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Seit Beginn der 1990er Jahre sind protektive Wirkungen von Tacrolimus auf Ischämie-Reperfusionsschäden der Leber bekannt. Die in bisherigen experimentellen Arbeiten beschriebene Spenderpräkonditionierung erscheint jedoch wegen potenzieller Nebenwirkungen klinisch nicht umsetzbar. Eine amerikanische Arbeitsgruppe konnte dabei in einer klinischen Pilot-Studie zeigen, dass die Spülung humaner Lebern mit Tacrolimus (20ng/ml) vor Implantation zu einer signifikanten Reduktion von Ischämie-Reperfusionsschäden nach Lebertransplantation führte. Unsere Arbeitsgruppe hat umfangreiche Untersuchungen mit Glutathion als Therapeutikum von Ischämie-Reperfusionsschäden nach warmer und kalter Ischämie durchgeführt. Gleichzeitig scheint, dass intrazelluläres Glutathion bei Anwesenheit hoher Konzentrationen von ROS über die Induktion von Radikalkettenreaktionen beziehungsweise die Thiolierung anderer Proteine selbst als Mediator von Ischämie-Reperfusionsschäden fungieren kann. In Vorarbeiten untersuchten wir die Wirkung von Tacrolimus im isoliert-perfundierten Modell der Rattenleber. Die Vorbehandlung mit Tacrolimus bewirkte bei Zufuhr von H2O2 eine Verringerung des ROS-induzierten zellulären Schadens, ausgedrückt in einer dosisabhängigen, signifikanten Verringerung des LDH-Efflux. Als Ursache hierfür wird eine verminderte intrazelluläre Akkumulation von zytotoxischem GSSG diskutiert, das nach Tacrolimus-Gabe vermehrt in Galle und Blut freigesetzt wurde, während die Aktivität der an Bildung und Abbau von GSH/GSSG beteiligten Enzyme Katalase, GSH-Peroxidase und GSSG-Reduktase unverändert war. Dieser Effekt konnte durch Gabe des p38 MAPK Inhibitors SB203580 imitiert werden. Wir übertrugen daraufhin das Konzept der Tacrolimus-Rinse in das Modell der arterialisierten, orthotopen Lebertransplantation an der Ratte. Die Spülung der Leber (20ml) mit Tacrolimus unmittelbar vor Implantation in den Empfängerorganismus führte zu einer signifikanten Reduktion des Ischämie-Reperfusionsschadens, gemessen in Transaminasen, LDH sowie Gallefluss. Das höchste Ausmass an Zytoprotektion wurde durch eine Tacrolimus-Konzentration von 10 ng/ml erreicht, wobei die protektive Wirkung der Tacrolimus-Rinse in der 10 ng-Gruppe stärker ausgeprägt war als in der 50 ng-Gruppe. Die Ursachen für diese inverse Dosis-Wirkungsbeziehung sind unklar, zumal keine statistische Signifikanz zwischen den beiden Gruppen besteht. Außerdem fehlen bislang systematische Untersuchungen zur optimalen Tacrolimus-Dosis in dieser Versuchsanordnung. Als Wirkmechanismus der Tacrolimus-Rinse postulieren wir - aufbauend auf Voruntersuchungen im isoliert perfundierten Modell und den erhobenen in-vivo-Daten - Veränderungen der zellulären Glutathionhomöostase: Hepatozyten setzten im Modell der Lebertransplantation nach Tacrolimus-Rinse vermehrt zytotoxisches GSSG in Blut und Galle frei, wodurch ROS-vermittelte Zellschäden während der Reperfusion minimiert werden. Zusammenfassend kann aufgrund der bisherigen Untersuchungen gezeigt werden, dass die Tacrolimus-Rinse eine neue und klinisch praktikable Therapieoption von Ischämie-Reperfusionsschäden der Leber darstellen könnte.

