Podcasts about Lysin

In dieser Episode sprechen Joshua Hübner und Martin Auerswald über das Epstein-Barr-Virus (EBV) – ein weit verbreitetes Virus, das häufig unterschätzt wird und bei vielen Menschen chronische Erschöpfung, Immunschwäche und andere Symptome auslösen kann. Du erfährst, wie EBV im Körper wirkt, wie man es diagnostiziert und warum Eigenverantwortung und ein starkes Immunsystem entscheidend sind, um gesund zu bleiben. Dazu gibt es praktische Tipps zur Ernährung, Stressbewältigung und natürlichen Heilmitteln, die dir helfen, EBV unter Kontrolle zu halten.

Der beste Tipp bei Fieberblasen. Eine Anleitung für den Leberwickel und was es mit einem erhöhten Prolaktin-Wert auf sich hat. Darum geht es in dieser Community Q&A Folge meines Podcasts.

SummaryIn dieser Episode von 'One and a Half Therapists' diskutieren Michi Kern und Patrick Dempt die Bedeutung von Aminosäuren und Eiweiß für die Gesundheit. Sie erklären, wie verschiedene Aminosäuren wie Tyrosin, Glutamin, Lysin und Arginin im Körper wirken und welche Rolle sie bei der Stimmungsregulation, dem Immunsystem und der allgemeinen Gesundheit spielen. Die beiden betonen die Wichtigkeit einer eiweißreichen Ernährung und geben Tipps, wie man sicherstellen kann, dass man genügend Aminosäuren zu sich nimmt, insbesondere für Veganer. Außerdem wird die Möglichkeit angesprochen, Aminosäuren durch Blutuntersuchungen zu messen, um Mängel zu identifizieren und gezielt zu beheben.KeywordsAminosäuren, Eiweiß, Gesundheit, Tyrosin, Glutamin, Lysin, Arginin, Stimmung, Immunsystem, ErnährungTakeawaysAminosäuren sind essentielle Bausteine für den Körper.Tyrosin spielt eine wichtige Rolle bei der Schilddrüsenfunktion und der Produktion von Dopamin.Phenylalanin und Tryptophan sind entscheidend für die Stimmung und die Bekämpfung von Depressionen.Glutamin ist wichtig für die Reparatur von Gewebe und die Gesundheit des Darms.Lysin stärkt das Immunsystem und hilft bei der Bekämpfung von Krankheiten.Arginin ist wichtig für die Gefäßerweiterung und die Wundheilung.Eine eiweißreiche Ernährung ist entscheidend für die allgemeine Gesundheit.Hülsenfrüchte allein decken nicht alle Aminosäuren ab, besonders für Veganer wichtig.Aminosäuren können durch Blutuntersuchungen gemessen werden, um Mängel zu identifizieren.Die empfohlene Eiweißzufuhr liegt zwischen 1,2 und 1,6 Gramm pro Kilogramm Körpergewicht.TitlesDie Geheimnisse der AminosäurenStimmungsaufhellende AminosäurenSound Bites"Eiweiß ist alles im Körper.""Aminosäuren sind die Bausteine des Lebens.""Serotonin ist das Glückshormon."Chapters00:00 Einführung in die Welt der Aminosäuren03:13 Die Bedeutung von Tyrosin und seine Funktionen05:52 Stimmungsregulation durch Aminosäuren09:12 Glutamin: Der Reparaturbaustein des Körpers12:08 Lysin und das Immunsystem15:04 Die Rolle von Arginin und seine gesundheitlichen Vorteile17:46 Aminosäuren für Veganer: Herausforderungen und Lösungen20:52 Die Wichtigkeit der Aminosäurenmessung23:49 Empfehlungen zur Eiweißzufuhr und AbschlussLust auf mehr? Dann Abonniere unseren Podcast und bleibe am Puls der neuesten Gesundheitstrends!**Folge uns auch auf Social Media:**Homepages: www.kernxund.de und www.patrick-dempt.deInstagram: @kernxund und @patrickdempt_personaltrainingONE AND A HALF THERAPISTSInformativ - Inspirierend - Unwiderstehlich Hosted on Acast. See acast.com/privacy for more information.

Fast jeder und jede hat ihn – aber er bricht nicht immer aus: Herpes ist schmerzhaft und kann sogar gefährlich werden. Doc Esser und Anne sprechen darüber, wie man die Bläschen auf der Lippe am besten behandelt und ob Lysin tatsächlich gegen Herpes hilft. Nächste Woche gibt es die zweite Folge zum Thema Herpes. Danach sprechen Doc Esser und Anne über Meditation. Kann die auch Nebenwirkungen haben? Schickt Eure Fragen gerne an docesser@wdr.de oder per WhatsApp an 0170 – 91 83 576. Von Anne Schneider ;Heinz-Wilhelm Esser.

Today, you'll learn about new ways to kill antibiotic resistant bacteria, the discovery of the most powerful pulsar we've ever seen, and the truth about hippo poop. Stopping Superbugs “Dangerous ‘superbugs' are a growing threat, and antibiotics can't stop their rise. What can?” by Nicoletta Lanese. 2023. “Retrospective, observational analysis of the first one hundred consecutive cases of personalized bacteriophage therapy of difficult-to-treat infections facilitated by a Belgian consortium.” by Jean-Paul Pirnay, et al. 2023. “Lysin therapy offers new hope for fighting drug-resistant bacteria.” by Vincent A. Fischetti. 2019. Powerful Pulsar “Highest-energy pulsar ever seen could indicate new physics.” by Robert Lea. 2023. “Discovery of a radiation component from the Vela pulsar reaching 20 teraelectronvolts.” by F. Aharonian, et al. 2023. “What are pulsars?” by Paul Sutter. 2022. Hippo Poop “Hippos might be ferocious fighters, but their big teeth make terrible chewers.” by Jake Buehler. 2023. “Hippos' constant defecating turns African pools into communal guts.” by Lauren Barnett. 2021. “Chewing, dentition and tooth wear in Hippopotamidae.” by Annika Avedik & Marcus Clauss. 2023. “Hippo eating great animal in the world.” YouTube Video. N.d. Hosted on Acast. See acast.com/privacy for more information.

In dieser Folge erfährst Du, wie der Heilpilz Coriolus versicolor Dein Immunsystem stärken kann.

Corona, Grippe, Verkühlung & Co.: Was nur lästig ist und was wirklich gefährlich. Wie Andreas sein Immunsystem auftrainiert und wie er Krankheitserregern ein Schnippchen hackt. Die Podcast-Folge, vor der deine Grippeviren Reißaus nehmen. Als ganz einfacher Weg zur HRV-Überprüfung bietet sich zum Beispiel die App „Heartbreath“ an.Die Versorgung mit Vitamin C geschieht am besten über Infusionen, gepuffertes long-release Vitamin C oder liposomale Vitamin-C-Produkte. Anbieter wie Life Extension, Pure Encapulations oder Thorne haben einen Vielzahl an guten Monopräparaten. Das angesprochene Infusionspräparat ist dieses.Eine gute Quelle für NAC. Ein vernünftiges Zink-Supplement für akute Nutzung. Je nach Bioverfügbarkeit sind zwischen 4-8 mg und bis zu 20 mg am Tag sinnvoll. Zu Spermidin kommt man am besten auf diesem Weg. Lysin gibt es hier, und Zistrosentee finden Sie im Teeladen Ihres Vertrauens. Andreas empfiehlt den Grünteekomplex Tigovit, der Code 31173 bringt 10% Rabatt.Das Buch „Ab jetzt Biohacking“ von Andreas Breitfeld und Stefan Wagner erscheint im Mai 2023 bei ecowing. Vorbestellen kann man es hier. Das Buch „Biohacking für Sportler“ von Andreas Breitfeld erschien im Riva-Verlag und gibt es hier.Das Buch „Viel Erfolg beim Misserfolg“ ist der Biohacking-Business-Ratgeber von Stefan Wagner, erschienen im Seifert Verlag, erhältlich hier. Andreas Breitfelds Website.Das ausführliche Porträt über Andreas Breitfeld in The Red Bulletin (Autor, übrigens: Stefan Wagner).Das Biohacking-Special, das Andreas Breitfeld und Stefan Wagner gemeinsam für The Red Bulletin INNOVATOR produziert haben.Stefan Wagners Biohacking-Kolumne im „carpe diem“.

▶️ Hast Du auch eine Frage, dann nutze unser Formular und schicke uns hierüber Deine Frage: https://fundamed.net/frage Aufgrund der Vielzahl an Fragen kann es sein, dass Deine Frage nicht gleich sofort beantwortet wird, Prof. Winkler & sein Expertenteam tun alles dafür, dass Du Deine Antwort schnellstmöglich erhältst. Vielleicht wurde Deine Frage ja auch schon einmal gestellt und beantwortet. Schaue einfach in Prof. Winklers YouTube-Kanal, dort findest Du alle „Frag doch mal den Prof.“-Folgen. ▶️ Wenn Du bisher noch keine Erfahrungen mit Blutwerten hast, dann ist das forever young-Seminar das ideale Einstiegs-Seminar für Dich. Das Seminar wurde vor Jahren von Dr. Strunz ins Leben gerufen und wird heute erfolgreich von Prof. Winkler und seinen Kollegen weitergeführt. ✅ Weitere Informationen, Termine und Anmeldung zum Einsteiger-Seminar für artgerechtes Leben: https://fundamed.net/forever-young​​​​ ▶️ Wenn Du schon einmal einen großen Bluttest gemacht hast und nun speziell auf Dich und Deine Bedürfnisse abgestimmtes Gesundheits-KnowHow erfahren möchtest, dann reserviere Dir jetzt Deinen Platz auf den FUNDAMED Aktiv-Tagen. Hier triffst Du im ausgesuchten kleinen Teilnehmerkreis Gleichgesinnte beim individuellen Exklusiv-Coaching durch Prof. Winkler & sein Expertenteam.✅ Weitere Informationen, Termine und Anmeldung zu den Fundamed-Aktiv-Tagen: https://www.fundamed-aktiv-tage.net​​​​ ❗️ABONNIERE UNS❗️ ✅Facebook: https://www.facebook.com/FundamedArztpraxen​ ✅ Instagram: https://www.instagram.com/fundamed_arztpraxen/​ ✅Youtube: https://www.youtube.com/channel/UC5oro2UPCZqxdmBJZmQCu0A​ Aus juristischen Gründen geben wir folgende Hinweise: Das FUNDAMED-Informationsangebot dient ausschließlich Ihrer Information und beruht auf den Erkenntnissen und Erfahrungen aus 30 Jahren ärztlicher Tätigkeit. Die zur Verfügung gestellten Inhalte können und dürfen nicht zur Erstellung eigenständiger Diagnosen verwendet werden und ersetzen ausdrücklich nicht eine persönliche Arztkonsultation. Eine Behandlung von Krankheiten im medizinischen Sinne findet nicht statt und auch ein sog. „Heilversprechen“ wurde und wird ausdrücklich nicht gegeben! Hinweis: Aus Gründen der Les- und Hörbarkeit wurde im (Sprech-)Text, falls es nicht explizit spezifisch ausgedrückt wurde, die männliche Form gewählt, nichtsdestoweniger beziehen sich die Angaben auf Angehörige aller Geschlechter. (Kann Spuren von Werbung enthalten)

Sanfte Methoden eine Herpes Infektion unterstützend zu behandeln.

Shownotes zur Episode und mehr: https://chromosome.de/protein-fuer-vegane-ernaehrung/  In dieser Episode geht es um: Lysin, Supplement Aminosäuren als NEM Zehn Lebensmittel mit Aminosäuren, Hanfsamen, Algen  Toller Salat, Zusammenstellung Willst du wissen, welcher vegane Ernährungstyp du bist? Finde es hier heraus! Mehr mr.broccoli: Podcast auf Spotify Apple Podcast Mehr Podcast Abonniere meinen YouTube Kanal   *Disclaimer: Ich wurde von keinem der genannten Unternehmen bezahlt. Trotzdem die Markierung als „Werbung“, da ich Marken und Produkte genannt habe. Alle genannten Aussagen dienen lediglich zu Informationszwecken und ersetzen nicht den Besuch eines Arztes.

Beim Blick in den Spiegel stellt man irgendwann einmal fest, dass das Bindegewebe nicht mehr ganz so straff ist. Das ist völlig normal. Gerade im Alter ist das einfach so. In diesem Podcast gebe ich Dir dennoch wertvolle Informationen und Tipps, um der Bindegewebsschwäche entgegenzuwirken. Wichtigster Nährstoff des Bindegewebes sind Kollagenfasern, die für ausreichend Elastizität und Festigkeit sorgen. Im Alter stellt der Körper weniger Kollagen her. Die wichtigsten Baustoffe des Kollagens sind Lysin und Vitamin C. Um nun diesem Prozess vorzubeugen, kann man - neben ausreichend Sport und Bewegung - vermehrt Lysin und Vitamin C über eine gesunde Ernährung zu sich nehmen. Vitamin C-haltige Früchte wie Orangen, Zitronen oder auch Hülsenfrüchte, die viel Lysin enthalten, helfen enorm. Viel Trinken, basische Ernährung und gezieltes Krafttraining sorgen ebenfalls dafür, dass Dein Bindegewebe in Form bleibt. #

Wie fest und flexibel Dein Bindegewebe ist, hängt ganz stark von Deiner Ernährung ab. Milch- und Vollkornprodukte, Fleisch aber auch Hülsenfrüchte spielen dabei eine wichtige Rolle - um nur einige Beispiel zu nennen. Sie kurbeln nämlich die Kollagenherstellung im Körper an. Außerdem solltest Du darauf achten, genügend Eiweiß mit Deinen Mahlzeiten aufzunehmen und Dich regelmäßig zu bewegen, also Sport zu treiben. Die wichtigsten Tipps für Deinen Alltag gibt es wie immer gratis in unserem Podcast.

