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Nab2 ist in Melanomen und Melanomzelllinien im Vergleich zu Melanozyten und benignen Nävi stark überexprimiert. Durch Stimulation mit Wachstumsfaktoren oder Phorbolester kann Nab2 außerdem in allen Geweben und Zelllinien transient induziert werden. Die Expressionskinetik folgt dabei der eines delayed early response-Gens. Das Nab2-Protein ist ein transkriptioneller Korepressor der für die Wachstums- und Differenzierungsregulation wichtigen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren Egr1, Egr2 und Egr3. Das sind immediate early response-Gene, die durch die selben Stimuli induziert werden wie Nab2. Nach Stimulation wird die Expression von Egr deswegen grundsätzlich von einem Anstieg der Nab2-Expression gefolgt. Nab2 ist deswegen wahrscheinlich der wichtigste Repressor der Egr-Aktivität und verhindert eine übermäßige Stimulation von Egr-Zielgenen. Ziel dieser Arbeit war es, die regulatorischen DNS-Abschnitte des Nab2-Gens zu isolieren und genau zu charakterisieren. Am Nab2-Promotor sollten dann die Ursachen für die Überexpression im Melanom untersucht und der Mechanismus der Nab2-Induktion nach Stimulation identifiziert werden. Dazu wurde die genomische Nab2-DNS in einer humanen DNS-Bibliothek durch DNS-Hybridisierung identifiziert und daraus isoliert. So konnte ein 7.391 bp langes DNS-Fragment kloniert werden, das 1.845 bp der 5´-untranslatierten Region sowie die gesamte, aus 7 Exons aufgebaute proteinkodierende Nab2-Sequenz enthält. Durch in silico Analysen der 5´-untranslatierten Region konnten eine putative Promotorregion von Position -705 bis -82 (+1 = Adenin des Startkodons), eine CpG Insel von Position -876 bis +82 aber keine klassischen Kernpromotorelemente wie eine TATA-Box oder ein Inr-Element identifiziert werden. Der Nab2-Promotor gehört deshalb zur Klasse der TATA- und Inr-losen CpG-Insel-Promotoren. Durch eine Kombination aus EST- und cDNS-Kartierungen sowie Primerextensionsversuchen konnte ein sehr großes Transkriptionsstartareal identifiziert werden, das sich von Position -366 bis -96 erstreckt. Um funktionelle Studien mit der 5´-untranslatierten Nab2-Region durchzuführen wurden 17 verschiedene 5´-verkürzte Abschnitte daraus in Luziferase-Reportervektoren kloniert und deren transkriptionelle Aktivität in verschiedenen Zelllinien untersucht. Für das Erreichen der maximalen Promotoraktivität (ca. dem 400fachen der Aktivität des Leervektors) war der Sequenzabschnitt stromabwärts von Position -679 ausreichend. Ab Position -58 war dann keine Promotoraktivität mehr detektierbar. Der Nab2-Promotor erstreckt sich also von Position -679 bis -58. Der Kernpromotor konnte aufgrund der Lokalisation der Transkriptionsstartpunkte (-366 bis -96) und des 3´-Endes des Promotors (-58) zwischen Position -366 und -58 eingegrenzt werden. Die sehr hohe Aktivität des gesamten Nab2-Promotors wird durch die aktivierende Region von Position -679 bis -263 hervorgerufen. Durch diesen DNS-Abschnitt steigt die Aktivität vom 15- bis 30fachen auf das ca. 400fache der Aktivität des Leervektors. In dieser positiven regulatorischen Region konnten 10 putative Sp1-Bindestellen identifiziert werden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit zu dem Aktivitätszuwachs beitragen. Um die Ursache der Überexpression von Nab2 in Melanomzelllinien zu Untersuchen, wurde die Aktivität der Nab2-Reporterkonstrukte in Melanomzelllinien, die Nab2 überexprimieren, und