Die Transplantatvaskulopathie stellt die häufigste Todesursache im langfristigen Verlauf bei Patienten nach Herztransplantation dar. Das morphologische Erscheinungsbild ist gekennzeichnet durch immunologisch bedingte Veränderungen von Arterien und Venen unterschiedlichen Kalibers und mündet zumeist in eine progrediente koronare Herzerkrankung. Durch die Denervierung des Herzens bei der Transplantation fehlen zumeist die klassischen Symptome einer myokardialen Ischämie, so dass ventrikuläre Arrhythmien, Herzinsuffizienz oder der plötzliche Herztod oft die ersten und einzigen Manifestationen der Erkrankung sind. Im Rahmen der routinemäßigen Nachsorgeuntersuchungen nach Herztransplantation ist es daher von Bedeutung, den Beginn der Erkrankung möglichst frühzeitig zu erkennen – am besten eben noch bevor sich erste klinische Anzeichen manifestieren. Unsere Arbeitsgruppe evaluierte die Rolle der Echokardiographie unter medikamentöser Herzbelastung, besonders im Hinblick auf den zusätzlichen diagnostischen Wert durch die Applikation von Ultraschall¬kontrastmitteln. Bei 30 Patienten (durchschnittlich 7,5 Jahre nach Herztransplantation) wurden im Rahmen der Dobutamin-Stressechokardiographie durch die zusätzliche Applikation von Ultraschallkontrastmittel Daten zur myokardialen Perfusion erhoben. Dazu wurden die Echokardiographie in drei Stufen ausgewertet und mit einem kombiniert morphologisch-funktionellen Goldstandard bestehend aus Koronarangiographie, IVUS und Myokard-Perfusions-Szintigraphie verglichen um dem heterogenen Erscheinungsbild der Transplantatvaskulopathie gerecht zu werden. Die ersten zwei Stufen beinhalteten die konventionelle Analyse von Wandbewegung und Wanddickenveränderung sowie die visuelle Beurteilung der Kontrastmittelverteilung im Myokard. Darüber hinaus wurden erstmalig an einem Kollektiv herztransplantierter Patienten Anflutungsgeschwindigkeit des Kontrastmittels und absolutes Perfusionsniveau quantitativ für die einzelnen Myokardabschnitte erfasst. Kurz zum physikalischen Hintergrund: Ultraschallkontrastmittel bestehen aus kleinen Gasgefüllten Mikorbläschen mit einer Phospholipid-Monolayer welche intravenös appliziert werden und mit dem Blutsrom ins Herzen gelangen. Moderne Sonogeräte ermöglichen es, diese Bläschen in vivo in Schwingung zu bringen und sie so sichtbar zu machen. Nach der Abgabe eines hochenergetischen Schallimpulses durch den Schallkopf werden sämtliche Gasbläschen im Myokard zerstört und in den darauf folgenden Herzzyklen kann die Geschwindigkeit der Wiederanflutung sowie die absolute Gasbläschenmenge quantitativ gemessen werden. Da sich das KM homogen im Blut verteilt können somit Rückschlüsse auf Anflutungsgeschwindigkeit und Perfusionsniveau gezogen werden. Bereits durch die visuelle Auswertung der Myokardkontrastechokardiographie ergab sich ein Zugewinn an Sensitivität und Spezifität im Vergleich zur herkömmlichen Dobutamin-Stressechokardiographie in der Diagnostik der hämodynamisch relevanten Transplantatvaskulopathie. Eine weitere Steigerung der Treffsicherheit wurde durch die zusätzlichen quantitativen Myokardanalysen erreicht. Für alle Auswertungen wurde das Myokard in den Standarschnittebenen untersucht und in insgesamt 18 Segmente unterteilt. Oben genannte Wiederanflutungskurven wurden für jedes Segment in Ruhe und bei Belastung gemessen und anschließend voneinander subtrahiert. Diese Delta Werte für den Anstieg der Kurve sowie das Absolute Perfusionsniveau ermöglichen quantitative Aussagen über eine etwaige Perfusionsverschlechterung von Stress im Vergleich zur Ruhe. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein präselektioniertes Patientengut von der hohen Sensitivität und Spezifität der Methode profitiert und die Anzahl der routinemäßig durchgeführten Koronarangiographien vermindert werden könnte.

In der vorgelegten Arbeit wurden Histonmethyltransferasen untersucht. Die beiden SET-Proteine, Enhancer of Zeste (E(z)) und PRset7 methylieren jeweils spezifische Lysine in den N-Termini der Histonmoleküle H3 bzw. H4 und wurden zu Beginn in E. coli exprimiert. In Histonmethyltransferase-(HMTase)-Versuchen konnte mit E(z) keine Aktivität erzielt werden. Mit einer eingeführten Mutation des aktiven Zentrums („E(z)mut“) und mit E(z) konnte nach der Inkubation mit Drosophila-Kernextrakten an beiden Proteinen die Histondeacetylase Rpd3 nachgewiesen werden, die enzymatisch aktiv war. Unsere Arbeitsgruppe konnte die HMTase-Aktivität eines E(z)-Komplexes bestätigen, die von einer (nicht-mutierten) SET-Domäne abhängt (Czermin et al., 2002). Die Untersuchungen zur Histonmethyltransferase PRset7 begannen mit Aktivitäts- und Spezifitätsversuchen an verschiedenen Substraten. Die nukleosomale Spezifität von PRset7 bestätigte sich gemäß den Ergebnissen von Fang et al. und Nishioka et al. (Fang et al., 2002; Nishioka et al., 2002b). PRset7 unterschied klar zwischen rekombinanten Nukleosomen (Histone rekombinant in E.coli exprimiert) und nativen Nukleosomen (Histone aus Drosophila-Embryos gereinigt), wobei letztere deutlich vermindert methyliert wurden. An rekombinanten, mit PRset7 methylierten Nukleosomen, konnte mit einem H4 K20-methyl-Antikörper eine H4 K20-Methylierung detektiert werden. Mit Hilfe verschiedener, rekombinanter Nukleosomen, deren H4-Moleküle N-terminal unterschiedlich lang waren, konnte die Substraterkennung bzw. -bindung von PRset7 auf maximal 9 Aminosäuren vor Lysin 20 eingegrenzt werden. Durch die Reinigung des Proteins wurde deutlich, dass kürzere Degradationsprodukte von PRset7 den wesentlichen Anteil der detektierten HMTase-Aktivität ausgemacht hatten, ohne die hohe nukleosomale Substratspezifität zu verlieren. Für die Substratherstellung weiterer in vitro-Versuche zur Beziehung zwischen H4-Acetylierung (K12 bzw. K16) und H4-Methylierung (K20) wurde die Histonacetyltransferase MOF rekombinant hergestellt, gereinigt und die enzymatische Aktivität bestätigt. Es ergab sich keine eindeutige positive oder negative gegenseitige Beeinflussung der beiden Modifikationen. Abschließend wurden die verwendeten Antikörper bezüglich ihrer Spezifität untersucht, welche gegeben war.