Lysin Simple und komplexe Infos zum Thema Lysin in diesem Kurzvortrag von Sukadev Bretz, dem Gründer von Yoga Vidya. Hier findest du: Seminare mit Sukadev Seminarübersicht Yoga Vidya YouTube Live Kanal Online Seminare Video Seminare Yoga Vidya kostenlose App Yoga Vidya Newsletter Kochrezepte Ayurvedische Ernährung Forum Onlineshop Schon ein kleiner Beitrag kann viel bewegen... Spende an Yoga Vidya e.V.! »

Lysin Simple und komplexe Infos zum Thema Lysin in diesem Kurzvortrag von Sukadev Bretz, dem Gründer von Yoga Vidya. Hier findest du: Seminare mit Sukadev Seminarübersicht Yoga Vidya YouTube Live Kanal Online Seminare Video Seminare Yoga Vidya kostenlose App Yoga Vidya Newsletter Kochrezepte Ayurvedische Ernährung Forum Onlineshop Schon ein kleiner Beitrag kann viel bewegen... Spende an Yoga Vidya e.V.! »

Bei Husten, Heiserkeit und anderen Erkältungssyptomen ist es u.a. sinnvoll, auf seine Zinkversorgung zu achten. Welche weiteren Spurenelemente und Mineralstoffe beachtet werden sollten, erfahren Sie in diesem Podcast. Bei Bronchitis schluckt man gerne einen Schleimlöser mit dem Wirkstoff N-Acetyl-Cystein. Dabei ist einem oft gar nicht bewusst, welchen zusätzlichen großen Nutzen Cystein auf das Immunsystem hat. Auch viele andere Aminosäuren wie Arginin, Glutamin und Lysin sind unabkömmlich für ein gut funktionierendes Immunsystem.

Lysin ist eine essenzielle Aminosäure, die für das Immunsystem von grosser Bedeutung ist. Es bekämpft Viren, gleichzeitig dient es auch der Schönheit - wir schauen uns das mit unserer Anti Aging Expertin genauer an.

Når immunforsvaret svækkes blomstrer dit forkølelsessår næsten helt sikkert. Men vidste du, at du kan bekæmpe det indefra med aminosyren Lysin?

Antibiotic resistance—the ability of bacteria to survive even large doses of broad-spectrum antibiotics—is a growing problem in the modern world, one that threatens the safety of everyone on the planet. But this hasn't always been the case; not more than 20 years ago, the idea of antibiotic resistance was not really on anyone's radar, which is a testament to how quickly the problem has developed, and therefore how time-sensitive it is to develop a solution. According to Dr. Vincent A. Fischetti, head of the Fischetti Lab at Rockefeller University, as well as the results from phase 2 clinical trials which put it to the test, the solution lies in a bacteriophage enzyme called lysin. On today's episode, Dr. Fischetti explains how bacteriophages (commonly referred to as phages) kill bacteria, and how he and his team harnessed this knowledge in a way that's led to the development of the first-ever alternative to antibiotics that's been FDA-approved to enter phase 3 clinical trials. This potential treatment for bacterial diseases in humans could very well eliminate the daunting threat of antibiotic resistance. Dr. Fischetti brings an impressive amount of fascinating information to the conversation today. By tuning in, you're bound to learn a number of things, including: How significantly the use of antibiotics in farm animals (to fatten them up, treat them as food products, etc.) has contributed to antibiotic resistance What bacteria do in order to avoid or resist being killed by a given antibiotic Where antibiotics come from and how they are used by the organisms that create them What the difference is between gram-negative and gram-positive bacteria Press play for all the details.

Protein - byggstenar för kroppen som hjälper oss som gillar att träna mycket att bibehålla och öka muskelmassan. Men hur mycket protein behöver du egentligen äta och hur tänker vi med vårt eget proteinintag? I det här kortavsnittet sammanfattar vi protein på 30 minuter och går igenom en studie från förra året på styrketränande kvinnor som fick käka mer eller mindre protein. I en studie från 2018 fick en grupp med styrketränande kvinnor köra samma träningsprogram och antingen äta efter WHO:s rekommendationer om proteinintag per dag (lågproteinkost) eller äta ett högt proteinintag. En högre mängd protein gav en ökad kroppsvikt, ökad fettfri massa (muskler) och minskad fettmassa. Jämfört med lågproteinkostgruppen som också ökade muskelmassan men inte alls lika mycket. Hög proteinkost 2,5g x kv/dag -2 kroppsfett % -1,1 fettmassa kg Fettfrimassa ökade med 2,1 kg Kroppsvikt ökade med 1 kg Låg proteinkost 0,8g x kv/dag -1,1 kroppsfett % -0,8 fettmassa kg Fettfrimassa ökade med 0,6 kg -0,2 kg kroppsvikt Viktiga saker att tänka på: Om du styrketränar mycket och vill gaina är rekommendationen för proteinintag att ligga mellan 1.4-2.0 g/kg kroppsvikt och dag. Om du vill få ut maximalt av all energi och tid du lägger ner på din träning, så rekommenderas du äta lite mer protein. Det är inte farligt att äta “för mycket” protein. I en långsiktig studie på ett år, där deltagarna åt 3 g/kg/dag visade inga negativa effekter på njur- och leverfunktion. Det är inte bråttom att få i dig protein i samband med styrketräningen. Ät dina vanliga mål mat, träna din träning. Det går att få i sig rekommenderad mängd protein per dag om du har koll och anstränger dig. Proteinrik mat FISK, KÖTT OCH ÄGG per 100 gram Tonfisk: 27 g Kyckling: 26 g Sardiner: 25 g Räkor: 24 g Kalkon: 22 g Rostbiff: 22 g Rökt lax: 21 g Ägg 13 gram Proteinrik mat BÖNOR OCH LINSER per 100 gram Sojabönor: 34 g Röda linser: 27 g Bruna linser: 25 g Mungbönor: 24 g Vita bönor: 21 g Kikärtor: 20 g Annat, ex Vitt bröd 10 g Havregryn 12 g Essentiella aminosyror Det finns tjugo aminosyror som bildar proteiner och av dessa är det åtta som kroppen inte kan tillverka själv – Fenylalanin, Tryptofan, Isoleucin, Metionin, Treonin, Leucin, Lysin och Valin. Dessa aminosyror kallas essentiella, då de är livsviktiga att få i sig via födan. För barn är även aminosyrorna Arginin och Histidin essentiella. Vegetabiliska livsmedel innehåller var för sig oftast inte de essentiella aminosyrorna i tillräckligt stor mängd, men tillsammans kompletterar de varandra. Detta kallas kompletterande verkan. Ett exempel är spannmål och baljväxter. Spannmål innehåller tillräckligt av aminosyrorna metionin och cystein som det finns begränsat av i bönor, ärtor och linser. Baljväxter innehåller mer av aminosyran lysin som det inte finns så mycket av i spannmål. Förutsatt att man inte äter väldigt ensidigt, får man därför i sig tillräckligt med protein även om mat äter enbart vegetarisk mat.

Heute ein Arzneimittel-Thema, nämlich Schmerzmittel, und zwar die rezeptfreien. // Viele Schmerzmittel sind rezeptfrei erhältlich,  aber apothekenpflichtig  ⇔ im Unterschied zum Ausland (dort of freiverkäuflich).  In der Apotheke aber nicht in der Freiwahl, nur von der Apothekerin oder dem Apotheker, aus der sogenannten Sichtwahl.  //   In der Werbung als Möglichkeit beworben, leistungsfähig zu bleiben trotz Schmerzen.  Die Risiken werden bagatellisiert (bei Risiken und Nebenwirkungen …) und von Patienten unterschätzt.  //   Medizinische Studien zeigen, dass Schmerzmittel zahlreiche Nebenwirkungen haben können, wie etwa Magenblutungen, Leber- und Nierenschäden und sogar zu plötzlichen Herzstillstand führen können.  //   Häufigste Formen Rückenschmerzen, letzte Folge Ausgiebig sich nicht in Patientenrolle fallen lassen, keine unnötige OP, keine Rückengymnastik, und natürlich Schmerzmittel nur ganz kurz und akut... Kopfschmerzen: Spannungskopfschmerzen, Migräne (eher Frauen) und der seltene Cluster-Kopfschmerz (eher Männer). Schmerzmittel können im Über­maß selber Entzugs-Kopf­schmerzen verursachen. Deshalb sollte niemand sie häufiger als zehn Tage im Monat nehmen, auch wegen der langfristigen Nebenwirkungen.  //   Migräne Prophylaxe, auch Neuerung gegenüber allein Betablockern Lebensführung Neues Injektionsmedikament  //   Substanzen Nicht-Opiate / Opiate Nicht-steroidale Antiphlogistika / Steroide wie Cortison Auch fiebersenkend (max. 3 Tage)  //   Maximal 10 Tage, Kombinationen ± Coffein vermeiden Paracetamol: nur analgetisch, antipyretisch; nicht entzündungshemmend Typische Arnzneistoffe: ASS, Ibuprofen, Diclofenac   //   Nebenwirkungen Ergeben sich aus den Wirkungen der Prostaglandine  //   Schleim und neutralisisierendes Bicarbonat in der Magenschleimhaut Glatte Muskulatur erschlaffend, Blutgefäße und Bronchien weiten sich Hemmung der Thrombenbildung  Nierendurchblutung  //   Folglich Nebenwirkungen  //   Magen-Darmgeschwüre und Blutungen Herz-Kreislaufrisiken: Herzinfarkt, Rhythmusstörungen. Schlaganfall - Ausnahme Aspirin / prim. Prävention wirkungslos, mögliches Risiko in Patientenb über 75 J.; https://www.welt.de/gesundheit/article162896074/Ibuprofen-erhoeht-Risiko-fuer-Herzstillstand.html https://www.gesundheitsstadt-berlin.de/aspirin-fuer-tausende-von-todesfaellen-verantwortlich-11455/ https://www.welt.de/gesundheit/article162896074/Ibuprofen-erhoeht-Risiko-fuer-Herzstillstand.html Schwere Nierenschädigung (ca. 20% aller Fälle von Nierentransplantationen); https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5698389/ Aspirin/Analgetika-Asthma: https://www.medmix.at/aspirin-asthma-und-analgetika-asthma-vermeiden  //   Besonderheiten Paracetamol: Lebertoxisch Schwellenwert ca. 8 g, d.h. mit 1 Packung https://www.deutsche-apotheker-zeitung.de/daz-az/2016/daz-28-2016/ueberdosis-paracetamol Nur kurzes Zeitfenster für Antidot, sonst nur noch Lebertransplantation  //   Mengenbegrenzungen und Rezeptfreiheit Die Packungsgrößen sollten daher auf eine Dosis von maximal vier Tagen zu begrenzen. Doch das Bundesgesundheitsministerium setzte dies bislang nicht um. ASS keine; Ibuprofen 400 mg ± Lysin 50 Tabl. Menge unbegrenzt; Diclofenac 25 mg 20 Tabl.; Paracetamol 10 g, i.e. 20 Tabl. à 500 mg  //   https://www.deutsche-apotheker-zeitung.de/news/medwissinfo/2019/03/01/pharmakokinetik-von-ibuprofen-aus-der-fix-kombination-ibuprofen-plus-coffein-im-vergleich-zu-ibuprofen-lysinat-oder-saeure https://www.deutsche-apotheker-zeitung.de/daz-az/2012/daz-8-2012/paracetamol-nur-noch-auf-rezept https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5422108/?report=reader https://www.bmj.com/content/357/bmj.j1909 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4033962/ Zusammenfassung: Bei weitem nicht so harmlos wie man meinen möchte T...

