Podcasts about transgens

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.

Im Zellkern einer jeden Zelle besteht eine gewisse Ordnung der darin vorhandenen DNA und Proteine. Diese Ordnung wird unter dem Begriff „Zellkernarchitektur“ zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit ging es um die nähere Betrachtung einiger Aspekte der Zellkernarchitektur. Diese Aspekte betrafen 1. die Anordnung von Genen, 2. die Anordnung von Chromatin mit Hilfe unterschiedlicher Histonmodifikationen und 3. die Anordnungen von Chromosomenabschnitten, die mit komplexen messenger RNA-Sonden hybridisiert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mittels 3D FISH die dreidimensionale Positionierung von drei auf dem Chromosom 1 lokalisierten Genen in Zellkernen der Burkitt- Lymphom Zelllinie DG75 bestimmt. Diese Zelllinie wurde von Stefan Bohlander zur Verfügung gestellt und enthielt einen induzierbaren episomalen Vektor für das CALM-AF 10 Gen. Messungen der Genexpression, die in der Bohlander Gruppe mit Hilfe eines Affymetrix- Chips durchgeführt wurden, zeigten das die Induktion des Transgens zu genomweiten Veränderungen der Expressionsmuster hunderter Gene in dieser Zelllinie führten. Die für die 3D FISH Experimente ausgewählten Markergene zeigten nach der Induktion eine signifikant veränderte Expression. Dennoch änderte sich die radiale Positionierung dieser Gene, darunter versteht man die mehr innere oder mehr periphere Position der Gene, nicht. Dieses Ergebnis schien zuerst darauf hinzuweisen, dass die Transkriptionsstärke keine bedeutsamer Faktor im Hinblick auf die radiale Positionierung ist. Die Befunde der Affymetrix-Chip Analyse für diese Gene konnten jedoch in einer anschließende Untersuchungen der Genexpression mit Real-Time-PCR nicht bestätigt werden, obwohl der Vergleich von Affymetrix-Chip und Real- Time-PCR Daten insgesamt eine klare Korrelation zwischen den Datensätzen zeigte. Bei Diskrepanzen gehen wir davon aus, dass Real-Time-PCR die zuverlässigeren Ergebnisse liefert. Bei der hier durchgeführten Real-Time-PCR Untersuchung wurden auch die Expressionsstärken aller in einer Nachbarschaft von etwa 1 Mbp um die Markergene annotierten Gene ermittelt. Dieses Fenster wurde gewählt, weil Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Thomas Cremer und anderen Gruppen gezeigt haben, dass ~1 Mbp Chromatindomänen die Basisstruktur der Chromatinorganisation darstellen. Als Maß für die gesamte Genexpression einer Chromatindomäne wurde eine „Total Expression Strength“ (TES) berechnet. Dieser Wert basiert auf den Real-Time-PCR Werten der annotierten Gene und berücksichtigt auch die Länge der ungespleissten RNA, die von einem Gen transkribiert wird. Dabei zeigte sich, dass das Markergen in der Domäne mit dem höchsten TES Wert am weitesten innen im Zellkern lokalisiert ist. Dieser Befund unterstützt Befunde aus der wissenschaftlichen Literatur, dass die radiale Positionierung von individuellen Genen von Eigenschaften der lokalen Umgebung abhängt. Da sich die Nachbarschaft der untersuchten Markergene nicht nur im Hinblick auf die TES Werte sondern auch im Hinblick auf die Dichte der dort annotierten Gene und den GC-Gehalt unterscheidet, bleibt offen, welcher dieser Parameter als Prädiktor für die zu erwartende radiale Position individueller Gene eine entscheidende Rolle spielt. Möglich ist auch, dass alle Parameter zusammenwirken oder dass je nach den speziellen Umständen einer Untersuchung verschiedene Parameter die radiale Positionierung eines Gens bevorzugt beeinflussen. Die Stabilität der radialen Positionierung der Markergene trotz einer genomweiten Veränderung des Genexpressionsmusters nach CALM-AF 10 Induktion stimmt mit Befunden verschiedener Arbeitsgruppe überein, die für einen hohen Grad an räumlicher Stabilität der Chromatinanordnung während der Interphase sprechen; ~1 Mbp Chromatindomänen zeigen dementsprechend meist nur sehr begrenzte lokale Bewergungen (

