.  Cumming School of Medicine research teams found hydroxychloroquine helped to slow the worsening of disability during the 18-month study involving participants at the MS clinic in Calgary. The research was published in Annals of Neurology. The experimental study, known as a single-arm phase II futility trial, followed 35 people between November 2016 and June 2021. Researchers expected to see at least 40 percent, or 14 participants, experience a significant worsening of their walking function, but at the end of the trial only eight participants had worsened. Hydroxychloroquine was generally well-tolerated.     Tree nut consumption is associated with better diet Louisiana State University,  January 16, 2022 A new study, published this week in the open access journal Nutrients, compares the nutrient adequacy and diet quality of those who consume tree nuts (almonds, Brazil nuts, cashews, hazelnuts, macadamias, pecans, pine nuts, pistachios and walnuts), and non-tree nut consumers in a nationally representative population. Tree nut consumption was associated with better nutrient adequacy for most nutrients that are lacking in the diets of many Americans, and with better diet quality. Researchers looked at 14,386 adults in the National Health and Nutrition Examination Surveys (NHANES). The data showed that, compared to non-consumers, tree nut consumers had a lower percentage of the population consuming usual intakes of nutrients below the recommended levels of vitamins A, E and C; folate; calcium; iron; magnesium; and zinc. Tree nut consumers had a higher percentage of the population over the recommendation for adequate intake for dietary fiber and potassium    Protein isolated from baker's yeast shows potential against leukemia cells University of Sao Paulo (Brazil), January 16, 2022  An enzyme identified in Saccharomyces cerevisiae, commonly known as brewer's or baker's yeast, has passed in vitro trials, demonstrating its capacity to kill acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells. "In this study, we characterize the enzyme L-asparaginase from S. cerevisiae. The results show this protein can efficiently annihilate leukemia cells with low cytotoxicity to healthy cells," said Gisele Monteiro, a professor at FCF-USP and the principal investigator for the published study. Production of the enzyme asparagine synthetase is deficient in ALL and several other types of cancer cells, which are therefore unable to synthesize the amino acid asparagine. "This type of cell depends on extracellular sources of asparagine, an essential amino acid for the synthesis of proteins and hence of DNA and RNA. So it's required for cell division," Monteiro said. "The enzyme asparaginase depletes this amino acid in the extracellular medium, converting it into aspartate and ammonia. In patients with ALL, this leads to a sharp fall in serum levels of asparagine, hindering protein synthesis in malignant cells and inducing apoptosis, or programmed cell death." The bacterial enzyme killed about 90 percent of the MOLT4 human leukemia cells and displayed low toxicity to the healthy HUVEC cells, killing only 10 percent. "The yeast enzyme killed between 70 percent and 80 percent of the MOLT4 cells and displayed less than 10 percent toxicity for HUVEC cells. Neither was significantly effective against REH cells."   Pakistan says trial of Chinese traditional medicine for Covid-19 successful International Center for Chemical and Biological Science (Pakistan), January 17, 2022 Local health authorities on Monday announced the completion of a successful clinical trial of Chinese traditional herbal medicine for treating Covid-19, as Pakistan enters a fifth wave of the pandemic driven by the Omicron variant. The Chinese medicine, Jinhua Qinggan Granules (JHQG) manufactured by Juxiechang (Beijing) Pharmaceutical Co Ltd, is already being used in the treatment of Covid-19 patients in China. “Since it was tried on patients with different variants of Covid-19, we expect it to be effective on Omicron as on other variants,” Professor Iqbal Chaudhry, director of the International Center for Chemical and Biological Science (ICCBS) in Karachi, where trials were conducted The trials were conducted on 300 patients who were treated at home, and would work on mild to moderate Covid-19 cases, Dr Raza Shah, principal investigator in the trials, told reporters, adding that the efficacy rate was around 82.67 per cent.   Berry compounds' heart health benefits linked to impact on platelets Sun Yat-sen University (Taiwan), January 14, 2022 The new study, published in Nutrition & Metabolism , deepens our understanding of the heart health benefits of anthocyanins, pigments found in many fruit like black raspberries, blueberries, blackberries, and blackcurrants. Chinese scientists report that 320 mg per day of purified anthocyanins, equivalent to about 100 g of fresh blueberries and blackcurrants, for 24 weeks were associated with significant reductions in platelet chemokine levels, which correlated to lower levels of inflammatory markers in people with elevated cholesterol levels. “Platelet chemokines are involved in inflammatory reactions, immune responses, and other aspects of the development of atherosclerosis,” explained researchers from Sun Yat-sen University. “These findings indicate a potential mechanism by which anthocyanins exert protective effects on the cardiovascular system, achieved through the comprehensive regulation of platelet chemokines, lipid metabolism and inflammation, in which platelet chemokines may play pivotal roles.”   OTHER NEWS Time to Boycott - Companies Discriminating Against Their Unvaccinated Employees The Naked Emperor, January 17, 2022 Suddenly, employment and discrimination laws don't exist. Here is an ever-growing list of companies that are discriminating against their employees. They need boycotting until they change their policies. ·  Finance o    Citigroup - Employees to lose their jobs by the end of the month if unvaccinated; o    Goldman Sachs - Told employees they will require a booster to work in the office from 1 February; o    JPMorgan Chase - Won't pay unvaccinated employees because they aren't allowed to go to the office; o    OneAmerica - Requiring vaccines for all employees; Healthcare o    National Health Service - Staff with direct contact with patients must have had a 1st dose by 3 February or risk losing their job at the end of March; o    Mayo Clinic - Has fired 700 unvaccinated employees; Retail o    Columbia Sportswear - Will begin firing unvaccinated employees from 1 Feb; o    Ikea - Has cut sick pay for unvaccinated staff forced to self-isolate; o    Kroger - Eliminated paid leave for unvaccinated employees who get COVID-19 and require them to pay monthly health insurance surcharges; o    Next - Sick pay cut for unvaccinated staff forced to self-isolate; o    Nike - If employees remain unvaccinated by 15 January they will be fired; o    Morrisons - Cut sick pay for unvaccinated staff in October 2021; o    Ocado - Unvaccinated isolating staff to have sick pay cut; o    Tyson Foods - Require COVID-19 vaccinations for its U.S workforce and providing $200 to full vaccinated frontline team members; o    Vans, Supreme, Timberland & The North Face (Parent company = VF Corporation) - will start firing unvaccinated employees by 31 January without severance; Services o    Wessex Water - To cut sick pay for unvaccinated staff who need to self-isolate; Tech o    Apple - Starting 24 January, employees will need proof of booster. Unvaccinated will need negative tests to go to work; o    Google - Tells unvaccinated employees they'll lose pay and will eventually be fired; o    Intel - Employees to go on unpaid leave if unvaccinated by 4 January;     The Age of Intolerance: Cancel Culture's War on Free Speech John and Nisha Whitehead, January 11, 2022 Cancel culture—political correctness amped up on steroids, the self-righteousness of a narcissistic age, and a mass-marketed pseudo-morality that is little more than fascism disguised as tolerance—has shifted us into an Age of Intolerance, policed by techno-censors, social media bullies, and government watchdogs. Everything is now fair game for censorship if it can be construed as hateful, hurtful, bigoted or offensive provided that it runs counter to the established viewpoint. In this way, the most controversial issues of our day—race, religion, sex, sexuality, politics, science, health, government corruption, police brutality, etc.—have become battlegrounds for those who claim to believe in freedom of speech but only when it favors the views and positions they support. This tendency to censor, silence, delete, label as “hateful,” and demonize viewpoints that run counter to the cultural elite is being embraced with a near-fanatical zealotry by a cult-like establishment that values conformity and group-think over individuality. This authoritarian intolerance masquerading as tolerance, civility and love (what comedian George Carlin referred to as “fascism pretending to be manners”) is the end result of a politically correct culture that has become radicalized, institutionalized and tyrannical. J.K. Rowling, author of the popular Harry Potter series, has found herself denounced as transphobic and widely shunned for daring to criticize efforts by transgender activists to erode the legal definition of sex and replace it with gender. Rowling's essay explaining her views is a powerful, articulate, well-researched piece that not only stresses the importance of free speech and women's rights while denouncing efforts by trans activists to demonize those who subscribe to “wrongthink,” but also recognizes that while the struggle over gender dysmorphia is real, concerns about safeguarding natal women and girls from abuse are also legitimate. Ironically enough, Rowling's shunning included literal book burning. Yet as Ray Bradbury once warned, “There is more than one way to burn a book. And the world is full of people running about with lit matches.” Indeed, the First Amendment is going up in flames before our eyes, but those first sparks were lit long ago and have been fed by intolerance all along the political spectrum. Consider some of the kinds of speech being targeted for censorship or outright elimination. Offensive, politically incorrect and “unsafe” speech:  Bullying, intimidating speech: Dangerous, anti-government speech:  The problem as I see it is that we've allowed ourselves to be persuaded that we need someone else to think and speak for us. And we've bought into the idea that we need the government and its corporate partners to shield us from that which is ugly or upsetting or mean. The result is a society in which we've stopped debating among ourselves, stopped thinking for ourselves, and stopped believing that we can fix our own problems and resolve our own differences. In short, we have reduced ourselves to a largely silent, passive, polarized populace incapable of working through our own problems and reliant on the government to protect us from our fears. We have allowed our fears—fear for our safety, fear of each other, fear of being labeled racist or hateful or prejudiced, etc.—to trump our freedom of speech and muzzle us far more effectively than any government edict could. Ultimately the war on free speech—and that's exactly what it is: a war being waged by Americans against other Americans—is a war that is driven by fear. By muzzling free speech, we are contributing to a growing underclass of Americans who are being told that they can't take part in American public life unless they “fit in.” Be warned: whatever we tolerate now—whatever we turn a blind eye to—whatever we rationalize when it is inflicted on others will eventually come back to imprison us, one and all.   Spain police officers in Valencia: "We are with the people, not with corrupt politicians. We are in contact with Portugal, Italy, France, Austria, Switzerland, Sweden, Germany and the Netherlands to unite all the police in Europe. Down with the health passport."     There Is Currently No COVID Medical Emergency Only Psychological Engineering Says Senior Israeli Immunologist GREAT GAME INDIA,  January 16, 2022 The attempts of governments across the globe at “psychological engineering” the population on Covid related matters has now been fully exposed after several years. A well respected immunologist in Israel heavily criticized the approach of every administration globally. In a scathing letter addressed to the Israeli Ministry of Health, a renowned immunologist denounced mass vaccination against COVID-19 and chastised officials who've already “branded” the unvaccinated “as spreaders of the disease.” The letter, penned by Professor Ehud Qimron, who is the head of Tel Aviv University's Department of Microbiology and Immunology, rips off vaccine-focused COVID tactics endorsed by authorities across the globe, which Qimron labels “doomed to fail.” “Two years late, you finally realize that a respiratory virus cannot be defeated and that any such attempt is doomed to fail,” he wrote to the Israeli health ministry. “You do not admit it, because you have admitted almost no mistake in the last two years, but in retrospect it is clear that you have failed miserably in almost all of your actions, and even the media is already having a hard time covering your shame.” Qimron reprimanded Israeli authorities for failing to recognize that COVID-19 vaccines will neither eliminate the virus or provide herd immunity, as the government's immunization campaign “failed” to do. “You refused to admit that the infection comes in waves that fade by themselves, despite years of observations and scientific knowledge,” he said. “You refused to admit that recovery is more protective than a vaccine, despite previous knowledge and observations showing that non-recovered vaccinated people are more likely to be infected than recovered people.” “You refused to admit that the vaccinated are contagious despite the observations. Based on this, you hoped to achieve herd immunity by vaccination — and you failed in that as well.” According to research, immunizations essentially inflict more harm than that of the virus on its own in younger demographics. According to a study released last month by British researchers, the jabs dramatically raise the chance of potentially life-threatening heart inflammation in males under 40 years old compared to COVID-19 and may lead in more lethal types of the heart ailment. “You have ignored many reports of changes in menstrual intensity and menstrual cycle times,” Qimron noted in his letter to the health ministry. “You hid data that allows for objective and proper research. Instead, you chose to publish non-objective articles together with senior Pfizer executives on the effectiveness and safety of vaccines.” “The truth is that you have brought the public's trust in you to an unprecedented low, and you have eroded your status as a source of authority,” he alleged, citing increased incidences of mental illness and misbehavior among Israeli pupils amid COVID regulations. “You have destroyed the education of our children and their future,” said Qimron. “You made children feel guilty, scared, smoke, drink, get addicted, drop out, and quarrel, as school principals around the country attest. You have harmed livelihoods, the economy, human rights, mental health and physical health.” You slandered colleagues who did not surrender to you, you turned the people against each other, divided society and polarized the discourse. You branded, without any scientific basis, people who chose not to get vaccinated as enemies of the public and as spreaders of disease. You promote, in an unprecedented way, a draconian policy of discrimination, denial of rights and selection of people, including children, for their medical choice. A selection that lacks any epidemiological justification. “There is currently no medical emergency,” the immunologist continued. “The only emergency now is that you still set policies and hold huge budgets for propaganda and psychological engineering instead of directing them to strengthen the health care system.” “This emergency must stop!”   Serious Health Risks of Covid-19 Vaccines: Open Letter to Cornell University Board of Trustees and President Martha Pollack Cornell University Community, January 12, 2022 Dear President Pollack and Cornell Board of Trustees, We are students, parents, alumni, faculty, and staff of Cornell University. We are grateful for Cornell's efforts at keeping students and the Ithaca community safe during this pandemic. As concerned members of the global Big Red family, we write this open letter to express our strong opposition to Cornell's Covid-19 booster mandate. In light of new data available about both the vaccine and the virus, we urge you to change the “mandate” to a “recommendation” based on the factors outlined below.  We appreciate that the booster mandate and new procedures for the spring term stem from the good intention to prevent severe illness. But as with any public health policy, many factors — scientific, ethical, and legal — must be considered and weighed. We are concerned that Cornell, in issuing this booster mandate, has overlooked recent and evolving scientific data regarding the vaccine and the virus that makes a booster mandate inappropriate and unnecessary, raising serious ethical and legal questions. In December 2021, Cornell identified over 1,600 Covid-19 positive cases with “every case of the Omicron variant to date [being] found in fully vaccinated students, a portion of whom had also received a booster shot.” Cornell's own data highlights that vaccination, even with the booster, has very limited capability in stopping virus transmission. A similar conclusion has been reached by CDC's research: vaccinated people seem to transmit Covid-19 similarly to unvaccinated people. The virus will continue to be transmitted among our highly vaccinated campuses. In a recent campus-wide email, Cornell explicitly acknowledged the impossibility of containing or eliminating Omicron, the flu, or other respiratory illnesses, which is why it will “shift from counting positive cases.”  As so many students test positive, they are, in essence, receiving a natural booster based on the very latest variants of the virus. And yet, Cornell is ignoring the natural immunity in these students and mandating a booster injection based on older variants, which Cornell knows is ineffective at stopping the spread of Covid-19 in the Cornell community. This decision is counter to science and seems like it was made less to promote students' health and more to achieve some other unstated goal of the administration. Otherwise, why require a booster injection that is ineffective, and potentially dangerous, for students who are naturally contracting and fighting off a virus that many scientists believe is becoming more endemic than pandemic? Mounting evidence points to serious risks from exposure to the Covid-19 vaccines. The latest scientific research shows that Covid-19 vaccine side effects such as myocarditis, thrombosis with thrombocytopenia syndrome, and pericarditis are more common in young people than we think (see references 1-5 listed below). Recently, an Oxford-conducted study of men under the age of 40 demonstrated that the risk of myocarditis after one dose mRNA exceeds the risk of myocarditis from an actual Covid-19 infection. Even more alarmingly, the CDC's Vaccine Adverse Event Reporting System (VAERS) indicates that there were over 15,000 Covid-19 vaccine related death cases in 2021, compared with the previous average of 158 vaccine related deaths per year (Pre-Covid-19), in the context of a yearly total of 280 million injections and 70 different vaccines. This data shows that, compared to other vaccines, Covid-19 injections carry around 100 times the risk of death. Considering new data on the virus and the vaccine, the university may very well cause disability or death by imposing further vaccine requirements, and it will have to bear the responsibility. Please do the right thing, and end this unnecessary and unethical mandate. EU Regulators, WHO Call for End to COVID Boosters, Citing Evidence Strategy Is Failing EU drug regulators, World Health Organization experts and the former chairman of the UK's COVID task force all cited mounting evidence mRNA COVID boosters aren't working and the strategy should be dropped. Childrens Health Defense, January 12, 2022   European Union drug regulators warned frequent COVID boosters could adversely affect the immune system and said there are currently no data to support repeated doses. According to the European Medicines Agency (EMA), continued booster doses every four months could pose a risk of overloading people's immune systems and lead to fatigue. Instead, the agency recommended countries space out the intervals between boosters and coordinate their programs with the onset of the cold season in each hemisphere — following blueprints of influenza vaccination strategies. Boosters “can be done once, or maybe twice, but it's not something that we can think should be repeated constantly,” Cavaleri said. “We need to think about how we can transition from the current pandemic setting to a more endemic setting.” The World Health Organization's (WHO) Technical Advisory Group on COVID-19 Vaccine Composition (TAG-CO-VAC) on Jan. 11 warned, “a vaccination strategy based on repeated booster doses of the original vaccine composition is unlikely to be appropriate or sustainable.” The expert group, created by the WHO to assess the performance of COVID vaccines, said providing fresh doses of already existing vaccines as new strains of the virus emerge is not the best way to fight a pandemic. “It's over, people,” Alex Berenson, former New York Times reporter and best-selling author, wrote. “Aside from a few unlucky Israelis, no one is going to receive a fourth dose of the original vaccine.” Berenson wrote: “Everyone with eyes can see it doesn't work against Omicron — and if you haven't gotten a third dose, at this point, why would you? You are getting at most weeks of marginally improved protection for potentially severe side effects. “Instead the WHO is now promising/demanding vaccines based on whatever the dominant Sars-Cov-2 strain is at the moment. That promise is as empty as all the others the health bureaucrats and vaccine companies have made.”   60% Of Omicron Hospitalization Numbers Were Incorrect Admits Canada's Chief Medical Officer GREAT GAME INDIA. January 17, 2022 Shocking statistics regarding Canada's Omicron hospitalizations being incorrect has come to light recently. The Premier of Alberta has claimed a staggering 60% disparity between the actual figures. Alberta Premier Jason Kenney and Alberta Chief Medical Officer Deena Hinshaw both confirmed that public figures for ICU capacity and COVID admissions were up to 60% incorrect. “Of the 163 omicron patients in hospital, 66 have a primary COVID diagnosis … and of the 14 omicron patients in ICU, 11 have a primary COVID diagnosis,” he stated. As per Kenney, this indicates that 60% of individuals labelled as staying in the hospital for an omicron ailment weren't there because they arrived sick with COVID, and also that the ICU statistics reflect the same rationale, with more than 20% of recorded stays being unintentional. This is consistent with developments found throughout Canada, as provincial medical authorities have shifted their focus and begun to release increasingly specific data on hospitalizations.