In diesem 43. Podcast geht es um die Kraft der Aminosäuren und welche Wirkungen eine einseitige Aufnahme bei Dir bewirken kann. Wir klären in diesem Podcast für Deinen Erfolg und Deine Erfüllung folgende Fragen: Sind Aminosäuren wirklich so wichtig als Bausteine des Lebens? Was ist ein Aminosäure-Pool? Warum sind die BCAAs so wirksam für Muskelaufbau? Wie kann ich Herpes Simples Bläschen aus meinem Leben verbannen? Warum sind die acht essentiellen Aminosäuren wirklich ein Hammer? Warum können zu viele Cashewkerne Probleme machen? Hier geht es zum POWER UP YOU LIFE SEMINAR: https://www.slatco-sterzenbach.com/shop/seminare/power-up-your-life Und hier geht es zum CFIT 4 LIFE & BUSINESS-Seminar: https://www.slatco-sterzenbach.com/shop/seminare/fit-4-life-business Gratis-Lebensrad: http://www.slatcosterzenbach.de/lebensrad/ ACHTUNG: Der Gutscheincode für unsere Seminare lautet: "Podcast18", damit erhältst Du 10% auf fast! alle unsere Seminare. Bei Fragen hier unsere Service-Hotline: 0800 - 47 66 64 63 (0800-IRONMIND) E-Mail: podcast@slatco-sterzenbach.com

In dieser Folge erfährst du mehr über die Getreidesorten Roggen und Gerste, die definitiv eine gute Alternative zu Weizen darstellen. Roggen ist eine verbreitete Getreideart aus der Familie der Süßgräser. Er liefert auch auf leichteren oder sandigen Böden und an kühleren oder feuchten Standorten noch gute Erträge. In Europa wird häufig Winterroggen angebaut, während Sommerroggen eine untergeordnete Bedeutung hat. Das Korn des Roggens wird für Nahrungs-, Futter- und Genussmittel verwendet. Auch wird die noch grüne Pflanze, Grünroggen, oder das bei der Ernte  zurückbleibende Stroh genutzt. Der Roggen besitzt 65 bis 200 Zentimeter lange Halme und 5 bis 20 Zentimeter lange Ährenaus einzelnen, meist zweiblütigen Ährchen mit schmalen Hüllspelzen Der Roggen ist einjährig, meist winterhart – Winterroggen - seltener ist der Sommerroggen. Er ist ein Intensivwurzler, seine Wurzeln reichen bis 1 Meter tief. Bei einer frei stehenden Pflanze können die Wurzeln eine Länge von 80 m und die Wurzelhaare eine Oberfläche von 400 Quadratmetern erreichen. Niedergedrückte Halme können sich so schnell wieder aufrichten. Der Roggen ist eine Allergiepflanze: Roggenpollen gelten als die stärksten Allergieauslöser unter den heimischen Gräsern. Fruchtreife ist von Juli bis August. Die Zeit von der Samenkeimung bis zur Fruchtreife beträgt beim Winterroggen etwa 280 bis 320 Tage. Der Roggen wird am meisten von dem stark giftigen Mutterkornpilz befallen. Nach der Infektion der Blüten entsteht an der Stelle der Früchte ein langes, braunes, hartes Korn. Man hat an zwei Stellen in steinzeitlichen Schicken in Nordsyrien Roggenkörner gefunden. Ansonsten fehlen Hinweise auf die Nutzung von Roggen aber fast völlig, bis er in archäologischen Funden in Europa, die aus der Zeit von ca. 1800–1500 v. Chr. stammen, wieder erscheint. Die Zusammensetzung von Roggen schwankt naturgemäß, sowohl in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen (Boden, Klima) als auch von der Anbautechnik (Düngung, Pflanzenschutz). Angaben je 100 g essbarem Anteil: Mineralstoffe: Natrium 4 mg, Kalium 510 mg, Magnesium 90 mg, Calcium 35 mg, Mangan 2,9 mg, Eisen, 2,8 mg, Kupfer, 0,39 mg, Zink, 2,9 mg, Phospos 335 mg, Selen 0,002 mg Roggen enthält auch noch Vitamine wie Thiamin (Vit. B1), Riboflavin (Vit. B2), Nicotinsäure (Vit. B3), Phantothensäure (Vit. B5), Vitamin B6, Folsäure, Vitamin E und Aminosäuren wie Tryptophan, Threonin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Valin, Tyrosin, Arginin, … Aus Sicht der TCM, stärkt Roggen unseren Geist, vertreibt Nässe und unterstützt die Leberenergie.Er zählt zu den thermisch neutralen Lebensmitteln im Feuer-Element. Ein klassisches Rezept mit Roggen ist der Feuerfleck, eine alte Brotflade, die nur aus Wasser und Roggenmehl gemacht wird und dann mit Sauerrahm oder Knoblauchpaste gefüllt wird!                     Gerste ist sehr wertvoll für unsere Gesundheit, die thermische Wirkung ist erfrischend. Sie leitet Hitze aus und wird daher in der TCM bei Hautkrankheiten wie Neurodermitis verwendet. Wie Reis gleicht Gerste den Wasserhaushalt im Körper aus beruhigt die Schleimhäute im Magen- Darmbereich ist antioxidativ, also ein toller Radikalfänger senkt hohes Cholesterin sehr gut bei Völlegefühl oder Verdauungsschwäche (löst Nahrungsstagnation und harmonisiert die Mitte) tonisiert das Qi und wirkt blutaufbauend – ideal für Frauen und “Burn-Out”-Gefährdete. stärkt das Bindegewebe und kräftigt Haare und Nägel (hoher Eisen-, Zink- und Mangangehalt) Gerste hat einen innigen Bezug zu Kiesel (Kieselsäuren werden die Sauerstoffsäuren des Siliziums bezeichnet) und die Fähigkeit Malz zu bilden. Die Kieselsubstanz der Gerste kann im menschlichen Körper alles unterstützen, was einer Elastizität bedarf: die Außenhaut · die Schleimhäute in sämtlichen Bereichen · Bänder, Sehnen; · Zwischengewebe · Gelenke · die Bandscheiben der Wirbelsäule Ein langes Köcheln der Körner, das Kiesel herauslöst, erweist sich als günstige Zubereitung zur Vorbeugung bzw. Verbesserung bei Hautkrankheiten, Neurodermitis, Allergien sowie Bandscheibenschäden oder Gewebsschäden. Als Getränk, dem Gerstenwasser, kann diese Zubereitungsform dem Ermüdeten, dem Lungenkranken und allgemein dem Rekonvaleszenten empfohlen werden. Als Schleim zubereitet dem Magen- und Darmkranken. Die angekeimte und gedarrte (gemälzte) Gerste oder der Gerstenmalzextrakt wirken stärkend auf die Muskel- und die Denktätigkeit und sind daher hauptsächlich in der Kleinkind- und Jugendernährung einzusetzen. Gerste ist eines der wenigen Getreidesorten, die den Körper entsäuern kann und somit eine unschätzbare Hilfe um die Gesundheit zu erhalten und Krankheiten zu besiegen. Übersäuerung, die durch zu viel Stress, negative Emotionen und Ernährung mit Weißmehlprodukten und Fleisch entsteht, ist Ausgangspunkt für fast jede Erkrankung. Mit Gerste mache ich sehr gerne Gerstlsuppe, Graupotto - ein sommerliches Gerstenrisotto, Ritschert mit Gerste anstatt mit Reis und einen Gerstenflockenbrei mit Früchten zum Frühstück. Music by Lee MacDougall

Einsichten und Darlegungen zu Lysin. Einige Infos rund um Lysin in diesem kurzen Vortrags-Podcast. Eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcasts von und mit Sukadev Bretz, Yogalehrer bei Yoga Vidya. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße aus dem Gebiet der Naturheilkunde. Bei eigener Erkrankung brauchst du Arzt oder … „Lysin“ weiterlesen

Thomas hat gefragt: Gewisse Nährstoffe würden nicht ankommen in pflanzlicher Form und ein paar semiessentielle Nährstoffe sollen wohl auch viel zu kurz kommen. Darunter fallen z.B. L-Carnitin, Taurin, Cholin & Creatin. Die Aminosäure Lysin wird natürlich auch gerne genannt. Manchmal hört man auch, bei Veganern sei der Homocystein Wert oft zu hoch was ein schlechtes Zeichen wäre.. Wie sehen da die Studien aus?? (und) welches Buch würde Niko empfehlen wenn man nur ein Buch empfehlen könnte zu dem ganzen Thema. Niko beantworte es. Viel spaß dabei und schreibt gerne eure fragen in die Kommentare Bücher: How not do die: http://amzn.to/2tFgOR3 Dr. Jacobs Weg: http://amzn.to/2tZDtXJ Die High-Carb-Diät: http://amzn.to/2tFoFho Proteinaholic: http://amzn.to/2u015eK Becoming Vegan: http://amzn.to/2tZG6II Eat to Live: http://amzn.to/2tFke68 Instagram Lifestyle ►►► http://bit.ly/VegainsIG Instagram Lifestyle ►►► http://bit.ly/VegainsFood YouTube (EN) ►►► http://bit.ly/Vegains iTunes (Podcast DE) ►►► http://bit.ly/1VegainsPodcast Facebook ►►► http://bit.ly/VegainsFacebook If you want to support me please buy on Amazon through this link ►►► http://bit.ly/VegainsSupport my 3 Years Vegan Transformation ►►►http://bit.ly/MyVeganTransformationVideo Intro Music: https://www.youtube.com/watch?v=0y89u... Peace

mTOR-Inhibitoren (Synonym: Rapamycin) sind Wirkstoffe, die sowohl in der Immunsuppression als auch in der antiproliferativen Therapie systemisch und lokal Verwendung finden. In Vorversuchen unserer Arbeitsgruppe mit Zellkulturen zeigte sich schnell ein großes Adsorptionspotential von Rapamycin – beziehungsweise von dessen Derivat Everolimus – an die Oberflächen von Zellkulturflaschen. Diese Adsorption hängt im Wesentlichen von zwei Faktoren ab: dem Proteingehalt des Mediums und der spezifischen Oberfläche der Zellkulturflaschen. Um dies zu zeigen, wurden verschiedene gebräuchliche Zellkulturflaschen (Nunclon, Ultra-low-attachment, Weichglas, unbehandelte Polystyren-Oberflächen und Polystyren Oberflächen beschichtet mit Collagen 1 beziehungsweise Poly-D-Lysin) sowie Duranglas-Petrischalen ausgewählt. Die Oberflächen der Zellkulturflaschen wurden eine Stunde mit Medium mit einer definierten Menge an Everolimus bedeckt, gespült und wiederum eine Stunde mit DMSO bedeckt. DMSO löst die Substanz wieder von der Oberfläche ab. Die Everolimuskonzentrationen im Medium nach einer Stunde und in der DMSO-Lösung wurden mittels LC-MS/MS bestimmt. Es zeigte sich signifikante Adsorption von Everolimus in absteigender Reihenfolge: Ultra-low-attachment > Unbehandeltes Polystyren > Collagen 1 > Nunclon > Poly-D Lysin > Weichglas > Duranglas (bei 10% FCS in Medium) und Ultra-low-attachment > Unbehandelt > Collagen 1 > Weichglas > Poly-D-Lysin > Duranglas (bei 30% FCS in Medium). Im Folgeversuch wurden vier der Zellkulturflaschen ausgewählt (Nunclon, Unbehandelt, Collagen 1, Duranglas-Petrischalen) und untersucht, ob die reine Adsorption von Everolimus an die Oberfläche ohne Everolimus im Medium negative Effekte auf das Zellwachstum hat. Dies konnte bei drei Zelllinien (293T, VSMC, HUVEC) mittels Zellzählung demonstriert werden. Bei allen drei Zelllinien wurden p-p70s6K- Western Blots durchgeführt. Die p-p70s6K ist ein downstream gelegenes Phosphorylierungsprodukt von mTOR, welches wiederum von Rapamycin/ Everolimus gehemmt wird. Teilweise zeigte sich hier eine absteigende Phosphorylierung. Bei HUVEC- Zellen wurde zusätzlich die Expression von VEGF und p-p70s6K mittels ELISA untersucht. VEGF ist ein Faktor, der Wachstumssignale spezifisch an Gefäß- Endothelzellen vermittelt. Hier konnte entgegen der Erwartungen sogar eine Zunahme der Expression mit steigender Everolimuskonzentration gemessen werden. Neuere Studien legen jedoch nahe, dass VEGF nicht ausschließlich über TOR aktiviert wird. Bei p-p70s6K zeigte sich die erwartete Abnahme der Expression. Die Versuche weisen auf eine signifikante Beeinflussung des Zellwachstums durch Everolimusadsorption an Oberflächen hin. Inwiefern sich Adsorption bei Zellversuchen mit Everolimus in Lösung auswirkt, ist noch unklar. Eine Minderung der Everolimuswirkung wäre denkbar. Um die Oberflächenadsorption bei Versuchen mit Everolimus möglichst gering zu halten, empfiehlt unsere Arbeitsgruppe anhand der Versuchsergebnisse die Kultivierung auf wenig absorbierenden Oberflächen wie Duranglas beziehungsweise die Erhöhung der FCS-Konzentration in Lösung, soweit von den Zellen toleriert.