HINTERGRUND: Krebserkrankungen sind nach kardiovaskulären Erkrankungen die zweithäufigste Krankheitsgruppe überhaupt in der Medizin. Nach dem aktuellen Stand der Forschung entstehen Tumoren durch Fehlregulation von Proliferation und Differenzierung einzelner Zellen. Diese Vorgänge können in Tiermodellen nachgebildet werden. Eine besonders hohe Aussagekraft haben dabei Tiermodelle, bei denen durch Verwendung eines hybriden Onkogens spontan ein Tumor entsteht. Ein hybrides Onkogen ist aus einem organspezifischen Promotor und einem bekannten Onkogen zusammengesetzt und führt zur Tumorentwicklung in einem bestimmten Organ. Ein Beispiel hierfür sind CEA424/SV 40 large T-Antigen – transgene Mäuse, sie entwickeln reproduzierbar einen Tumor im Antrum des Magens. ZIELSETZUNG: An diesem Tiermodell sollten die Faktoren der organselektiven Entwicklung des Tumors aufgeklärt werden. Hypothesen hierzu waren einerseits, dass dies durch die Integration des Transgens verursacht ist, andererseits, dass im betroffenen Organ spezifische Stimulatoren wirken. Zudem sollte auf der Grundlage von Genexpressionsdaten der Phänotyp der Tumorzellen identifiziert werden. METHODEN: Zunächst wurde mit Walking-PCR die Integrationsstelle identifiziert. Darüber hinaus wurde mit RT-PCR gezielt die Expression von Genen untersucht, welche an der Regulation von Proliferation und Differenzierung des Magens beteiligt sind. Mikroarray-Analysen und ihre computergestützte Auswertung dienten zudem zur Erstellung von Genexpressionsprofilen für verschiedene Zeitpunkte der Tumorentwicklung. ERGEBNISSE: Das Transgen wurde auf dem Chromosom 4 der transgenen Mäuse lokalisiert. Ein Einfluss der Integrationsstelle auf die organspezifische Tumorentstehung konnte dabei nicht gesehen werden. Die Genexpressionsanalyse ergab, dass im Verlauf der Tumorentwicklung die Wnt-Signalkaskade hochreguliert ist. Dieser Signalweg ist als wichtiger Stimulator der Proliferation vor allem in Stammzellmilieus des Gastrointestinaltraktes bekannt. Weiterhin zeigte sich für die Differenzierungsfaktoren Ihh, Notch1 und Pdx1 sowie für das Hormon Gastrin mit fortschreitender Tumorentwicklung eine verminderte Expression, was auf einen Verlust bestimmter Differenzierungswege im Tumorgewebe schließen lässt. In den Genexpressionsprofilen zeigte sich ein neuroendokriner Phänotyp der Tumorzellen.

Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse tragen aus dem Blickwinkel der Evolutionsbiologie zu unserem Verständnis der Regulation von Genexpression bei. Ich verwende einen bestens bekannten Modellorganismus, die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, nicht nur als Objekt der Beobachtung, sondern auch als ein genetisches Manipulationswerkzeug, und untersuche drei verschiedene Aspekte des Prozesses, durch den die in der DNA gespeicherte Information förmlich „entfesselt“ oder umgesetzt wird zu biologischem Sinn, letztlich also zu Form und Funktion. In Kapitel 1 zeige ich zunächst, dass eine Inaktivierung des X-Chromosomes (und somit Genregulation auf chromosomaler Ebene) in der männlichen Keimbahn von D. melanogaster stattfindet. Im Gegensatz zur X-Inaktivierung in weiblichen Säugetieren, wo dies in den somatischen Zellen als Mechanismus zur Dosiskompensation auftritt, ist diese Art der Inaktivierung auf die Spermatogenese beschränkt und wurde wahrscheinlich während der Genomevolution als eine Möglichkeit etabliert, schädliche Auswirkungen in Zusammenhang mit Sexualantagonismus zu umgehen. Durch P-Element-vermittelte Keimbahntransformation erhielt ich fast 50 unabhängige Insertionen eines testisspezifischen Reportergenkonstrukts und untersuchte die dazugehörigen Reportergenaktivitäten durch Messung der Enzymaktivität und durch quantitative RT-PCR. Autosomale Insertionen