in Karzinomzelllinien, die nur wenig Nab2 exprimieren, verglichen. Die Reporterkonstukte zeigten jedoch in Melanom- und Karzinomzelllinien ungefähr die gleiche Aktivität. Die Ursache für die Überexpression in Melanomzelllininen konnte durch diese Versuche nicht identifiziert werden. Schließlich wurde die Aktivität der Reporterkonstrukte in unstimulierten und PMA stimulierten Zellen verglichen. Durch die PMA-Stimulation stieg die Aktivität des Nab2-Promotors auf das ca. 3fache der Basalaktivität an. Die gesteigerte Nab2-Expression nach Stimulation wird demnach auf der Transkriptionsebene reguliert. Anhand der Verkürzungskonstrukte konnte ein 19 bp langer DNS-Abschnitt zwischen Position -232 und -213 identifiziert werden, der diesen Anstieg der Promotoraktivität nach Stimulation hervorruft. In diesem Abschnitt liegen je eine Egr1- und Sp1-Bindestelle, die sich teilweise überlappen. Bei Kotransfektion eines Egr1-Expressionsvektors mit den Nab2-Reporterkonstrukten konnte ein Aktivitätsanstieg vergleichbarer Größenordnung wie durch PMA-Stimulation beobachtet werden. Wurde die Egr1-Bindestelle an Position -222 durch Mutation inaktiviert, so nahm die Induzierbarkeit des Nab2-Promotors durch PMA um 35-50% und durch Egr1-Kotransfektion um 64-73% ab. Diese Daten zeigen, dass Egr1 alleine in der Lage ist, den Nab2-Promotor maximal zu aktivieren und dass dieser Effekt vorwiegend über die Egr1-Bindestelle an Position -222 vermittelt wird. Weil der Promotor aber nach der Inaktivierung der Egr1-Bindestelle an Position -222 noch durch PMA und durch Egr1-Kotransfektion aktivierbar ist, sind weitere Egr1-Bindestellen und womöglich noch andere Transkriptionsfaktoren an der Aktivierung beteiligt. Diese Daten zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Egr1 seinen eigenen Korepressor Nab2 induziert. Funktionell liegt also ein negativer Rückkoppelungs-Mechanismus vor, der eine überschießende Egr1-Aktivität verhindert.

Plasma-Kallikrein (PK) ist eine Serinprotease, die als inaktives Zymogen Plasma- Prokallikrein (PPK) in der Leber gebildet und in den Blutstrom sezerniert wird. Dort erfolgt die Konvertierung zum aktiven Enzym im Kontaktphasen-System der Blutgerinnung. Neben der Funktion im Kontakt-System spielt diese Protease sowohl in der Fibrinolyse als auch im Kallikrein-Kinin-System eine zentrale Rolle. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PPKmRNA auch außerhalb der Leber exprimiert wird. Daraus ist zu schließen, dass dort ebenfalls PPK-Protein gebildet wird und dass diesem extrahepatischen, gewebeständigen PPK bzw. PK spezielle lokale Funktionen zukommen. Dieser Befund bildet die Grundlage dieser Dissertation. Mit dem langfristigen Ziel die physiologische und pathophysiologische Rolle des extrahepatisch gebildeten PPK aufzuklären, sollte in dieser Arbeit zunächst mittels einer quantitativen PCR-Technik (TaqMan) untersucht werden, in welchem Umfang PPK-mRNA und die mRNAs der übrigen Komponenten des Kontaktphasen-Systems in humanen Zellen bzw. Geweben exprimiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht werden, ob bzw. inwieweit das PPK-Gen gewebespezifisch reguliert werden kann. Hierzu sollten die regulatorisch bedeutsamen Regionen des PPK-Gens charakterisiert werden. Mittels der TaqMan-Technologie konnte die PPK-mRNA-Expression in allen untersuchten humanen Geweben quantifiziert werden. In neun Geweben liegt die mRNA-Expression im Vergleich zur Leber zwischen 1 % und 68 % und