Audiovortrag zum Thema Lysin Simple und komplexe Fakten und Meinungen rund um dieses Thema aus dem Yoga Blickwinkel von Sukadev, dem Gründer des gemeinnützigen Vereines Yoga Vidya e.V. Dieser Audiovortrag ist eine Ausgabe des Audiovortrag zum Thema Fastenaufbau Simple und komplexe Fakten und Meinungen rund um dieses Thema aus dem Yoga Blickwinkel von Sukadev, dem Gründer des gemeinnützigen Vereines Yoga Vidya e.V. Dieser Audiovortrag ist eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcast. Er ist ursprünglich aufgenommen als Diktat für einen Lexikonbeitrag im Yoga Wiki Bewusst Leben Lexikon. Zum ganzheitlichen Yoga kann man auch die Theorie von Karma und Reinkarnation dazu zählen. In Ayurveda Ausbildungen erfährst du mehr zum Thema Gesundheit und Prävention. Vielleicht magst du ja deine Gedanken dazu in die Kommentare schreiben. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße. Bei eigener Erkrankung brauchst du einen Arzt oder Heilpraktiker. Hier findest du: Seminare mit Sukadev Seminarübersicht Themenbezogene Seminare Yoga Vidya YouTube Live Kanal Online Seminare Video Seminare Yoga Vidya kostenlose App Yoga Vidya Newsletter Unseren Online Shop Schon ein kleiner Beitrag kann viel bewegen... Spende an Yoga Vidya e.V.! kunde-podcast.podspot.de">Naturheilkunde Podcast. Er ist ursprünglich aufgenommen als Diktat für einen Lexikonbeitrag im Yoga Wiki Bewusst Leben Lexikon. Zum ganzheitlichen Yoga kann man auch die Theorie von Karma und Reinkarnation dazu zählen. In Ayurveda Ausbildungen erfährst du mehr zum Thema Gesundheit und Prävention. Vielleicht magst du ja deine Gedanken dazu in die Kommentare schreiben. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße. Bei eigener Erkrankung brauchst du einen Arzt oder Heilpraktiker. Hier findest du: » » » » » »

Die vorliegende Arbeit untersucht die Frage, ob humanes CFTR-Protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) sumoyliert wird und welche funktionelle Bedeutung die Sumoylierung des CFTRs hat. In der kaukasischen Bevölkerung gilt die Cystischen Fibrose (CF) oder Mukoviszidose als eine der häufigsten Erbkrankheiten. Mutationen im CFTR-Gen, die zu einer drastischen Beeinträchtigung der Funktion des CFTR-Proteins führen, bilden die molekulare Basis der Entstehung der CF. So sind häufig die Reifung und der Transport von CFTR an die Plasmamembran betroffen. Diese Prozesse und verschiedene Aktivitätszustände im CFTR werden u.a. durch posttranslationale Modifikationen (z.B. Phosphorylierungen) spezifischer Konsensus-Motive reguliert. In diesem Zusammenhang führte eine genaue Betrachtung der Primärsequenz von CFTR zur Identifikation von zwei hoch konservierten Motiven, die dem publizierten SUMO-Konsensus-Motiv (ψKxE, nachfolgend SUMO-Motiv genannt) an Position 447 und 1486, bezogen auf das zentrale Lysin, an welchem die Sumoylierung stattfindet, entsprachen. Die Sumoylierung, als eine Form der posttranslationale Modifikationen, wird durch kleine Ubiquitin-ähnliche Proteine (small ubiquitin-like modifier, SUMO) vermittelt. Diese stellen eine Klasse von regulatorischen Proteinen dar, die die Aktivität des Zielproteins, dessen Lokalisation oder die Interaktion mit anderen Proteinen steuern. Damit ergab sich ein relevanter Anknüpfungspunkt, die Rolle der bislang für die CFTR-Regulation noch nicht beschriebenen Form der posttranslationalen Kontrolle durch Sumoylierung zu untersuchen. Als Resultat der hier beschriebenen Untersuchungen konnte die Sumoylierung als notwendiger Bestandteil der Regulation des intrazellulären Transportes von CFTR identifiziert werden. Konkret wurde mit dem Yeast-Two-Hybrid-Verfahren gezeigt, dass CFTR-Domänen an den identifizierten SUMO-Motiven in der Nukleotid-bindedomäne 1 (NBD-1) und am C-Terminus von CFTR sumoyliert werden. Im Säugerzellsystem wurde die spezifische Sumoylierung kompletten CFTRs durch transiente Transfektion von CFTR- und SUMO-Expressionskonstrukten sowie in Zellen, welche CFTR und SUMO endogen exprimieren, verifiziert. Verhindert man weiterhin auf transiente Weise in Säugerzellen die Sumoylierung, durch Mutation der beiden SUMO-Motive oder durch Überexpression der SUMO-spezifischen Protease (SENP1), erreicht CFTR nicht die apikale Plasmamembran. Im Gegensatz zu F508, welches im ER verbleibt, wird CFTR, welches Mutationen in den SUMO-Motiven trägt, im Golgi-Apparat zurückgehalten. Diese Beobachtung konnte mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation und anschließendem Nachweis der Proteine in den entsprechenden Fraktionen über die Western-Blot-Methode gezeigt werden. Abschließend wurden am Beispiel eines zum SUMO-Motiv benachbart gelegenen Di-Leucin-Motives erste experimentelle Hinweise erhalten, wonach beide CFTR-Motive in der Interaktion mit dem für den vesikulären Transport funktionell wichtigem Adaptor-Protein (AP) Komplex zusammenwirken. Mit den vorliegenden Resultaten konnte erstmals die Hypothese formuliert werden, dass die hier beschriebene Sumoylierung eine Form der Modifikation ist, welche am Transport von CFTR an die Plasmamembran maßgeblich beteiligt ist.

Tue, 21 Jul 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10400/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10400/1/Wolf_Alexander.pdf Wolf, Alexander ddc

Einige auf myeloiden und lymphoiden Zellen bei Mensch und Maus identifizierte Rezeptorfamilien weisen sowohl aktivierende als auch inhibitorische Rezeptoren auf, die wichtige Funktionen bei der Regulation des Immunsystems haben. Die Triggering Receptors Expressed on Myeloid Cells (TREMs) stellen eine dieser immunregulatorischen Rezeptorfamilien dar und wurden beim Säuger bereits genauer untersucht. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die Mitglieder der TREMs beim Huhn eingehend charakterisiert. Der potentiell aktivierende TREM-A1 besaß eine extrazytoplasmatische Ig-Domäne und einen kurzen zytoplasmatischen Abschnitt, im transmembranen Bereich aber Lysin, als eine positiv geladene AS, die mit einem ITAM-haltigen Adaptormolekül assoziieren könnte. TREM-A1 hatte ein MR von etwa 25 kDa. Die mRNA für das membranständige TREM-A1 wurde vor allem in Makrophagen detektiert, aber auch in Gehirn, Knochenmark, Milz, Bursa und Thymus. Auf Proteinebene konnte die Expression durch einen neu hergestellten, spezifischen monoklonalen Antikörper auf Monozyten und Makrophagen, aber auch auf etwa 50% der B-Zellen und einer Subpopulation der T-Zellen nachgewiesen werden. Die mRNA der Ig-Domäne von TREM-A1 war in Thrombozyten viel höher exprimiert als die mRNA für den membranständigen Rezeptor, was einen Hinweis auf die Existenz einer löslichen Splice-Variante von TREM-A1 in diesen Zellen liefert. Mit Hilfe von Reportergenassays und löslichen Rezeptorkonstrukten konnte gezeigt werden, dass der Ligand von TREM-A1 auf stimulierten Milzleukozyten exprimiert wird, nicht jedoch auf stimulierten oder unstimulierten anderen Leukozyten. TREM-A1 wies in AS-Sequenz und Gewebeverteilung hohe Ähnlichkeit zu TREM-2 beim Säuger auf. Der inhibitorische TREM-B1 besaß zwei Ig-Domänen und einen langen zytoplasmatischen Bereich mit zwei ITIMs. TREM-B1 hatte ein MR von etwa 47 kDa und wurde mit Hilfe der qPCR vor allem auf Thrombozyten detektiert. Die ITIMs im zytoplasmatischen Anteil wurden nach Pervanadatbehandlung phosphoriliert und rekrutierten die Protein-Tyrosin-Phosphatasen SHP-1 und SHP-2. Der Ligand von TREM-B1 wurde auf mit PMA/CaIonophor stimulierten Milzleukozyten exprimiert, nicht jedoch auf mit ConA stimulierten Milzleukozyten oder auf stimulierten bzw. unstimulierten Leukozyten anderer Organe. TREM-B1 wies in AS-Sequenz und Gewebeverteilung hohe Ähnlichkeit zu TLT-1 beim Säuger auf. Vom inhibitorischen TREM-B2 existierten drei Varianten, die aber alle einen langen zytoplasmatischen Bereich mit zwei ITIMs besitzen. TREM-B2v1 besaß zwei extrazytoplasmatische Ig-Domänen, TREM-B2v2 nur eine, wobei die membran-proximale Ig-Domäne von TREM-B2v1 fehlte. TREM-B2v3 hatte die beiden Ig-Domänen von TREM-B2v1 doppelt. Die mRNA aller drei Varianten wurde vor allem in PBMC und Makrophagen exprimiert, etwas weniger hoch in Knochenmark, PBL, Milz und Caecaltonsillen.

Das Cad-System von E. coli gehört zu den Säure-induzierbaren Aminosäure-Decarboxylase-Systemen und spielt eine wichtige Rolle bei der Säureschutzantwort. In diesem System erfolgt die Reizwahr-nehmung, Signaltranslokation über die Membran und Transkriptionsregulation durch ein einziges Protein, nämlich CadC. In Gegenwart von induzierenden Bedingungen (niedriger pH-Wert und Lysin) aktiviert CadC die Expression des cadBA-Operons, dadurch kommt es zur Decarboxylierung von Lysin zu Cadaverin und CO2 durch die Lysin-Decarboxylase CadA und zum Export von Cadaverin durch den Lysin/ Cadaverin-Antiporter CadB. Dabei werden Protonen aus dem Cytoplasma entfernt und der extrazelluläre pH-Wert durch das basische Cadaverin erhöht. Das Lysin-Transportprotein LysP inhibiert die cadBA-Expression bei nicht-induzierenden Bedingungen, das bei der Decarboxylierung gebildete Cadaverin übt einen negativen Rückkopplungseffekt auf die Expression von cadBA aus. Im Rahmen der vorgelegten Arbeit wurden die Regulation des Cad-Systems durch CadC und die Lysin-spezifische Permease LysP, die Reizwahrnehmung durch CadC und die Struktur von CadC untersucht. Mittels Transkriptions- und Translationsanalysen wurde das Cad- System u. a. in E. coli MG1655 (Wildtyp) und E. coli MG1655-lysP211 (lysP-negativ) untersucht. Die cadBA- Expression war in E. coli MG1655-lysP211 deutlich höher als im Wildtyp, als Folge dessen war auch die relative Menge an CadA und die Konzentration an extrazellulärem Cadaverin erhöht. Des Weiteren war in dieser Mutante durch den Wegfall des Repressors LysP der Bedarf an extrazellulärem Lysin als Induktor der cadBA-Expression vollständig eliminiert. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Theoretische Physik der Universität zu Köln wurde anhand der für E. coli MG1655 (Wildtyp) gemessenen Daten ein mathematisches Modell erstellt und mit Hilfe dieser Daten die Dynamik des Cad-Systems in E. coli MG1655-lysP211 berechnet. Die in vivo bestimmten Ergebnisse wurden durch die in silico erhaltenen Daten sehr gut wiedergegeben. In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass CadC kein Sensor für Lysin ist. In vitro Experimente (ITC-Messungen, Tryptophanfluoreszenz-Messungen) ergaben, dass CadC nur eine extrem niedrige Affinität für Lysin aufweist, in vivo war ein bestimmter Schwellenwert für die Induktion der cadBA-Expression nötig, ansonsten hatte die Lysin- Konzentration keinen Einfluss. Da Lysin somit nicht durch CadC wahrgenommen wird und deshalb die Interaktion zwischen CadC und dem Transportprotein LysP nicht über die Konkurrenz beider Proteine um das Substrat Lysin erfolgt, beruht die Lysin-Abhängigkeit der cadBA-Expression vermutlich auf einer direkten Interaktion zwischen CadC und LysP. In vitro konnten CadC und LysP in Proteoliposomen quervernetzt werden, dies indizierte eine Affinität beider Proteine zueinander. Das Vorhandensein von Lysin löst die Interaktion zwischen CadC und LysP auf und ist somit ein wichtiger Schritt für die Aktivierung von CadC. Durch Messungen der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz mit der periplasmatischen Domäne von CadC (CadC188-512) konnte gezeigt werden, dass diese eine Affinität für den Inhibitor Cadaverin aufweist, der KD-Wert hierfür betrug 96 µM. In vivo Experimente bestätigten, dass das Vorhandensein der periplasmatischen Domäne für die Hemmung der cadBA-Expression durch Cadaverin essentiell ist. Somit scheint die Inhibierung der cadBA-Expression durch Cadaverin über eine direkte Interaktion mit der periplasmatischen Domäne von CadC zu erfolgen In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Biologische Chemie der Technischen Universität München wurden Strukturuntersuchungen zu CadC188-512 und CadC mittels 3D-Kristallisation durchgeführt. CadC188-512 konnte sehr gut überproduziert und gereinigt werden, und es entstanden bereits Kristalle, von denen einer am Synchrotron vermessen werden konnte. Die Auflösung (2,5 Å) war jedoch für eine Strukturaufklärung noch zu gering. In der periplasmatischen Domäne von CadC befinden sich zwei Cysteinreste. Mit Hilfe von in vitro Experimenten konnte die Ausbildung einer Disulfidbrücke in CadC188-512 bestätigt werden. Durch die Reduktion der Disulfidbrücke war die Affinität für den Ligand Cadaverin geringfügig vermindert. Das Auflösen der Disulfidbrücke könnte ein wichtiger Mechanismus für die Aktivierung von CadC darstellen. Wurde die Ausbildung einer Disulfidbrücke durch die Substitution der Cysteinreste durch Alanin verhindert, so wurde die cadBA-Expression in vivo Lysin-unabhängig aktiviert. Möglicherweise repräsentieren diese CadC-Derivate ein „semi-aktives“ CadC, das für eine volle Aktivierung nur noch einen Reiz benötigt.