dieses Konstrukts zeigten das erwartete Muster hoher männchen- und testisspezifischer Expression. Insertionen auf dem X-Chromosom zeigten dagegen wenig bzw. gar keine Expression des Transgens. Da die X-chromosomalen Insertionen die euchromatischen Abschnitte des Chromosoms abdeckten (bestimmt durch inverse PCR), konnte eine systematische Bevorzugung bestimmter Regionen bei Insertionen, die ein Fehlen von Expression auf dem X-Chromosom hätte erklären können, ausgeschlossen werden. Der Effekt scheint eine globale Eigenschaft des X-Chromosomes zu sein. Lediglich die Testisspezifität des transgenen Konstrukts ist für das Erscheinen des Effekts erforderlich, was somit eine Selektionshypothese für die X-Inaktivierung erhärtet sowie einige Beobachtungen erklären könnte, die im Zusammenhang mit der Verteilung von im Männchen und Testis exprimierten Genen im Drosophila-Genom gemacht wurden. In Kapitel 2 untersuche ich dann mutmaßliche cis-regulatorische Sequenzen und ihr Vermögen, allelspezifische Genexpression zu steuern. Nachdem Microarray-Studien umfangreiche Variabilität im Primärmerkmal Genexpression in unterschiedlichsten Taxa aufgedeckt haben, ist eine naheliegende Frage, mit der sich Evolutionsbiologen konfrontiert sehen, die nach der dieser Variabilität zugrunde liegenden genetischen Quelle. Neben epigenetischen Mechanismen gibt es einen Disput darüber, ob regulatorische Sequenzen nahe des exprimierten Gens (cis-Faktoren) und anderswo im Genom kodierte Faktoren (trans-Faktoren) einen qualitativ und quantitativ unterschiedlichen Beitrag zur Variabilität der Genexpression liefern. Hierzu wählte ich ein Gen von D. melanogaster, das nachweislich konsistente Expressionsunterschiede zwischen afrikanischen und nicht-afrikanischen („kosmopolitischen“) Stämmen zeigt, und klonierte die entsprechenden stromaufwärts flankierend gelegenen Teile jeweils in ein bakterielles Reportergenkonstrukt, um – nach erfolgreicher Integration ins Fruchtfliegengenom – direkt die von ihnen gesteuerte Auswirkung auf die Genexpression zu vergleichen. Der beobachtete Effekt war klein, jedoch signifikant, und zeigte sich nur in transgenen Fliegen, die ein X-Chromosom des afrikanischen Ausgangsstammes besaßen. Dies legt den Schluss nahe, dass zusätzlich zu den cis-regulatorischen Faktoren auch noch trans-Faktoren (vor allem auf dem X-Chromosom) zu dem zwischen den Stämmen beobachteten Expressionsunterschied beitragen. Letztendlich untersuche ich in Kapitel 3 das Phänomen des Codon bias durch seinen Zusammenhang mit Genexpression. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes werden viele der proteinogenen Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert. Dies ermöglicht es, synonyme Codons in einer kodierenden Gensequenz auszutauschen, ohne dabei die Aminosäurensequenz des kodierten Polypeptids zu verändern. Ob dies Konsequenzen für die produzierte Proteinmenge hat (Translationseffizienz) ist Gegenstand dieses Kapitels. Ich verglich dabei die von zwei Allelen des Gens Alkoholdehydogenase (Adh) (von D. melanogaster) vermittelte Enzymaktivität direkt miteinander, welche sich in sieben Leucin-Codons unterschieden. Es ergab sich nahezu kein Unterschied in der ADH-Enzymaktivität, obwohl eines der Allele aus gänzlich optimalen Leucin-Codons bestand und das andere sieben suboptimale Leucin-Codons enthielt. Da Letzteres die Wildtypform von Adh war, legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass das Adh-Gen in seiner Leucin-Codonzusammensetzung (und vielleicht auch in seiner Codonzusammensetzung allgemein) bereits ausreichend optimiert ist. Weitere Versuche, die Zahl der optimalen Leucin-Codons zu erhöhen, können sogar einen Negativeffekt hinsichtlich der Enzymproduktion haben; dies möglicherweise aufgrund einer Sättigung des tRNA-Pools und/oder der Konsequenzen veränderter mRNA-Sekundärstrukturen.

