Podcasts about zielzellen

Das größte Problem für HIV-infizierte Personen ist die Tatsache, dass die Infektion nicht „geheilt“ werden kann und die Betroffenen ihr Leben lang infiziert bleiben. Deshalb erfordert die HIV Infektion die dauerhafte Anwendung von Therapien, die das Virus an der Replikation hindern und damit die „Viruslast“ im Körper möglichst gering halten. Die optimale Bekämpfung der HIV-Infektion wären Wirkstoffkombinationen die sowohl die Produktion des Virus durch persistent infizierte Reservoirs als auch die Neuinfektion von HIV-Zielzellen unterbinden. Interessanterweise sind einige zelluläre Faktoren bekannt, die in die HIV-Replikation eingreifen und der HIV-Produktion entgegenwirken können. Ein Beispiel für solche HIV-Restriktionsfaktoren sind die Risp/ Fam21 Proteine, die mit dem HIV Rev Protein interagieren und so vermutlich seine regulatorische Funktion hemmen können. Frühere Untersuchungen an persistent HIV-infizierten Astrozyten belegten einen Zusammenhang zwischen der Expressionsstärke von Risp/ Fam21 und der Hemmung der HIV Produktion in diesen Zellen. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der quantitativen PCR Analyse gezeigt, dass risp/ fam21 Gene in unterschiedlichen Stärken in menschlichen Zellen exprimiert werden. Zur Modulation der Risp/ Fam21 Expression in diesen als auch anderen für HIV relevanten Zellen wurde ein lentivirales Vektorsystem etabliert. In akut infizierten T-Zellen wurde kein Einfluss der Risp/ Fam21-Modulation auf die HIV-Infektion gefunden, was die Theorie nahelegt, dass Risp/ Fam21 Proteine nur in persistent infizierten Zellen wie den o.g. Astrozyten eine Aktivität zeigen könnten. Um neue Inhibitoren der akuten HIV-Infektion gesunder Zellen zu identifizieren, wurde die medizinische Heilpflanze Cistus incanus (Ci) im Hinblick auf ihre anti-HIV Aktivität getestet. Bei dieser Pflanze handelt es sich um eine sehr polyphenolreiche Pflanze und Polyphenole stellen eine interessante Klasse an HIV-Inhibitoren dar. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Präparate aus Ci die Infektion von Zellen hemmen, indem sie spezifisch an die Virusoberfläche binden und die Anheftung der Viren an die Zielzellen verhindern. Präparate aus Ci inhibieren ein sehr breites Spektrum an verschiedenen HIV-Laborstämmen und –Patientenisolaten.

Das West-Nil-Virus (WNV) ist ein zur Familie der Flaviviren gehörendes Arbovirus, das weltweit zunehmende Verbreitung findet. Das natürliche Reservoir des Virus sind Vögel. Nach Übertragung durch Stechmücken kann es zu Infektionen von „Fehlwirten“, insbesondere Pferden und Menschen, kommen. Die meisten Infektionen verlaufen asymptomatisch oder mit der Entwicklung des West-Nil-Fiebers, einer relativ milden, Grippe-ähnlichen Erkrankung. In einigen Fällen, vor allem bei immungeschwächten und älteren Individuen, können aber auch lebensbedrohliche Infektionen mit schwerer neurologischer Symptomatik (z.B. Enzephalitiden) die Folge sein. WNV-Impfstoffe sind bisher nur für die Veterinärmedizin zugelassen und diese benötigen für einen effektiven Schutz häufige Auffrischungen. Außerdem gibt es keine effizienten Therapiemöglichkeiten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung weiterer wirksamer WNV-Impstoffe wünschenswert. Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene rekombinante Vakzinkandidaten auf Basis des Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) zu entwickeln, zu analysieren und bezüglich ihrer Eignung als Vektorvakzin zu bewerten. Das in seiner Replikationsfähigkeit extrem limitierte und hoch attenuierte MVA gehört bei der Entwicklung neuartiger rekombinanter Virusvakzine zu den viel versprechendsten Kandidaten. Potentielle WNV-Vektorvakzine beruhen überwiegend auf der Expression der beiden viralen Hüllproteine prM/M und E oder Teilen davon. Gerade das E-Protein stellt nach einer Infektion das Hauptzielantigen der adaptiven Immunantwort dar, indem es eine Vielzahl an immunogenen und protektiven Epitopen aufweist. Die fünf in dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Viren exprimierten zum Teil das E-Protein in unterschiedlicher Ausführung oder prM/M und E simultan. Damit wurden verschiedene Ansätze zur Induktion einer Immunantwort generiert und untersucht. Alle rekombinanten MVA-Vektorviren waren bis auf die inserierten Zielsequenzen identisch und erwiesen sich als genetisch stabil. Die Replikationsdefizienz der Viren in den humanen und equinen Zielzellen konnte eindeutig nachgewiesen und somit ihre biologische Sicherheit belegt werden. Für die Erzeugung hochtitriger Virusstocks und zur Impfstoffproduktion in größerem Umfang war es notwendig zu zeigen, dass sich die ins MVA-Genom inserierten Sequenzen nicht negativ auf das Vermehrungspotential der Viren in permissiven Zellen auswirkten. Es konnte belegt werden, dass alle Konstrukte dem Wildtypvirus ähnliche, und somit zur Produktion ausreichende, Wachstumsfähigkeiten besaßen. Als weitere wichtige Voraussetzung für die potentielle Verwendung der rekombinanten Viren als Kandidaten-Vakzine galt eine effiziente rekombinante Proteinexpression. Durch die Analyse der Proteinsynthese mittels Westernblot konnte nachgewiesen werden, dass diese bei allen Konstrukten stabil und produktiv verlief. Auch die Lokalisierung der rekombinanten E-Proteine durch Immunfluoreszenzfärbung und nachfolgender Konfokalmikroskopie infizierter Zellen brachte das erwartete Ergebnis. Abschließend wurden zur ersten Einschätzung der Immunogenität der rekombinanten Viren WNV-spezifische Antikörper- und T-Zellantworten im Mausmodell untersucht. Alle Vektorviren waren in der Lage humorale und zelluläre Immunantworten zu induzieren. Hierbei erwies sich MVA-WNVESOL, was die, mittels Antigen-ELISA ermittelte, Antikörperantwort anbelangt als viel versprechendster Kandidat. Bezüglich der CD8+-T-Zellantwort konnte sich dies jedoch nicht bestätigen. Es ist anzumerken, dass weiterführende Untersuchungen der Testimpfstoffe in anderen präklinischen Modellen in Zukunft noch durchzuführen sein werden. Die in dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Viren und gewonnenen Erkenntnisse belegen die Fähigkeit von MVA als viel versprechenden Vektorvakzin-Kandidaten gegen WNV. Die nachgewiesene Sicherheit und zugleich gute Vermehrungsfähigkeit in permissiven Zellen, die effiziente WNV-Antigen-Expression und die ersten positiven Daten zur Immunogenität aller Konstrukte sprechen für eine zukünftige, weitere Nutzung und Untersuchung dieser Vektorviren, um als langfristiges Ziel einen potenten WNV-Impfstoff zu erhalten.

