Podcasts about wirtszellen

In dieser Folge präsentieren wir ein Interview, das Christoph mit Dr. Robert Hertel vom Institut für Mikrobiologie und Genetik in Göttingen geführt hat. Robert ist Mikrobiologe und beschäftigt sich in seiner Arbeit mit Viren, die nicht Menschen oder Tiere befallen, sondern Bakterien als Wirtszellen befallen - so genannte Bakteriophagen.

  Aus aktuellem Anlass nehme ich das Thema „Coronavirus-Epidemie in China“ auf. Seit Dezember 2019 werden zunehmend Infektionen mit einem bis dato unbekannten Virus, ausgehend von einem Markt in der chinesischen Provinz Wuhan, gemeldet. Es führt zu schweren Infektionen nach einer Inkubationszeit von 1-14 Tagen und dringt über den ACE2-Rezeptor in die Wirtszellen ein, ähnlich … Weiterlesen

Sie leben im Boden und im Wasser und werden als austrocknungsresistente Zysten auch über die Luft verbreitet. Manchen Mikroorganismen – Bakterien und Viren — dienen Amöben als Wirtszellen, Transportmittel und zur Vermehrung, wie beispielsweise dem einerseits humanmedizinisch wichtigen, andererseits aber auch als biologischer Kampfstoff eingestuften Umweltbakterium "Burkholderia pseudomallei". Dieses Bakterium verursacht die noch weitgehend unbekannte und schwere Infektionskrankheit Melioidose. Obwohl schon seit Jahrzehnten Berichte über Erkrankungsfälle aus Afrika vorliegen, ist die Epidemiologie der afrikanischen Melioidose und die Verbreitung von Burkholderia pseudomallei in der Umwelt vollkommen unerforscht.In dieser Sendung stellen wir das KEF-Projekt AMENET: Das afrikanische Melioidose-Netzwerk vor. Dieses Projekt wird im Rahmen von ERAfrica — einem EU-finanzierten Programm zur Stärkung der Forschungszusammenarbeit europäischer mit afrikanischen Ländern — gefördert. Ziel des Projektes mit österreichischer Beteiligung ist es, ein afrikanisches Forschungsnetzwerk aufzubauen, welches sich der Epidemiologie und Charakterisierung von B. pseudomallei und der Bedeutung von Amöben für dessen Verbreitung widmet. Die Melioidose ist als "neglected disease" klassifiziert. Das Netzwerk soll zunächst auf jene Regionen in Westafrika und Madagaskar fokussieren, wo das Vorkommen der Erkrankung bekannt ist, und es soll die Expertise unterschiedlicher wissenschaftlicher Disziplinen in einem gemeinsamen Forschungsprogramm vereinen.Gestaltung und Moderation: Maiada Hadaia (für den Sendungsinhalt verantwortlich)Gast:Assoz.-Prof. Mag. Dr. Julia Walochnik, Institut für Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin an der Medizinische Universität Wien, Mitarbeiterin im KEF Projekt AMENET: Das afrikanische Melioidose-NetzwerkSendetermin: Freitag, 19.06.2015, 20:00-21.00 UhrMusik: Podington Bear-Wook; Tchakare Kanyembe-track 2; Tchakare Kanyembe-track 4; Salam-05-Kairo. Nachzuhören auf Free Music Archive (FMA), einer Community für freie, legale und unlimitierte Musik, die unter Creative Commons Lizenzen veröffentlicht wurde.