Erkenntnisse zur funktionalen Zellkernarchitektur wurden bisher überwiegend an fixierten Zellen durch in situ Methoden erlangt. Durch Etablierung eines Lebendzell-Systems sollte überprüft werden, ob es möglich ist, ein einzelnes Transgen auf DNA-Ebene zu visualisieren und es bei seiner transkriptionellen Aktivierung zu beobachten. Das hier entwickelte „Gene Positioning System“ (GePS) nutzt das Lac-Operator/Lac-Repressor-GFP-System („Gene Tag“) als visualisierende Komponente, um das Indikatorgen auf DNA-Ebene sichtbar zu machen. Das Indikatorgen selbst basiert auf der induzierbaren Transkriptionseinheit von HIV-1, die spezifisch durch das virale Protein Tat aktiviert werden kann und die Transkription eines Reportergens (DsRed) kontrolliert. Im transient transfizierten Status konnte das Indikatorgen als Episom durch Bindung des „Gene Tags“ als punktförmiges Signal im Kern detektiert werden. In den etablierten und charakterisierten Zelllinien HeLa-Indi war dies durch Bindung des „Gene Tags“ an 64 Lac-Repressor-Bindungsstellen eines einzelnen Transgens nicht möglich. Die Etablierung der stabilen Zelllinien und die transiente Expression ermöglichten einen direkten Vergleich der Transkription von der integrierten und episomalen HIV-1 LTR. In beiden Fällen konnte eine spezifische Transkriptionsaktivierung durch Tat auf Protein- und RNA-Ebene beobachtet werden. Auch eine Tat-unabhängige Basisaktivität in Form von Volllänge-Transkripten konnte immer nachgewiesen werden, die in verschiedenen Zelllinien und dem episomalen Indikatorgen aber zu keiner nachweisbaren Proteinexpression führte. Die induzierte Expression des Indikatorgens des „GePS“ konnte darüber hinaus in wichtigen HIV-1 Zielzellen (CD4 positive Lymphozyten) gezeigt werden. Des Weiteren konnten Erkenntnisse über die Tat-induzierte, von der HIV-1 LTR ausgehenden Transkription und der Zusammenhang zum Spleißen gewonnen werden. Durch quantitative PCR wurde deutlich, dass sowohl im epsiomalen als auch integrierten Status erst durch die gesteigerte Transkription das Spleißen der Indikatorgen-RNA induziert wird, das Spleißen also co-transkriptionell stattfindet. Tat selbst spielt bei der Rekrutierung von Spleißfaktoren nur eine indirekte Rolle, da durch die transkriptionsdefiziente Mutante Tat(K41A) kein Spleißen initiiert wird. Durch verschiedene methodische Ansätze wurde versucht, die Frage der Chromatinzusammensetzung von nicht replizierenden Episomen in menschlichen Zellen zu beantworten. Weder durch eine Colokalisations-Untersuchung noch eine Chromatin IP konnte jedoch eine spezifische Assoziation des episomalen Indikatorgens mit dem Histon H3 nachgewiesen werden. Eine Bindung von Proteinen an die Episomen konnte am Beispiel von p50, einer Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκB, gezeigt werden. Für die produktive Replikation der Retroviren ist die Integration der proviralen DNA ins Genom der Wirtszelle nötig, jedoch konnte für HIV gezeigt werden, dass nicht integrierte zirkuläre HIV-DNA in sich nicht teilenden Zellen persistiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vermutung, dass nicht integrierte retrovirale DNA transkribiert werden kann und dadurch die exprimierten Proteine Bedeutung für den Lebenszyklus von HIV und durch ihre Persistenz Einfluss auf die Wirtszellen haben können.