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.10.14.337824v1?rss=1 Authors: Schwab, M., De Trizio, I., Shiu, J.-Y., Ghobrial, M., Surucu, O., Girolamo, F., Errede, M., Yilmaz, M., Haybaeck, J., Moiraghi, A., Monnier, P., Lawler, S., Greenfield, J. P., Radovanovic, I., Frei, K., Schlapbach, R., Vogel, V., Virgintino, D., De Bock, K., Walchli, T. Abstract: Glioblastoma (GBM) is amongst the deadliest human cancers and is characterized by high levels of vascularisation. Angiogenesis is highly dynamic during brain development and almost quiescent in the adult brain, but is reactivated in vascular-dependent CNS pathologies such as brain tumors. Nucleolin (NCL) is a known regulator of cell proliferation and angiogenesis, but its roles on physiological and pathological brain vasculature remain unknown. Here, we studied the expression of Nucleolin in the neurovascular unit (NVU) in human fetal brains and human gliomas in vivo as well as its effects on sprouting angiogenesis and endothelial metabolism in vitro. Nucleolin is highly expressed in endothelial- and perivascular cells during brain development, downregulated in the adult brain, and upregulated in glioma. Moreover, Nucleolin expression in tumor- and blood vessel cells correlated with glioma malignancy in vivo. In culture, siRNA-mediated NCL knockdown reduced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) sprouting angiogenesis, proliferation and filopodia extension, and reduced glucose metabolism. Mechanistically, RNA sequencing of Nucleolin knockdown in HUVECs revealed a putative p53-TIGAR-HK2 regulation of endothelial glycolysis. These findings identify Nucleolin as a neurodevelopmental factor reactivated in glioma that positively regulates sprouting angiogenesis and endothelial metabolism. Our findings have important implications in therapeutic targeting of glioma. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