Cronobacter sakazakii ist ein ubiquitäres Gram-negatives Stäbchenbakterium, das neben anderen Lebensmitteln vor allem in Milchpulver vorkommt und insbesondere bei Neonaten zu nekrotisierender Enterocolitis (NEC), Bakteriämie und Meningitis führen kann. Trotz der umfangreichen Forschung der letzten Jahre ist nach wie vor wenig über die Pathogenese von Cronobacter spp. sowie potentielle Virulenzfaktoren bekannt. Um neue Erkenntnisse über Pathogenitätsmechanismen von C. sakazakii zu erhalten, wurden in dieser Arbeit 28 Transposoninsertionsmutanten des klinischen Isolats C. sakazakii ES5 in drei unterschiedlichen Zelllinien auf ihre Fähigkeit an die eukaryotischen Zellen zu adhärieren, in sie einzudringen und in ihnen zu proliferieren, untersucht. Die inaktivierten Gene dieser Mutanten codieren für Proteine des Energiestoffwechsels, der Zellwand und des Biofilms, der Motilität der Bakterien und der Carotinoidbiosynthese. Angelehnt an den in vivo Infektionsweg von C. sakazakii - orale Infektion des Organismus, primäre lokale Infektion im Darm, systemische Infektion über die Invasion in Makrophagen und schließlich das Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke und die Infektion des Gehirns - wurden für die Studie Caco-2 Darmepithelzellen, RAW-264.7 Makrophagen-Zellen sowie HBMEC Hirnendothelzellen ausgewählt. Beim Screening aller drei Zelllinien konnte festgestellt werden, dass die Flagellenstruktur betreffende Mutationen bei C. sakazakii ES5 zu fast 100%iger Attenuation der Invasion der Wirtszellen führen. Dies lässt auf die Bedeutung der Flagellen als Pathogenitätsfaktor schließen. Bedingt sein könnte die Attenuierung durch die verminderte Motilität der Bakterien, durch die instabile Interaktion von Flagellen mit den eukaryotischen Zellen selbst oder möglicherweise durch die fehlende Sekretion von Virulenzfaktoren durch das Typ-III-Flagellen-Sekretionssystem. Weiterführende Untersuchungen zu der Motilität der Transposoninsertionsmutanten zeigten, dass die Flagellenfunktion bei C. sakazakii ES5 durch Suppression reguliert zu sein scheint, da die bei C. sakazakii ES5 vorhandene Hemmung des Flagellen-vermittelten Swimmings im Weichagar z.B. unter Zugabe von steril filtriertem Überstand einer C. sakazakii ES5-Kultur wieder aufgehoben werden konnte. Des Weiteren fielen zwei Mutanten mit verminderter Serumresistenz durch reduzierte Virulenz auf, sowie eine Mutante, deren unterbrochenes Gen für einen putativen Reifungsfaktor der 30S-Untereinheit der Ribosomen codiert. Bei diesen drei Mutanten könnten die inaktivierten Gene für potentielle Virulenzfaktoren codieren und sollten näher untersucht werden. Transposonmutanten aus der orthologen Gruppe für Energiestoffwechsel zeigten ebenfalls eine verminderte Invasion. Diese Stämme hatten bei der biochemischen Charakterisierung der Metabolisierung definierter Kohlenstoffquellen bei den Aminosäuren und den Zwischenprodukten des Intermediärstoffwechsels ein vom Wildtyp ES5 abweichendes Metabolisierungsmuster. Die Unterbrechungen im Citratzyklus führten z.B. zur schwächeren Verstoffwechselung von L-Glutamat, dafür wurde L-Asparagin besser als Substrat verwertet. Somit konnte die Fähigkeit zur Anpassung durch Umstellung des Metabolismus bei C. sakazakii ES5 bestätigt werden. Weiterhin ergab der Vergleich des Kohlenstoff-Metabolismus von Cronobacter spp. mit dem von Salmonella enterica sv. Typhimurium einige interessante Unterschiede: C. sakazakii konnte im Gegensatz zu S. Typhimurium eine Vielzahl in der Umwelt vorkommender C-Quellen zur Energiegewinnung nutzen, was darauf schließen lässt, dass das ubiquitäre Bakterium Cronobacter spp. ursprünglich mit Pflanzen assoziiert war. Glucose-6-Phosphat, ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt, das bei pathogenen Enterobacteriaceae neben Glucose und Mannose intrazellulär als die bevorzugte Kohlenstoffquelle gilt, wurde von C. sakazakii dagegen in vitro nicht metabolisiert. Es bleibt zu klären, ob C. sakazakii in der Lage ist, intrazellulär seinen Stoffwechsel umzustellen und Glucose-6-Phosphat als C-Quelle zu nutzen. C. sakazakii ist ein gelb pigmentiertes Bakterium und synthetisiert die Pigmente über Carotinoid-Biosynthese. In den Infektionsversuchen zeigte sich, dass pigmentlose Mutanten in der Invasion von RAW-264.7-Zellen attenuiert sind. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass bei der de novo Carotinoid-Synthese das CrtY-Protein (Lycopin-ß-Cyclase) die ß-Cyclisierung von Lycopin zu ß-Carotin ausführt. Nach Komplementierung der crtY-Mutante zeigte sich erneut die wildtypische gelbe Pigmentierung der Bakterienkolonien von C. sakazakii ES5crtY::Tn5/pUC19-crtY, anstatt der pinken Koloniefärbung der Mutante. Die Reduzierung der Invasion in HBMEC-Zellen um mehr als 30% konnte durch die Komplementation des crtY-Gens aufgehoben werden: die konstitutive Expression des Gens führte zu einem Invasionswert von 122% des Wildtyps. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Infektionsexperimente in drei Zelllinien der Infektionsweg von C. sakazakii ES5 nachgestellt, neue potentielle Virulenz-assoziierte Faktoren identifiziert und die Fähigkeit der spezifischen Anpassung an das intrazelluläre Milieu als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal bestätigt werden.