Bei fehlender Muttermilch werden Hydrolysat-Nahrungen für die Ernährung Frühgeborener eingesetzt. In dieser Studie wurden die Auswirkungen zweier verschiedener Hydrolysat-Nahrungen (auf Casein- oder Molkenprotein-Basis)auf die Konzentration der Aminosäuren im Plasma der damit ernährten frühgeborenen Kinder beschrieben und diskutiert. Als Vergleichsgruppen wurden muttermilchernährte frühgeborene und termingeborene Kinder herangezogen. Die Plasma-Konzentrationen von Cystin und Arginin waren in beiden formelernährten Gruppen erniedrigt. In der Gruppe der mit Molkenprotein-Hydrolysat ernährten Kinder wurden zudem signifikant erhöhte Konzentrationen für Threonin und Lysin gemessen. Die Plasma-Aminosäuren-Profile deuten an, dass die Protein-Zusammensetzung der Hydrolysate weiter verbessert werden muss, wenn diese als adäquater Ersatz zur Muttermilch verwendet werden sollen.

In der vorgelegten Arbeit wurden Histonmethyltransferasen untersucht. Die beiden SET-Proteine, Enhancer of Zeste (E(z)) und PRset7 methylieren jeweils spezifische Lysine in den N-Termini der Histonmoleküle H3 bzw. H4 und wurden zu Beginn in E. coli exprimiert. In Histonmethyltransferase-(HMTase)-Versuchen konnte mit E(z) keine Aktivität erzielt werden. Mit einer eingeführten Mutation des aktiven Zentrums („E(z)mut“) und mit E(z) konnte nach der Inkubation mit Drosophila-Kernextrakten an beiden Proteinen die Histondeacetylase Rpd3 nachgewiesen werden, die enzymatisch aktiv war. Unsere Arbeitsgruppe konnte die HMTase-Aktivität eines E(z)-Komplexes bestätigen, die von einer (nicht-mutierten) SET-Domäne abhängt (Czermin et al., 2002). Die Untersuchungen zur Histonmethyltransferase PRset7 begannen mit Aktivitäts- und Spezifitätsversuchen an verschiedenen Substraten. Die nukleosomale Spezifität von PRset7 bestätigte sich gemäß den Ergebnissen von Fang et al. und Nishioka et al. (Fang et al., 2002; Nishioka et al., 2002b). PRset7 unterschied klar zwischen rekombinanten Nukleosomen (Histone rekombinant in E.coli exprimiert) und nativen Nukleosomen (Histone aus Drosophila-Embryos gereinigt), wobei letztere deutlich vermindert methyliert wurden. An rekombinanten, mit PRset7 methylierten Nukleosomen, konnte mit einem H4 K20-methyl-Antikörper eine H4 K20-Methylierung detektiert werden. Mit Hilfe verschiedener, rekombinanter Nukleosomen, deren H4-Moleküle N-terminal unterschiedlich lang waren, konnte die Substraterkennung bzw. -bindung von PRset7 auf maximal 9 Aminosäuren vor Lysin 20 eingegrenzt werden. Durch die Reinigung des Proteins wurde deutlich, dass kürzere Degradationsprodukte von PRset7 den wesentlichen Anteil der detektierten HMTase-Aktivität ausgemacht hatten, ohne die hohe nukleosomale Substratspezifität zu verlieren. Für die Substratherstellung weiterer in vitro-Versuche zur Beziehung zwischen H4-Acetylierung (K12 bzw. K16) und H4-Methylierung (K20) wurde die Histonacetyltransferase MOF rekombinant hergestellt, gereinigt und die enzymatische Aktivität bestätigt. Es ergab sich keine eindeutige positive oder negative gegenseitige Beeinflussung der beiden Modifikationen. Abschließend wurden die verwendeten Antikörper bezüglich ihrer Spezifität untersucht, welche gegeben war.

Abläufe in der Zelle eines multizellulären Organismus im Rahmen des Zellzyklus oder beim Vorgang der Differenzierung unterliegen strengen Kontrollmechanismen. Ein prominentes Regulationsprotein dieser Mechanismen ist der Retinoblastoma Tumorsuppressor (pRB). Im Zellzyklus liegt die Hauptfunktion pRBs in der Kontrolle des Übergangs von der G1- in die S-Phase. In der aktiven, nichtphosphorylierten Form reprimiert pRB die Expression von S-Phase Genen durch Inaktivierung des Transkriptionsfaktors E2F. Cyclin-abhängige Kinasen überführen pRB in eine mehrfach phosphorylierte, inaktive Form, wodurch die S-Phase eingeleitet wird. Im Gegensatz dazu übt pRB bei Differenzierungsvorgängen aber auch koaktivierende Funktionen aus und wird im Rahmen dieser Prozesse acetyliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass pRB nicht nur phosphoryliert und acetyliert wird, sondern darüber hinaus durch den small ubiquitin-like modifier (SUMO) modifiziert wird. Aktives pRB stellt das bevorzugte Substrat dieser Modifikation dar. Das Akzeptorlysin 720 ist konserviert und liegt in einer für die pRB-Funktion entscheidenden Domäne, der sogenannten pocket B Region. Zusammen mit der pocket A Region bildet sie die pocket Domäne, deren strukturelle Integrität sowohl für die Tumorsuppressorfunktion pRBs als auch für die Modifikation durch SUMO essenziell ist. An die pocket B Region binden neben zellulären Regulationsproteinen des Zellzyklus und der Differenzierung auch virale Onkoproteine, die pRB inaktivieren und dadurch für die Transformation einer Zelle verantwortlich sind. Diese viralen Onkoproteine und bestimmte zelluläre Proteine inhibieren die SUMO-Modifikation pRBs. Umgekehrt steigt die SUMOylierung von pRB an, wenn mutierte pRB-Versionen eingesetzt werden, die keine viralen oder zellulären Proteine mehr über die pocket B Region binden können. Eine Version von pRB, bei der das Lysin 720 zu Arginin ausgetauscht wurde und die somit nicht mehr SUMOyliert werden kann, besitzt ein stärkeres Repressionspotenzial auf die E2F-abhängige Genexpression, wie Reportergenversuche zeigten. Die SUMOylierung vermindert also pRBs Potenzial zur E2F-Reprimierung. Möglicherweise wird durch die SUMO-Modifikation von pRB die Zusammensetzung der Bindungspartner an der wichtigen pocket B Region moduliert.

In dieser Arbeit entwickelten und synthetisierten wir ein Tetramer des Kernsignales des großen T-Antigens des SV40 Viruses (PKKKRKV). Dadurch erhielten wir einen neuen nicht-viralen Vektor (NLSV404). Diese 4,4 kDA großen Peptide enthalten hauptsächlich die positiv geladene Aminosäure Lysin und komplexieren DNS durch elektrostatische Anziehungskräfte. Durch die Komplexierung wird die DNS vor dem Abbau durch DNasen geschützt. NLSV404 zeigt Eigenschaften eines Kerntransportsignals, welches wir durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung bestätigen konnten. Des Weiteren transfizierten Komplexe aus DNS und NLSV404 viele verschiedene Zelllinien, wie z.B. 16HBE14o-, HeLA S6 und Cos7 Zellen. Vergleiche der Transfektionseffizienz von NLSV404 Komplexen mit Komplexen, die aus der Mutante der Kernlokalisierungssequenz des T-Antigens gebildet wurden (cNLS, fungiert nicht mehr als Kernlokalisierungssignal), resultierten in einer mindestens 20-fach höheren Transfektionsrate. Hingegen waren NLSV404 Komplexe mindestens 100-mal effizienter als cNLS Komplexe, wenn man die Versuche mit Zellen durchführte, die in ihrer Zellteilung gehindert wurden. Die Inkubation von Zellen mit freiem NLSV404 vor der Transfektion der Zellen mit NLSV404 Polyplexen hatte einen dramatischen Einbruch in der Transfektionseffizienz zur Folge, welches Rückschlüsse auf einen kompetitiven Hemmungsmechanismus zulassen. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass NLSV404 ein viel versprechender nicht-viraler Genvektor ist.

Das Cad-System von Escherichia coli gehört zu den pH-induzierbaren Aminosäure-Decarboxylase- Systemen. Der Aktivator des Cad-Systems ist der membrangebundene Transkriptionsregulator CadC. CadC ist gleichzeitig Sensor für die Umweltreize pH und Lysin, und Effektorprotein, das die Expression des cadBA-Operons induziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden der molekulare Mechanismus der transkriptionellen Aktivierung des cadBA-Operons durch CadC und verschiedene Modelle für die Aktivierung eines membranintegrierten Transkriptionsaktivators untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Footprint-Analysen innerhalb der regulatorischen Region des cadBA-Operons die zwei CadC-Bindestellen Cad1 (erstreckt sich von bp -150 bis -112, relativ zum Transkriptionsstart des cadBA-Operons) und Cad2 (bp -89 bis -59) identifiziert werden. DNA-Bindeexperimente in vitro zeigten, dass CadC mit einer höheren Affinität an Cad1 als an Cad2 bindet. Die Affinität von CadC zu Cad1 und Cad2 wurde durch unterschiedliche pH-Werte oder durch Lysin und Cadaverin nicht signifikant beeinflusst. Die Analyse der Bindestellen Cad1 und Cad2 in vivo ergab, dass das Vorhandensein beider Bindestellen für die Induktion der cadBA-Expression durch Lysin und einen niedrigen externen pH-Wert essentiell ist. Desweiteren wurde die Repression des cadBA-Operons unter nicht-induzierenden Bedingungen durch den globalen Repressor H-NS untersucht. Deletionsanalysen der regulatorischen Region des cadBA-Operons indizierten zwei H-NS-Bindestellen stromaufwärts der CadC-Bindestellen. Rechner-gestützte Sequenzanalysen legten die Existenz von zwei weiteren H-NS-Bindestellen nahe, die mit den CadC-Bindestellen und der -35/-10-Region von PCad überlappen. In hns- Deletionsstämmen war die cadBA-Expression sowohl unter induzierenden als auch unter nicht-induzierenden Bedingungen signifikant erhöht. Für die Aktivierung des cadBA-Operons war CadC essentiell. Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum Oligomerisationszustand von CadC indizierten, dass CadC Tetramere ausbildet. Die periplasmatische Domäne war für die Oligomerisierung von CadC essentiell. Die Tetramere traten sowohl unter induzierenden als auch unter nicht-induzierenden Bedingungen auf. Daher scheint eine Aktivierung von CadC durch eine Oligomerisierung von CadC-Monomeren, die durch Umgebungsbedingungen wie den pH-Wert und die Lysin-Konzentration moduliert wird, unwahrscheinlich. Basierend auf den oben angeführten Daten wurde ein Modell für die transkriptionelle Aktivierung des cadBA-Operons entwickelt. Demzufolge bildet H-NS unter nicht-induzierenden Bedingungen innerhalb der regulatorischen Region des cadBA-Operons einen Repressionskomplex. Unter induzierenden Bedingungen bindet CadC als Tetramer zunächst an die Bindestelle Cad1, wodurch die anschließende Bindung an Cad2 erleichtert und stabilisiert wird. Durch die Bindung von CadC wird der H-NS vermittelte Repressionskomplex aufgelöst, wodurch eine Interaktion der RNA-Polymerase mit der -35/-10-Region von PCad und die cadBA-Transkription ermöglicht werden. Verschiedene membranintegrierte Transkriptionsfaktoren in eukaryontischen Zellen werden durch eine Regulierte Proteolyse (RP) aktiviert. Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum molekularen Mechanismus des membran-integrierten Transkriptionsaktivators CadC ergaben bisher keine Hinweise darauf, dass CadC unter induzierenden Bedingungen durch einen Mechanismus ähnlich den der Regulierten Proteolyse aktiviert wird. Um die Funktion der Transmembrandomäne und der periplasmatischen Domäne für die Aktivierung von CadC genauer zu analysieren, wurden verschiedene C-terminal verkürzte CadC-Derivate hinsichtlich ihrer Funktionalität untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine Membranassoziation oder -integration von CadC für die Induktion der cadBA-Expression notwendig war. Desweiteren war die periplasmatische Domäne für die CadC-Aktivierung essentiell. In Zusammenarbeit mit dem Department für Physik der LMU München wurde ein in silico Modell für die Regulation der cadBA-Expression erstellt. Zur Überprüfung des Modells wurde die Expression des Cad-Systems während einer simulierten Magen-Passage in vivo analysiert. Die experimentellen Daten stimmten mit dem Modell sehr gut überein. Das Modell ist also in der Lage, die in vivo-Daten zu abzubilden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der genauen physiologischen Funktion des Cad-Systems. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Cad-System eine wichtige Funktion für die Säureresistenz von E. coli bei extremen Säurestress bei pH-Werten

