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Die Innenmembran von Mitochondrien besitzt zwei Translokasen für den Import von Proteinen. Der TIM23-Komplex vermittelt die Translokation über und in die Innenmembran, der TIM22-Komplex inseriert Proteine mit mehreren hydrophoben Segmenten in die Innenmembran. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Komponenten dieser Translokationsmaschinerien in N. crassa und S. cerevisiae identifiziert und charakterisiert werden. In N. crassa waren zu Beginn der Arbeit im Vergleich zu S. cerevisiae nur wenige Komponenten der TIM-Translokasen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Tim22, Tim54 und Tim44 in N. crassa identifiziert. Dies wurde entweder durch die Verwendung degenerierter Primer in PCR-Reaktionen mit cDNA aus N. crassa oder durch Durchmustern von Datenbanken erreicht. Die identifizierten Proteine des TIM22-Komplexes wurden bezüglich ihrer Lokalisation und Topologie untersucht. Es handelt sich bei Tim22 um ein Membranprotein der inneren mitochondrialen Membran mit vier Transmembranhelices, das sowohl den N- als auch den C-Terminus in den Intermembranraum exponiert. Tim54 ist ebenso in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt nur eine Transmembranhelix. Der größte Teil des Proteins liegt im Intermembranraum, nur wenige Aminosäurereste befinden sich in der mitochondrialen Matrix. Ferner wurde der TIM22-Komplex von N. crassa charakterisiert. Dazu zählten die Untersuchungen der beteiligten Komponenten, der Komplexgröße und der Stabilität des Komplexes. In N. crassa besteht der TIM22-Komplex aus den Komponenten Tim22, Tim54, Tim9 und Tim10, die einen etwa 350 kDa großen Komplex bilden. Für spätere funktionelle Untersuchungen wurde der TIM22-Komplex bzw. Tim22 alleine gereinigt. Beides wurde in Lipidvesikel rekonstituiert. Dieses Verfahren bietet die Grundlage für Untersuchungen in einem definierten experimentellen System, wie Proteine der Carrier-Familie in Lipidmembranen inseriert werden. In S. cerevisiae wurde mit Tim16 eine neue Komponente des mitochondrialen Importmotors des TIM23-Komplexes identifiziert. Dies konnte durch Koreinigung mit einer weiteren Komponente des Importmotors, Tim14, erreicht werden. Die strukturelle Vorhersage für Tim16 ähnelt stark der des J-Proteins Tim14. Tim16 fehlt allerdings das für die Funktion von J-Proteinen essentielle HPD-Motiv. Tim16 ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und peripher mit der inneren mitochondrialen Membran assoziiert. Durch Depletion von Tim16 wird der Import von Substraten in Mitochondrien beeinträchtigt, die vom mitochondrialen Importmotor abhängig sind. Durch Koimmunopräzipitationen und Quervernetzungsexperimente wurde Tim16 als neue Komponente des mitochondrialen Importmotors der TIM23-Translokase definiert. Funktionell spielt Tim16 eine große Rolle für die Integrität des Importmotors. Die genaue Struktur des Importmotors, seine Regulation und dessen Dynamik im Zuge der Translokation von Präproteinen muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden.

Thu, 9 Dec 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3138/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3138/1/Adam_Alexander.pdf Adam, Alexander ddc:610, ddc:600, Medizinis

Mitochondria are essential cellular organelles of eukaryotic organisms, which import most of their proteinaceous constituents from the cytoplasm. Two mitochondrial membranes contain different translocation machineries which are involved in the import and proper sorting of mitochondrial precursor proteins. The TIM22 translocase in the inner mitochondrial membrane mediates the import of polytopic proteins into this membrane. In addition to the membrane integrated components Tim22 and Tim54, the TIM22 translocase possesses components in the intermembrane space, termed Tim9 and Tim10. In the present study, the tim9 and tim10 genes of the TIM22 translocase of N. crassa were identified. The structural and functional characteristics of the corresponding gene products, the Tim9 and Tim10 proteins, were examined. Tim9 was demonstrated to be an essential protein. The Tim9 and Tim10 proteins were shown to build a 70-80 kDa heterohexameric complex in the mitochondrial intermembrane space. The isolated Tim9•Tim10 complex had the same oligomeric structure as the native one, and it proved fully functional in interacting in vitro with its physiological substrate, the ADP/ATP carrier (AAC). Peptide library screens were performed to determine the structural determinants of the substrates that are recognised by the Tim9•Tim10 complex. Efficient binding to the regions covering residues of the hydrophobic membrane spanning domains and of the connecting hydrophilic loops was observed. In this way, Tim9 and Tim10 proteins interact with their substrates, while the hydrophobic regions of the substrates are still present in the TOM complex and thereby protected from the aqueous environment of the intermembrane space compartment. Furthermore, when enclosed into proteoliposomes containing the reconstituted TOM complex, Tim9•Tim10 complex specifically promoted the translocation of the AAC precursor. Hence, the Tim9•Tim10 complex and the TOM complex are both necessary and sufficient to facilitate translocation of carrier proteins across the outer mitochondrial membrane. Finally, peptide screens and chemical cross-linking experiments were used to identify the precursor of N. crassa Tim23 protein as a novel substrate of the Tim9•Tim10 complex.

