Podcasts about melanozyten

Die Einnahme oraler Kontrazeptiva kann zu unerwünschten Pigmentveränderungen an der Haut, auch Melasma genannt, führen. Histologische Kennzeichen von Melasma sind eine epidermale Hyperpigmentierung, ein Anstieg melanogener Enzyme und ein Anstieg der Melanozytenzahl. Pathophysiologisch bedeutsam ist, dass Melanozyten sowohl Östrogen- als auch Progesteron-Rezeptoren besitzen. Für die Entstehung des Melasma durch Kontrazeptiva werden vor allem die erhöhten Östrogen-Spiegel im Serum der Patientinnen verantwortlich gemacht. Orale Kontrazeptiva enthalten in der Regel eine Kombination aus synthetischen Derivaten der natürlichen weiblichen Geschlechtshormone, nämlich aus einem Östrogen (Ethinylestradiol) und einem Gestagen (Progesteron bzw. synthetische Gestagene). Bei der retrospektiven Auswertung einer Zulassungsstudie eines oralen Kontrazeptivums mit den Inhaltsstoffen Ethinylestradiol und Chlormadinonacetat wurde die Beobachtung gemacht, dass unter Anwenderinnen des Studienpräparates die Prävalenz von Melasma deutlich geringer war als unter Einnahme anderer Kontrazeptiva vor Studienbeginn. Da sich die Kontrazeptiva untereinander nicht im Östrogen-, aber im Gestagen-Anteil unterscheiden, wurde vermutet, dass Chlormadinonacetat im Gegensatz zu anderen Gestagenen eine hemmende Wirkung auf die Östrogen-vermittelte Entstehung von Melasma haben könnte. Um diese Hypothese experimentell zu untermauern, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, wie sich humane Melanozyten in vitro unter Stimulation mit Östrogen und Gestagenen verhalten. Hierfür wurden primäre Melanozyten aus menschlichen Hautgeweben unterschiedlicher Spender isoliert und in Kultur gebracht. Die Melanozytenkulturen wurden unterschiedlichen Konzentrationen von Ethinylestradiol und Progesteron beziehungsweise Chlormadinonacetat ausgesetzt. Die Zellvitalität wurde mittels eines fluorimetrischen Assays ausgewertet und die Pigmentbildungsaktivität mit Hilfe eines 3H-Tyrosin-Assays bestimmt. Darüber hinaus wurden die Melanozyten in einigen Versuchsreihen zusätzlich mit ultraviolettem Licht aus dem UVA- und UVB-Bereich bestrahlt, da das Auftreten von Melasma vornehmlich in sonnenexponierten Hautarealen beobachtet wird. Es konnte gezeigt werden, dass Östrogen mit spenderabhängigen Unterschieden eine wachstumsstimulierende und eine pigmentbildungsfördernde Wirkung auf Melanozyten hatte. Sowohl Progesteron als auch Chlormadinonacetat hemmten die wachstumsstimulierenden Effekte von Östrogen, während sie keinen Einfluss auf die Pigmentbildungsaktivität hatten. Daraus ließ sich schlussfolgern, dass Chlormadinonacetat möglicherweise durch Hemmung der Proliferation den Melanozyten-aktivierenden Einflüssen von Östrogen entgegenwirkt, was in der Praxis mit einer geringeren Inzidenz von Kontrazeptiva-assoziierten Pigmentveränderungen einhergeht. Dies würde wiederum bedeuten, dass der Gestagen-Anteil in einem oralen Kontrazeptivum entscheidend ist für die Häufigkeit des Auftretens von Melasma.