Die Marek’sche Erkrankung (MD) ist weltweit eines der bedeutendsten Probleme in der Geflügelindustrie und verantwortlich für erhebliche wirtschaftliche Schäden. Die MD wird durch ein lymphotropes und strikt zell-assoziiertes α-Herpesvirus (MDV) verursacht, das immunsuppressiv wirkt und regelmäßig T Zelltumore induziert. B- und T-Zellen sind die primären Zielzellen des MDV in vivo. In B-Zellen kommt es zu einer lytischen Infektion und zum massiven Untergang der infizierten Zellen. Dagegen wird eine latente Infektion primär in CD4+ αβTCR+ T-Zellen beobachtet, welche nach Reaktivierung des Virus auch transformieren und Lymphome bilden können. Bis heute basieren alle Untersuchungen zur MD Pathogenese entweder auf in vivo Versuchen oder aber auf Zellkultursystemen, die mit Fibroblasten oder Nierenzellen arbeiten. Ein in vitro Infektionssystem für B- und T-Zellen, den primären Zielzellen des Virus, konnte bis heute nicht etabliert werden. Ursächlich hierfür war das Fehlen geeigneter Zellkultursysteme für diese Zellen, die ex vivo nur eine sehr kurze Überlebenszeit und einen schnellen apoptotischen Zelltod zeigen. Fortschritte in der aviären Immunologie haben zur Charakterisierung zahlreicher Zytokinen und Wachstumsfaktoren geführt, die B- und T-Zellen in vitro aktivieren, zur Proliferation anregen und erhöhte Überlebensraten induzieren. Diese Zytokine wurden in der vorliegenden Arbeit genutzt, um neue Kultursysteme für Hühner-Lymphozyten zu etablieren, mit deren Hilfe in vitro MDV Infektionsmodelle für B- und T Zellen aufgebaut werden konnten. Die erfolgreiche Infektion der Zellen wurde mit Hilfe genetisch modifizierten MDV-Reporterviren (MDV RB-1B UL47GFP und RB-1B MeqGFP-UL47RFP) nachgewiesen. Die aus der Milz, dem Blut und der Bursa Fabricii isolierten B-Zellen wurden mit löslichem chCD40L stimuliert und mit MDV RB-1B UL47GFP infizierten Fibroblasten co-kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion konnten infizierte B-Zellen durch die Expression von UL47GFP durchflusszytometrisch identifiziert werden. Die Infektion wurde zusätzlich durch die zytoplasmatische Färbung der MDV-Proteine ICP4 und gB bestätigt. Der Anteil infizierter Bursa-B-Lymphozyten stieg von 2,5% am ersten Tag nach der Infektion (p.i.) bis auf ca. 15% an Tag 4 p.i. Vergleichbare Werte wurden auch für B-Zellkulturen aus der Milz und dem Blut gefunden. Die durchflusszytometrische Charakterisierung der infizierten Zellpopulation erfolgte mit Hilfe zahlreicher Hühner-spezifischer monoklonaler Antikörper. Infizierte B-Zellen sind chBu1+ und zeigen einen distinkten Phänotyp sowie eine intermediäre Zellgröße. Für die weitere Charakterisierung wurden infizierte und nicht infizierte Bursa-B-Zellen durchflusszytometrisch sortiert (> 95% Reinheit) und Mikroarray basierten Genexpressionsanalysen unterzogen. Auch T-Zellen aus der Milz, dem Blut und dem Thymus konnten nach αVβ1-TCR (TCR-2) Stimulation auf dieselbe Weise mit RB-1B MeqGFP-UL47RFP infiziert werden. Der Hauptteil der infizierten T-Zellen zeigte einen CD4+ αVβ1-TCR+ Phänotyp, allerdings fanden sich auch einige infizierte CD8+ T-Zellen. Durch die alleinige Expression von MeqGFP oder die gleichzeitige Expression von UL47RFP und MeqGFP konnten die infizierten Thymozyten in eine latent und eine zytolytisch infizierte Population unterteilt werden. Während die zytolytisch infizierte Population primär aus B-Zellen und CD8+ T-Zellen bestand, waren die latent infizierten T-Zellen zum Großteil CD4+ T Zellen. Erstmals gelang es in dieser Arbeit die Übertragung des Virus von der B-Zelle auf die T Zellen durch Co-Kultivierung mit durchflusszytometrisch sortierten infizierten B Zellen direkt nachzuweisen. Darüber hinaus konnten aus Langzeitkulturen infizierter Thymozyten vier lymphoblastoide Zelllinien (JS1 –JS4) isoliert werden. Alle vier Linien zeigten ein homogenes, lymphoblastoides Erscheinungsbild und waren CD4+, αVβ1-TCR+, MHC I+ und MHC II+. Dieser Phänotyp entspricht exakt dem von in vivo transformierten T Zelllymphomen. Das in dieser Arbeit etablierte Infektionssystem ist das erste Kultursystem, mit dem eine reproduzierbare und effiziente MDV Infektion von Lymphozyten in vitro erreicht wird. Es spiegelt die verschiedenen Phasen des natürlichen Infektionszyklus wider. Damit eröffnet sich erstmals ein Weg, die Interaktion von B-Zellen und Virus, bzw. T-Zellen und Virus detailliert und zu definierten Zeitpunkten zu analysieren. Hervorzuheben ist, dass die hier beschriebenen Methoden nicht nur verbesserte Untersuchungsmöglichkeiten bieten, sondern auch dazu beitragen können, die Zahl der bisher notwendigen Tierversuche in der MDV-Forschung deutlich zu reduzieren.

Es gibt zahlreiche Bemühungen, neue Immuntherapien zur Behandlung von malignen Tumoren zu entwickeln, da die Prognose vieler Krebserkrankungen immer noch schlecht ist. Dazu muss das Verständnis, wie die verschiedenen Immunzellen innerhalb des Tumormilieus miteinander interagieren, verbessert werden. Mausmodelle für Spontantumoren spiegeln die klinische Situation besser wider als transplantierbare Tumoren und stellen somit eine gute Möglichkeit dar, die während der Tumorentwicklung stattfindenden Immunreaktionen zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurde mit Mäusen gearbeitet, in deren B-Zellen das Onkogen c-MYC konstitutiv exprimiert wird und die nach einigen Wochen spontan B-Zell-Lymphome entwickeln. Frühere Arbeiten haben bereits gezeigt, dass natürliche Killerzellen (NK-Zellen) aus c-MYC-Tumoren im Vergleich zu Organen aus Wildtyp (wt)-Mäusen kaum Interferon-gamma (IFN-) produzierten und die Fähigkeit, Zielzellen zu töten, stark reduziert war. Dementsprechend sezernierten Tumor-infiltrierende dendritische Zellen (TIDZ) geringere Mengen Interleukin-12 (IL-12), das für die Induktion einer Th1 (T-Helferzelle 1) / ZTL (zytotoxischer T-Lymphozyt)-Antwort essenziell ist, aber vermehrt das immuninhibierende Zytokin IL-10. Für die Aktivierung von naiven T-Zellen ist die Hilfe von NK-Zellen und DZ notwendig, die in c-MYC-Mäusen offenbar nicht gegeben war. Es wurde daher erwartet, dass intratumorale T-Zellen nicht bzw. nur ungenügend aktiviert werden. Überraschenderweise wiesen Tumor-infiltrierende T-Zellen jedoch einen aktivierten Phänotyp auf, zeigten zum Teil sogar eine erhöhte IFN--Produktion, konnten degranulieren und proliferierten in vivo. Trotzdem übernahmen intratumorale T-Zellen im Gegensatz zu NK-Zellen keine immunüberwachende Funktion über die Lymphomentstehung, da c-MYC-Mäuse nach Depletion der T-Zell-Population nicht früher erkrankten als unbehandelte Tiere. Offenbar wurden T-Zellen in c-MYC-Tumoren Antigen-spezifisch aktiviert, was dazu führte, dass sie aufgrund der langanhaltenden Stimulation in einen Erschöpfungszustand geraten sind. Dies spiegelte sich in einer hohen Expression des Erschöpfungsmarkers PD-1 (Programmed Cell Death 1) wider. Die Interaktion des koinhibitorischen Rezeptors PD-1 mit dem entsprechenden Liganden PD-L1, der vor allem auf DZ in c-MYC-Tumoren detektiert wurde, führt in T-Effektorzellen zur Inhibierung des aktivierenden T-Zell-Rezeptor (TZR)-Signals. So konnten T-Zellen aus c-MYC-Tumoren im Vergleich zu T-Zellen aus normalen Mäusen in vitro über den TZR tatsächlich nicht mehr stimuliert werden, was ebenfalls für eine Erschöpfung sprach. Zudem exprimierten intratumorale T-Zellen neben PD-1 die koinhibitorischen Moleküle CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Antigen 4) und LAG-3 (Lymphocyte Activation Gene 3). Die Stimulierbarkeit der T-Zellen in vitro konnte durch Zugabe blockierender Antikörper (AK) gegen PD-1 und CTLA-4 verbessert werden. Aufgrund dieser Beobachtung wurden junge, noch gesunde c-MYC-Mäuse mit diesen AK behandelt. Durch die PD-1/CTLA-4-Blockade in vivo zeigten die Tiere ein signifikant verlängertes Überleben. Neben CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten wurde in c-MYC-Tumoren innerhalb der CD4+ T-Zellpopulation ein sehr hoher Anteil Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (Treg) detektiert. Diese waren aktiviert, proliferierten in vivo und produzierten IL-10. Die koinhibitorischen Moleküle, welche auch auf erschöpften T-Zellen zu finden waren (PD-1, LAG-3 und CTLA-4), wurden ebenfalls von Treg exprimiert, was bekanntlich zur Verstärkung ihrer suppressiven Aktivität führt. Es wurden vor allem Helios-exprimierende natürliche Treg (nTreg) detektiert. Doch auch IL-10-produzierende, regulatorische Foxp3- Tr1-Zellen (T Regulatory Type 1 Zelle), die zu den induzierten Treg (iTreg) zählen, waren in c-MYC-Tumoren zu finden. Schließlich fanden sich auch T-Zellen, die sowohl IFN- als auch IL-10 produzierten. Diese könnten aus Th1-Zellen entstanden sein, welche die Zytokinexpression umgestellt haben. Treg unterdrückten in c-MYC-Tieren anscheinend eine effektive Antitumor-Immunantwort. Daher wurden Foxp3+ Treg in DEREG/c-MYC-Mäusen, die einen transgenen Diphtherietoxin (DT)-Rezeptor tragen, spezifisch durch DT-Injektionen in vivo depletiert. Erstmals wurde der DEREG-Mechanismus zur Treg-Depletion in einem endogenen Tumormodell angewandt. Die Depletion der Foxp3+ Treg verschaffte den DEREG/c-MYC-Mäusen einen leichten Überlebensvorteil. Diese Ergebnisse sind relevant für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Verfahren zur Behandlung maligner Erkrankungen in der Klinik.