Die TIM22-Translokase in der mitochondrialen Innenmembran vermittelt die Insertion von polytopen Innenmembranproteinen mit internen Signalsequenzen wie der mitochondrialen Metabolit-Carrier. Dabei unterstützt eine Gruppe von strukturell verwandten Proteinen mit charakteristischem Metallbindungsmotiv (Cys4-Motiv) die Passage der hydrophoben Vorstufenproteine über den Intermembranraum. Dies sind in der Hefe Tim9, Tim10 und Tim12 sowie Tim8 und Tim13. Die Familie dieser kleinen Tim-Proteine ist evolutionär konserviert. Im Menschen wurden sechs Mitglieder dieser Proteinfamilie identifiziert: Tim9, Tim10a und Tim10b sowie DDP1, DDP2 und Tim13. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Komponenten der TIM22-Translokase der Säugetiere strukturell und funktionell charakterisiert. Bei ihnen handelt es sich ebenfalls um mitochondriale Intermembranraumproteine. Sie sind in der Lage, mittels der vier konservierten Cysteinreste ein Zn2+-Ion zu binden und damit vermutlich eine Zinkfinger-Struktur auszubilden. Mutationen, die zu einem Verlust des DDP1 Proteins führen, sind die Ursache für das Mohr-Tranebjaerg Syndrom, einer neurodegenerativen Erkrankung, die sich im Wesentlichen durch Taubheit und Dystonie auszeichnet. Eine Punktmutation im DDP1-Gen, die zu einem Austausch eines der konservierten Cysteine führt (DDP1C66W), verursacht den Verlust der Zinkbindungskapazität und resultiert in einem fehlgefalteten, instabilen Protein. Es wurde gezeigt, dass das mutierte DDP1 nicht mehr in der Lage ist, mit seinem Partnerprotein Tim13 zu interagieren und keinen funktionellen DDP1-Tim13 Komplex ausbilden kann. Die menschlichen Proteine der Tim9 und Tim10-Gruppen, Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie ihre homologen Hefeproteine in zwei hetero-oligomeren Komplexen organisiert, einem 70 kDa-Komplex bestehend aus Tim9 und Tim10a sowie einem 450 kDa Tim9-10a-10b-Komplex. Beide Komplexe sind fest mit der Innenmembran assoziiert. Tim10b zeigt eine geringere Sequenzhomologie zu Hefe-Tim10 als Tim10a. Es liegt genauso wie Tim12 nur in dem hochmolekularen Komplex vor und weist die stärkste Membranassoziation auf. Es zeigt damit strukturelle Ähnlichkeit zu Tim12. Aufgrund der Membranassoziation der kleinen TIM-Komplexe entfällt aber wahrscheinlich die Funktion des Tim12 als Vermittler zwischen dem löslichen Komplex und der Membran. Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie die Hefe-Proteine am Import von mitochondrialen Carriern beteiligt. Die Bindung an Translokationsintermediate von Carrier-Vorstufenproteinen erfolgt in Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen wie Zn2+. Die Struktur des TIM22-Komplexes weist signifikante Unterschiede zu der aus der Hefe bekannten Organisation auf. Humanes Tim22 ist im Vergleich zu Hefe-Tim22 wenig konserviert. Es liegt kein stabiler Komplex vor, der Tim22 und die kleinen Tim-Proteine enthält. Sie befinden sich vermutlich in dynamischer Interaktion mit Tim22, die wahrscheinlich nur während der Translokation eines Vorstufenproteins auftritt. Bisher ist kein Komplexpartner des humanen Tim22 bekannt. Homologe zu Tim54 und Tim18, den membranintegralen Komplexpartnern des Tim22, wurden