in sechs Geweben zwischen 0,1 % und 1 %. Diese Ergebnisse sprechen für eine ubiquitäre, aber teils sehr unterschiedliche Expression der PPK-mRNA in humanen Geweben. Die mRNAs von hochmolekularem Kininogen (HK), niedermolekularem Kininogen (LK), Faktor XI (FXI) und Faktor XII (FXII) werden dagegen nur in wenigen Geweben exprimiert. Die Transkripte von HK, LK und FXI findet man außerhalb der Leber nur noch in Nierengewebe in signifikanter Menge, während FXII-mRNA nahezu ausschließlich in der Leber synthetisiert wird. Ein gemeinsames Merkmal aller Transkripte ist, dass sie in Lebergewebe am stärksten expimiert werden. Zellstimulationsversuche mit HepG2-Zellen ergaben, dass die PPK-mRNA-Synthese mittels Lipopolysacchariden (LPS) kurzfristig induziert werden kann, was für eine wesentliche Funktion von PPK bzw. PK bei Entzündungsreaktionen spricht. Im Gegensatz hierzu bewirkt Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eine Herabregulation der PPK-Transkription. Untersuchungen zur Stabilität der mRNAs von PPK und dem Haushaltsgen GAPDH mit den Transkriptionsinhibitoren Actinomycin D, α-Amanitin und DRB zeigten, dass die mRNAAbbaurate in HepG2-Zellen vom jeweils eingesetzten Transkriptionsinhibitor abhängt. Bei allen Transkriptionsinhibitoren wurde das PPK-Transkript im Vergleich zu GAPDH deutlich schneller (Faktor 3-5) abgebaut. Dies weist darauf hin, dass die PPK-mRNA-Spiegel in den Zellen durch ständige Neusynthese aufrechterhalten werden, um eine kontinuierliche Produktion von PPK zu gewährleisten. Mittels der RLM-RACE Methode wurden in Leber-, Pankreas-, Nieren- und Testisgewebe die PPK-Transkriptionsstartpunkte (TS) identifiziert. Während in der Leber und im Pankreas nur TSs in Exon 1 des PPK-Gens benutzt werden, findet man in Nieren- und Testisgewebe TSs sowohl in der upstream-Region als auch in Intron 1. Weiterhin wurden in Nierengewebe drei am 5´-Ende verkürzte PPK-Transkripte detektiert, die aufgrund dieser Deletion keine Signalpeptid- Sequenz enthalten und dadurch eine intrazelluläre Lokalisation der entsprechenden PPK-Isoform bedingen. Die Consensussequenz-Analyse für die Transkriptionsinitiation zeigt, dass jedem experimentell ermittelten Transkriptionsstart eine TATA-Box oder/und ein Initiator-Element assoziiert ist. Außerdem konnte durch die RLM-RACE-Analysen die Existenz eines weiteren untranslatierten Exons im 5´-Bereich des PPK-Gens ausgeschlossen werden. Unter Anwendung der Genome Walker Technik wurde die Promotorregion (P-1729) stromaufwärts von Exon 1 kloniert und mittels Reportergen-Studien analysiert. In HepG2-Zellen zeigt dieses Gensegment eindeutig transkriptionsaktivierende Kapazität. Durch die Generierung von neun Verkürzungsvarianten konnten der Core-Promotor (-158 bis +22), Enhancerbereiche (-1675 bis -1494) und Silencerregionen (-1304 bis -674) charakterisiert werden. Die Transkriptionsfaktoren-Analyse ergab, dass bei der Regulation durch die P-1729 Region neben ubiquitär exprimierten auch streng gewebespezifische Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle spielen. Reportergen-Untersuchungen des Intron-1-Bereichs in HEK 293-Zellen zeigten, dass auch diese Region des PPK-Gens transkriptionsaktivierende Kapazität besitzt. Ebenso zeigt aber auch der P-1729 Bereich in HEK 293-Zellen Promotoraktivität. Somit können innerhalb eines Zelltyps beide Promotorbereiche funktionell aktiv sein, wodurch eine alternative Regulation der PPK-Transkription ermöglicht wird.