Das Ektromelievirus, der Erreger der Mäusepocken, wird dem Genus der Orthopockenviren zugeordnet und gehört zu den Vertretern, die nur für einen Wirt virulent sind. Das Ektromelievirus ist spezifisch an die Maus adaptiert und induziert dort eine zyklisch, systemische Infektionskrankheit. An der Ausbildung dieser letalen Erkrankung sind vermutlich eine Vielzahl regulatorischer Virusproteine beteiligt, die sehr genau an das Immunsys-tem der Maus angepasst sind. Kandidaten für sogenannte Immunevasi-onsgene sind für fast alle Orthopockenviren identifiziert und beschrieben. Aufgrund limitierter Untersuchungsmöglichkeiten ist aber noch sehr wenig über die Funktionen dieser Gene bekannt, vor allem mit welchen Mecha-nismen die hier kodierten Faktoren agieren, um in vivo die Entwicklung eines fatalen Krankheitsverlaufes zu fördern. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen neuen experimentellen Ansatz für die Analyse der Pathogenesemechanismen der Ektromelievirusinfektion in vitro und in vivo in der Maus zu entwickeln. Die Strategie beruhte auf der Markierung des Ektromelievirus mit einem rekombinanten Gen zur Ex-pression eines Fluoreszenzproteins. Dieser Reporter sollte neue nützliche Einblicke in den Ablauf des Lebenszyklus des Erregers ermöglichen, gleichzeitig sollte das fluoreszenzmarkierte Virus im Vergleich zu nicht rekombinantem Ektromelievirus unveränderte biologische Eigenschaften besitzen. Als Fluoreszenzmarker diente in der hier vorliegenden Arbeit das Protein mCherry, das mit den etablierten Detektionssystemen den best-möglichen Nachweis virusinfizierter Zellen in vitro und in vivo ermöglichen sollte. Zunächst konnte zur Generierung eines rekombinanten Ektromelie-mCherry Virus im Genom des Ektromelievirus ein neuartiger Insertionslo-kus identifiziert werden. Der Einbau der Fremdgensequenzen in den Zwi-schengenlokus EVM063 und EVM064 interferierte nicht mit anderen funk-tionellen Bereichen des Ektromeliegenoms und erlaubte die Herstellung stabiler rekombinanter Ektromelieviren. Die neue Insertionsstelle kann somit in Zukunft auch für die Konstruktion anderer gentechnisch modifi-zierter Ektromelieviren eingesetzt werden. Nach der erfolgreichen Rekom-bination des Ektromelie-mCherry Virus wurden drei voneinander unab-hängige klonale Isolate dieses Virus gewonnen und einer detaillierten Charakterisierung in in vitro Infektionsexperimenten unterzogen. Das mCherry Protein erwies sich hierbei als ein ausgezeichnetes molekularbio-logisches Werkzeug zur direkten Markierung der Infektion unterschiedli-cher Zielzellen mit Ektromelievirus. Jedes der drei untersuchten rekombi-nanten Ektromelieviren vermittelte eine deutlich sichtbare rote Fluores-zenz infizierter Zellen bereits innerhalb eines einzigen Infektionszyklus (12 Stunden nach Infektion). Zur Prüfung ob Einbau und Expression des Re-portergens das natürliche Infektionsverhalten des Ektromelievirus beein-flusst, wurde das Wachstum der drei rekombinanten Ektromelieviren in verschiedenen etablierten Zelllinien und in in vitro präparierten primären Mauszellen analysiert. Alle Ektromelie-mCherry-Viren wiesen eine mindes-tens genau so gute Vermehrungsfähigkeit wie das nicht rekombinante Ektromelie-Wildtypvirus auf. Zudem identifizierten die vergleichenden Un-tersuchungen das Ektromelie-mCherry-Virus 1 als das Virus mit den bes-ten Wachstumseigenschaften auf permanenten und primären Zellkulturen. Dieses Virus bietet sich daher als eine besonders vielversprechende Aus-gangsbasis für die Herstellung von gezielt mutierten Viren und für weitere Untersuchungen in in vitro und in vivo Infektionsexperimenten an. Mit den in dieser Arbeit dargestellten Experimenten ist es zum ersten Mal gelun-gen, rekombinante mCherry-markierte Ektromelieviren zu konstruieren, die in allen untersuchten biologischen Eigenschaften mit einem hoch virulen-ten Ektromelie-Wildtypvirus übereinstimmen. Die zukünftige Nutzung die-ser Viren verspricht völlig neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen einem wirtspezifischen Orthopockenvirus und seinem natürlichen Wirt. Als Ergebnis erwartet werden dürfen ein um-fassenderes Verständnis zur Pathogenese systemischer Virusinfektionen und grundlegende Erkenntnisse zur Funktion der Immunabwehr. Beides sind wichtige Voraussetzungen für die Entwicklung neuer wirksamer Impf-stoffe und Therapieansätze.

Willkommen in der Welt der Biologie! Mein Name ist Alia Korth und heute geht es um Adrenalin. Das Wort Adrenalin kommt aus dem Lateinischen und bedeutet in etwa “zu der Niere”. Dieser etwas seltsame Name kommt daher, dass das Adrenalin im Nebennierenmark gebildet wird. Das Hormon Adrenalin wird in Stresssituationen ins Blut abgegeben und löst so eine ganze Reihe von Abläufen im Körper aus. Die Wichtigsten sind eine Steigerung der Herzfrequenz, ein Anstieg des Blutdrucks, eine Erweiterung der Bronchiolen, welche eine erhöhte Aufnahme von Sauerstoff ermöglicht, eine schnellere Bereitstellung von Energiereserven durch Fettabbau, eine Umwandlung von Glukose, also Traubenzucker, in verschiedene Stoffe, sowie im “Normalzustand” des Körpers eine Regulierung des Blutdrucks und der Magendarmtätigkeit. Aber wie funktioniert das eigentlich, was ist ein Hormon? Das Wort Hormon kommt aus dem Griechischen und bedeutet “Antreiben”. Hormone sind chemische Signal- und Botenstoffe, die meist in Hormondrüsen gebildet werden. Von dort aus gelangen sie ins Blut und zu den Zielzellen. Das Hormon funktioniert wie ein Schlüssel, die Zielzelle wie ein Schloss. Nur wenn diese zusammenpassen erfolgt die vorgesehene Reaktion. Die Wirkungsdauer der Homone kann zwischen Sekunden, wie bei Adrenalin, und Tagen, wie bei dem Schilddrüsenhormon, welches den Stoffwechsel ermöglicht und bei Kindern das Wachstum fördert, reichen. Ich hoffe, dass es euch gefallen hat und würde mich freuen, wenn ihr auch beim nächsten Mal wieder einschaltet, wenn es wieder heißt “willkommen in der Welt der Biologie”. Weitere “in 2 Minuten” Podcasts findet ihr im Internet unter www.in2minuten.com.