mTOR-Inhibitoren (Synonym: Rapamycin) sind Wirkstoffe, die sowohl in der Immunsuppression als auch in der antiproliferativen Therapie systemisch und lokal Verwendung finden. In Vorversuchen unserer Arbeitsgruppe mit Zellkulturen zeigte sich schnell ein großes Adsorptionspotential von Rapamycin – beziehungsweise von dessen Derivat Everolimus – an die Oberflächen von Zellkulturflaschen. Diese Adsorption hängt im Wesentlichen von zwei Faktoren ab: dem Proteingehalt des Mediums und der spezifischen Oberfläche der Zellkulturflaschen. Um dies zu zeigen, wurden verschiedene gebräuchliche Zellkulturflaschen (Nunclon, Ultra-low-attachment, Weichglas, unbehandelte Polystyren-Oberflächen und Polystyren Oberflächen beschichtet mit Collagen 1 beziehungsweise Poly-D-Lysin) sowie Duranglas-Petrischalen ausgewählt. Die Oberflächen der Zellkulturflaschen wurden eine Stunde mit Medium mit einer definierten Menge an Everolimus bedeckt, gespült und wiederum eine Stunde mit DMSO bedeckt. DMSO löst die Substanz wieder von der Oberfläche ab. Die Everolimuskonzentrationen im Medium nach einer Stunde und in der DMSO-Lösung wurden mittels LC-MS/MS bestimmt. Es zeigte sich signifikante Adsorption von Everolimus in absteigender Reihenfolge: Ultra-low-attachment > Unbehandeltes Polystyren > Collagen 1 > Nunclon > Poly-D Lysin > Weichglas > Duranglas (bei 10% FCS in Medium) und Ultra-low-attachment > Unbehandelt > Collagen 1 > Weichglas > Poly-D-Lysin > Duranglas (bei 30% FCS in Medium). Im Folgeversuch wurden vier der Zellkulturflaschen ausgewählt (Nunclon, Unbehandelt, Collagen 1, Duranglas-Petrischalen) und untersucht, ob die reine Adsorption von Everolimus an die Oberfläche ohne Everolimus im Medium negative Effekte auf das Zellwachstum hat. Dies konnte bei drei Zelllinien (293T, VSMC, HUVEC) mittels Zellzählung demonstriert werden. Bei allen drei Zelllinien wurden p-p70s6K- Western Blots durchgeführt. Die p-p70s6K ist ein downstream gelegenes Phosphorylierungsprodukt von mTOR, welches wiederum von Rapamycin/ Everolimus gehemmt wird. Teilweise zeigte sich hier eine absteigende Phosphorylierung. Bei HUVEC- Zellen wurde zusätzlich die Expression von VEGF und p-p70s6K mittels ELISA untersucht. VEGF ist ein Faktor, der Wachstumssignale spezifisch an Gefäß- Endothelzellen vermittelt. Hier konnte entgegen der Erwartungen sogar eine Zunahme der Expression mit steigender Everolimuskonzentration gemessen werden. Neuere Studien legen jedoch nahe, dass VEGF nicht ausschließlich über TOR aktiviert wird. Bei p-p70s6K zeigte sich die erwartete Abnahme der Expression. Die Versuche weisen auf eine signifikante Beeinflussung des Zellwachstums durch Everolimusadsorption an Oberflächen hin. Inwiefern sich Adsorption bei Zellversuchen mit Everolimus in Lösung auswirkt, ist noch unklar. Eine Minderung der Everolimuswirkung wäre denkbar. Um die Oberflächenadsorption bei Versuchen mit Everolimus möglichst gering zu halten, empfiehlt unsere Arbeitsgruppe anhand der Versuchsergebnisse die Kultivierung auf wenig absorbierenden Oberflächen wie Duranglas beziehungsweise die Erhöhung der FCS-Konzentration in Lösung, soweit von den Zellen toleriert.

