Podcasts about tfpi

Amy Shapiro discusses the recent approval of concizumab for the treatment of patients with hemophilia. This novel subcutaneous homeostatic rebalancing agent has proven to be useful for the treatment of patients with hemophilia A and B, and we hope you find this talk to be useful to understand it.

Subendothelial lokalisierter Tissue Factor bildet das wichtigste Startsignal für die Blutgerinnung. Unter physiologischen Bedingungen verhindert die Endothelbarriere den Kontakt von TF mit plasmatischen Gerinnungsfaktoren und damit den Gerinnungsstart. Neue Untersuchungen haben gezeigt, daß präformierter TF in ruhenden Plättchen gespeichert ist. Nach Kontakt mit Kollagen wird dieser TF auf der Plättchenoberfläche und auf zirkulierenden Mikrovesikeln exprimiert. In der vorliegenden Arbeit fanden wir, daß für die funktionelle Aktivierung des intravaskulären TF Interaktionen von Plättchen, Neutrophilen und Mikrovesikeln notwendig sind. Die TF-Aktivität sowie die TF-abhängige Fibrinbildung wurden in einem System aus isolierten Blutzellen und parallel in einem der In-vivo-Situation nahestehenden Vollblutsystem gemessen. Neben zirkulierenden Mikrovesikeln wurden auch in vitro hergestellte Mikrovesikel eingesetzt und mittels ELISA auf ihren TF-Gehalt untersucht. Dabei zeigte sich, daß in Analogie zu den „Mutterzellen“ Plättchen-Mikrovesikel TF enthalten, während in Neutrophilen-Mikrovesikeln kein TF nachweisbar war. Die Förderung der thrombozytären TF-Aktivität durch Neutrophile lässt sich vermutlich durch die Fähigkeit der Leukozyten erklären mittels sezernierter Sauerstoffradikale (und Proteasen) TF zu aktivieren und seinen physiologischen Antagonisten TFPI zu hemmen. TFPI ist ein physiologischer Antagonist des TF, der von aktivierten Thrombozyten sezerniert wird. Für die Aktivierung des thrombozytären TF ist die Adhäsion von Plättchen an Leukozyten notwendig. Antikörper gegen Adhäsionsmoleküle für den Plättchen-Leukozyten-Kontakt, wie P-Selektin oder PSGL-1, reduzierten die TF-Aktivität. Da das von aktivierten Plättchen sezernierte ADP die Plättchen-Leukozyten-Adhäsion und die TF-Freisetzung aus alpha-Granula fördert, bildet das ADP-System ein interessantes Ziel für pharmakologische Interventionen. Tatsächlich konnte durch Blockierung des ADP-Rezeptors P2Y12 die Aktivität des blutassoziierten TF merklich gesenkt werden. Dies wurde im Rahmen einer Studie mit dem Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel ex vivo und in in-vitro-Analysen beobachtet. Zusammen mit früheren Arbeiten ermöglicht die vorliegende Studie eine substantielle Erweiterung des Modells der schnellen Aktivierung der Blutgerinnung durch intravaskulären TF. Der im Rahmen dieser Arbeit beschriebene Aktivierungsmechanismus zeigt, daß das ADP-Amplifikationssystem der Thrombozyten und Sauerstoffradikale der Neutrophilen von erheblicher Bedeutung für die Aktivierung des intravaskulären TF sind. Für die pathologische Bedeutung dieser im Rahmen thromboembolischer Ereignisse bestehen bereits zahlreiche Hinweise.