Die Behandlung zerstörter Gewebe- und Organstrukturen nach akuten Verletzungen oder chronischen Krankheitsverläufen hat sich zu einer enormen Belastung für das heutige Gesundheitswesen entwickelt. Neue Konzepte der Geweberekonstruktion durch Tissue Engineering führten in den letzten Jahren zu einer erheblichen Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung einer genaktivierten Fibrinmatrix zur lokalen Expression des Wachstumsfaktors epidermal growth factor (EGF). Das Konzept beinhaltet die gemeinsame Applikation autologer Keratinozyten und nicht-viraler Genvektoren mit PEI in Form einer injizierbaren Fibrinkleberzubereitung. Durch Variationen von PEI-Struktur, N/P-Ratio und dem Zusatz des abschirmenden Hüllpolymers P6YE5C wurde das Transfektionsverhalten unterschiedlicher Genvektorformulierungen in der Fibrinmatrix untersucht. Durch den Einsatz von fluoreszenzmarkierten Genvektoren wurde der Transfektionsverlauf innerhalb der Matrix visualisiert und dokumentiert. Größere Mengen ungeschützter Genvektoren führten in Fibrin trotz ihres toxischen Potentials zu hohen Genexpressionen. Ein protektiver Effekt durch den Zusatz des schützenden Hüllpolymers P6YE5C schien in Fibrin als nicht zwingend notwendig. Daraufhin wurde ein möglicher Einfluss der Fibrinmatrix auf Genvektorformulierungen untersucht. Erste Vorversuche in Zellkultur zeigten eine Steigerung des Transfektionspotentials nicht-viraler Genvektoren mit PEI nach Vorinkubation mit einer Fibrinogen-Lösung. Aus der Perspektive einer kommerziellen Anwendung heraus wurde ein lagerungsfähiges Lyophilisat aus genaktiviertem Fibrinogen entwickelt, das zum Versuchszeitpunkt als Fibrinklebervorstufe mit Wasser rehydratisiert und gemeinsam mit Thrombin zur Herstellung der genaktivierten Fibrinmatrix eingesetzt werden konnte. Der Einsatz des schützenden Hüllpolymers P6YE5C hatte dabei einen entscheidenden Einfluss auf die unmittelbare Verfügbarkeit der eingesetzten Genvektoren. Für die Regeneration von Knochenbrüchen bleibt dagegen der Einsatz medizinischer Implantate von entscheidender Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wird in einem weiteren Ansatz die Entwicklung und Charakterisierung genaktivierter Polymerfilme aus PDLLA und PLGA zur Beschichtung medizinischer Implantate beschrieben. Die neue Grenzfläche zwischen Implantat und Knochenstruktur soll zur lokalen Transfektion und Expression therapeutischer Gene dienen. Dafür wurden nicht-virale Genvektoren lyophilisiert und als Dispersion in organischen Lösungen der Polymere PDLLA und PLGA auf resistente Oberflächen aufgetragen und getrocknet. Die Besiedelung der verbliebenen Polymerfilme mit Zellen führte über den direkten Kontakt mit genaktivierten Polymerstrukturen zur Expression des eingesetzten Gens. Durch Variation von Polymer- und Genvektormenge wurde anhand der gemessenen Genexpressionen sowie der metabolischen Aktivität transfizierter Zellen das System optimiert. Die Bestimmung der Transfektionseffizienz sowie des Freisetzungsverhaltens formulierter Genvektoren diente zur Charakterisierung der genaktivierten Polymeroberflächen aus PDLLA und PLGA. Trotz struktureller Ähnlichkeiten der eingesetzten Filmbildner zeigte sich das Freisetzungsverhalten aus PDLLA gegenüber PLGA abhängig der eingesetzten Polymer- und Genvektormengen. Das Beschichtungsprinzip konnte ebenfalls für die Aktivierung von Folien aus Aluminiumlegierung eingesetzt werden und führte zur Expression des therapeutischen Gens bone morphogenic protein-2 (BMP-2). Die Verwendung von Poly-[Tyrosincarbonaten] als strukturelle Alternative zu PDLLA bzw. PLGA führte zu keiner Genexpression. Hohe medizinische Anforderungen und individuelle Interaktionen einzelner Matrixkomponenten machen genaktivierter Biomaterialien zu komplexen Applikationsformen der regenerativen Medizin. Kleinste Veränderungen im komplexen Verbund aus Matrixstrukturen, Genvektoren und Zielzellen können drastische Effekte im Gesamtsystem verursachen. Abhängig von Indikation und Materialeigenschaften müssen die Formulierungen individuell angepasst und optimiert werden. Wird dieser Arbeitsaufwand investiert, bietet der Einsatz genaktivierter Biomaterialien gegenüber herkömmlichen Behandlungsformen großes therapeutisches Potential.

Die beiden Pathogen-assoziierten molekularen Muster, CpG-Oligonukleotide, als Imitate bakterieller DNA, und LPS, sind in der Lage, das menschliche Immunsystem zu stimulieren. Vor Entdeckung der Toll-like Rezeptoren konnte nicht zwischen direkten und indirekten Effekten von CpG-Oligonukleotiden und LPS auf Zellen des menschlichen Immunsystems unterschieden werden. Durch die Entdeckung der Toll-like Rezeptoren und vor allem die Charakterisierung von TLR9 als Rezeptor für CpG und TLR4 als Rezeptor für LPS entstand die Möglichkeit, die Zielzellen von PAMPs an Hand der Expression der dazugehörigen Rezeptoren zu definieren. Dendritische Zellen sind im Immunsystem des Menschen essenziell für die Auslösung einer Immunantwort. Sie sind in der Lage, eindringende Pathogene an Hand von PAMPs schnell und sicher zu erkennen, und daraufhin eine passende Immunantwort zu initiieren. Zwei Subpopulationen von dendritischen Zellen konnten kürzlich im peripheren Blut identifiziert werden: Plasmazytoide dendritische Zellen (PDC) und myeloide dendritische Zellen (MDC). In der vorliegenden Arbeit wurden die Unterschiede zwischen PDC und MDC in ihren Reaktionen auf CpG-Oligonukleotide, LPS und CD40 Ligand charakterisiert. Funktionelle Untersuchungen zeigten, dass nur PDC und nicht MDC direkte Zielzellen von CpG-ODN im humanen Immunsystem darstellen, während LPS MDC aktiviert, jedoch nicht PDC. Damit konsistent konnte auf molekularbiologischer Ebene nachgewiesen werden, dass PDC TLR9 exprimieren, jedoch nicht TLR4, während MDC den für die Erkennung von LPS notwendigen Rezeptor TLR4 besitzen, aber TLR9 nicht exprimieren. In gemischten Populationen reagierten auch myeloide dendritische Zellen auf CpG-Oligodesoxynukleotide, was auf eine indirekte Aktivierung durch plasmazytoide dendritische Zellen hinweist. PDC reagierten nach Stimulation mit ODN 2006 mit einer Hochregulation von Reifemarkern und kostimulatorischer Moleküle, der Expression von Chemokinrezeptoren, der Produktion proinflammatorischer Chemokine und einer verminderten Apoptoserate. Nach Stimulation mit ODN 2216 sezernierten sie große Mengen IFN-α, während ODN 2006 für die Induktion von IFN-α eine Kostimulation mit CD40 Ligand benötigte. Weder ODN 2006, ODN 2216 oder CD40 Ligand alleine waren in der Lage, IL-12 in PDC zu induzieren, die synergistische Stimulation von PDC mit CpG-ODN und CD40 Ligand führen jedoch zur Produktion großer Mengen an IL-12. Unter optimaler Stimulation mit ODN 2006 und CD40 Ligand können PDC damit gleichzeitig IL-12 und IFN-α produzieren. Das Verhältnis der produzierten Zytokine ist dabei abhängig vom Differenzierungsgrad der PDC. Durch zunehmende Ausreifung der PDC mit IL-3 verschiebt sich nach der Stimulation das Produktionsverhältnis an sezernierten Zytokinen zugunsten von IL-12. Ausreifung mit ODN 2006 ermöglicht PDC, zudem naive allogene CD4 Zellen zu aktivieren, und induziert in Kokulturen IL-12-abhängig ein Th1-gerichtetes Zytokinprofil in den CD4 T-Zellen. IFN-α schien dabei eine geringe Rolle zu spielen. Durch die Charakterisierung der PDC als TLR9-tragende Zielzelle für CpG-DNA, trägt diese Arbeit entscheidend dazu bei, die PDC als Schlüsselzelle für die physiologischen Wirkungen von TLR9-Liganden zu identifizieren und zu verstehen. Dies ist von hoher Relevanz für die Entwicklung therapeutischer Anwendungen von CpG-ODN in der Tumortherapie, Asthmabehandlung, Infektionsprophylaxe und als Adjuvans bei Impfungen.