Nab2 ist in Melanomen und Melanomzelllinien im Vergleich zu Melanozyten und benignen Nävi stark überexprimiert. Durch Stimulation mit Wachstumsfaktoren oder Phorbolester kann Nab2 außerdem in allen Geweben und Zelllinien transient induziert werden. Die Expressionskinetik folgt dabei der eines delayed early response-Gens. Das Nab2-Protein ist ein transkriptioneller Korepressor der für die Wachstums- und Differenzierungsregulation wichtigen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren Egr1, Egr2 und Egr3. Das sind immediate early response-Gene, die durch die selben Stimuli induziert werden wie Nab2. Nach Stimulation wird die Expression von Egr deswegen grundsätzlich von einem Anstieg der Nab2-Expression gefolgt. Nab2 ist deswegen wahrscheinlich der wichtigste Repressor der Egr-Aktivität und verhindert eine übermäßige Stimulation von Egr-Zielgenen. Ziel dieser Arbeit war es, die regulatorischen DNS-Abschnitte des Nab2-Gens zu isolieren und genau zu charakterisieren. Am Nab2-Promotor sollten dann die Ursachen für die Überexpression im Melanom untersucht und der Mechanismus der Nab2-Induktion nach Stimulation identifiziert werden. Dazu wurde die genomische Nab2-DNS in einer humanen DNS-Bibliothek durch DNS-Hybridisierung identifiziert und daraus isoliert. So konnte ein 7.391 bp langes DNS-Fragment kloniert werden, das 1.845 bp der 5´-untranslatierten Region sowie die gesamte, aus 7 Exons aufgebaute proteinkodierende Nab2-Sequenz enthält. Durch in silico Analysen der 5´-untranslatierten Region konnten eine putative Promotorregion von Position -705 bis -82 (+1 = Adenin des Startkodons), eine CpG Insel von Position -876 bis +82 aber keine klassischen Kernpromotorelemente wie eine TATA-Box oder ein Inr-Element identifiziert werden. Der Nab2-Promotor gehört deshalb zur Klasse der TATA- und Inr-losen CpG-Insel-Promotoren. Durch eine Kombination aus EST- und cDNS-Kartierungen sowie Primerextensionsversuchen konnte ein sehr großes Transkriptionsstartareal identifiziert werden, das sich von Position -366 bis -96 erstreckt. Um funktionelle Studien mit der 5´-untranslatierten Nab2-Region durchzuführen wurden 17 verschiedene 5´-verkürzte Abschnitte daraus in Luziferase-Reportervektoren kloniert und deren transkriptionelle Aktivität in verschiedenen Zelllinien untersucht. Für das Erreichen der maximalen Promotoraktivität (ca. dem 400fachen der Aktivität des Leervektors) war der Sequenzabschnitt stromabwärts von Position -679 ausreichend. Ab Position -58 war dann keine Promotoraktivität mehr detektierbar. Der Nab2-Promotor erstreckt sich also von Position -679 bis -58. Der Kernpromotor konnte aufgrund der Lokalisation der Transkriptionsstartpunkte (-366 bis -96) und des 3´-Endes des Promotors (-58) zwischen Position -366 und -58 eingegrenzt werden. Die sehr hohe Aktivität des gesamten Nab2-Promotors wird durch die aktivierende Region von Position -679 bis -263 hervorgerufen. Durch diesen DNS-Abschnitt steigt die Aktivität vom 15- bis 30fachen auf das ca. 400fache der Aktivität des Leervektors. In dieser positiven regulatorischen Region konnten 10 putative Sp1-Bindestellen identifiziert werden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit zu dem Aktivitätszuwachs beitragen. Um die Ursache der Überexpression von Nab2 in Melanomzelllinien zu Untersuchen, wurde die Aktivität der Nab2-Reporterkonstrukte in Melanomzelllinien, die Nab2 überexprimieren, und in Karzinomzelllinien, die nur wenig Nab2 exprimieren, verglichen. Die Reporterkonstukte zeigten jedoch in Melanom- und Karzinomzelllinien ungefähr die gleiche Aktivität. Die Ursache für die Überexpression in Melanomzelllininen konnte durch diese Versuche nicht identifiziert werden. Schließlich wurde die Aktivität der Reporterkonstrukte in unstimulierten und PMA stimulierten Zellen verglichen. Durch die PMA-Stimulation stieg die Aktivität des Nab2-Promotors auf das ca. 3fache der Basalaktivität an. Die gesteigerte Nab2-Expression nach Stimulation wird demnach auf der Transkriptionsebene reguliert. Anhand der Verkürzungskonstrukte konnte ein 19 bp langer DNS-Abschnitt zwischen Position -232 und -213 identifiziert werden, der diesen Anstieg der Promotoraktivität nach Stimulation hervorruft. In diesem Abschnitt liegen je eine Egr1- und Sp1-Bindestelle, die sich teilweise überlappen. Bei Kotransfektion eines Egr1-Expressionsvektors mit den Nab2-Reporterkonstrukten konnte ein Aktivitätsanstieg vergleichbarer Größenordnung wie durch PMA-Stimulation beobachtet werden. Wurde die Egr1-Bindestelle an Position -222 durch Mutation inaktiviert, so nahm die Induzierbarkeit des Nab2-Promotors durch PMA um 35-50% und durch Egr1-Kotransfektion um 64-73% ab. Diese Daten zeigen, dass Egr1 alleine in der Lage ist, den Nab2-Promotor maximal zu aktivieren und dass dieser Effekt vorwiegend über die Egr1-Bindestelle an Position -222 vermittelt wird. Weil der Promotor aber nach der Inaktivierung der Egr1-Bindestelle an Position -222 noch durch PMA und durch Egr1-Kotransfektion aktivierbar ist, sind weitere Egr1-Bindestellen und womöglich noch andere Transkriptionsfaktoren an der Aktivierung beteiligt. Diese Daten zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Egr1 seinen eigenen Korepressor Nab2 induziert. Funktionell liegt also ein negativer Rückkoppelungs-Mechanismus vor, der eine überschießende Egr1-Aktivität verhindert.

Mit speziell angefertigten cDNA-Makro-Arrays wurden Melanomzelllinien und kulti-vierte Melanozyten auf die transkriptionelle Aktivität von Genen untersucht, welche bekannterweise bei der zellulären Signaltransduktion von Bedeutung sind. Zur Analyse der daraus erhaltenen Daten wurde das Computer-Programm "GeneFish" geschrieben, welches auch für zukünftige, ähnliche Fragestellungen in anderen Systemen verwendbar ist. Mit Hilfe dieses Programmes wurde gefunden, dass bei ADAM-9, ADAM-10, HER3, FAK, SHC und dem IGF-1-Rezeptor die Unterschiede der Expression zwischen Melanomzelllinien und Melanozyten besonders ausgeprägt waren. Bei weiteren Genen wurden schwächer ausgeprägte, jedoch ebenfalls interessante Expressionsmuster beobachtet. Die Rolle von HER3 wurde durch Einführung einer dominant negativ wirkenden Mutante von HER3 in Melanomzelllinien weitergehend untersucht. Bei Verwendung eines konstitutiv exprimierenden Expressionssystems starben die transgenen Zellen, was einem lethalen Effekt der Mutante zugeschrieben wurde. Mit einem induzierbaren Expressionssystem wurden Zellklone erhalten, die veränderte biologische Eigenschaften aufwiesen, welche jedoch unabhängig von der Expression des Transgens waren. Trotz dieser technischen Schwierigkeit bleibt HER3 eines der vielversprechendsten Gene für die künftige Forschung an Melanomen.