Die ersten transgenen Tiere wurden durch viralen Gentransfer erzeugt. Für die initialen Versuche wurden prototypische Retroviren, wie der murine Leukämievirus (MuLV), verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, daß die proviralen Gene in diesen Mäusen stark methyliert waren und nicht oder nur in geringen Mengen exprimiert wurden ("gene silencing"). Ein Durchbruch für die virale Transgenese kam erst mit der Verwendung lentiviraler Vektoren. Lentiviren sind in der Lage eine Vielzahl verschiedener Zelllinien (auch terminal differenzierte Zellen) effizient zu transduzieren und ihre virale DNA stabil in das Wirts-Chromosom zu integrieren. Obwohl bereits transgene Nagetiere durch lentivirale Vektoren erzeugt werden konnten, waren initiale Versuche in höheren Säugetieren (Affen) nicht erfolgreich. Dies warf die Frage auf, ob lentiviraler Gentransfer in höheren Säugetieren anwendbar ist. Transgene Schweine und Rinder wären von großer biomedizinischer Bedeutung. Ihre potentiellen Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine über klinische Modelle zur Untersuchung humaner Erkrankungen bis hin zur Xenotransplantation. Obwohl mit der klassischen DNA-Mikroinjektion transgene Schweine und Rinder erzeugt werden können, ist das Verfahren in diesen Spezies jedoch sehr ineffizient und dementsprechend kostenintensiv. Da hohe Produktionskosten den möglichen Anwendungen entgegenstehen, wurde versucht ein effizientes Verfahren, daß auf lentiviralem Gentransfer beruht, zu entwickeln. Für die Entwicklung der lentiviralen Transgenese in Schweinen wurden Zygoten mit Lentiviren infiziert und in Empfänger transferiert. Die verwendeten Vektoren trugen einen eGFP-Reporter, um die Effizienz der Transduktion schnell und einfach beurteilen zu können. Von den 46 geborenen Ferkeln waren 32 transgen und 30 zeigten Transgen-Expression (65%). Die hohe Transgenese-Rate, die mit dem lentiviralen Gentransfer erreicht werden konnte, stellt eine 27fache Steigerung der Effizienz im Vergleich zur klassischen DNA-Mikroinjektion dar. Die Untersuchung der transgenen Ferkel zeigte Transgen-Expression in allen Organe und keinen sichtbaren Mosaicismus der F0-Tiere. Des weiteren konnte eine nahezu lineare Korrelation zwischen der Anzahl der integrierten Proviren und der Höhe der Transgen-Expression gezeigt werden. Die Expression der lentiviralen Transgene war stabil und wurde nicht nach der Geburt der Tiere abgeschaltet. Durch die Wahl geeigneter Promotoren war es möglich sowohl ubiquitäre, als auch Gewebe-spezifische Expression (in der Haut) zu erreichen. Die integrierten Proviren wurden über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben und in der F1-Generation unverändert stark exprimiert. Die Weitergabe der integrierten Proviren an die nächste Generation ist die Basis für Erzeugung transgener Linien. Zur Erzeugung transgener Rinder wurden initial ebenfalls Zygoten infiziert. Diese wurden in vitro bis zum Blastozysten-Stadium (Tag 7) kultiviert. Überraschenderweise zeigten die Blastozysten nur sehr geringe Transgen-Expression. Nachdem durch Transfer solcher Blastozysten keine transgenen Nachkommen erzeugt werden konnten, wurde zur Infektion von Oozyten (vor der Befruchtung) gewechselt. In den aus Oozyten-Infektion stammenden Blastozysten war die Gentransfer-Rate wesentlich höher (insgesamt 83% eGFP+ Blastozysten) und die eGFP-Fluoreszenz um ein Vielfaches intensiver. Acht eGFP-positive Blastozysten wurden in vier Empfänger transferiert, was zur Geburt von vier transgenen Rindern führte. Alle erzeugten transgenen Rinder zeigten stabile Expression des Transgens in allen untersuchten Organen. Als eine weitere Methode zur Erzeugung lentiviral transgener Rinder wurde der Kerntransfer (NT) untersucht. Hierzu wurden Haut-Fibroblasten vom Rind lentiviral transduziert und als Donor-Zellen verwendet. Dieser Ansatz war zwar wesentlich ineffizienter als die direkte Infektion von Oozyten, trotzdem konnte ein transgenes Rind erzeugt werden, das starke Transgen-Expression zeigte. Da die Expression lentiviraler Integranten offenbar durch das klassische Klonen nicht abgeschaltet wird, eröffnet diese Methode viele Möglichkeiten für die Produktion transgener Tiere. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die epigenetische Regulation lentiviraler Vektoren untersucht. Dazu wurden transgene Founder-Schweine verpaart, um Tiere mit einzelnen lentiviralen Integranten (F1-Generation) zu erzeugen. Die Expressions-Analyse dieser Schweine zeigte, daß etwa 1/3 der Proviren nur schwach bzw. gar nicht exprimierten. Durch Southern Blot Analysen mit Methylierungs-sensitiven Restriktions-Enzymen wurde der Grad der proviralen Methylierung bestimmt. Dieser korrelierte negativ mit der Transgen-Expression. Zur genaueren Analyse der Methylierungs-Dichte wurden die verschiedenen Proviren mittels Bisulfit-Sequenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, daß in den schwach bzw. nicht-exprimierenden Integranten nahezu alle CpG-Dinukleotide innerhalb der untersuchten Sequenzen methyliert waren. Um den Einfluß der Methylierung auf die Expression zu untersuchen, wurde von einem nicht-exprimierenden Schwein Haut-Fibroblasten isoliert und mit dem Methylase-Inhibitor 5-AzaC inkubiert. Dadurch konnte die abgeschaltete eGFP-Expression wieder reaktiviert werden. Dagegen hatte der Histon-Deacetylase Inhibitor TSA keinen starken Einfluß auf die Transgen-Expression. Chromatin-Modifikationen durch TSA-abhängige HDACs scheinen also bei der epigenetischen Regulation lentiviraler Vektoren in Schweinen keine entscheidende Rolle zu spielen. Abschließend konnte durch einen Methylierungs-sensitiven Southern Blot gezeigt werden, daß der Grad der DNA-Methylierung durch Hemmung zellulärer Methylasen (mit 5-AzaC) signifikant reduziert wurde. Lentiviraler Gentransfer stellte sich als eine sehr effiziente Methode zur Erzeugung transgener Schweine und Rinder heraus. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch hohe Transgenese-Raten und hohe Transgen-Expression aus. Außerdem werden die lentiviralen Integranten über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben. Obwohl die Transkription einiger Proviren epigenetisch reguliert wurde, ist die Häufigkeit des aufgetretenen Silencings deutlich geringer als bei prototypischen Retroviren.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde an Hand dreier verschiedener Ansätze, die Bedeutung von HSP70 für die Stressreaktion der Bauchspeicheldrüse und den Schweregrad bei der akuten experimentellen Pankreatitis untersucht. Im Zentrum stand dabei die Frage, ob durch die verschiedenen gewählten Präkonditionierungsmodelle HSP70 induziert werden kann und welche Auswirkungen HSP70 auf die pankreatitisspezifischen Parameter, insbesondere der frühzeitigen intrazellulären Trypsinaktivierung hat. Von besonderem Interesse war zudem die hormonelle Präkonditionierung mit dem Atrial Natriuretischen Peptid zur Prävention vor einer Caerulein-induzierten Pankreatitis durch Induktion von HSP70. Weiterhin wurde die Bedeutung der Hyperthermie-Präkonditionierung an isolierten Azinuszellen eingehend studiert und schließlich durch die Generierung einer transgenen Maus versucht, die genaue Funktion von HSP70 bei der akuten experimentellen Pankreatitis aufzudecken. Am Modell frisch isolierter Azinuszellen wurde untersucht, ob und in welchem Ausmaß es durch eine Hyperthermie Präkonditionierung zu Veränderungen in der azinären Antwort auf eine CCK- Hyperstimulation kommt. Die Hyperthermie führt sowohl im Pankreas als auch in Azinuszellen zu einer verstärkten Expression von Hitzeschockproteinen, insbesondere von HSP70. Die Untersuchung des