Die Schleimhaut des nasalen Raums stellt das primäre Kontaktorgan für inhalierte Stoffe dar. Um den Körper vor toxischen Wirkungen zu schützen und den Geruchssinn zu unterstützen, besitzen die Epithelzellen der respiratorischen Anteile erhebliche metabolische Kompetenz. Interindividuelle Unterschiede im Fremdstoffmetabolismus können in Verbindung mit einer beruflichen Exposition gegenüber inhalativen Karzinogenen zur Entstehung von Malignomen des sinonasalen Raums führen. Um gefährliche Stoffe und gefährdete Populationen anhand von in-vitro-Versuchen identifizieren zu können, wurde ein dreidimensionales Kultursystem humaner nasaler Mukosa vorgestellt, das die Verhältnisse in vivo möglichst realistisch abbildet. Dazu wurden Resektate humaner nasaler Mukosa in 1 mm3 großen Fragmenten unter optimierten Umweltbedingungen kultiviert. Innerhalb einer Woche bildeten sich daraus vollständig epithelisierte Miniorgane mit physiologischen histomorphologischen und funktionellen Eigenschaften. Um die Leistungsfähigkeit der Miniorgane zu evaluieren, wurden sie ein- oder mehrfach gegenüber den bekannt genotoxischen Substanzen Natriumdichromat, N-Nitrosodiethylamin (NDEA) und N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) exponiert. Parallel dazu wurden zum Vergleich Einzelzellsuspensionen mit diesen Stoffen inkubiert. Die induzierten genetischen Schäden wurden mit Hilfe der alkalischen Version des Einzelzell-Mikrogelelektrophorese-Assay quantifiziert. Der Anteil apoptotischer Vorgänge an hohen DNS-Schäden im Einzelzell-Mikrogelelektrophorese- Assay wurde durch den Annexin-V-Affinitätstest erfasst. Um den Erhalt der metabolischen Kompetenz der Zellen der Miniorgane im Verlauf der Kultivierung zu belegen, wurde die Konzentration von Cytochrom P450 2A6, einem Schlüsselenzym im Metabolismus zahlreicher inhalativer Giftstoffe, durchflusszytometrisch bestimmt. Die Miniorgane blieben über den Kulturzeitraum strukturell und funktionell intakt. Die einmalige Exposition gegenüber Natriumdichromat und MNNG verursachte erhebliche genetische Schäden, die bei wiederholter Inkubation trotz 48stündiger Reparaturphasen weiter zunahmen. Im Falle von Natriumdichromat stieg analog dazu der Anteil apoptotischer Zellen rasant an. Bei MNNG war dagegen keine erhöhte Apoptoserate nachweisbar. Die wiederholte Inkubation der Miniorganen mit NDEA ergab weder einen signifikanten genotoxischen Effekt, noch einen Anstieg der Apoptoserate, obwohl das für die Aktivierung von NDEA entscheidende Apoenzym Cytochrom P450 2A6 über den gesamten Untersuchungszeitraum in den Zellen nachgewiesen werden konnte. Im Vergleich der DNS-Fragmentierung erwiesen sich die in Suspension inkubierten Einzelzellen als empfindlicher gegenüber der Wirkung von Natriumdichromat und MNNG. Miniorgane nasaler Mukosa sind für toxikologische Studien optimal geeignet, da sie Untersuchungen an humanem Zielgewebe über einen längeren Untersuchungszeitraum erlauben. Dies eröffnet vielfältige Versuchsanordnungen hinsichtlich Expositionsfrequenz und Reparaturintervallen. Zudem erscheinen die Kulturen ausreichend robust, um zukünftig verschiedene realistische Expositionsmodelle, wie Begasungsanlagen und komplexe Mischungen, einzusetzen.

Für die stabile, regulierte Expression eines therapeutischen Gens in Zielzellen stellen künstliche menschliche Chromosomen (HACs) derzeit das einzige Konzept dar, das hohe Sicherheit und technische Realisierbarkeit bietet. Künstliche Chromosomen (HACs) mit dem CFTR-Gen sollen sich durch den Transfer definierter HAC-Konstrukte effizient formieren, ohne dabei die Zielzellen zu stören. Im Augenblick werden künstliche Chromosomen zur Klärung vieler grundlegender Fragen auf dem Gebiet der Chromosomenstruktur und -funktion sowie der Genregulation konstruiert. In der vorliegenden Arbeit sollte die zugrundeliegende de novo HAC-Technologie der Arbeitsgruppe, die sich auf die Konstruktion und den intakten Transfer von PACs mit den funktionellen Komponenten menschlicher Chromosomen (zentromerische, telomerische und genomische Sequenzen mit oris und Gene) konzentriert, weiterentwickelt werden. Die Verwendung von PACs als Kloniervektoren erlaubt die stabile Klonierung langer, genomischer DNA, die biochemische Verknüpfung über lox/Cre vermittelte Rekombination, sowie die Darstellung grosser Mengen intakter, supercoiled PAC DNA durch Anwendung einer in der Arbeitsgruppe entwickelten Technik (Reinigung der supercoiled DNA Fraktion in Agaroseplugs von gebrochener und genickter DNA im elektrischen Feld). Eine Verbesserung der Vektoren ist nötig, da die Effizienz der HAC Formierung bisheriger Vektoren für eine klinische Anwendung nicht ausreicht. Dafür wurden zunächst Marker benötigt, die Anzeigen können wieviele Zellen mit wievielen Vektormolekülen transfiziert wurden und wieviele der physikalisch erfolgreich transfizierten Zellen stabile HACs bilden (genetische Funktion). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Expressionsmarker entwickelt, die eine Formierung stabiler HAC-Linien durch grüne Fluoreszenz anzeigen können. So wurde ein tetratelomerischer PAC-Vektor „pTT“ konstruiert, der stabil eine EGFP-Kassette exprimiert, ein funktionelles Zentromer trägt (TTE1), und für die Klonierung weiterer genomischer Komponenten eine weiss/blau selektionierbare Sal I Stelle enthält. Ausserdem wurde ein CFTR-Gen-basierender „genomischer“ Marker (159 kb) vorgestellt, der den intakten Transfer langer, genomischer DNA und die Expression vom CFTR Promoter anzeigen kann. Besonders hervorzuhebende Ergebnisse aus der Arbeit sind: 1) Kopiezahlabhängigkeit bei der transienten Expression. Einzelne Markergen-Kopien genügen nicht, um Anwesenheit der transfizierten DNA mittels transienter Expression nachzuweisen. 2) Sichtbar transient exprimierende HAC Konstrukte (große Zahl) führen nicht zu stabilen Linien, was nahelegt, dass ein „low copy“ HAC Transfer benötigt wird. Für eine Optimierung und besseres „low copy“ HAC-Monitoring wurden multimere Marker (EGFP Array) und DNA-tags (Gal4-BD, Lac-Operator) entwickelt und stehen nun für einen Einsatz bereit. 3) Für den „low copy“ Transfer wurden neben Lipofektionsassays und der Mikroinjektion insbesondere eine neue Methode, die Baktofektion, eingesetzt, bei der die DNA nicht aus Bakterien isoliert werden muss: Modifizierte Transferbakterien dringen in die Zelle ein und geben die DNA-Konstrukte nach Autolyse frei („suicidal transfer“). Dabei wurde ein funktioneller Transfer genomischer DNA nachgewiesen. Es konnte zum einen gezeigt werden, dass Zentromer tragende Konstrukte effizient de novo HACs bildeten, und zum anderen, dass das lange genomische CFTR Expressionskonstrukt CGT21 stabil vom CFTR Promoter exprimiert wird. Damit steht nun die Baktofektion als effizienteste Methode zur HAC Optimierung zur Verfügung. 4) Durch Auszählung der stabilen Klone, Isolierung von Stichproben klonaler Linien und einem HAC-Formierungsassay mittels FISH Analyse, wurden folgende grundlegende Beobachtungen gemacht: Die Rate der Formierung stabiler Klone mit HAC Konstrukten hängt nicht von a) der Zahl der im einzelnen Konstrukt vorhandenen, oder cotransfizierten Zahl der BS Marker, b) nicht von der Orientierung der alpha-sat DNA relativ zum BS-Gen oder dem entgegengesetzt gerichteten EGFP-Gen, und c) nicht absolut von der Verwendung unterschiedlicher alpha-sat Sequenzen der zwei homogenen Array Typen auf Chr.5 ab, wobei der Vektor pTT mit dem Zentromer E1 die besten Ergebnisse der HAC Bildung erzielte und die höchsten Klonzahlen in Cotransfektionen mit einem telomerisierten Genkonstrukt erhalten wurden, nicht aber in Cotransfektionen mit dem Telomervektor ohne einklonierte genomische DNA. Diese Erkenntnisse haben direkte Relevanz für die Weiterentwicklung CFTR exprimierender HAC Vektoren. Mit den Konstrukten pTTE1 und CGT21, und den zukünftig erweiterten Konstrukten mit multimeren Markern bzw. Tags und einem kompletten CFTR Gen, kann nun auch der physikalische Transfer der HAC Konstrukte in Zielzellen, sowie deren Funktion effizient untersucht werden. Damit konnten wichtige Voraussetzungen für die Weiterentwicklung einer stabilen CFTR Gentherapie geschaffen werden.