Mitochondrien und Chloroplasten sind Zellkernbestandteile, die vor allem eines gemeinsam haben: ihre Entstehung. Sie stammen von Bakterien ab, die vor etwa zwei Milliarden Jahren von Wirtszellen aufgenommen wurden. An der LMU werden diese faszinierenden Zellorganellen in zwei Arbeitsgruppen erforscht. Professor Walter Neupert vom Adolf-Butenandt-Institut ist seit langem dominierend auf dem Gebiet der Mitochondrien, Professor Jürgen Soll vom Department Biologie I erhielt dieses Jahr den Leibniz-Preis für seine Arbeit an den Chloroplasten.

Herpesviren exprimieren Micro-(mi)RNAs, welche die Expression von zellulären und viralen Genen beeinflussen. Das Genom des Kaposi Sarkom Assoziierten Herpesvirus (KSHV) kodiert ein Cluster von insgesamt 12 miRNAs, welche sowohl während der latenten, als auch während der lytischen Infektion exprimiert werden. Da bisher nur sehr wenige zelluläre Zielgene für KSHV miRNAs bekannt sind, war es das Ziel dieser Studie, Gene zu identifizieren, deren Expression durch virale miRNAs von KSHV beeinflusst wird. Zu diesem Zweck wurden KSHV miRNAs mit Hilfe eines lentiviralen Transduktionssystems in B-Zellen und in Endothelzellen exprimiert. Diese sind beide natürliche Wirtszellen für KSHV. Die dabei entstandenen Zelllinien wurden mit Hilfe von zwei unterschiedlichen experimentellen Ansätzen untersucht: Beim ersten Ansatz wurde das gesamte Expressionsprofil dieser Zellen mit Hilfe von Microarrays analysiert und, nach Filterung durch bioinformatische Methoden, wurden Kandidaten für eine Regulation durch virale miRNAs identifiziert. Das Ergebnis wurde anhand biochemischer Methoden validiert und zwei zelluläre Transkripte als Zielgene bestätigt. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass KSHV miRNAs die Caspase 3 inhibieren und dadurch die Zellen vor Apoptose schützen. Im zweiten, weitaus effizienteren Ansatz, wurden die sogenannten RISC-Komplexe mit Hilfe von AGO2-spezifischen Antikörpern sowohl aus den KSHV miRNA exprimierenden Zellen als auch aus latent KSHV infizierten Zellen isoliert und die daran gebundenen mRNAs identifiziert. Der RISC-Komplex spielt die entscheidende Rolle bei der miRNA-induzierten Regulation und enthält neben Proteinkomponenten (u.a. Argonauten (AGO)-Proteinen) sowohl die aktiven miRNAs als auch die regulierten mRNAs. Nach Isolierung der gebundenen RNAs konnten mit dieser Methode 72 Gene als Zielgene für KSHV miRNAs identifiziert werden. Viele davon spielen eine wichtige Rolle in unterschiedlichen Prozessen wie Zellzykluskontrolle, in der Apoptose oder der mRNA-Prozessierung. Insgesamt 11 identifizierte Zielgene wurden mit Hilfe von real-time PCRs untersucht und 10 bestätigt. Mittels 3’UTR-Luciferase-Assays wurden 6 davon weiter analysiert und bestätigt. Für die Gene LRRC8D, NHP2L1 und GEMIN8 konnten die zuständigen KSHV miRNAs und die dazugehörigen Bindungsstellen auf dem Transkript identifiziert werden. Bei den letzteren beiden lagen diese interessanterweise nicht wie erwartet in der 3’UTR, sondern in dem kodierenden Bereich.