Both activated platelets and circulating microparticles were described to express tissue factor (TF), the principal initiator of coagulation, on their cell surface (intravascular TF). It is still not clear whether TF is functionally active on activated platelets. TF expressed on activated monocytes and various other cell types has been described to be functionally inactive (encrypted or latent TF). In the present study, cellular mechanisms are analyzed that could release the TF procoagulant activity of blood components. Tissue factor pathway inhibitor-1 (TFPI) represents the main physiologic inhibitor of the coagulation start. It inhibits the ternary initiator complex of the extrinsic coagulation pathway by first binding the circulating factors X / Xa and subsequently interacting with VII / VIIa. We found that after stimulation with thrombin and collagen type I, TFPI was recovered in the platelet releasate and it was degraded by neutrophil elastase (NE) released from activated neutrophils. TFPI degradation was also induced by NE on neutrophil microparticles. We found that NE is bound to negatively charged macromolecules (proteoglycans, RNA) on the surface of activated neutrophils by polar interactions. Overall, we could provide substantial experimental evidence that upon interaction of activated platelets with PMN a microenvironment is formed, which allows the efficient degradation of TFPI by the PMN-associated serine protease NE. This cross talk between the innate immune system and the coagulation system might be of general importance in pathologies, such as sepsis, arterial and venous thrombosis and myocardial infarction. TF-encryption has represented an unsolved problem for several decades. We reveal that thiol-disulfide exchange in the extracellular C186/C209 disulfide pair of TF triggers the TF procoagulant activity. Formation of the intramolecular C186/C209 disulfide activates TF procoagulant function, whereas reduction of the disulfide to the appropriate sulfhydryls and the formation of mixed disulfides (protein S-glutathionylation of TF) were found to suppress its procoagulant function. TF activation is supported by the thiol isomerase protein disulfide isomerase (PDI) and it is facilitated by the reactive oxygen species (ROS) detoxifying enzyme glutaredoxin (GRX). Protein S-glutathionylation of TF was uncovered as one reversible mechanism preventing the intravascular coagulation start. We suggest that thiol isomerases are injury-responsive signals driving coagulation through posttranslational cysteine modifications of TF. This mechanism could help to explain the augmented occurrence of vasoocclusive pathologies during ageing, where increasing concentrations of ROS might favour TF oxidation.

Akute Koronarerkrankungen stellen direkte Folgen arterieller Thrombosen dar und bilden die Haupttodesursache in den Industrienationen. Einige der molekularen Mechanismen der Pathogenese von arteriellen Thrombosen wurden in den letzten Jahren unter in vitro Bedingungen charakterisiert. Ihre Relevanz im intakten Organismus wird erst durch die Analyse der arteriellen Thrombogenese in vivo ersichtlich. Die bislang etablierten Tiermodelle der Thrombose/Hämostase reflektieren wahrscheinlich nur einen geringen Anteil der bei Patienten mit thrombotischen Erkrankungen beobachteten Veränderungen. Ein Ziel dieser Arbeit bestand daher darin, neue krankheitsrelevante Mausmodelle der Thrombose/Hämostase zu etablieren. Mittels chemischer Mutagenese wurden in Mäusen zufällig über das gesamte Genom verteilte Mutationen induziert und die Fibrinbildung in den Nachkommen geprüft. Ausgehend von phänotypisch auffälligen Tieren konnten mehrere, über Generationen hinweg stabile Mauslinien mit Blutgerinnungsstörungen gezüchtet werden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde mittels eines arteriellen Thrombosemodelles in der Maus erstmals die Bedeutung von Serinproteasen der neutrophilen Granulozyten für die Thrombusbildung nachgewiesen. Intravitalmikroskopische Untersuchungen in GECGdefizienten Tieren identifizierten diese Serinproteasen als entscheidende Mediatoren für eine stabile Thrombusbildung. Dabei wurde die proteolytische Inaktivierung von TFPI, des Inhibitors des Gerinnungsstartes, durch die Serinproteasen als zugrunde liegender Mechanismus ermittelt. Desweiteren konnte ein zentraler neuer Mechanismus der initialen Gerinnungsaktivierung etabliert werden. Nach endothelialer Schädigung wurde eine massive Freisetzung der Thiol- Isomerase PDI beobachtet, die über die Aktivierung des zentralen gerinnungsstartenden Proteins TF die Fibrinbildung in vivo induzierte. Demzufolge bewirkte die Inhibition der endogenen PDI-Aktivität eine Verminderung der TF-abhängigen Fibrinbildung. Untersuchungen mit TF-positiven Mikropartikeln zeigten, dass PDI intravasalen TF über einen redoxabhängigen Mechanismus aktiviert. Die in der vorliegenden Arbeit aufgedeckten Regulierungsmechanismen der Fibrinbildung in vivo tragen zum Verständnis der komplexen Pathologie der arteriellen Thrombogenese im Menschen bei und weisen daher neue Perspektiven für therapeutische Ansätze auf.

Mature endothelial cells are terminally differentiated cells with a low proliferative potential and their capacity to substitute damaged endothelium is limited. Accumulating evidence in the last years indicates that mammalian organisms contain a unique subtype of circulating, bone marrow-derived cells with properties similar to those of embryonal angioblasts. These cells were called endothelial progenitor cells (EPCs). In the present work, we have studied the role of B-Raf and C-Raf, two members of a central intracellular signalling pathway, for the proliferation and differentiation of mouse embryonic EPCs. A further purpose of the study was to evaluate the anticoagulant properties of the mature endothelium and in particular the role of Tissue factor pathway inhibitor (TFPI). We prepared gene constructs allowing us to activate or inhibit the downstream signalling of B-Raf and C-Raf, and on the other side we have used RNA interference to knock down these proteins. We found that both B-Raf and C-Raf are engaged in the proliferation of the eEPCs. However, B-Raf is mostly responsible for the differentiation, and cAMP is activating the differentiation through B-Raf, but not through C-Raf. To delineate the participation of the endothelium in coagulation, the role of native TFPI and its mutated forms in intravascular fibrin formation was analyzed. Particular attention was given to TFPI mutants being resistant towards cleavage by leukocyte proteases that might inactivate TFPI under physiological and pathophysiological conditions. The novel insights on the differentiation and proliferation of the endothelial progenitor cells obtained in the present work, may give us the opportunity to regulate their functionality in certain cases, and eventually using them as therapeutic agents in some kind of diseases (e.g. myocardial infarction, stroke).