Aus dem Blut gesunder Spender wurden T-Zellen aufgereinigt und mit Zytokinen stimuliert. Diese T-Zellpopulationen zeigten daraufhin zwar die Expression charakteristischer T-Zelloberflächenmoleküle, ihre Funktion glich aber Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals diese so genannten NK-ähnlichen T-Zellen auf ihren Phänotyp und ihre Funktion hin im Detail untersucht. Im Gegensatz zu spezifischen MHC-restringierten T-Zellen lysieren NK-ähnliche T-Zellen HLA-negative Zielzellen. Aufgrund ihrer NK-ählichen Funktion könnten diese Effektorzellen in Tumortherapien gegen Tumore eingesetzt werden, die vermindert HLA-Moleküle auf der Zelloberfläche exprimieren, um einer spezifischen T-Zellantwort zu entgehen.

In der vorliegenden Arbeit wurden die immunogenen Eigenschaften des Nichtstruktur-proteins 3 (NS3) des Virus der Bovinen Virusdiarrhö (BVDV) erstmals im natürlichen Wirt charakterisiert. Hierzu wurden sechs Kälber dreimal im Abstand von vier Wochen mit BVDV-NS3-rekombinantem modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA) intramuskulär immunisiert (>108 infektiöse Einheiten). Vier Kälber, die mit LacZ-rekombinantem MVA (>108 infektiöse Einheiten) immunisiert wurden, bildeten die Kontrollgruppe. Fünf Wochen nach der letzten Immunisierung erfolgte eine Belastungsinfektion mit dem BVD-Virusisolat PT810 (106 kulturinfektiöse Dosen50). Für die Untersuchung der BVDV-spezifischen zellulären Immunitätsmechanismen wurden die Lymphozyten aller Tiere mit infektiösem BVDV-PT810 in vitro restimuliert und mit Hilfe verschiedener Testsysteme untersucht. Eine zytofluorometrische Nachweismethode (Fluoreszenzfarbstoff: Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester [CFSE]) diente der Detektion einer antigenspezifischen Lymphozytenproliferation. Die Aktivität BVDV-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) gegen autologe, BVDV-infizierte Zielzellen wurde mit Durchflusszytometrie gemessen. Mit Hilfe einer Real Time PCR wurde die Interleukin-2 (IL-2) und 4 (IL-4) mRNA-Synthese untersucht. Ein kommerziell erhältlicher ELISA (Bovigam) diente dem Nachweis der γ-Interferon-Synthese. Über einen Zeitraum von 19 Tagen nach der intranasalen BVDV-Testinfektion wurden die Kälber täglich klinisch untersucht, die Gesamtleukozytenzahl im peripheren Blut bestimmt, quantitative BVDV-Isolierungen aus den Leukozyten durchgeführt und BVDV-spezifische Antikörper mit Serumneutralisationstesten gemessen. Bereits vor der Belastungsinfektion ließ sich bei allen Kälbern, die mit BVDV-NS3-rekombinatem MVA immunisiert wurden, eine antigenspezifische Lymphozytentransformation nachweisen. Ebenso konnte bei vier Tieren der Versuchsgruppe (N = 6) nach der dritten Immunisierung eine deutliche BVDV-spezifische Zytotoxizität gegenüber autologen Hodenzellen detektiert werden. Nach der BVDV-Belastungsinfektion war die spezifische Zytotoxizität bei fünf der sechs BVDV-NS3-MVA-Impftiere höher als bei den Tieren der LacZ-Kontrolle. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe ließ sich bei der Versuchsgruppe nach der dritten Immunisierung ein deutlicher Anstieg der IL-2 und IL-4 mRNA-Syntheserate von in vitro mit BVDV-restimulierten Lymphozyten nachweisen. Bei fünf der sechs Kälber war zu diesem Zeitpunkt auch γ-Interferon detektierbar. Der Nachweis von BVDV-neutralisierenden Antikörpern war vor der Testinfektion bei keinem Kalb möglich. Nach der Testinfektion konnte ein spezifischer Priming-Effekt für alle immunologischen Parameter, einschließlich der Bildung BVDV-neutralisierender Antikörper, festgestellt werden. Erwartungsgemäß wurden bei beiden Tiergruppen keine Krankheitssymptome beobachtet. Das Ausmaß der Leukopenie infolge der Testinfektion war gleich. Dagegen war der semiquantitativ bestimmte BVDV-Titer in Blutproben der Kontrollgruppe an den Tagen 3-13 nach der Infektion etwa doppelt so hoch (1,9-fach) wie bei der Versuchsgruppe (p = 0,016; signifikant). Im Mittel war bei der Versuchgruppe an 6,7 Tagen und bei der Kontrollgruppe an 8,0 Tagen BVDV reisolierbar (p = 0,121; nicht signifikant). Neben den beachtlichen immunologischen Stimulationseffekten wurde die Reduktion der Viruslast als Hinweis für eine protektive Wirkung des BVDV-NS3 gewertet.