Sylvain Galvani and Timothy Hla explain why the lipid S1P protects blood vessels when it is bound to HDL.

Background: Gap junctional calcium signal propagation (transfer of calcium or a calcium releasing messenger via gap junctions) between vascular cells has been shown to be involved in the control of vascular tone. We have shown before that nitric oxide (NO) inhibits gap junctional communication in HeLa cells exclusively expressing connexin 37 (HeLa-Cx37) but not in HeLa-Cx40 or HeLa-Cx43. Here we studied the effect of NO on the gap junctional calcium signal propagation in endothelial cells which, in addition to Cx37, also express Cx40 and Cx43. Furthermore, we analyzed the impact of NO on intermuscle and on myoendothelial gap junction-dependent calcium signal propagation. Since specific effects of NO at one of these three junctional areas (interendothelial/myoendothelial/ intermuscle) may depend on a differential membrane localization of the connexins, we also studied the distribution of the vascular connexins in small resistance arteries. Results: In endothelial (HUVEC) or smooth muscle cells (HUVSMC) alone, NO did not affect gap junctional Ca2+ signal propagation as assessed by analyzing the spread of Ca2+ signals after mechanical stimulation of a single cell. In contrast, at myoendothelial junctions, it decreased Ca2+ signal propagation in both directions by about 60% (co-cultures of HUVEC and HUVSMC). This resulted in a longer maintenance of calcium elevation at the endothelial side and a faster calcium signal propagation at the smooth muscle side, respectively. Immunohistochemical stainings (confocal and two-photon-microscopy) of cells in co-cultures or of small arteries revealed that Cx37 expression was relatively higher in endothelial cells adjoining smooth muscle (culture) or in potential areas of myoendothelial junctions (arteries). Accordingly, Cx37 - in contrast to Cx40 - was not only expressed on the endothelial surface of small arteries but also in deeper layers (corresponding to the internal elastic lamina IEL). Holes of the IEL where myoendothelial contacts can only occur, stained significantly more frequently for Cx37 and Cx43 than for Cx40 (endothelium) or Cx45 (smooth muscle). Conclusion: NO modulates the calcium signal propagation specifically between endothelial and smooth muscle cells. The effect is due to an augmented distribution of Cx37 towards myoendothelial contact areas and potentially counteracts endothelial Ca2+ signal loss from endothelial to smooth muscle cells. This targeted effect of NO may optimize calcium dependent endothelial vasomotor function.

The potential toxicity of nanoparticles currently raises many discussions in public and scientific life. The question whether nanoparticles are a threat to human health cannot be answered to complete satisfaction at the current state of knowledge. A versatile tool to investigate nanotoxicity are fluorescence microscopy and live-cell imaging as they provide excellent resolution and direct insight into cellular processes. In this work fluorescence based methods are used to investigate the influence of silica nanoparticles on human health, more precisely on the blood vessel system. At first, the synthesis and characterization of the following three different types of perylene labeled amorphous SiO 2 nanoparticle species is described: surface-labeled monodisperse particles, particles with a dye-containing silica core and a non-fluorescent silica shell and a surface-labeled nanoparticle network. The labeling of nanoparticles should not induce artificial cytotoxic effects when they are used for cytotoxicity assessment. This is achieved either by incorporating the dye into the nanoparticle’s structure or by covering only a minor surface fraction by dye molecules. The surface-labeled silica species are used to investigate nanotoxicity throughout this thesis. Another prerequisite for reliable dose-dependent nanotoxicity studies is the knowledge about the number of nanoparticles taken up by an individual cell. We therefore developed the Nano_In_Cell_3D ImageJ macro which is able to quantify nanoparticle uptake into cells. Nano_In_Cell_3D uses the fluorescence image of the cell membrane to segment the cell into an intracellular space, a transition region (e-membrane region) and an extracellular space. The number of present nanoparticles is calculated from the fluorescence intensity of each region. This custom-made method offers the possibility to quantify nanoparticles in the individual cellular regions. Nano_In_Cell_3D was validated by comparing the results to the well established quenching method. By using Nano_In_Cell_3D we could show that the cytotoxic impact of nanoparticles onto different cell lines correlates to their intracellular uptake. Primary human vascular endothelial cells (HUVEC) take up 310 nm silica nanoparticles more efficiently and are more sensitive to this nanoparticle species than cancer cells derived from the cervix carcinoma (HeLa). Upon nanoparticle contact, cellular viability of HUVEC is strongly reduced and membrane permeability increases leading to apoptosis. In contrast, HeLa cells show a considerable lower effect in both cellular viability and membrane permeability and do not show apoptosis. In consistence to these findings, HUVEC take up approximately 20 times more particles than HeLa cells within 4h. Interestingly nanoparticle uptake is clathrin mediated in both cell types. HUVEC grow in the blood vessel system under natural conditions and are therefore exposed to blood flow conditions. The latter can be simulated using a microfluidic system. We chose a microfluidic system based on the surface acoustic wave (SAW) technology which was characterized concerning fluid evaporation behavior, fluid temperature and flow velocities. Based on these results the system can be further improved to allow the assessment of nanotoxicity at blood flow conditions in a next step. The last part of the thesis focuses on interactions between silica nanoparticles and giant unilamellar vesicles (GUV)s. The latter serve as a simple model for the cell membrane. Nanoparticles in contact with the lipid membrane influence the morphological behavior of the vesicles during phase transition. In absence of nanoparticles, vesicles typically show extracellular budding processes. Nanoparticlesin contact with the cell membrane induce intravesicular budding of daughter vesicles, similar to endocytosis observed in living cells. Furthermore exocytosis processes were observed where daughter vesicles crossed the GUV membrane and were transferred from the intravesicular to the extravesicular space. These observations suggest that the fundamental mechanism of endocytosis can partly be explained by simple physical effects. In summary, this theses provides an experimental strategy to investigate the impact of nanoparticles onto human cells using SiO 2 nanoparticles as an example. Starting with the synthesis and characterization of nanoparticles it tackles the question how to quantify nanoparticle uptake into cells. Furthermore we could prove that cytotoxic effects can be correlated to nanoparticle uptake and were able to show that nanoparticles influence artificial membranes which is a first step to understand the basic mechanisms of nano-toxicity. The methodology developed in this thesis is expected to provide insight into cytotoxicity of a broad variety of different nanoparticle types.