Effekts der Hyperthermie an isolierten Azinuszellen, die einer Hyperthermie Präkonditionierung unterzogen wurden, stellte sich als ein nicht prakti-kables Modell heraus, da die Zellen durch die vorangegangene Hyperthermie so in ihrer Funktionalität geschädigt waren, dass sie keine Reaktion mehr auf die Stimulation mit ver-schiedenen CCK- Konzentrationen zeigten. Die Kombination einer in vivo Hyperthermiebe-handlung von Ratten mit einem in vitro Modell der experimentellen Pankreatitis an frisch isolierten Azinuszellen, gewonnen aus den vorbehandelten Tieren, zeigte dann eine sehr deut-liche Reduktion der CCK- vermittelten intrazellulären Trypsinaktivierung. Dies spricht dafür, dass die Präkonditionierung und die darausfolgende gesteigerte HSP70 Expression eine Pro-tektion des Pankreas bewirkt und dadurch eine Reduktion der pathophysiologisch für die Ent-stehung der Pankreatitis bedeutsamen frühzeitigen intrazellulären Trypsinaktivierung hervor-ruft. Die hormonelle Präkonditionierung mit ANP hat sich als wirksamer Schutz vor Ischämie- Reperfusionsschäden in der isoliert perfundierten Rattenleber herausgestellt. Untersuchungen haben gezeigt, dass der protektiven Effekt von ANP über einen Anstieg des cGMP- Spiegels, eine Aktivierung des Hitzeschocktranskriptionsfaktors (HSF) und die dadurch hervorgerufene Expression von HSP70 zustande kommt. Pankreas- Azinuszellen weisen ANP- Rezeptoren auf und reagieren auf ANP mit einem Anstieg des cGMP- Spiegel. Deshalb wurde der Effekt der intravenösen ANP- Präkonditionierung untersucht, als mögliche Protektion des Pankreas vor einer Caerulein- induzierten Pankreatitis. Eine Gabe von ANP 20 Minuten vor der Induk-tion einer akuten Pankreatitis erwies sich aber als nicht protektiv. Dagegen konnte 24 h nach einer Präkonditionierung eine Induktion der HSP70 Expression und eine Protektion des Pank-reas vor einer experimentellen Pankreatitis beobachtet werden. Jedoch zeigte sich bei der Kontrollgruppe, die nur mit NaCl vorbehandelt wurde, der gleiche Effekt auf ANP. Dies lässt darauf schließen, dass Stress hervorgerufen durch die Anästhesie und die Katheterisierung der Jugularvene für eine Präkonditionierung und damit für eine Protektion ausreichend ist und damit ANP, im Gegensatz zum Modell des Ischämie-Reperfusionsschadens Leber, nicht für eine Präkonditionierung des Pankreas eingesetzt werden kann. Die Generierung einer transgenen Maus, zum definitiven Beweis des protektiven Potentials von HSP70, führte zwar zu einer Inkorporation des Transgens, aber zu keiner Expression von HSP70 auf Proteineben, so dass hier keine neuen Erkenntnisse gewonnen werden konnten.

Die Generierung genetisch modifizierter Organspendertiere stellt eine Möglichkeit dar, die Überlebenszeit eines porcinen Xenotransplantats in einem humanen Empfänger zu verlängern. So könnte durch Transgenexpression von TGF-b1 oder TRAIL auf dem Xenotransplantat möglicherweise die zelluläre Abstoßungsreaktion inhibiert werden. Grundlagen zur Untersuchung dieser Strategien in-vivo wurden durch die hier analysierten Tiermodelle in Maus und Schwein geschaffen. In Mäusen wurde ein Modell eines Mifepristone-induzierbaren Genregulatorsystems etabliert, das die gewebespezifische und zeitlich kontrollierte Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 ermöglichen sollte. In diesem System sollte der chimäre Transaktivator GLVPc nur im Herzen exprimiert werden, und dieser sollte in doppelt-transgenen (dtg) Mäusen erst nach Verabreichung des Induktors Mifepristone eine auf das Herz beschränkte, zeitlich kontrollierbare Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 induzieren. Eine herzspezifische Expression sollte durch den murinen alpha myosin heavy chain (aMyHC)-Promotor erreicht werden. Schon die Analyse der einfach-transgenen Mauslinien ergab jedoch eine ubiquitäre