Besonders Zytostatika-vielfachresistente Tumorzellen stellen bei der Chemotherapie ein großes Problem dar. Mit der Entwicklung der Gentherapie ergibt sich eine neue erfolgversprechende Perspektive für die Bekämpfung von malignen Tumorerkrankungen. Sehr viel versprechend ist die Entdeckung von E1A-deletierten Adenoviren, die in vielfachresistenten Tumorzellen, welche häufig den humanen Transkriptionsfaktor YB-1 im Kern enthalten, eine E1A-unabhängige adenovirale Replikation und virale Tumorzelllyse durchführen können. In der vorliegenden Arbeit sollte durch den Einsatz einer in der Gentherapie erst neuen Technologie - der Magnetofektion - eine gezielte lokoregionäre Applikation dieser onkolytischen adenoviralen Vektoren in die vielfachresisten Tumorzellen erreicht werden. Bei der Magnetofektion werden die adenoviralen Vektoren durch elektrostatische Wechselwirkungen an nanokristalline Eisenoxidpartikel gebunden und mit Hilfe eines externen magnetischen Feldes in den Zielzellen angereichert. Die Studien wurden in der Zellkultur an vielfachresistenten und nicht resistenten Tumorzellen durchgeführt. Zur Feststellung der zielgerichteten adenoviralen Infektion wurde das Reportergen LacZ eingesetzt; mit Hilfe der x-Gal Färbung konnte durch Blaufärbung der infizierten Zellen nachgewiesen werden, dass im Einflussgebiet des Magnetfeldes eine effiziente Infektion stattgefunden hat, sowohl in CAR-positiven wie auch in CAR-negativen vielfachresisten Tumorzellen. Um den Grad der adenoviralen Replikation abschätzen zu können, wurden Southern-Blot-Analysen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass E1A-deletierte adenovirale Vektoren in den vielfachresistenten Tumorzellen eine sehr effiziente E1A-unabhängige Replikation durchführen können. Weiterhin konnte der Nachweis der adenoviralen Replikation und der darauf folgenden Tumorzelllyse anhand des Virus-assoziierten cytopathogenen Effektes in den vielfachresistenten Tumorzellen mit der Kristallviolettfärbung erbracht werden. Die adenovirale Replikation und Partikelzahlbildung in vielfachresistenten Tumorzellen konnte anhand eines Plaque-Assay bestimmt werden. Dazu wurden E1A-deletierte Adenoviren nach Infektion von resistenten und nicht resistenten Tumorzellen getrennt aus dem Einflussbereich und außerhalb des Einflussbereiches des Magnetfeldes isoliert. Es zeigte sich, dass die adenovirale Replikation/Partikelbildung im Wirkungsbereich des Magneten deutlich erhöht war. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass durch die Magnetofektion eine zielgerichtete adenovirale Infektion und eine Erhöhung der Transfereffizienz im Wirkungsbereich des Magnetfeldes erreicht werden kann. Somit können E1A-deletierte Adenoviren im Einflussgebiet des Magneten vielfachresistente Tumorzellen, die YB-1 im Kern enthalten sehr effizient infizieren und eine gezielte Tumorzelllyse durchführen.

Pathogene Yersinien injizieren während einer Infektion über ihr TypIII-Sekretionssystem bakterielle Moduline, sogenannte Yops, in Immunzellen, um das Immunsystem zu stören. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass die injizierten Yersinia enterocolitica-Moduline YopE und YopT das Aktinzytoskelett angreifen. Mit dem Ziel der näheren Charakterisierung der zugrunde liegenden Mechanismen wurde insbesondere der Effekt von Y. enterocolitica-YopE auf aktinregulierende Signaltransduktionswege in menschlichen Endothelzellen (HUVEC) untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Yersinia-Stamm hergestellt, welcher YopE als einzigen Effektor transloziert. Mit diesem Stamm infizierte ruhende HUVEC zeigten eine Veränderung des Aktinzytoskeletts ähnlich wie nach Mikroinjektion von dominant negativem N17Rac, was auf eine Inaktivierung von Rac hindeutete. Zur weiteren Untersuchung wurden in infizierten Endothelzellen durch extrazelluläre Stimuli einzelne Rho-GTPasen aktiviert und die dabei ausgebildeten Aktinstrukturen beobachtet. Dabei ergab sich keine Beeinträchtigung der Neubildung CDC42- und Rho-vermittelter Aktinstrukturen (Filopodien und Stressfasern) durch YopE, jedoch eine spezifische Hemmung Rac-induzierter Lamellipodien. Frühere Untersuchungen hatten demonstriert, dass es sich bei YopE um ein sogenanntes GAP („GTPase activating protein“) handelt, welches in vitro die Proteine Rho, Rac und CDC42 hemmt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass in Endothelzellen transloziertes YopE höchst selektiv auf die Ras-ähnliche GTPase Rac wirkt, jedoch keinen Effekt auf CDC42 oder Rho ausübt. Diese Ergebnisse zeigen, dass YopE von Yersinia Rho- GTPase-abhängige Signaltransduktionswege mit einer bemerkenswerten Spezifität in primären Zielzellen beeinflussen kann. Überdies wurde die genannte Spezifität auch in primären Makrophagen nachgewiesen. Weiterhin zeigte sich im HUVEC-Infektionsversuch, dass die Hemmung der typischerweise Rho-vermittelten Aktin-Stressfasern YopT-abhängig ist. Morphologische Veränderungen von Aktinstrukturen, wie sie typischerweise bei der Unterbrechung von CDC42- oder Racvermittelten Signalen vorkommen, wurden nicht beobachtet. In Zusammenhang damit konnte gezeigt werden, dass genannter Effekt auf eine chemische Modifikation und folgliche Inaktivierung von RhoA zurückzuführen ist (Zumbihl et al., 1999). Damit unterscheiden sich YopT und YopE in ihrem Wirkmechanismus und spezifischen Zielmolekül, greifen andererseits jedoch beide direkt an Rho-GTPasen an. Sie könnten deshalb synergistisch bei der Pathogenität von Y. enterocolitica wirken. Darüber hinaus könnten YopE und YopT aufgrund ihrer Spezifität zukünftig als wertvolle Hilfsmittel zur Untersuchung zellulärer Regulationsvorgänge dienen