in menschlichen Datenbanken nicht identifiziert. Aufgrund der veränderten strukturellen Organisation ist das menschliche Tim22 nicht in der Lage, mit den Proteinen aus der Hefe funktionell zu kooperieren. Es hat vermutlich eine Anpassung an veränderte Substratspezifizitäten stattgefunden, die auch die Beteiligung weiterer bisher unidentifizierter Komponenten der TIM22-Translokase einschließen könnte. Ein neues Intermembranraumprotein menschlicher Mitochondrien, Cmi1, ist an der Biogenese der kleinen Tim-Proteine beteiligt. Eine Überexpression im Hefesystem führt zur signifikanten Erhöhung der Proteinmengen von kleinen Tim-Proteinen im mitochondrialen Intermembranraum. Cmi1 unterstützt vermutlich die rasche stabile Faltung der neu importierten kleinen Tim-Proteine. Da Cmi1 in der Lage ist, Metall-Ionen zu binden vermittelt es möglicherweise den Transfer von Zink-Ionen.

Ziel dieser Arbeit war es, den Import von Carrierproteinen über die TIM22-Translokase näher zu charakterisieren. Die Arbeit befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung von drei neuen Komponenten des TIM22-Komplexes, Tim9, Tim10 und Tim12. Insbesondere wurde der Import des AAC-Vorstufenproteins über den TOM-Komplex zum TIM22-Komplex in die mitochondriale Innenmembran untersucht. Tim9, Tim10 und Tim12 sind Untereinheiten der TIM22-Translokase, die im Intermembranraum lokalisiert sind. Sie liegen in zwei hexameren Komplexen vor, dem TIM9⋅10-Komplex und dem TIM9⋅10⋅12-Komplex. Der TIM9⋅10-Komplex liegt löslich im Intermembranraum vor, während der TIM9⋅10⋅12-Komplex peripher mit dem TIM22- Komplex assoziiert ist. Dieser vermittelt die membranpotentialabhängige Insertion von Präproteinen mit internen Importsignalen in die mitochondriale Innenmembran. Tim9, Tim10 und Tim12 sind strukturell verwandt und in der Lage, mittels konservierter Cysteinreste ein Zinkfinger-Motiv auszubilden. Die Interaktion der AAC-Vorstufe mit dem TIM9⋅10- und dem TIM9⋅10⋅12-Komplex wird vermutlich durch die Wechselwirkung der Zinkfinger mit der Carrier-Signatur vermittelt. Diese ist in allen Mitgliedern der mitochondrialen Carrier-Familie konserviert. Der Import des AAC erfolgt in definierten Stufen: Das Vorstufenprotein wird im Cytosol synthetisiert (Stufe I) und bindet an Rezeptoren des TOM-Komplexes (Stufe II). Der AAC wird zum Importkanal geleitet und teilweise über die Außenmembran transloziert (Stufe IIIa). Die vollständige Translokation wird durch die Interaktion des dritten Moduls des AAC mit dem TOM-Komplex verhindert. Segmente des AAC, die in den Intermembranraum exponiert sind, binden an den hexameren TIM9⋅10-Komplex. Jeder der drei Module kann mit dem TIM9⋅10-Komplex interagieren. Nachfolgend wird das Vorstufenprotein auf den TIM9⋅10⋅12- Komplex auf der Außenseite der Innenmembran übertragen. Der dritte Modul bleibt noch fest an den TOM-Komplex gebunden. Es enthält das Signal für die membranpotentialabhängige Insertion des AAC in die Innenmembran. Für die Freisetzung des AAC aus dem TOM-Komplex und seine Membraninsertion sind sowohl ein Membranpotential als auch die Rekrutierung eines funktionellen TIM22-Komplexes an die Kontaktstelle zwischen Außenund Innenmembran erforderlich.