Das Gefäßendothel hat eine wichtige Funktion in der lokalen Regulation des Gefäßtonus. Veränderungen im Blutfluss („shear stress“) und/oder die Bindung von vasoaktiven Substanzen (Histamin, ATP) führen über einen endothelialen Calciumanstieg zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), das in der benachbarten glatten Gefäßmuskulatur zur Relaxation der Zellen und damit zur Dilatation des Gefäßes führt. Für eine wirkungsvolle Endothelfunktion ist dabei ein synchrones Verhalten aller Endothelzellen - als Folge eines synchronen zytosolischen Calciumanstiegs – eine wichtige Voraussetzung. Für die vorliegende Arbeit wurde postuliert, dass eine synchrone Calciumantwort nach Stimulation der Endothelzellen mit Histamin oder ATP entscheidend von der Gap Junction Kopplung zwischen den Zellen abhängt. Dieser Kopplung käme somit eine neue modulierende Rolle für die Reaktion des Endothels auf vasodilatierende Substanzen zu. Kultivierte humane Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC) wurden mit Histamin oder ATP vor, während und nach pharmakologischer Gap Junction Blockade stimuliert und der zeitliche Verlauf des Calciumanstiegs in allen individuellen Zellen eines Sichtfeldes wurde mit Hilfe eines Mikroskop-basierten Kamerasystems analysiert. Als Maß für die calciumabhängige NO-Bildung wurde der Histamin-induzierte cGMP Anstieg in Endothelzellen unter Kontrollbedingungen und nach Gap Junction Inhibition untersucht. Die Verteilung von Histamin- und ATP-Rezeptoren innerhalb der HUVECPopulation wurde mit Durchflusszytometrie bzw. Immunfluoreszenz analysiert. Zusätzlich wurde nach mechanischer Stimulation von Einzelzellen untersucht, ob der von Gap Junctions abhängige zytosolische Calciumanstieg in Nachbarzellen („Calciumwelle“) auf der Ausbreitung von Ca2+ und/oder der Ausbreitung des calciumfreisetzenden Signalstoffs IP3 beruht. Ausgehend von initial reagierenden Zellen erfolgte der Calciumanstieg nach Zugabe von Histamin und ATP zeitlich verzögert in deren Nachbarzellen. Während einer Blockade der gap-junctionalen Kommunikation konnte nur in etwa 40 % der Zellen eine Calciumreaktion beobachtet werden. Diese Beobachtungen an HUVEC wurden zudem in ersten Versuchen am isolierten Gefäß nach Stimulation mit ATP bestätigt. Die Histaminrezeptoren waren in HUVEC-Kulturen inhomogen verteilt und nur in einem Teil der Zellen nachweisbar. Außerdem war nach einer Gap Junction Blockade die cGMP-Konzentration (als Maß für die NO-Bildung) in HUVEC-Zelllysat nach Stimulation mit Histamin deutlich verringert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass IP3 eine wichtige Rolle für die Ausbreitung der Calciumwelle über Gap Junctions spielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions für eine synchrone Antwort des Endothels auf die vasoaktiven Substanzen Histamin und ATP wesentlich ist. Eine Inhibition der interzellulären Kommunikation führt zu einem verminderten Calciumanstieg und verminderter NO-Produktion in der Endothelschicht. Gap Junctions modulieren somit die Sensitivität des Endothels auf vasoaktive Substanzen. Eine gezielte Beeinflussung der Gap Junction-Permeabilität des Endothels könnte somit ein vielversprechender Ansatzpunkt für die Therapie von pathophysiologischen Gefäßveränderungen wie Atherosklerose oder Diabetes darstellen, die mit vasomotorischen Endothelfunktionsstörungen einhergehen.

Cathepsine sind lysosomale Cysteinproteasen, die neben der allgemeinen Proteindegradation in Lysosomen auch spezifische Funktionen ausüben, die eine limitierte Proteolyse erfordern. Zudem werden Cathepsine sezerniert, weshalb man sie auch im Extrazellulärraum findet, wo sie ebenfalls an verschiedenen biologischen Vorgängen, wie etwa der Zellmigration/Invasion, teilnehmen. Über Cathepsin X, einen relativ neu entdeckten Vertreter dieser Proteinklasse, war zu Beginn der Promotionsarbeit noch wenig bekannt. Die Struktur und das Aktivitätsprofil konnten zwar bereits gelöst werden, über mögliche (patho-)physiologische Funktionen gab es jedoch noch keine Erkenntnisse. Das Hauptziel meiner Untersuchungen war daher, mittels geeigneter Methoden nähere Aufschlüsse über die Rolle von Cathepsin X oder seiner Proform innerhalb und außerhalb der Zelle zu erlangen. Dies sollte vorwiegend durch die Analyse der Expression und Sekretion dieser Protease, sowie durch das Auffinden von Interaktionspartnern erfolgen. Wie sich in Vorversuchen zeigte, wird Cathepsin X in humanen Leukozyten unterschiedlich stark exprimiert. Da eine hohe Expression insbesondere in Monozyten vorlag, wurde für weitere Analysen das Zellmodell THP-1 eingesetzt, das auch für die Differenzierung zu Makrophagen-ähnlichen Zellen durch Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) oder all-trans Retinsäure (ATRA) verwendet werden kann. Interessanterweise zeigten diese Agenzien unterschiedliche Auswirkungen auf die Expression und Sekretion von Cathepsin X. So wurde mit PMA eine starke intra- und extrazelluläre Erhöhung der Protease verzeichnet, während mit ATRA das Gegenteil der Fall war. Da eine differenzielle Expression von Cathepsin X in Leukozyten auf eine mögliche Funktion in der Entzündungsantwort hindeutet, schien eine Untersuchung der Wirkung von proinflammatorischen Zytokinen und extrazellulären Matrix (EZM)-Proteinen sinnvoll, weil diese Faktoren ebenfalls die Sekretion von Proteasen beeinflussen können. Die untersuchten Zytokine hatten allerdings keinen Effekt auf die Sekretion von Cathepsin X aus THP-1-Zellen, wohingegen mit dem EZM-Protein Vitronektin eine Verdopplung der Cathepsin-X-Konzentration im Medium beobachtet wurde. In diesem Kontext konnte nachgewiesen werden, dass Vitronektin durch die Interaktion mit dem Zelloberflächenrezeptor Integrin avb3 den Sekretionsapparat der Zelle beeinflusst, wobei offensichtlich das Sequenzmotiv Arginin-Glyzin-Aspartat (RGD), welches in Vitronektin enthalten ist, für diesen Vorgang entscheidend ist. Neben Cathepsin X wurde auch für die Cathepsine B und L eine erhöhte Freisetzung nach Inkubation mit Vitronektin gemessen, was zeigt, dass dieser durch das EZM-Protein ausgelöste Mechanismus nicht auf Cathepsin X beschränkt ist. Umgekehrt ließ sich in einem weiteren Zellmodell (HUVEC) durch den Einsatz von „small-interfering RNA“ (siRNA) die Expression von Cathepsin X erniedrigen, was zu einer verminderten Migration der HUVEC in einem Invasionsversuch führte. Dies deutet auf eine Funktion von Cathepsin X in der Zellmotilität hin. Weil Cathepsin X, ähnlich wie Vitronektin, ein exponiertes RGD-Motiv in seiner Proregion aufweist, sollte nun eine mögliche Interaktion mit Integrinen untersucht werden. Tatsächlich ließ sich eine RGD-abhängige Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 zeigen. Somit werden in dieser Arbeit zwei wesentliche neue Aspekte in der Regulation der Sekretion und seiner Beteiligung an Migrationsvorgängen gezeigt, wobei die Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 eine besondere Rolle zu spielen scheint. Ob diese beiden Vorgänge miteinander gekoppelt sind, konnte mit den bisherigen Ergebnissen noch nicht bewiesen werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse jedoch darauf hin, dass extrazelluläres (Pro)Cathepsin X neben seiner Rolle als Protease auch nicht-proteolytische Funktionen, beispielsweise als Ligand bestimmter Zelloberflächenstrukturen ausüben kann. Dieser Aspekt könnte im Hinblick auf eine therapeutische Inhibition von Angiogenese und Metastasierung von Tumorzellen durch Antikörper gegen Cathepsin X und/oder Integrine von großem Nutzen sein.