Das Endometrium stellt ein komplexes Gewebe dar, das sehr genauen Kontrollmechanismen unterliegt. Die zyklischen Veränderungen und damit auch die Vorbereitung auf die Implantation einer Blastozyste werden durch verschiedene Faktoren reguliert. Hierzu gehören endokrine Mechanismen, vermittelt durch die Steroidhormone Östradiol und Progesteron, die Abstimmung des Immunsystems und die Anpassung der Gefäßversorgung. So spielen sowohl eine Vielzahl an Zytokinen als auch Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel VEGF, eine entscheidende Rolle. Das Ziel unserer Untersuchung war eine genauere Betrachtung der Regulationsmechanismen im endometrialen Zellverband anhand von Zellkulturen, durch Immunhistochemie sowie durch Analyse des Uterussekretes. IL-6, ein gut bekanntes Phospho-Glykoprotein, wird im endometrialen Gewebe sowohl von Epithel- als auch von Stromzellen produziert. IL-6 erfüllt im menschlichen Organismus vielfältige Funktionen. Eine entscheidende Rolle scheint ihm bei Entstehung und Erhalt einer frühen Schwangerschaft zuzukommen. IL-6 zeigt ein typisches Verteilungsmuster im Menstruationszyklus mit niedrigen Spiegeln in der Proliferationsphase und einem deutlichen Anstieg in der Sekretionsphase. Bei den zyklischen Veränderungen des Endometriums ist die Revaskularisierung des Gewebes und deren Regulation durch VEGF ein entscheidender Prozess. VEGF existiert in fünf Isoformen, die durch alternatives Spleißen der mRNA entstehen. Es kann sowohl in Stroma- wie auch in Epithelzellen nachgewiesen werden. Im Vergleich zur Proliferationsphase tritt VEGF ebenso wie IL-6 verstärkt in der Sekretionsphase auf. Dieses Verhalten konnte von uns mit Hilfe der Immunhistochemie bestätigt werden. Im Uterussekret steigt die VEGF-Konzentration im Verlauf des Zyklus an. Diese Tatsachen legen eine Regulation von IL-6 und VEGF durch die Steroidhormone 17ß-Östradiol und Progesteron nahe. Das Verhalten von Interleukin-6 in Bezug auf die Stimulation durch die Steroidhormone 17ß-Östradiol und Progesteron wird in der Literatur widersprüchlich dargestellt. So wird zum einen die Erhöhung der IL-6-Konzentration in endometrialen Stroma- und Epithelzellen beschrieben, zum anderen deren Abfall. In den von uns angelegten Versuchen konnte keine statistisch signifikante Änderung von IL-6 durch Östradiol oder Progesteron festgestellt werden. Einige vorhergehende Studien legten die Regulation von VEGF durch Östradiol und Progesteron nahe. Jedoch scheint es keinen direkten Weg der Regulation durch diese Faktoren zu geben. Östrogen verstärkte den mitogenen Effekt von parallel applizierten Wachstumsfaktoren, Progesteron inhibierte diesen. In endometrialen Stroma- und Epithelzellkulturen wurde die Stimulation von VEGF durch Östrogen von anderen Autoren nachgewiesen. Diese Stimulation konnte von uns nicht bestätigt werden. Es stellt sich die Frage, ob eine indirekte Beeinflussung von VEGF durch andere auto- beziehungsweise parakrine Mechanismen vorliegt. Unser Ziel war es nun, die Regulation von IL-6 und VEGF durch andere Faktoren, wie beispielsweise Zytokine, zu untersuchen. IL-1ß erweist sich in diesem Zusammenhang als relevant. Es zeigt ein zyklisches Verhalten im Endometrium mit hohen Spiegeln in der Sekretionsphase zur Zeit der Implantation. Gleichzeitig steigt auch seine Serumkonzentration an. IL-1ß stimuliert IL-6 in endometrialen Stromazellkulturen, nicht jedoch in Epithelzellen. Eine Stimulation von VEGF durch IL-1ß konnte von uns nicht festgestellt werden. Ein weiterer bedeutender Faktor, der von uns genauer untersucht werden sollte, war LIF. LIF erfüllt breite biologische Funktionen, was die Vielzahl an Zielzellen im menschlichen Organismus verdeutlicht. Auch im Endometrium spielt LIF vor allem bei der Implantation eine entscheidende Rolle. Die von uns untersuchte Regulation von VEGF und IL-6 durch LIF erbrachte kein signifikant positives Ergebnis. So konnte eine Stimulation durch LIF weder in Stroma- noch in Epithelzellkulturen nachgewiesen werden. Des weiteren analysierten wir die Regulation von VEGF durch IL-6. Auch hier zeigte sich weder in den Stroma- noch in den Epithelzellkulturen eine statistisch erfassbare Veränderung. Unter verringerter Sauerstoffversorgung finden im Zellverband bestimmte Veränderungen statt, die eine optimale Anpassung an die veränderten Umweltbedingungen ermöglichen. Die Hypoxie erweist sich als relevanter Faktor für eine gesteigerte Produktion von Interleukin-6 in verschiedenen Zelltypen. Es wurde gezeigt, dass sowohl endometriale Stroma- als auch Epithelzellen auf ein verringertes Sauerstoffangebot im Sinne einer IL-6 Erhöhung reagieren. Auch VEGF wird in endometrialen Stroma- und Epithelzellkulturen durch eine Reduktion des Sauerstoffangebots induziert. Hierbei kann man eine deutlichere Steigerung von VEGF in Stroma- als in Epithelzellkulturen beobachten. Unsere Versuchsansätze an Zellkulturen, am Uterussekret und an Endometriumsschnitten haben einen Beitrag zum genaueren Verständnis der Regulationsmechanismen im endometrialen Zellverband geleistet. Die Komplexität der Abläufe jedoch erfordert weiterhin intensive Forschungsarbeit in vivo sowie in vitro, um einen vollständiges Bild des Endometriums zu vermitteln. In diesen Erkenntnissen liegt die Chance, Therapieansätze für einige Erkrankungen, wie zum Beispiel Endometriose oder auch Infertilität zu entwickeln.

Aufgrund der Zunahme an Organ- und Knochenmarkstransplantationen und der damit verbundenen Immunsuppression bzw. immunsuppressiven Therapie sowie der zunehmenden Zahl an AIDS-Patienten ist das Zytomegalovirus (CMV) als Pathogen in den letzten zwanzig Jahren trotz der Einführung wirksamer antiviraler Medikamente bis heute von großer klinischer Bedeutung. Während bei immunkompetenten Personen eine primäre CMV-Infektion durch das Immunsystem kontrolliert werden kann, führt eine Primärinfektion oder eine Reaktivierung einer latenten CMV-Infektion in immunsupprimierten Patienten zu lebensbedrohlichen Komplikationen. Die Pathogenese einer CMV-Infektion wird entscheidend von der Qualität der antiviralen Immunantwort des Wirtes beeinflusst und Kenntnisse über die Interaktion von CMV mit dem Immunsystem sind für die Prophylaxe und Behandlung einer CMV-Infektion von großer Bedeutung. Dendritische Zellen (DCs) sind die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems und spielen bei der Initiierung einer antiviralen Immunantwort eine zentrale Rolle. Die Stimulation von naiven T-Zellen durch DCs und die Auslösung einer zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort trägt entscheidend zur Eliminierung von viral-infizierten Zellen bei. Die Interaktion des Zytomegalovirus mit dendritischen Zellen gibt dem Virus eine Möglichkeit, seine Eliminierung durch das Immunsystem des Wirtes entscheidend zu beeinflussen. Zur Identifikation von Zielzellen für latente und lytische Infektionen durch MCMV und zur Untersuchung der Auswirkungen einer MCMV-Infektion auf den Phänotyp und die Funktion der Zellen wurde die murine hämatopoetische Stammzelllinie FDCP-Mix als Modellsystem verwendet. Definierte Differenzierungsstadien der Zellen entlang der dendritischen Reihe wurden hierzu mit einer GFP-exprimierenden MCMV-Mutante infiziert. Während undifferenzierte FDCP-Mix-Zellen und von FDCP-Mix-Zellen abgeleitete reife DCs nicht produktiv infizierbar waren, setzten unreife DCs infektiöse Virusnachkommen frei. In reifen DCs wurden nur virale Proteine der sehr frühen und frühen Phase der viralen Genexpression synthetisiert, während späte Genprodukte nicht nachgewiesen werden konnten. Die Infektion unreifer und reifer DCs resultierte anfänglich in deren Aktivierung, erkennbar an der vorübergehend verstärkten Expression der Oberflächenmoleküle CD80, CD86, CD40, MHC-Klasse-I und Klasse-II. Die verstärkte Expression der MHC- und ko-stimulatorischen Moleküle auf reifen DCs einige Stunden nach Infektion spiegelte sich in einer gesteigerten Stimulation naiver autologer T-Zellen durch infizierte DCs wider. In der späten Phase der Infektion war die Aktivierung von autologen T-Zellen beeinträchtigt. Dies korrelierte mit der reduzierten Oberflächenexpression der MHC- und ko-stimulatorischen Moleküle auf infizierten reifen DCs. Allogene T-Zellen konnten durch MCMV-infizierte DCs weder in der frühen noch in der späten Phase der Infektion stimuliert werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass DCs im Laufe einer MCMV-Infektion mehrere Rollen spielen: (1) unreife DCs produzieren MCMV-Nachkommen und können so zur Verbreitung des Virus im Wirt beitragen; (2) in einem frühen Stadium der Infektion aktivieren DCs naive T-Zellen und initiieren damit eine antivirale Immunantwort, die einer Ausbreitung der viralen Infektion entgegenwirkt. (3) Zu einem späteren Zeitpunkt der Infektion ist die Stimulation der T-Zell-Proliferation durch MCMV-infizierte DCs beeinträchtigt. Dies ist einer der Mechanismen, welche die Persistenz des Virus in seinem Wirt ermöglichen. Unabhängig vom Zeitpunkt der Infektion ist bei der allogenen Transplantation die Induktion der T-Zell-Antwort immer beeinträchtigt. Die Unfähigkeit der CMV-infizierten DCs, naive allogene T-Zellen zu stimulieren, trägt so zu einer reduzierten antiviralen Kontrolle bei, was CMV-verbundene Krankheiten nach allogenen Knochenmarkstransplantationen begünstigt und gravierende gesundheitliche Probleme zur Folge hat.

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte Pseudotypisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt. Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV essentiell ist. Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen zuzutreffen. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive, hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten, daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit dem c-kit Rezeptor erfolgt. Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus" zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.