Bei Yersinia enterocolitica handelt es sich um einen humanpathogenen Keim, der ein Typ III Sekretionssystem (T3SS) zur Translokation von Effektorproteinen in Wirtszellen nutzt, um die Zellen zu paralysieren und der angeborenen Immunantwort zu entgehen. Die homologen Proteine YscM1 und YscM2, die bisher als funktionell äquivalent galten, wurden als Interaktionspartner der Phosphoenolpyruvatcarboxylase (PEPC) identifiziert. Die PEPC trägt durch die Bildung von Oxalacetat zur Auffüllung des Citratzyklus bei. Daher wurde die Interaktion der PEPC mit den YscM Proteinen in vivo und in vitro untersucht. Darüber hinaus wurden verschiedene weitere T3SS-Proteine aus Y. enterocolitica wie die Chaperone SycO, SycE und SycD und YscY/YscX charakterisiert und auf eine mögliche Verknüpfung zu den YscM Regulatoren überprüft. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung verschiedener Regulatorproteine des Typ III Sekretionssystems, die ein regulatorisches Netzwerk bilden könnten.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.

Erkenntnisse zur funktionalen Zellkernarchitektur wurden bisher überwiegend an fixierten Zellen durch in situ Methoden erlangt. Durch Etablierung eines Lebendzell-Systems sollte überprüft werden, ob es möglich ist, ein einzelnes Transgen auf DNA-Ebene zu visualisieren und es bei seiner transkriptionellen Aktivierung zu beobachten. Das hier entwickelte „Gene Positioning System“ (GePS) nutzt das Lac-Operator/Lac-Repressor-GFP-System („Gene Tag“) als visualisierende Komponente, um das Indikatorgen auf DNA-Ebene sichtbar zu machen. Das Indikatorgen selbst basiert auf der induzierbaren Transkriptionseinheit von HIV-1, die spezifisch durch das virale Protein Tat aktiviert werden kann und die Transkription eines Reportergens (DsRed) kontrolliert. Im transient transfizierten Status konnte das Indikatorgen als Episom durch Bindung des „Gene Tags“ als punktförmiges Signal im Kern detektiert werden. In den etablierten und charakterisierten Zelllinien HeLa-Indi war dies durch Bindung des „Gene Tags“ an 64 Lac-Repressor-Bindungsstellen eines einzelnen Transgens nicht möglich. Die Etablierung der stabilen Zelllinien und die transiente Expression ermöglichten einen direkten Vergleich der Transkription von der integrierten und episomalen HIV-1 LTR. In beiden Fällen konnte eine spezifische Transkriptionsaktivierung durch Tat auf Protein- und RNA-Ebene beobachtet werden. Auch eine Tat-unabhängige Basisaktivität in Form von Volllänge-Transkripten konnte immer nachgewiesen werden, die in verschiedenen Zelllinien und dem episomalen Indikatorgen aber zu keiner nachweisbaren Proteinexpression führte. Die induzierte Expression des Indikatorgens des „GePS“ konnte darüber hinaus in wichtigen HIV-1 Zielzellen (CD4 positive Lymphozyten) gezeigt werden. Des Weiteren konnten Erkenntnisse über die Tat-induzierte, von der HIV-1 LTR ausgehenden Transkription und der Zusammenhang zum Spleißen gewonnen werden. Durch quantitative PCR wurde deutlich, dass sowohl im epsiomalen als auch integrierten Status erst durch die gesteigerte Transkription das Spleißen der Indikatorgen-RNA induziert wird, das Spleißen also co-transkriptionell stattfindet. Tat selbst spielt bei der Rekrutierung von Spleißfaktoren nur eine indirekte Rolle, da durch die transkriptionsdefiziente Mutante Tat(K41A) kein Spleißen initiiert wird. Durch verschiedene methodische Ansätze wurde versucht, die Frage der Chromatinzusammensetzung von nicht replizierenden Episomen in menschlichen Zellen zu beantworten. Weder durch eine Colokalisations-Untersuchung noch eine Chromatin IP konnte jedoch eine spezifische Assoziation des episomalen Indikatorgens mit dem Histon H3 nachgewiesen werden. Eine Bindung von Proteinen an die Episomen konnte am Beispiel von p50, einer Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκB, gezeigt werden. Für die produktive Replikation der Retroviren ist die Integration der proviralen DNA ins Genom der Wirtszelle nötig, jedoch konnte für HIV gezeigt werden, dass nicht integrierte zirkuläre HIV-DNA in sich nicht teilenden Zellen persistiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vermutung, dass nicht integrierte retrovirale DNA transkribiert werden kann und dadurch die exprimierten Proteine Bedeutung für den Lebenszyklus von HIV und durch ihre Persistenz Einfluss auf die Wirtszellen haben können.