Der Hauptregulator der vaskulären Homöostase ist das Endothel, welches eine Vielzahl an vasoprotektiven Effekten ausübt. Die Integrität und Regulation des endothelialen Zellayers der Blutgefäße ist von großer Bedeutung bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die Basis dieser Phänomene ist in der dynamischen und exakt kontrollierten Regulation des Zytoskeletts begründet. Die wichtigsten Regulatoren des Zytoskeletts stellen die GTPasen der Rho-Familie und deren Effektoren dar. Im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten wir in primären humanen Nabelschnurendothelzellen, eine neu in Erscheinung tretende Zytoskelettstruktur, der wir in Anlehnung an ähnliche Proteingruppierungen in monozytären Zellen den Namen HUVEC-Podosomen gaben. HUVEC-Podosomen sind aufgrund ihrer Komponenten mit klassischen Podosomen vergleichbar. Allerdings gibt es zwischen beiden Strukturen auch Unterschiede, denn während klassische Podosomen aus Ring und Kern bestehen, zeigen HUVEC-Podosomen eine zweischichtige Architektur. Wie wir weiterhin nachweisen konnten liegen Podosomen der Endothelzellen an der ventralen Plasmamembran und haben engen Kontakt mit der extrazellulären Matrix.. Somit fungieren sie, wie auch die klassischen Podosomen, als Adhäsionsstrukturen. Sie dienen aber nicht nur der Adhäsion, denn wie bei FITC-markierten Monolayer-Versuchen gezeigt werden konnte, haben sie auch eine proteolytische Aktivität, die insbesondere beim Matrixverdau und der daran anschließenden Migration von Bedeutung ist. Ferner können wir zeigen, daß HUVEC-Podosomen in ruhenden, konfluenten Zellayern nicht beobachtet werden können. Sie lassen sich aber in migratorischen (subkonfluent oder nach Verwundung) HUVEC, in hoher Anzahl und diversen ringförmigen Formationen, vorwiegend in Bereichen nahe dem Leitsaum nachweisen. Wie wir mit Hilfe von live cell imaging-Experimenten zeigen konnten, sind diese Strukturen hochdynamisch und breiten sich wellenartig mit einem weiten Radius innerhalb einer Zelle aus. Scheinbar dispergieren diese Formationen oder fusionieren mit der Zellplasma, wodurch sie die enthaltenen Proteine für viele andere zytoplasmatische oder membranöse Prozesse freigeben könnten. Durch Experimente, in denen Zytokine wie VEGF, bzw. Zytokin-produzierende Zellen wie Monozyten den HUVEC-Kulturen zugegeben wurden, konnten wir zeigen, daß diese die Bildung von Podosomen induzieren und sogar erheblich steigern. Unsere Arbeiten mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GTPase-Mutanten zeigten weiterhin, daß diese bei der Organisation und Entstehung der HUVEC-Podosomen von entscheidender Bedeutung sind. Ferner konnte mit Hilfe von Mikroinjektionsversuchen von einer Teildomäne (A) des N-WASP-Proteins verifiziert werden, daß der Mechanismus zur Bildung der HUVEC-Podosomen eine Arp2/3-abhängige Aktinnukleation beinhaltet. Weiterhin ist die Bildung dieser Adhäsionsstrukturen auch von Src Tyrosinkinasen und PI3-Kinase abhängig. Eine der Komponenten von HUVEC-Podosomen ist das Markerprotein Drebrin. Drebrin kann nur in diesen Strukturen und an Zell-Zell-Kontakten in HUVEC detektiert werden. Mikroinjektionsversuche von diversen Konstrukten der unterschiedlichen Regionen von Drebrin zeigen, daß dieses Protein von großer Bedeutung für die Bildung und Struktur der HUVEC-Podosomen ist. Die einzelnen Protein-Protein-Interaktionen von podosomalen Komponenten untereinander und mit Drebrin wurden mit Hilfe von Immunpräzipitation getestet. Es ist uns jedoch nicht gelungen einen Drebrin-Interaktionspartner zu finden. Eine Interaktion von Drebrin konnten wir nur mit Drebrin selbst in Form einer Dimerisierung bzw. mit F-Aktin nachgeweisen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß es sich bei HUVEC-Podosomen um ein multifunktionelles Organell handelt. Wie wir in dieser Arbeit darstellen, sind HUVEC-Podosomen Adhäsionsstrukturen. Sie können am häufigsten am Leitsaum detektiert werden, wobei ihre Generierung nur in Zellen mit migratorischen Phänotyp (in Zellen am Wundrand oder in subkonfluenten layern) detektiert werden kann. Beide Tatsachen sprechen dafür, daß HUVEC-Podosomen den Prozeß der Migration unterstützen. Zudem können diese Adhäsionsstrukturen die Matrix degradieren, wodurch sie so wiederum zur Migration aber auch invasiven Prozessen beitragen könnten. HUVEC-Podosomen könnten auch eine Funktion als Speicherform ihrer Komponenten ausüben. Sie fusionieren mit der Zellmembran und liefern so möglicherweise notwendige Proteine und Signale, die die Induktion von Protrusionen ermöglichen und so migratorische Prozesse unterstützen könnten. Durch die Involvierung u. a. von Drebrin, das an Zell-Grenzen detektiert werden kann, können HUVEC-Podosomen möglicherweise einen Einfluß auf Zell-Zell-Kontakte und Vorgänge wie Angiogenese ausüben. Dies bestätigt auch die Tatsache, daß Zytokine die Anzahl an Zellen erhöhen, die HUVEC-Podosomen generieren können und Vorgänge wie Wundheilung beschleunigt ablaufen lassen und so u. U. eine klinische Relevanz haben könnten.