Biochemische Untersuchungen beschreiben NC2 als einen Transkriptionsrepressor, welcher stabil an das TATA-Box bindende Protein (TBP) bindet. Die spezifische Bindung von NC2 an TBP inhibiert die weitere Anlagerung der generellen Transkriptionsfaktoren TFIIA und TFIIB und führt dadurch zur Unterbrechung der Bildung des Initiationskomplexes. NC2 besteht aus zwei Untereinheiten, NC2a und NC2b, die starke Homologien zu den Histonen H2A bzw. H2B aufweisen. Alle Erkenntnisse zu Beginn dieser Arbeit basierten auf Beobachtungen, die in vitro erhalten wurden. Unklar sind die Funktionen von NC2 in der Zelle. Die Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, ein in vivo-Modellsystem zu etablieren. Als Modellorganismus wurde die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt. Hefe hat zwei Proteine, die stark homolog zum menschlichen NC2 sind. Beide sind essentiell für das vegetative Wachstum von Hefe. Für Plasmid-Austausch-Experimente wurden Hefestämme konstruiert, bei denen die chromosomalen Gene für NC2a und NC2b durch Wildtyp-Kopien auf einem URA3-Plasmid ersetzt wurden. Mit Hilfe einer negativen Selektion gegen das URA3-Gen in Anwesenheit von 5-FOA gelang es, die humanen NC2a- und NC2b-Gene als episomale Kopien in Hefe stabil einzubringen. So zeigte sich unter anderem, daß die beiden humanen NC2-Untereinheiten, sowohl einzeln in Kombination mit ihrem Dimerisierungspartner aus Hefe als auch gemeinsam in Form des menschlichen binären Komplexes, fähig waren, die physiologische Funktion ihres Gegenstückes aus Hefe zu übernehmen. Das gleiche System wurde auch eingesetzt, um Deletionsmutanten der humanen NC2-Gene in vivo zu untersuchen. Es wurde festgestellt, daß in beiden NC2-Untereinheiten die Domänen, welche für die in vivo-Funktion notwendig sind, die vom Mensch zur Hefe konservierten Regionen enthalten. Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit bestand darin, spontane Suppressoren einer limitierenden NC2-Funktion in vivo zu isolieren und Suppressoren mit genomischen Punktmutationen zu charakterisieren. Gefunden wurde eine Punktmutation in der großen Untereinheit (Toa1) des Hefe-TFIIA, welche einen einzigen Aminosäure-Austausch von Valin zu Phenylalanin verursacht. Hefezellen, die diese Suppressor-Mutation in Toa1 (mt- Toa1) tragen, weisen einen Kälte-sensitiven Phänotyp auf und sind trotz fehlender NC2-Gene lebensfähig. Die biochemischen Eigenschaften des rekombinanten Proteins der Suppressor-Mutante wurden durch Gelretardations-, Footprinting- und in vitro Transkriptionsexperimente untersucht. Das Protein mt-Toa1 war in der Lage, stabile TFIIA-Komplexe zusammen mit der kleinen Untereinheit Toa2 auszubilden und die Rekrutierung von TBP an die TATA-Box auf dem Promotor zu unterstützen. Allerdings zeigten weitere Untersuchungen der Suppressor-Mutante, daß der ternäre Komplex aus mt-yTFIIA, TBP und DNA weniger stabil ist. Hinweise darauf gab die reduzierte Menge an Protein-DNA-Komplexen im Fall von mtyTFIIA in Gelretardationsexperimenten unter sättigenden Bedingungen. Das mt-yTFIIA verlor zugleich seine Antirepressionsaktivität in in vivo-Transkriptionsexperimenten in Anwesenheit von NC2. Die Isolierung und Charakterisierung der Suppressor-Mutante von NC2 lieferten zum ersten Mal den Beweis, daß die Genregulation in vivo eine präzise Balance zwischen positiv und negativ wirkenden Aktivitäten erfordert. Gleichzeitig bestätigen sie die in vitro Beobachtungen, insbesondere das Gleichgewicht zwischen TFIIA und NC2 in der Kompetition um das TATA-bindende Protein TBP. Eine weitere Aufgabe der Arbeit waren Mutagenese-Studien von humanem NC2 in vivo und in vitro. Innerhalb des Histone-Fold-Motives beider NC2-Untereinheiten wurden Punktmutanten isoliert, die ihre essentielle Funktion in der Hefezelle vollständig verloren haben. Es konnten Mutanten identifiziert werden, die Einfluß auf das Wachstum der Hefe mit dem Verlust der in vitro-Aktivität korrelierten. Die Charakterisierung dieser Mutanten lieferte erste Hinweise auf funktionelle Oberflächen von NC2, die für die ternäre Komplexbildung (NC2-TBP-DNA) und die Repressionsfunktion wichtig sind. Zusammengefaßt schafft die vorliegende Arbeit einen Einblick in die NC2-Funktion in der Zelle und erweitert unser Verständnis über den molekularen Mechanismus der Transkriptionsregulation während der Initiation der Klasse II-Transkription.