Tue, 4 Oct 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5833/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5833/1/Heimerl_Christiane.pdf Heimerl, Christiane ddc:570, ddc:500, Fakultät f

Podosomen sind aktinreiche Strukturen des Zytoskeletts primärer humaner Makrophagen. Für Adhäsion, Polarisation und Chemotaxis sind diese Strukturen von essentieller Bedeutung. Ihr ständiger Umbau und ihre Regulation unterliegt einer fein abgestimmten Balance der Rho GTPasen Rho, Rac und Cdc42. Pathogene Yersinien spp. haben Aktinzytoskelett von Wirtszellen durch Modulation von Rho GTPasen als Angriffsobjekt gewählt. Mit ihrem plasmidkodierten Typ III Sekretions- und Translokationsapparat werden wichtige Immunfunktionen paralysiert. In dieser Arbeit wurde in primären humanen Makrophagen der Einfluss von Yersinien-Effektoren auf Podosomen untersucht. Konkret interessierte die Frage, welchen Effekt YopE auf diese Strukturen hat. Hierzu wurden in einem standardisierten Verfahren gewonnene und gereinigte Makrophagen gesunder Spender mit unterschiedlichen Mutanten der Spezies Yersinia enterocolitica für verschiedene Zeiten infiziert. Nach Färbung der Zellen mit Rhodamin-Phalloidin wurde die Anzahl der verbliebenen Zellen mit Podosomen im konfokalen Mikroskop ermittelt und statistisch ausgewertet. Es konnte erstens gezeigt werden, daß ein voll virulenter Yersinien Stamm in der Lage ist, nach einer Infektion von bereits 30 min die podosomalen Strukturen der Makrophagen vollkommen zu zerstören. Zweitens sind an diesem Effekt verschiedene Yersinien-Effektoren und zusätzlich der Typ III Sekretions- und Translokationsapparat beteiligt. Drittens reicht YopE für die Zerstörung von Podosomen alleine aus. Viertens ist die GAP-Aktivität von YopE für die Destruktion von Podosomen nicht notwendig und lässt auf GAP-unabhängige Mechanismen von YopE schliessen. Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten, daß YopE ein wichtiger aber nicht der alleinige Effektor der Yersinien bei der Paralyse von menschlichen Makrophagen und insbesondere der Zerstörung podosomaler Adhäsionsstrukturen ist.