Der Großteil der in eukaryontischen Zellen ablaufenden chemischen Reaktionen finden in Zellkompartimenten statt, die durch Membranen eingeschlossen werden. SNARE-Proteine sind essentielle Komponenten für die Fusion von gleichartigen (homotypischen) als auch verschiedenartigen (heterotypischen) Membranen. SNAREs sind meist über eine C-terminale Transmembran-Domäne in der „Geber“-Membran verankert. N-terminale 60-70 Aminosäuren lange Hepta-Peptide (SNARE-Motiv) können über Coiled-Coil Formierung den Kontakt mit einem SNARE an der „Empfänger“-Membran herstellen (trans-SNARE Komplex). In der vorliegenden Arbeit wurden die Plasmamembran SNAREs SNC1 und SNC2 in Saccharomyces cerevisiae auf posttranslationale Modifikation durch Ubiquitin untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Ubiquitylierung an mindestens zwei Lysinen im Substrat erfolgt. Die kovalente Verknüpfung erfolgt durch die Ubiquitin-Ligase RSP5. In Mutanten, die die Sekretion von SNC1/SNC2 zur Plasmamembran inhibieren (sec17-1, sec18-1, sed5-1 und sec1-1), liegen die SNAREs in nicht-modifizierter Form vor. In den Endozytose-Mutanten end3 und end4, die für die Invagination von endozytotischen Vesikeln defekt sind, akkumuliert ubiquityliertes SNC1 an der Plasmamembran. Die Ubiquitylierungs-Reaktion muß daher an der Plasmamembran erfolgen. Eine der Ubiquitylierungsstellen, Lysin-63, befindet sich in der Coiled-Coil-Domäne der SNAREs. Der Austausch des Lysins durch ein Arginin an dieser Stelle führt dazu, dass SNC1 nicht mehr in das Lumen der Vakuole lokalisiert wird. Stattdessen verbleibt das Protein in der Membran der Vakuole. Die zweite Ubiquitylierungsstelle konnte noch nicht identifiziert werden. Das Ubiquitin Bindeprotein DDI1 interagiert mit SNC1/SNC2, und beeinflußt die Verfügbarkeit des SNAREs für den trans-SNARE Komplex. Ob DDI1 über die interne UBA (ubiquitin-associated)-Domäne mit ubiquityliertem SNC1/SNC2 interagiert, ist noch unbekannt.

In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden Histon-Methyltransferasen Su(var)3-9 und E(Z) aus Drosophila melanogaster charakterisiert. Die Histonmethylierung als Modifikation war schon länger bekannt gewesen, bis zum Jahr 2000 war jedoch vor allem die Acetylierung etwas genauer untersucht worden. Su(var)3-9 war die einzige bekannte Histon-Lysin-Methyltransferase, als diese Arbeit begonnen wurde. Zur Charakterisierung wurde das myc-getagte Enzym aus Drosophila-Kernextrakt durch Affinitätschromatographie aufgereinigt und zunächst die Substratspezifität festgestellt. Wie das humane Enzym Suv39H1 methyliert es ebenfalls spezifisch H3-K9 (Lysin 9 im Histon H3). Das aus den Kernextrakten aufgereinigte Enzym besitzt aber auch die Fähigkeit, ein an H3-K9 präacetyliertes Substrat zu methylieren. Die Vermutung, dass Su(var)3-9 mit einer Histondeacetylase assoziiert ist, konnte durch Verwendung von TSA als HDAC-Inhibitor bestätigt werden. Es stellte sich heraus, dass HDAC1 (Rpd3) mit Su(var)3-9 assoziiert ist. Um das Enzym besser untersuchen zu können, wurde es als Volllängenprotein und als Deletionsmutante in E. coli exprimiert. Die Aufreinigung des rekombinanten Enzyms sowie seine Lagerbedingungen wurden optimiert. Das Volllängenprotein Su(var)3-9 liegt – wie durch Gelfiltration festgestellt - als Dimer vor, die Interaktion mit sich selbst ist über den N-Terminus vermittelt. Su(var)3-9 bindet an sein eigenes, bereits methyliertes Substrat. Dies wurde an Peptiden untersucht, die den ersten 20 Aminosäuren des Histons H3 entsprechen, und entweder an Lysin 9 dimethyliert oder unmodifiziert waren. Die Interaktion mit dem methylierten Substrat ist auf die Chromodomäne von Su(var)3-9 zurückzuführen, ist jedoch schwächer als die Wechselwirkung von HP1 mit methyliertem H3-K9. Des weiteren wurde eine Drosophila-Zelllinie stabil mit Su(var)3-9 transfiziert. Das überexprimierte Protein ist jedoch nur schwach aktiv. Die Tatsachen, dass Su(var)3-9 mit HDAC1 interagiert sowie mit seinem eigenen Substrat assoziiert, ermöglichen die Aufstellung von Hypothesen über die bis jetzt kaum erhellte Ausbreitung von Heterochromatin in euchromatische Bereiche. Durch die Wechselwirkung mit der Deacetylase könnte Su(var)3-9 auch in aktiv transkribierte Bereiche vordringen und diese methylieren. Die Acetylierung, Zeichen für aktive Transkription, würde durch die Methylierung ersetzt werden. Die Interaktion mit seinem umgesetzten Substrat könnte verhindern, dass das Enzym sich nach der Reaktion entfernt, vielmehr könnte Su(var)3-9 entlang eines DNA-Stranges sukzessive alle Nukleosomen methylieren. Die darauffolgende Bindung von HP1 an methyliertes H3-K9 könnte den heterochromatischen Charakter des Chromatins verstärken und für längere Zeit festlegen. Aus Drosophila-Kernextrakten gelang es weiterhin, den E(Z)/ESC-Komplex über Säulenchromatographie aufzureinigen. Dieser enthält neben E(Z), ESC, p55 und Rpd3 auch Su(z)12. E(Z), ESC und Su(z)12 gehören der Polycomb-Gruppe an. Deren Funktion ist die dauerhafte Repression der homöotischen Gene. Sie spielen daher eine wichtige Rolle im „Zellgedächtnis“ während der frühen Entwicklung von Drosophila. Es konnte gezeigt werden, dass der E(Z)/ESC-Komplex Lysin 9 sowie Lysin 27 im Histon H3 methyliert. Außerdem wurde in vitro ein Teilkomplex aus rekombinantem E(Z), p55 und ESC rekonstituiert, der das Histon H3 methylieren kann. Ein Teilkomplex, der E(Z) mit mutierter SET-Domäne enthält, ist nicht in der Lage, H3 zu methylieren. Die Vorhersage, dass E(Z) aufgrund seiner SET-Domäne eine Methyltransferase sein müsse, konnte durch vorliegende Untersuchungen bestätigt werden. Polycomb ist ein weiteres Protein aus der Polycomb-Gruppe. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses Protein spezifisch an das Histon H3 bindet, das an K27 trimethyliert ist. Polycomb besitzt wie HP1 eine Chromodomäne. Aus den vorliegenden Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Nach der Methylierung von H3-K9 sowie H3-K27 durch den E(Z)/ESC-Komplex in homöotischen Genen, die schon abgeschaltet sind und weiterhin reprimiert werden müssen, bindet Polycomb an dieses Methylierungsmuster. Polycomb befindet sich in einem großen Komplex mit weiteren Polycomb-Gruppen-Proteinen. Die Bindung dieses Komplexes an Chromatin könnte ein denkbarer Mechanismus sein, wie die dauerhafte Repression der homöotischen Gene vermittelt wird. Um den E(Z)/ESC-Komplex genauer untersuchen zu können, wurden Viren für das Baculosystem hergestellt, so dass eine Einzel- oder auch Coexpression der Proteine möglich ist. Die Aktivität von E(Z), das im Baculosystem exprimiert wurde, ist nicht besonders hoch. Es bindet unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen weder an DNA, noch an Histone noch an H3-Peptide, die methyliert sind. Innerhalb des E(Z)/ESC-Komplexes bindet E(Z) an p55, Rpd3, ESC sowie Su(z)12. Su(z)12 interagiert mit p55, Rpd3 und E(Z). Die weiteren Interaktionen werden am besten durch eine bildliche Darstellung (siehe Abb. 86) vermittelt. In einem Luciferase-Assay wurde eine repressive Wirkung von E(Z) festgestellt. Dieses Experiment bedarf allerdings eines aktivierten Systems. Ferner muss durch Mutationsanalysen sichergestellt werden, dass die repressive Wirkung auf die Methyltransferase-Aktivität von E(Z) zurückzuführen ist. Kürzlich wurde entdeckt, dass E(Z) sowie Su(z)12 in verschiedenen Tumoren überexprimiert sind. Noch ist weder deren Funktion in den Tumorzellen klar, noch weiss man, ob die Überexpression der Grund oder eine Folge der Tumorbildung ist, noch kennt man alle Zielgene, die durch eine Überexpression von E(Z) und Su(z)12 beeinflusst werden. In nächster Zeit sind hier Einsichten in die Wirkungsweise von E(Z), Su(z)12 und anderen Polycomb-Gruppen-Proteinen zu erwarten.

Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Bereiche gegliedert. Der erste Themenbereich beschäftigte sich mit der Transformation von pflanzlichen Mitochondrien bzw. mit den Voraussetzungen, die erfüllt sein müssen, um Mitochondrien höherer Pflanzen zu transformieren. Im zweiten Themenbereich wurde die Regulation der Lysinbiosynthese erstmals mit Hilfe der Plastidentransformation modifiziert sowie ein universeller plastidärer Selektionsmarker entwickelt und etabliert. Mitochondrientransformation- In dieser Arbeit wurden zwei Strategien zur Transformation von Mitochondrien höherer Pflanzen entwickelt. Zum einen wurde ein mitochondrienspezifischer Ansatz gewählt, d.h. es wurden Selektionsmarker verwendet, die eine hemmende Wirkung auf die Atmungskette der Mitochondrien besitzen. Zum anderen wurden in Anlehnung an seit die seit 1990 erfolgreich durchführbare Plastidentransformation generelle Inhibitoren der Proteinbiosynthese verwendet, welche durch die Produkte der entsprechenden in die Mitochondrien eingebrachten Resistenzgene detoxifiziert werden sollten. Markergenstrategie- Geeignete Selektionsbedingungen zur Identifizierung von mitochondrialen Transformanten wurden bei Tabakblättern und Tabakprotoplasten mit den Antibiotika Blasticidin, Chloramphenicol und Hygromycin als Hemmstoffe ermittelt. Aus Transformationen mit den mitochondrialen Transformationskassetten pBMhph II, pBMhph III und pBMhph IV konnten über 200 Hygromycin-resistente Linien selektiert und charakterisiert werden. PCR- und Southern-Analysen lassen bei mindestens 7 Linien eine zielgerichtete mitochondriale Integration des Transgens vermuten. Möglicherweise sind aber nur wenige Kopien des Transgens in das Mitochondriengenom inseriert bzw. repliziert worden, was eine eindeutige Charakterisierung erschwert. Bei einer großen Anzahl resistenter Linien handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle zielortfremde Integrationen der Transformationskassetten in die Plastiden-, Kern- oder Mitochondriengenome. Mitochondrienspezifischer Transformationsansatz- Die in dieser Arbeit entwickelten mitochondrienspezifischen Transformationsvektoren pUMmyx II, pUMglu II, pUMarg II und pUManti II enthalten ein Fragment des mitochondrialen cob-Gens. In dieses cob-Fragment wurden Punktmutationen eingeführt, die zu einer Veränderung der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur des Apocytochroms b führen. Bei einer korrekten homologen Integration dieses modifizierten cob-Fragmentes in das Mitochondriengenom sind die Inhibitoren Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben nicht mehr in der Lage, an den Komplex III der mitochondrialen Atmungskette zu binden. Zur Bestimmung optimaler Selektionsbedingungen von mitochondrialen Transformanten mit den Hemmstoffen Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben wurden Testreihen mit Tabakblättern, Tabakprotoplasten sowie Tabak- und Arabidopsis-Suspensionskulturen durchgeführt. Bei „particle-gun“-Transformationen von Tabakblättern mit der Transformationskassette pUMarg II wurden 23 Moa-Stilben-resistente Linien selektiert. Bei 18 Linien konnte eine Integration des mutierten cob-Fragmentes eindeutig per PCR und Sequenzierung nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um eine mitochondriale Integration handelt, konnte nicht eindeutig belegt werden. In diesem Fall wäre jedoch zu klären, auf welchem Mechanismus der offensichtliche selektive Vorteil der mit dem Transformations-vektor transformierten Pflanzen beruht, da die Integration des cob-Gen-Fragmentes nur innerhalb des mitochondrialen Zielortes funktionell sein dürfte. Plastidentransformation- Bei dem plastidären Transformationsansatz dieser Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt. Zum einen wurde der „feedback“-Regulationsmechanismus der DHDPS innerhalb des Aspartat-Stoffwechsels durch die Integration eines insensitiven dhdps-Gens in die Plastiden von Tabak und Kartoffel beeinträchtigt. Der Gehalt der essentiellen Aminosäure Lysin wird somit gesteigert. Zum anderen wurde das insensitive dhdps-Gen als Markergen genutzt, um eine Selektion von plastidären Transformanten auf dem Lysinanalogon AEC zu ermöglichen. Erhöhung des Lysingehaltes- Es konnten 34 Spectinomycin-resistente Tabakklone selektiert werden, die mit der Transformationskassette pHoDh2b transformiert wurden. Die molekularbiologische Charakterisierung der Transformanten konnte bei 8 Linien eindeutig eine korrekte plastidäre Integration der Transgene belegen. Biochemische Analysen zeigen eine bis zu 32-fache Erhöhung an freiem Lysin im Blattgewebe von plastidären Transformanten. Es war damit erstmals mit der Plastidentransformation möglich, regulatorisch die Lysinbiosynthese zu verändern. AEC als plastidärer Selektionsmarker- AEC (S-Aminoethyl-L-Cystein) konkurriert als Lysinanalogon mit Lysin um den Einbau in Polypeptide. Wird die AEC-Konzentration im pflanzlichen Gewebe im Vergleich mit Lysin zu hoch, kommt es zum Erliegen des Stoffwechsels und damit zum Absterben der Zelle. Durch die Überproduktion von Lysin in den Transformanten verschiebt sich das Verhältnis von AEC → Lysin. Es wird somit kompetitiv mehr Lysin in die Polypeptide eingebaut. Dies lässt sich als Selektionsvorteil nutzen. Mit dem „Markergen“ dhdps-r1 und AEC als selektivem Hemmstoff wurden insgesamt 49 Tabaklinien selektiert. Bei 3 selektierten Linien konnte eindeutig die korrekte plastidäre Intergration der Transformationskassette nachgewiesen werden. Es ist damit erstmals gelungen, einen antibiotikumfreien universell einsetzbaren plastidären Selektionsmarker zu etablieren. In weiteren Transformationsexperimenten konnten mit dem gleichen „Markergen“ plastidäre Tomatentransformanten identifiziert und charakterisiert werden (Diplomarbeit L. Schaeffer). Damit ist es bereits bei 2 Spezies gelungen, AEC als selektiven Hemmstoff einzusetzen. Bei weiterer Optimierung der Selektionsbedingungen dürfte es möglich sein, auch bei weiteren Pflanzenspezies diesen universellen Selektionsmarker zu etablieren.