Der Tissue Factor (TF) der Gefäßwand gilt heute als der wichtigste Starter der menschlichen Blutgerinnung. Es wird davon ausgegangen, dass die Lokalisation von TF innerhalb der Gefäßwand unter physiologischen Verhältnissen eine strikte Trennung von den plasmatischen Gerinnungsfaktoren gewährleistet, so dass es unter physiologischen Bedingungen nur nach Wegfallen der endothelialen Barriere zur Bildung des TF/VIIa-Komplexes und dort zur Auslösung der Blutgerinnung kommt. Nach der bisherigen Lehrmeinung stellen Monozyten die einzigen bekannten Blutzellen dar, die nach Langzeitstimulationsbedingungen in der Lage sind, TF zu synthetisieren und zu exprimieren. Der monozytäre TF spielt vor allem bei der Pathogenese der Sepsis und der damit assoziierten Disseminierten Intravasalen Gerinnung (DIC) eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit zeigte sich, dass TF bereits nach einer fünf minütigen Stimulation von Vollblut mit fibrillärem Kollagen in Monozyten-Plättchen-Komplexen und Neutrophilen-Plättchen-Komplexen gemessen wurde. Die TF Präsentation in den Leukozyten-Plättchen-Komplexen war streng abhängig von der vorhandenen Plättchenzahl. Mit Hilfe von Vollblutgerinnungsmodellen und prokoagulatorischen Assays konnte gezeigt werden, dass der schnell präsentierte Tissue Factor funktionell aktiv war und somit die Fibrinbildung auslöste. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass das TF Antigen auf der Oberfläche von Plättchen vorhanden war, die sich in Konjugaten mit Leukozyten befanden. Um die Frage nach dem Ursprung dieses intravaskulären TF zu klären, wurden Monozyten, Neutrophile Granulozyten und Plättchen auf ihren Gehalt an TF Protein mit einem Double-Sandwich-ELISA untersucht. Dabei konnte nur in den Plättchen TF Antigen nachgewiesen werden. Weitergehende Untersuchungen zeigten, dass TF in der Tat in den a-Granula und dem „open cannanicular system“ der Plättchen lokalisiert ist. In den Plättchen und in deren Vorläuferzellen war keine m-RNA für TF vorhanden. So bleibt die letztendliche Quelle des intravaskulären TF bis auf weiteres ungeklärt. Durch Hemmung von Adhäsionsproteinen, die die Interaktion von Plättchen mit Leukozyten vermitteln, wie P-Selektin und CD40L, konnte die TF-Präsentation in den Plättchen-Leukozyten-Komplexen inhibiert werden. Daher ist davon auszugehen, dass mehrere Adhäsionsproteine an dem Prozess der Präsentation von intravaskulärem TF beteiligt sind. Ein aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit abgeleitetes Modell der Aktivierung des intravaskulären TF geht davon aus, dass in dem zwischen Leukozyten und Plättchen entstandenen Microenvironment ein von dem Plasma weitgehend unabhängiger Raum entsteht. In diesem Microenvironment wird möglicherweise der von den aktivierten Plättchen sezernierte TFPI durch die leukozytenassoziierte Elastase sowie weitere Proteasen und reaktive Sauerstoffspezies inaktiviert. TF kann damit zusammen mit FVIIa und FXa die Gerinnung starten. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die gesamte Blutgerinnung auf der Oberfläche von Plättchen stattfinden kann. Der intravaskuläre TF spielt vermutlicherweise eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gerinnung innerhalb des lumenwärts wachsenden Thrombus. Somit kann die Fibrinbildung gezielt dort aktiviert werden, wo sie benötigt wird, um den Thrombus zu stabilisieren. Das Vorhandensein eines schnell aktivierbaren, intra-vaskulären Tissue Factor Systems stellt ein neues Konzept dar, um sowohl den physiologischen als auch den pathologischen Gerinnungsstart besser zu verstehen.