Die Rolle der Transduktion beim horizontalen Gentransfer ist bislang wenig untersucht. Die Bedeutung, die diesem Mechanismus beim Austausch von genetischem Material in der Natur zukommt, kann nur geklärt werden, wenn möglichst umfassende Informationen über das Vorkommen von transduzierenden Bakteriophagen verfügbar sind. Zur Erforschung des Ausmaßes des phagenvermittelten Gentransfers war es notwendig, Methoden zu entwickeln, die nicht auf die Verfügbarkeit kultivierbarer Indikatorbakterien zum Nachweis von Phagen sowie Spender- und Empfängerstämme zum Nachweis der Transduktion angewiesen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur indikatorunabhängigen Identifizierung transduzierender Bakteriophagen entwickelt. In Phagenpartikel verpackte DNA wurde als Template für die PCR-Amplifikation von bakterieller 16S rDNA eingesetzt. Dabei wurden PCR-Primer verwendet, die eine Amplifikation der 16S rRNA-Gene der meisten Eubakteria ermöglichen. Die Sequenzierung der klonierten Amplifikationsprodukte ermöglichte die retrospektive Identifizierung der Wirtsbakterien. Zur Etablierung dieser Methode wurde der generell transduzierende Salmonella-Phage P22 eingesetzt. Erste Anwendungen auf verschiedene Umweltproben zeigten, daß dieser Ansatz den Nachweis generell transduzierender Bakteriophagen ohne Isolierung und Kultivierung der Wirtszellen ermöglicht. Daher ist es auch möglich, Phagen, die am Gentransfer beteiligt sind, ohne Selektion durch die derzeit kultivierbaren Wirte zu detektieren. Schon in den ersten Testanwendungen konnten Phagen von 26 verschiedenen Gramnegativen Bakterienspezies nachgewiesen werden, bei denen bisher keine transduzierenden Viren bekannt waren. Die Untersuchung einer Moorquellwasserprobe brachte Informationen über Phagen mit bisher unbekannten Wirtszellen. Die hier vorgestellte Methode kann als Prototyp des indikatorunabhängigen Nachweises generell transduzierender Phagen für prinzipiell alle Bakterienarten gelten. Unter Einsatz verschiedener 16S rDNA-Primerpaare ist der Suche nach transduzierenden Partikeln in der Umwelt nahezu keine Grenze gesetzt. Dieser Ansatz erlaubt sowohl die Überprüfung einer Probe auf das Vorkommen transduzierender Phagen mit unterschiedlichen Wirtsspezifitäten als auch die gezielte Suche nach am DNA-Transfer beteiligten Phagen spezieller Vertreter der Prokaryonten. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der bisher unbekannten Salmonella-Phagen 7D, PS79 und A12. Es konnte gezeigt werden, daß diese nicht mit P22 sowie anderen prominenten Bakterienviren verwandt sind und daher drei neue Phagenfamilien repräsentieren. Mikrobiologische Untersuchungen erbrachten, daß es sich dabei um zwei temperente und einen virulenten generell transduzierenden Phagen handelt. Bezüglich ihrer morphologischen und Nukleinsäure-Merkmale zählen sie zur Familie der Caudovirales. Die Phagen wurden in Hinsicht auf ihr Wirtsspektrum sowie auf phagenvermittelte Schutzmechanismen lysogener Zellen untersucht. Im Rahmen der molekulargenetischen Analyse konnte die Größe der Phagengenome ermittelt werden und für 7D und PS79 konnten Restriktionskarten für acht bzw. sieben Enzyme erstellt werden. Der Phage A12 entzog sich, wahrscheinlich aufgrund ausgeprägter DNASekundärstrukturen, einer ausführlichen Restriktionskartierung, so daß diese auf ein Enzym beschränkt werden mußte. Untersuchungen PS79-lysogener Zellen weisen darauf hin, daß der Prophage als extrachromosomale Replikationseinheit vorliegt. Für den Phagen 7D wurde die Integration durch ortsspezifische Rekombination sowie der Integrationsort auf dem Chromosom von Salmonella nachgewiesen. Die Charakterisierung der Phagen 7D, PS79 und A12 erbrachte neue Informationen über die Vielfalt generell transduzierender Bakteriophagen bei Salmonella. Insgesamt zeigen die erzielten Ergebnisse deutlich, daß der horizontale Transfer genetischen Materials durch Transduktion, insbesondere im Hinblick auf die Sicherheitsforschung im Zusammenhang mit der Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen, nicht länger als vernachlässigbarer Faktor eingestuft werden kann.