Das Protein Ubiquitin kann posttranslational an Proteine geknüpft werden. Dieser Vorgang ist für den Abbau von Proteinen durch das Proteasom notwendig.Neben dieser Funktion hat die Modifikation mit Ubiquitin noch weitere Funktionen,die nicht zum Abbau des Proteins führen.Ubiquitin- ähnlichen Proteine,wie beispielsweise SUMO,sind ebenfalls nicht direkt am Proteinabbau beteiligt.Die Konsequenz der Modifikation,und das Zusammenspiel Ubiquitin-ähnlicher-Systeme mit dem Ubiquitin-System sind bisher allerdings wenig verstanden. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)ist eine zentrale Komponente der DNA-Replikation und DNA-Reparatur.Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden,daß PCNA über drei verschiedene posttranslationale Modifikationen reguliert wird.In der S-Phase des Zellzyklus wird PCNA durch SUMO modifiziert.Nach DNA-Schädigung wird PCNA dagegen durch Komponenten des RAD6 -DNA-Reparaturwegs mono-oder multiubiquitiniert. Alle drei Modifikationen finden am gleichen,zwischen eukaryontischen Spezies kon servierten Lysin statt.Der RAD6 -DNA-Reparaturweg reguliert postreplikative DNA-Reparatur.Eine Schlüsselstellung innerhalb dieses Reparaturwegs nehmen zwei Ubiquitin-konjugierende Enzyme,RAD6 sowie das Heterodimer UBC13/MMS2,die über die RING-Finger Prote ine RAD18 bzw.RAD5 an das Chromatin rekrutiert werden,ein.Interessanterweise interagiert neben PCNA auch das SUMO-konjugierende Enzym UBC9 mit den beiden RING-Finger Proteinen sowie mit PCNA selbst und ist so ebenfalls mit dem RAD6 -Reparaturweg assoziiert.Nach DNA-Schädigung wird PCNA von RAD6/RAD18 monoubiquitiniert.Alternativ kann PCNA durch das hierfür zusätzlich notwendige Heterodimer UBC13/MMS2 und das RING-Finger- Protein RAD5 mit speziellen,Lysin-63-verknüpften Ubiquitinketten, multiubiquitiniert werden.PCNA-Ubiquitinierung ist essentiell für DNA- Reparatur,da eine PCNA-Mutante,die nicht mehr modifiziert wird,starke Sensitivität gegenüber DNA-Schädigung besitzt. Es konnte gezeigt werden,daß die verschiedenen Modifikationen unterschiedlich auf die Funktionen von PCNA einwirken können. SUMOylierung von PCNA wirkt inhibierend auf RAD6 -abhängige DNA- Reparatur.PCNA-Multiubiquitinierung durch Lysin-63-verknüpfte Ubiquitinketten aktiviert PCNA in dem UBC13/MMS2/RAD5-abhängigen Zweig RAD6 -abhängiger DN A -Reparatur,der fehlerfrei arbeitet.PCNA- Monoubiquitinierung scheint dagegen den fehlerhaften Zweig RAD6 - abhängiger DNA-Reparatur zu aktivieren.ˇ

= u Beginn dieser Arbeit wurde den Hinweisen nachgegangen, daß Pd(II)-Zentren in der Lage sind, die Bildung von Peptidbindungen aus nicht aktivierten Aminosäureestern zu vermitteln. Dies führte zu der Charakterisierung der Verbindungen 1-5, die sich durch die Koordination der Ester-Carbonylgruppe am Metallzentrum auszeichnen. Die Aktivierung der Carbonyl-Gruppen läßt sich durch die starke Verschiebung der C=O-Banden nach kleineren Wellenzahlen im IR-Spektrum belegen.In einer Folgereaktion kann durch Umsatz mit einem Überschuß an Wasser das Hydrolyse-Produkt 6 isoliert werden. Bei Versuchen mit Butylamin als Reaktionspartner bleibt die Carbonsäureester-Gruppe im Molekül erhalten. Die Bildung einer Amid-Bindung wird nicht beobachtet. Beim Umsatz von Glycinester mit der Komplex-Verbindung (en)PdCl2, die von Kostic zur sequenzspezifischen Hydrolyse von Peptiden eingesetzt wurde, konnte Verbindung 7 erthalten werden. Die Bildung eines Peptids am Komplex wird nicht beobachtet. Die Reihe von Metallionen für die bekannt ist, daß sie Aminosäureester aktivieren können, und damit eine katalytische Peptidbildung ermöglichen, konnte in dieser Arbeit wesentlich erweitert werden. Neu untersucht wurden die Metallverbindungen aus der Gruppe der Seltenen Erden, aber auch andere starke Lewis-Säuren, wie die Chloride der Metalle der vierten, fünften, und sechsten Nebengruppe in ihren jeweils höchsten Oxidationsstufen. Der Schlüssel hierfür ist die Verwendung des wenig koordinierenden Lösungsmittels Dichlormethan. In der Reihe der dreiwertigen Metallionen ergibt sich mit geringen Abweichungen eine Abhängigkeit der Peptidausbeute von dem effektiven Ionenradius. Je kleiner der Ionenradius, desto höher ist das Verhältnis Z/r (Ladung/Radius), und desto effektiver ist die Aktivierung der Aminosäureester. Hier ragen vor allem die „klassischen“ Lewis-Säuren Al 3+ und Fe 3+ heraus. Das Resultat, das für Fe 3+ -Ionen (Umsatz von Glycinester zu 82 %) erzielt wurde, ist höher als jedes andere, das unter diesen Reaktionsbedingungen bisher verzeichnet wurde. Die Ausbeuten der Metallionen aus der Gruppe der Seltenen Erden litten unter einer im Laufe der Zeit zunehmenden Vergiftung des Katalysators durch Komplexbildung. Kinetische und analytische Untersuchungen belegen dies. In der Gruppe der vierwertigen Metallionen wurden mit HfCl4 und ZrCl4 hohe Ausbeuten (um 60 %) erzielt. Dieses Ergebnis zeigt die Verwandtschaft zu der katalytischen Veresterung von Carbonsäuren, für die in einem Screening vor allem Hf 4+ hervorragende Ergebnisse erbrachte. Übergangsmetallchloride mit den Oxidationsstufen V und VI konnten diese Resultate nicht erreichen. Probleme bereiten hier beispielsweise Redox-Instabilitäten der höchsten Oxidationsstufe. Betrachtet man die Ergebnisse innerhalb der Gruppen, so ist eine Abhängigkeit der Ausbeute von der thermodynamischen Stärke der M-N-Bindung zu beobachten. Schließlich konnte die Abhängigkeit der Ausbeute von dem sterischen Anspruch der Aminosäure-Seitenkette, die schon für die Cu 2+ -Katalyse bekannt war, auch für das Zr 4+ nachgewiesen werden. Selbst funktionelle Seitenketten, wie im Histidin vorhanden, konnten die Peptidbildung im Fall der Zr 4+ -Katalyse nicht unterdrücken. Die Erweiterung des Konzeptes der templat-gesteuerten Cyclotetrapeptid-Synthesen führte zur Darstellung der Asparaginsäure enthaltenden makrocyclischen Komplexen 8 und 9. In dieser Synthese wird der Templat-Effekt in doppelter Weise ausgenutzt. Das Metallion schafft nicht nur die räumliche Nähe und die Aktivierung der zunächst nicht reaktiven Edukt-Peptidester, sondern legt auch die Ringgröße auf die begünstigte Zahl von 14 Gliedern fest. Verbindung 8 konnte erfolgreich zum vierfach geladenen Komplexanion 10 hydrolysiert werden. 10 sollte sich nach Austausch der PPN + -Kationen gegen Na + durch eine verbesserte Wasserlöslichkeit auszeichnen, die wichtig ist für potentielle Anwendungen (z.B. als Röntgenkontrastmittel). Mit Verbindung 11 konnte ein Cyclopeptidkomplex mit Glutaminsäure-Komponenten dargestellt werden. Unter Vermeidung des zu gespannten 12-gliedrigen Rings bildet sich ein größerer Zyklus mit 16 Atomen um das Pd(II)-Ion. Positioniert man den funktionellen Aminosäureester am Amino-Terminus des Edukt- Dipeptids in Kombination mit einer ß-Aminosäure-Einheit, so erhält man mit 12 und 13 Cyclopeptidkomplexe, deren Seitenketten im Vergleich zu denen von 8 und 9 um eine Methylen-Gruppe verlängert sind. Werden ungeschützte, Stickstoff-enthaltende Aminosäuren als Komponenten in der Cyclotetrapeptid-Synthese eingesetzt, können nur offenkettige Peptidkomplexe wie 14 isoliert werden. Das starke Koordinationsvermögen der Seitenkette verhindert die Ausbildung der Cyclopeptid-Vorläufer-Komplexe. Schützt man hingegen das Amino-Ende von Ornithin oder Lysin, so ist der Ringschluß möglich und es können die Komplexe 15-17 isoliert werden. Aus 17 kann in einem weiteren Schritt durch Einwirkung von HCl das freie Cyclotetrapeptid von dem Metallion abgespalten werden. Aufgrund der geringen Löslichkeit des noch Boc-geschützten cyclischen Peptids 18 gelingt die Freisetzung der Amino-Gruppe der Seitenkette erst unter Einwirkung von TFA. Ausgehend von Verbindung 9 konnte ein weiteres Beispiel für die -C-Hydroxylierung der Glycinkomponente in Ni-Cyclotetrapeptidkomplexen unter Lufteinwirkung gesichert werden, die stufenweise erfolgt (21b und 22b). Von 21a konnte nach vielen Versuchen ein Kristall gewonnen werden, dessen Qualität für die Röntgen- strukturanalyse hinreichend war. Mit Verbindung 24 wurde erstmals ein ungeladener Cyclopeptid-Komplex isoliert, dessen Ligand teilweise protoniert ist.