Vaskuläre Erkrankungen sind als Ursache für Mortalität und Morbidität führend in westlichen Industrieländern. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass oxLDL eine herausragende Rolle bei der Atheroskleroseinduktion bzw. -progression zukommt. Die initiale Wirkung von im Blut zirkulierendem oxLDL findet auf der Ebene der Interaktion mit dem vaskulären Endothel statt und resultiert in der endothelialen Dysfunktion. Da die Zellfunktion durch die Integrität der Endothelzellschicht bzw. deren interzelluläre Kommunikation mitbestimmt ist, wäre es denkbar, dass für die oxLDL-induzierten Veränderungen im Endothel u. a. die Beeinflussung der Zell-Zell-Kommunikation via Gap Junctions eine Rolle spielt. Bislang war jedoch wenig darüber bekannt, welchen Einfluss oxLDL auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt. Außerdem war es nicht geklärt, inwiefern diese Veränderungen in der Zell-Zell-Kommunikation die Induktion und den Schweregrad der oxLDL-induzierten Apoptose beeinflussen. Ziele der Studie waren daher i) zu analysieren, ob und über welche Mechanismen oxLDL einen Einfluss auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt, ii) zu untersuchen, welche Bedeutung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions bzw. einzelnen Connexinen bei der Induktion der Apoptose zukommt. Mittels der Dye-Transfer-Methode nach Farbstoffinjektion in eine einzelne Zelle konnten wir zeigen, dass oxLDL eine signifikante Steigerung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions in HUVEC induziert. Dieser Effekt ist dosisabhängig: er zeigte sich nur bei geringen oxLDL-Konzentrationen (15 bzw. 26 μg/ml) und wurde bei weiterer Erhöhung der Konzentration bis auf 100 μg/ml wiederum aufgehoben. Die durch oxLDL verstärkte Zell-Zell-Kommunikation wurde in Endothelzellen durch einen cAMP/PKA abhängigen Mechanismus vermittelt, wobei die cAMP-Freisetzung durch ein Cyclooxygenaseprodukt, wahrscheinlich Prostacyclin, getriggert wurde. Mittels immunhistochemischer Färbungen für Cx37 und Cx43 konnten wir nicht bestätigen, dass die oxLDL-induzierte Verstärkung der Zell-Zell-Kommunikation infolge einer Hochregulation der Connexin-Expression auftritt. Im zweiten Teil der Studie wurde der Einfluss von oxLDL auf die Apoptoseinduktion analysiert. Die Apoptose wurde mittels der Annexin V - Propidium Iodid Färbung bzw. durch Nachweis des Mitochondrienmembranpotentials durchflusszytometrisch erfasst. OxLDL verursachte einen signifikanten Anstieg der Apoptoserate in HUVEC. Zur Aufklärung der Rolle bestimmter Connexine wurden weitere Experimenten in Cx-transfizierten HeLa-Zellen durchgeführt. In diesen Zellen erhöhen einzelne Connexine die Apoptoserate in unterschiedlichem Ausmaß: Cx43 > Cx40 > Cx37. Um zu prüfen, ob die bloße Anwesenheit der Connexine dafür von Bedeutung war oder ob von Connexinen gebildete Gap Junctions dafür von Bedeutung waren, wurden weitere Experimente durchgeführt. Dafür wurden in einem neuen Versuchsansatz Zellen in Suspension (keine Zell-Zell-Kontakte) sowie adhärente Zellen im Monolayer (bestehende Zell-Zell- Kontakte) einer proapoptotischen Stimulation durch Streptonigrin unterzogen. Die Zellen in Suspension wiesen erst zu einem deutlich späteren Zeitpunkt apoptotische Veränderungen auf. Das deutet auf eine Beteiligung der Gap Junctions bei der Apoptoseinduktion hin. Diese Interpretation wurde durch Befunde einer weiteren Versuchsreihe bestätigt. Bei Inkubation von apoptotischen Cx43-positiven Zellen mit intakten Zellen wurde die Apoptoserate der Letzteren nur dann signifikant erhöht, wenn diese ebenfalls Connexin 43 exprimierten und funktionelle Gap Junctions mit den bereits apoptotischen Zellen de novo bilden konnten. Somit demonstriert diese Arbeit, dass Gap Junctions eine wichtige Rolle bei der Apoptoseinduktion spielen. In nachfolgenden Studien soll in Atherosklerose-Modellen überprüft werden, ob und inwiefern die hier beschriebenen Mechanismen auch unter den In-Vivo-Bedingungen bei den oxLDL-assoziierten Gefäß/Endothelschäden eine Rolle spielen.

Endothelial cell survival is indispensable to maintain endothelial integrity and initiate new vessel formation. We investigated the role of SHP-2 in proliferation, survival and sprouting of human microvascular- and umbilical vein endothelial cells (HMEC, HUVEC) using antisense oligonucleotides (AS-ODN) and a pharmacological SHP-2 inhibitor (PtpI IV). Knock-down of SHP-2 decreased bFGF and PDGF dependent endothelial cell proliferation (p

Tumor angiogenesis is a process that requires migration, proliferation, and differentiation of endothelial cells. We hypothesized that decrease in pancreatic tumor growth due to inhibition of src activity is associated with the inability of src kinase to trigger a network of such signaling processes, which finally leads to endothelial cell death and dormancy of angiogenesis. The therapeutic efficacy of Src kinase inhibitor AZM475271 was tested in nude mice orthotopically xenografted with L3.6pl pancreatic carcinoma cells. No liver metastases and peritoneal carcinosis were detected and a significant effect on the average pancreatic tumor burden was observed following treatment with AZM475271, which in turn correlated with a decrease in cell proliferation and an increase in apoptotic endothelial cells. AZM475271 was shown to significantly inhibit migration of human umbilical vein endothelial cells in an in vitro Boyden Chamber cell migration assay. In a rat aortic ring assay we could demonstrate as well inhibition of endothelial cell migration and sprouting following therapy with Src kinase inhibitor at similar doses. Furthermore, we could show reduced proliferation of HUVECs determined with the TACS MTT Cell Viability Assay Kit. The blockade of Src kinase significantly reduced the level of VEGF in L3.6pl medium, the effect which was found also in the cell culture supernate from HUVECs. Inhibition of Src kinase by AZM475271 also showed prevention of survival signalling from VEGF and EGF receptors. Treatment with AZM475271 resulted in VEGF – dependent inhibition of tyrosine phosphorylation of FAK. HUVECs were also examined using propidium iodide staining for cell cycle analysis by FACS. Inhibition of src kinase promoted HUVEC apoptosis in a dose-dependent manner. Taken together, our results suggest that the Src kinase inhibitor AZM475271, in addition to its effects on tumor cells, suppresses tumor growth and metastasis in vitro and in vivo potentially also by anti-angiogenic mechanisms.

Bakterielle Toxine aktivieren spezifische Signalwege in humanen Zellen und modulieren so deren Funktion und Morpholgie. Ein besseres Verständnis der Effekte von Toxinen auf humane Zellen könnte zur Aufklärung der Pathogenese bakterieller Erkrankungen beitragen. In dieser Arbeit wurde der Effekt des Exotoxins CNF-1 aus Escherichia coli auf die Morphologie humaner Endothelzellen (HUVEC) und die beteiligten Signalwege untersucht. CNF-1 führt in HUVEC zeitabhängig sowohl zur Bildung von Aktinfasern als auch zur Ausbildung von "membrane ruffles" und Filopodien. Diese Aktinstrukturen werden durch Aktivierung der GTPasen Rho, Rac und CDC42 induziert. Rho führt in Endothelzellen über Rho-Kinase zu einer Myosinleichtketten (MLC)- Phosphorylierung und dadurch zur Hemmung von MLC-Phosphatase. Stimulation der Endothelzellen mit CNF-1 führt hingegen abhängig von Rho und Rho-Kinase ohne Hemmung der MLC-Phosphataseaktivität zu einem Anstieg der MLC-Phosphorylierung und einer Zellkontraktion. Es konnte gezeigt werden, dass zwar Rac und CDC42 in den ersten Stunden durch CNF aktiviert werden, diese aber nicht für die MLC-Phosphorylierung verantwortlich sind. 24h nach CNF-Stimulation zeigt sich immer noch eine Aktivierung von RhoA, nicht aber von CDC42 und Rac. Trotzdem kommt es zu einem Anstieg der MLC-Phosphatase und dadurch zu einem Abfall der MLC-Phosphorylierung und Zellausbreitung. Diese Ergebnisse zeigen, dass CNF zu einer Entkopplung des Rho, Rho-Kinase, Myosinleichtketten-Phosphatase-Signalweges führt. Diese Entkopplung könnte eine Rolle bei der pathologischen Wirkung des Toxins spielen.