Salmonellosen gehören weltweit zu den drei häufigsten registrierten, lebensmittelbedingten bakteriellen Darmerkrankungen. Dabei sind bestimmte S. enterica-Subspezies-I-Serovare an einen speziellen Wirt adaptiert, andere Serovare zeigen hingegen ein breites Wirtsspektrum. Der Krankheitsverlauf einer Salmonellose wird aber auch von der Spezies des infizierten Wir- tes bestimmt. Je nach infiziertem Wirt können beispielsweise milde bis akute Enterocolitis, aber auch schwere systemische Infektionen beobachtet werden. Um sich im Laufe ihrer Evolution optimal an ihre Wirte anzupassen, haben Salmonella spp. nach der Abspaltung vom kommensalen E. coli schrittweise neue Virulenzeigenschaften er- worben. Dies geschah vor allem über horizontalen Gentransfer (Ochman und Moran, 2001). Im ersten Schritt wurde die Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 (SPI1), später SPI2 erworben. Beide Inseln kodieren jeweils einen Typ-III-Translokationsapparat und dazu gehörende trans- lozierte Effektorproteine, welche die Wirtszellreaktionen zum Vorteil des Pathogens modulie- ren. Die Inseln sind zu unterschiedlichen Phasen der Salmonellosen aktiv. Das für die Wirts- zellinvasion verantwortliche Typ-III-Translokationssystem von SPI1 kann auch Effektoren in die Wirtszellen schleusen, die außerhalb der SPI1 kodiert sind. Der in SPI1 kodierte Translo- kationsapparat ist in Salmonella spp. hoch konserviert (Li et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der translozierten Effektorproteine bei der Evolu- tion von Salmonella spp. hin zu tierpathogenen Erregern untersucht. Es konnte gezeigt wer- den, daß die meisten SPI1-abhängig translozierten Effektoren (SipA, SipB, SipC, SptP, SopB, SopD und SopE2), ob innerhalb oder außerhalb von SPI1 kodiert, ebenfalls hoch konserviert vorliegen. Phylogenetische Analysen zeigten, daß diese konservierten Effektoren früh in der Salmonella-Entwicklung, nämlich zwischen 50 und 160 Millionen Jahren (im Zeitrahmen der SPI1-Aufnahme), akquiriert wurden. So handelt es sich hierbei um Faktoren mit einer basalen bzw. zentralen Virulenzfunktion, die Salmonella spp. von kommensalen Escherichia spp. unterscheiden. Es konnte gezeigt, daß die konservierten Effektorproteine SopE2 und SopB maßgeblich an der Wirtszellinvasion beteiligt sind (Mirold et al., 2001). Diese Invasion-vermittelnden Effek- toren sind weit entfernt von SPI1, in separaten chromosomalen Loci, kodiert. Diese Beobach- tung steht in gewissem Widerspruch zur klassischen Definition der Pathogenitätsinsel. Die invasionsrelevanten Effektoren SopB und SopE2 bilden zusammen mit dem SPI1- Translokationsapparat eine funktionelle Einheit (ein sogenanntes „Invasionsvirulon“), obwohl sie nicht -wie für Pathogenitätsinseln postuliert- auf demselben chromosomalen Element ko- diert sind. Zusammen mit den phylogenetischen Daten aus dieser Arbeit, deuten diese Ergeb- nisse daraufhin, daß der letzte gemeinsame Vorfahre aller heutigen Salmonella spp. bereits sämtliche für die Wirtszellinvasion benötigten Effektorproteine kodierte und daß die Modula- tion der Signaltransduktionswege in der Wirtszelle in S. bongori und in sämtlichen S. enteri- ca-Subspezies konserviert sind. Es wird vielmehr ein Translokationsmodul durch die SPI1 bereitgestellt, durch das sowohl konservierte als auch variabel vorkommende Effektorproteine in die Wirtszelle geschleust werden können. Es konnten jedoch auch Variationen festgestellt werden. Die beiden für die Effektorproteine SopE- und AvrA-kodierenden Gene sind variabel in der Salmonella-Population verteilt. AvrA ist am Rande der SPI1 kodiert und es wird vermutet, daß es nicht zum Kern der SPI1 gehört. Das variable SopE ist bei Zentisom 60 des Salmonella-Chromosoms, abgetrennt von SPI1 (Zentisom 63), kodiert. Das variable Effektorprotein