Ziel dieser Arbeit sollte die Entwicklung einer automatisierten, hochparallelen und nachweis-starken Sequenzierungsmethode für Proteine im Rahmen der Proteomanalytik sein. Zur Kon-zeption der Methodik sollte dabei mit der sogenannten Leitersequenzierung eine Kopplung aus enzymatischem Aminosäureabbau und MALDI-Massenspektrometrie zum Einsatz kom-men. Die experimentellen Grundparameter für die Leitersequenzierung im Bezug auf die nasschemischen Sequenzierungsschritte und die massenspektrometrischen Messung wurden dabei im ersten Teil der Arbeit zunächst manuell ausgearbeitet. Im zweiten Abschnitt wurden dann die Möglichkeiten einer Automatisierung der so erarbeiteten Methode zur Leitersequen-zierung auf verschiedenen Ebenen evaluiert. Da der enzymatische Abbau eines Gesamtproteins durch dessen intrinsische Eigenschaften wie Sekundärstruktur, Tertiärstruktur (Zugänglichkeit der Proteintermini für die Exopepti-dase) oder Lösungsverhalten erschwert ist, wurden die Sequenzierungsprotokolle der Leiter-sequenzierung für proteolytisch erzeugte, RP-HPLC-gereinigte Spaltfragmente von Proteinen optimiert. Zudem besitzt die MALDI-MS, wie auch andere gängige massenspektrometrische Verfahren, im Massenbereich über ca. 5-10 kDa eine zu geringe Auflösung und Genauigkeit, um eine eindeutige Zuordnung der Massendifferenzen in den Leiterpeptidspektren zu den durch Exopeptidase abgespaltenen Aminosäure zu erlauben. Bei Versuchen mit verschiede-nen Endopeptidasen stellte sich – entgegen theoretischen Erwartungen – heraus, dass vor allem auch Proteinspaltungen mit Endoproteinase GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin, neben Spaltungen mit Endoproteinase LysC, gute Voraussetzungen für die nachfolgende enzymatische Sequenzierung liefern. Mit den Proteinfragmenten aus Spaltungen der Endoproteinasen GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin wurden bei den enzymatischen Sequenzierungen die höchsten Sequenzabdeckungen erzielt. In der technischen Ausführung wurden alle Experimente im Hinblick auf eine Sequenzierung direkt auf dem Target (on-target) optimiert. Geringfügige Anpassungen der erarbeiteten Methoden erlaubten jedoch auch eine Sequenzierung von Peptiden, die zuvor auf PVDF-Membran (Immobilon PSQ) aufgetragen wurden. Ein relativ kontrollierter und reproduzierba-rer Abbau war in einem Temperaturbereich von ca. 25-35°C möglich. Die enzymatischen Sequenzierungen erfolgten ausschließlich mit kommerziell erhältlichen Exopeptidasepräpara-tionen. Eine zusätzliche Aufreinigung der eingesetzten Enzyme erwies sich als nicht notwen-dig. Um eine einfache Interpretation der massenspektrometrischen Resultate zu gewährleisten, wurden nur Monopeptidylpeptidasen eingesetzt. Für C-terminale Sequenzierungen wurden mit CPY, CPP, CPW, CPA und CPB Carboxypeptidasen unterschiedlicher Spezifität einzeln und in verschiedenen Kombinationen untersucht. Von der N-terminal Seite aus wurden Sequenzierungen mit APM, LAP, API und AAP durchgeführt. Eine Betrachtung der Sequen-zierungen zeigt dabei, dass zumeist nur aus kombinierten Resultaten der Anwendung verschiedener Carboxy- beziehungsweise Aminopeptidasen eine ausreichende Sequenzinfor-mation erhalten werden kann. C-terminal ist der Anteil sequenzliefernder Fragmente bei der Verwendung von CPY, sowie bei den sequenziellen Peptidasenkombinationen sb(CP-I) und den Peptidasenmischungen pb(CP) mit maximal 42% am höchsten. Hier treten auch vermehrt längere Teilsequenzen mit bis zu 12 AS auf. N-terminal hebt sich APM als Einzelpeptidase mit überdurchschnittlich guten Sequenzresultaten gegenüber den anderen Aminopeptidasen ab. Bis zu 34% der getes-teten Peptide liefern allein schon mit diesem Enzym eine Sequenzinformation. Zudem wurden längere Teilsequenzen mit bis zu 9 AS im Vergleich zu anderen Aminopeptidasen häufiger erhalten. Sequenzierungen mit Aminopeptidasenmischungen bei N-terminaler Sequenzierung brachten im Gegensatz zu Carboxypeptidasenmischungen bei C-terminaler Sequenzierung kaum deutliche Vorteile. Auch sehr lange Sequenzabschnitte mit bis zu 16 AS N-terminal und bis zu 25 AS C-terminal wurden in Einzelfällen erhalten. C- und N-terminal am häufigsten wurden jedoch aus den Leiterspektren Teilsequenzen mit bis zu 6 AS erhalten (85% aller sequenzliefernden Proteinfragmente). Der größte Teil der Sequenzabdeckung stammt mit 70% aus Teilsequenzen mit 3-9 AS. Unter dem Hauptaspekt einer möglichen Steigerung der Sequenzinformation bei den Leiter-sequenzierung wurden unterschiedliche Peptidderivatisierungen untersucht. Die gezielte N-terminale Modifizierungen brachte in vielen Fällen durch die resultierende Massenverschie-bung des derivatisierten Peptids einen Gewinn an C-terminaler Sequenzinformation. Gegen-über entsprechend nicht-modifizierten Peptiden konnten durch die Massenverschiebung auch Leiterpeptide beobachtet werden, die sonst mit Signalen der MALDI-Matrix interferieren. Bei Modifikationsreagenzien, die eine fixierte positive Ladung oder ein ausgedehntes, delokali-siertes Elektronensystem ins Peptid einbrachten, wie z.B. Sulforhodamin B oder FMOC-NHS wurde dabei zusätzlich auch eine sehr gute Response im Massenspektrum beobachtet. Die Empfindlichkeiten lagen selbst bei der Sequenzierung der Rohprodukte solcher Derivate im unteren fmol-Bereich. Das charakteristische Isotopenmuster Brom-haltiger Peptidderivate erlaubte weiterhin ein stark vereinfachtes Auslesen der Leitersequenz aus dem Massenspekt-rum. Während die Leitersequenzierung allgemein keine Unterscheidung der isobaren Aminosäuren Leucin und Isoleucin erlaubt, gelang die Unterscheidung der ebenfalls isobaren Aminosäuren Lysin und Glutamin nach einer schnellen und selektiven Acetylierung des Lysins mit anschließender C-terminaler Sequenzierung.Im Hinblick auf die Analyse post-translationaler Modifikationen wurden insbesondere Phosphorylierungen eingehender untersucht. Dabei war sowohl bei der N-terminalen, als auch bei der C-terminalen Leitersequenzierung ein enzymatischer Abbau der phosphorylierten Aminosäuren zu beobachten und damit die entsprechende Phosphorylierungsstelle schnell und eindeutig zu identifizieren. Die N-terminale Sequenzierung mit APM lieferte die besten Resultate und ermöglichte sowohl den Abbau von Phosphotyrosin wie auch Phosphoserin, während der C-terminale Abbau sich auf Phosphotyrosin beschränkt zeigte. Aus der Summe der erhaltenen Resultate (Sequenzen) folgt, dass die Leitersequenzierung unter den gegebenen Voraussetzungen – insbesondere der limitierenden Verfügbarkeit zusätzlicher Exopeptidasen mit ergänzenden Spaltungsspezifitäten – im wesentlichen als Instrument zur schnellen Generierung kurzer Sequenztags geeignet ist. Auf diesem Gebiet stellt die erarbeitete Leitersequenzierung im Vergleich zur Edman-Sequenzierung eine wesentlich schnellere Alternative dar. Im Gegensatz zu rein massenspektrometrischen Sequenzierungen ist die Interpretation der Sequenzen im Massenspektrum stark vereinfacht und daher zumeist eindeutig. Die Empfindlichkeit der Methode ist stark von der untersuchten Peptidsequenz abhängig. Generelle Werte für die Empfindlichkeit lassen sich somit nicht angeben, die Resultate lassen jedoch für eine Peptidausgangsmenge im oberen fmol-Bereich (1000-500fmol) eine Leitersequenzierung ausnahmslos möglich erscheinen. Die Ergebnisse von Verdünnungsreihen zeigen zudem, dass auch nach Sequenzierung von Peptidmengen im mittleren bis unteren fmol-Bereich (50-10fmol) ein Auslesen der Peptidsequenz aus dem Massenspektrum zumeist möglich ist. Zum Erreichen solcher Empfindlichkeiten ist die weit-gehende Minimierung von Suppressionseffekten und damit die Verwendung von DHB als MALDI-Matrix eine notwendige Voraussetzung. Eine Evaluierungsstudie mit vier verschiedenen Proteinen führt zum Schluss, dass die Metho-dik auch für die de novo Sequenzierung unbekannter Proteine ein hohes Potential birgt. Die ermittelte Sequenzabdeckung der überlappenden Spaltfragmente lag bei maximal 80%. Im Bereich prolinhaltiger Sequenzabschnitte fehlen Überlappungen dabei am häufigsten, da auf Seiten der N-terminalen Sequenzierung geeignete Exopeptidasen zu Spaltung der Iminbindung nicht verfügbar waren. Zur Herstellung von Oligonucleotidsequenzen, die dann als Hybridisierungssonden in der Nucleinsäureanalytik eingesetzt werden, ist die Länge der erhaltenen Sequenzabschnitte jedoch in fast allen Fällen ausreichend. Die Methoden „MALDI-LS 1.42s“ für die Probenpräparation mit dem Pipettierroboter MultiPROBE II, sowie „multiprobe_5“ für die MALDI-MS Messung mittels AutoXecute auf dem Bruker Reflex III Massenspektrometer, erlauben eine Umsetzung der manuell ausgear-beiteten Methodik auf ein vollständig automatisiertes System. Eine Excel-Tabellenvorlage, die in konvertierter Form von beiden beteiligten Geräten gelesen werden kann, ermöglicht eine zentrale und einfache Dateneingabe für die Proben. Diese Art der Dateneingabe erlaubt im Zusammenspiel mit dem ausgearbeitetem Automatisierungspro-gramm eine vollkommen flexible, individuelle Behandlung der einzelnen Proben. Die erfor-derliche „Ortspräzision“ bei der Abgabe der Flüssigleiten auf dem MALDI-Target konnte durch eine entsprechenden ausgelegte Performance-Datei für den Pipettiervorgang erreicht werden. Querkontaminationen beim Pipettieren wurden durch organische Spülschritte in der Methode eliminiert. In der Summe lieferten die auf dem automatischen Pipettiersystem mit der Methode MALDI-LS 1.42s präparierten Proben im Massenspektrum vergleichbare Abbauspektren und somit auch die gleiche Sequenzinformation, wie entsprechend manuell präparierte Proben. Bei den automatischen MALDI-MS Messungen war eine Anpassung der Parameter insbeson-dere aufgrund der bevorzugten Verwendung der DHB-Matrix notwendig. Ein erhöhter Aceto-nitrilgehalt von 50% im Lösungsmittel der DHB sorgte für eine Verbesserung der Präparation im Bezug auf die automatische AutoXecute Messung. Mit speziellen Rasterkoordinaten, die bei der Laserabtastung der einzelnen Probenspots auf die besonderen Kristallisationseigen-schaften der DHB-Matrix zugeschnitten wurden, konnten gute Ergebnisse erzielt werden. Vorteile zeigten die DHB-Präparationen, im Vergleich zu CHCA-Präparationen, in der Toleranz gegenüber geringfügigen Mengen von Puffersalzen, wie sie bei der enzymatischen Sequenzierung üblich sind. Die Toleranzschwelle für den Abbruch der automatischen Messung musste jedoch bei den enzymatisch sequenzierten Proben und Verwendung von DHB-Matrix im Vergleich zu Messungen salzfreier Peptidproben in CHCA-Matrix erhöht werden, was im Durchschnitt zu etwas längeren Messzeiten führte. Die in dieser Arbeit weiterentwickelten Methoden zur enzymatischen on-target Sequenzie-rung von Peptiden erlauben somit, in Verbindung mit den beschriebenen Hard- und Software-komponenten zur automatischen Probenpräparation und MALDI-MS Messung, deren Einsatz für eine schnelle Sequenzierung in der Proteinanalytik. Zusätzliche Verbesserungen könnten jedoch, bei entsprechender Verfügbarkeit, noch durch Exopeptidasen mit ergänzender Spaltungsspezifität (z.B. X-Pro Aminopeptidase, EC 3.4.11.9) erzielt werden. Auf Seiten der Automatisierung ergäben sich durch die ausschließliche Ver-wendung eines 96er oder 384er Mikrotiterplattenformat auf allen Geräten (Pipettierrobot und MALDI-MS) deutliche Vereinfachungen in der Methode, bei gleichzeitig noch höherem Probendurchsatz.

Wed, 1 Jan 1969 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/9453/1/9453.pdf Werle, Eugen; Hochstrasser, Karl; Gebhardt, Maria; Fink, Edwin; Fritz, Hans