Pathogene Yersinien injizieren während einer Infektion über ihr TypIII-Sekretionssystem bakterielle Moduline, sogenannte Yops, in Immunzellen, um das Immunsystem zu stören. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass die injizierten Yersinia enterocolitica-Moduline YopE und YopT das Aktinzytoskelett angreifen. Mit dem Ziel der näheren Charakterisierung der zugrunde liegenden Mechanismen wurde insbesondere der Effekt von Y. enterocolitica-YopE auf aktinregulierende Signaltransduktionswege in menschlichen Endothelzellen (HUVEC) untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Yersinia-Stamm hergestellt, welcher YopE als einzigen Effektor transloziert. Mit diesem Stamm infizierte ruhende HUVEC zeigten eine Veränderung des Aktinzytoskeletts ähnlich wie nach Mikroinjektion von dominant negativem N17Rac, was auf eine Inaktivierung von Rac hindeutete. Zur weiteren Untersuchung wurden in infizierten Endothelzellen durch extrazelluläre Stimuli einzelne Rho-GTPasen aktiviert und die dabei ausgebildeten Aktinstrukturen beobachtet. Dabei ergab sich keine Beeinträchtigung der Neubildung CDC42- und Rho-vermittelter Aktinstrukturen (Filopodien und Stressfasern) durch YopE, jedoch eine spezifische Hemmung Rac-induzierter Lamellipodien. Frühere Untersuchungen hatten demonstriert, dass es sich bei YopE um ein sogenanntes GAP („GTPase activating protein“) handelt, welches in vitro die Proteine Rho, Rac und CDC42 hemmt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass in Endothelzellen transloziertes YopE höchst selektiv auf die Ras-ähnliche GTPase Rac wirkt, jedoch keinen Effekt auf CDC42 oder Rho ausübt. Diese Ergebnisse zeigen, dass YopE von Yersinia Rho- GTPase-abhängige Signaltransduktionswege mit einer bemerkenswerten Spezifität in primären Zielzellen beeinflussen kann. Überdies wurde die genannte Spezifität auch in primären Makrophagen nachgewiesen. Weiterhin zeigte sich im HUVEC-Infektionsversuch, dass die Hemmung der typischerweise Rho-vermittelten Aktin-Stressfasern YopT-abhängig ist. Morphologische Veränderungen von Aktinstrukturen, wie sie typischerweise bei der Unterbrechung von CDC42- oder Racvermittelten Signalen vorkommen, wurden nicht beobachtet. In Zusammenhang damit konnte gezeigt werden, dass genannter Effekt auf eine chemische Modifikation und folgliche Inaktivierung von RhoA zurückzuführen ist (Zumbihl et al., 1999). Damit unterscheiden sich YopT und YopE in ihrem Wirkmechanismus und spezifischen Zielmolekül, greifen andererseits jedoch beide direkt an Rho-GTPasen an. Sie könnten deshalb synergistisch bei der Pathogenität von Y. enterocolitica wirken. Darüber hinaus könnten YopE und YopT aufgrund ihrer Spezifität zukünftig als wertvolle Hilfsmittel zur Untersuchung zellulärer Regulationsvorgänge dienen

Modification of cellular functions by overexpression of genes is increasingly practised for research of signalling pathways, but restricted by limitations of low efficiency. We investigated whether the novel technique of magnetofection (MF) could enhance gene transfer to cultured primary endothelial cells. MF of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) increased transfection efficiency of a luciferase reporter gene up to 360-fold compared to various conventional transfection systems. In contrast, there was only an up to 1.6-fold increase in toxicity caused by MF suggesting that the advantages of MF outbalanced the increase in toxicity. MF efficiently increased transfection efficiency using several commercially available cationic lipid transfection reagents and polyethyleneimine (PEI). Using PEI, even confluent HUVEC could be efficiently transfected to express luciferase activity. Using a green fluorescent protein vector maximum percentages of transfected cells amounted up to 38.7% while PEI without MF resulted in only 1.3% transfected cells. Likewise, in porcine aortic endothelial cells MF increased expression of a luciferase or beta-galactosidase reporter, reaching an efficiency of 37.5% of cells. MF is an effective tool for pDNA transfection of endothelial cells allowing high efficiencies. It may be of great use for investigating protein function in cell culture experiments.

Reaktive – Sauerstoff - Spezies (ROS) spielen in der Physiologie und Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. So kommt es z.B. bei Hypertonie, Atherosklerose, Ischämie / Reperfusion und weiteren Krankheiten und Stoffwechselstörungen, wie z.B. Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus zu einem Ungleichgewicht zwischen Sauerstoffradikalbildung und anti - oxidativen Mechanismen. Superoxidanionen (O2 -) spielen insofern eine besondere Rolle, als sie durch direkte Interaktion endotheliales NO inaktivieren, so daß es seine vasodilatatorische, anti – proliferative und plättchenaggregationshemmende Funktion nicht mehr voll erfüllen kann. Damit ist O2 - maßgeblich an der Induktion der Endotheldysfunktion beteiligt. Bei Beginn dieser Arbeit gab es erste Hinweise, daß eine der leukozytären NAD(P)H - Oxidase ähnlichen Oxidase auch im Endothel existiert und wesentlich zur endothelialen O2 - - Bildung beiträgt. Wenig erforscht waren jedoch die Regulationsmechanismen dieser Oxidase. Ein bisher noch nicht bekannter Stimulus zur Steigerung der endothelialen O2 - - Bildung wurde 1996 beschrieben. In Endothelzellen aus bovinen Pulmonararterien führte eine Depolarisation zu einer gesteigerten O2 - - Bildung. Dies kann insofern von Bedeutung sein, als es sowohl unter physiologischen, als auch pathophysiologischen Bedingungen zu akuten oder chronischen Veränderungen des endothelialen Membranpotentials kommt. In dieser Arbeit wurde nun untersucht, ob eine NAD(P)H – Oxidase in der Tat auch in humanen Endothelzellen vorhanden ist, ob sie im Gegensatz zur leukozytären Form konstitutiv aktiv ist, und welchen Beitrag sie zur basalen endothelialen O2 - - Bildung leistet. Weitere Untersuchungen in HUVEC sollten zeigen, ob und wie sich sowohl De – als auch Hyperpolarisation der Zellmembran auf die O2 - - Bildung auswirken, welches Enzym hierbei eine Rolle spielt und welche Signaltransduktionsmechanismen beteiligt sind. Zur O2 - - Messung an vaskulären Zellen war die Verwendung der Lucigenin – Chemilumineszenz – Methode etabliert, so daß auch hier anfänglich mit dieser Methode gearbeitet wurde. Da jedoch dann Befunde veröffentlicht wurden, die zeigten, daß Lucigenin in Enzymsyste-men, die sonst kein oder nur wenig O2 - produzieren, zu einer erheblichen O2 - - Bildung führte, mußte mit weiteren Methoden der O2 - - Messung überprüft werden, ob diese Nachteile auch unter unseren Versuchsbedingungen auftraten. Verwendet wurden hierzu die MCLA – verstärkte Chemilumineszenz, die NBT – und Cytochrom C – Methode. Mit diesen verschiedenen, voneinander unabhängigen Methoden zeigte sich, daß in Anwesenheit von NADH Lucigenin selbst zu einer wesentlich gesteigerten O2 - - Bildung in Lysaten von humanen Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC) führt. Daher wurde zur Untersuchung der endothelialen O2 - - Bildung in dieser Arbeit schließlich nur die Cytochrom C Methode verwendet. Zur Überprüfung der Auswirkungen der verwendeten Substanzen auf das Membranpotential wurde die Membranpotentialmeßmethode mittels dem Potential – sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Bis - oxonol aufgebaut und verwendet. Intakte HUVEC zeigten eine basale O2 - - Produktion, die durch bekannte Inhibitoren der leukozytären NAD(P)H – Oxidase, mit unterschiedlichen Wirkmechanismen signifikant gehemmt wurde (Diphenyleniodonium ca. 48%, Phenylarsenoxid ca. 34% ). Ebenso resultierte die Inaktivierung des GTP - bindenden - Proteins rac mit Clostridium difficile Toxin B in einer signifikanten Reduktion der basalen endothelialen O2 - - Produktion um ca. 30%. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß nach Aufhebung der zellulären Integrität durch das Lysieren der HUVEC die Gabe von NADH eine um ca. 2.7 fach erhöhte O2 - - Produktion im Vergleich zu NADPH bewirkte. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz bzw. rtPCR konnten außerdem zumindest ein Teil der leukozytären NAD(P)H – Oxidase Untereinheiten, p67phox und gp91phox auch in HUVEC nachgewiesen werden. Zur gezielten Depolarisation des Membranpotentials wurden ein Puffer mit erhöhter Kaliumkonzentration (90 mM), der nicht selektive Kalium – Kanal - Blocker Tetrabutylammonium Chlorid (1 mM) und das Kation – Ionophor Gramicidin (1 µM) verwendet. Die basale endotheliale O2 - - Produktion wurde durch diese Substanzen in ähnlichem Ausmaß (~ 60% ) signifikant gesteigert (n=23, p