SopE und wahrscheinlich auch AvrA tragen vermutlich als „Adaptationsproteine“ zur Feinmodulation der Wechselwirkung mit dem Wirt bei. Vermutlich existieren noch wesentlich mehr variable Effektorproteine, die zu dieser Feinanpassung beitragen. In dieser Arbeit wurde weiterhin der horizontale Transfer von sopE detailliert untersucht. SopE ist in Typhimurium auf SopEΦ, einem Bakteriophagen der P2-Familie, kodiert. SopE ist das erste Effektorproteingen, bei dem die horizontale Übertragung über den Mechanismus der lysogenen Konversion nachgewiesen werden konnte. Bisher war bei Salmonella spp. nur der Phagen-vermittelte horizontale Transfer durch Transduktion bekannt. Die spezifische Integra- tionsstelle von SopEΦ in das Salmonella-Chromosom wurde näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, daß SopEФ in der attL-Region eines bereits integrierten kryptischen Propha- gen (CP4-57) integriert ist, der seinerseits in ssrA, dem Gen für die kleine stabile tmRNS, integriert ist. Epidemiologische Untersuchungen wiesen zudem darauf hin, daß der Erwerb des sopE-Gens durch lysogene Konversion mit SopEФ einen selektiven Vorteil gegenüber sopE-negativen Typhimurium-Stämmen darstellen. SopE-tragende S. enterica-Subspezies-I-Serovar Typhi- murium-Stämme lösten in den siebziger und achtziger Jahren verstärkt Epidemien aus. Darü- berhinaus konnte gezeigt werden, daß SopEФ-Lysogene eine gesteigerte Virulenz aufweisen. Dies wurde sowohl in Zellkulturversuchen (diese Arbeit) als auch in Rinderinfektionsversu- chen (Zhang, zur Publikation eingereicht) experimentell nachgewiesen. Schließlich wurde in dieser Arbeit auf die Koevolution von Salmonella spp. und Virulenzfak- tor-tragenden Bakteriophagen untersucht. Es wurde festgestellt, daß die genetischen Mecha- nismen, welche den Modulaustausch zwischen Bakteriophagen vermitteln, auch dazu führen, die Flexibilität der Salmonella spp. bezüglich der Wirtsanpassung zu steigern. Dieser Mecha- nismus stellt möglicherweise für die Bakterien und damit auch für die assoziierten Bakteri- ophagen einen Selektionsvorteil dar. Es wurde beobachtet, daß der Virulenzfaktor SopE in einigen Serovaren der S. enterica-Subspezies-I nicht auf einem P2-ähnlichen sondern auf ei- nem lambdoiden Bakteriophagen kodiert ist. Es konnte demzufolge zum ersten Mal beobach- tet werden, daß ein Virulenz-vermittelndes Effektorproteingen in dem Genom zweier ver- schiedener Phagenfamilien kodiert ist und durch diese Phagen möglicherweise horizontal transferiert werden kann. Die ermittelten DNS-Sequenzen um sopE lassen vermuten, daß eine konservierte sopE-tragende Kassette (oder „Moron“) durch homologe Rekombination zwi- schen den zwei verschiedenen Bakteriophagenfamilien (P2- und lambdoid) transferiert wor- den ist. Diese Art des Transfers von Virulenzgen-Modulen zwischen verschiedenen Phagen- Familien erlaubt die flexible Neukombination von Phagen-kodierten Effektorproteinen. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß variabel vorkommende translozierte Effektorpro- teine die Pathogen-Wirt-Beziehung optimieren können. Neukombinationen dieser Effektoren können über horizontalen Transfer hergestellt werden und somit die optimale Anpassung an die jeweiligen Wirte gewährleisten. Dabei spielt der horizontale Transfer von Virulenzgenen über konvertierende Bakteriophagen eine wesentliche Rolle. Günstige Kombinationen von variablen Effektorproteinen sind wahrscheinlich entscheidend an der Entstehung neuer Epi- demiestämme beteiligt. Die effizienten horizontalen Transfermechanismen zwischen ver- schiedenen Salmonella spp. als auch zwischen verschiedenen Phagenfamilien tragen so dazu bei, daß Salmonella spp. ein äußerst breites Spektrum von Wirten infizieren können und daß neue Epidemieklone mit höherer Frequenz entstehen können.