Expression von mRNA des Transaktivators bzw. des konstitutiv aktiven TGF-b1 in allen untersuchten Organen. Außerdem wurde im Herzen von dtg Mäusen eine von der Mifepristone-Gabe unabhängige hohe Transgenexpression von TGF-b1 nachgewiesen und eine Expressionssteigerung von TGF-b1 nach Mifepristone-Gabe war nicht reproduzierbar. Auffällig war überdies die hohe Letalität dtg Mäuse innerhalb der ersten vier Lebenswochen. Somit wurde durch das verwendete Genregulationssystem keine auf das Herz beschränkte, zeitlich kontrollierbare Transgenexpression von TGF-b1 erreicht. Da jedoch konstitutiv aktives TGF-b1 im Myokard dtg Mäuse synthetisiert wurde, könnten diese Herzen dennoch für Transplantationsversuche verwendet werden. Dadurch wäre zumindest die Untersuchung der Wirkung von TGF-b1 auf das Transplantatüberleben möglich. Sollten transgene Schweine für die Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 erstellt werden, so wäre allerdings ein anderes bzw. modifiziertes Genregulationssystem zu verwenden, welches eine sichere zeitliche und gewebespezifische Kontrolle der TGF-b1-Expression gewährleistet. Des Weiteren dürfte der bei den Mäusen verwendete aMyHC-Promotor für eine hohe Transgenexpression im Schweineherzen nicht geeignet sein. Das untersuchte porcine Tiermodell umfasste verschiedene transgene Schweinelinien, die ein Expressionskonstrukt für humanen TRAIL unter der Kontrolle des murinen H-2Kb-Promotors integriert haben. Transgenexpression wurde in zahlreichen Organen mit höchsten Expressionsniveaus in Milz und Lunge detektiert, was auf eine gewebespezifische Expression des Transgens durch den murinen Promotor hinwies. Des Weiteren wurde humanes TRAIL-Protein nur in der Zellmembranfraktion von Gewebelysaten detektiert und sollte daher für eine Interaktion mit Rezeptoren zugänglich sein. Überdies war eine Regulation der humanen TRAIL-Expression durch den murinen Promotor in aktivierten transgenen Lymphozyten zu beobachten, welche erhöhte Expressionsniveaus gegenüber nicht stimulierten Lymphozyten aufwiesen. Daher kann vermutet werden, dass die humane TRAIL-Expression bei Auftreten von Entzündungsreaktionen erhöht sein dürfte. Die biologische Wirksamkeit des Transgens wurde durch einen TRAIL-spezifischen Apoptose-induzierenden Effekt von transgenen Lymphoblasten auf Jurkat-Zellen gezeigt. All dies sind Voraussetzungen für einen möglichen protektiven Effekt von humanem TRAIL zur Verhinderung einer Zell-vermittelten Xenotransplantatabstoßung. Die Selektion von bisher nicht oder wenig untersuchten Linien erfolgte durch Analyse der Transgenexpression auf peripheren Blutlymphozyten. Dies stellte einen Kompromiss dar, um kosten- und zeitsparend gut exprimierende transgene Schweine für die Zucht von homozygoten und/oder multitransgenen Tieren zu selektionieren. Nicht nur das Expressionsmuster von humanem TRAIL und die Regulation durch den H-2Kb-Promotor in transgenen Schweinen, sondern auch die Analyse der Sequenz und der Expression des endogenen porcinen TRAIL sind in Bezug auf ihren möglichen Einfluss auf des Überleben des Xenotransplantats von Interesse. Die Aminosäuresequenz von porcinem TRAIL hat 86 % Ähnlichkeit mit der von humanem TRAIL. Eine mögliche Interaktion von porcinem TRAIL mit humanen Rezeptoren ist anzunehmen. Außerdem wurde eine gewebespezifische und entwicklungsabhängige Expression von porcinem TRAIL in zahlreichen Organen nachgewiesen. Dies dürfte mit den verschiedenen Funktionen von porcinem TRAIL in Zusammenhang stehen.

Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Bereiche gegliedert. Der erste Themenbereich beschäftigte sich mit der Transformation von pflanzlichen Mitochondrien bzw. mit den Voraussetzungen, die erfüllt sein müssen, um Mitochondrien höherer Pflanzen zu transformieren. Im zweiten Themenbereich wurde die Regulation der Lysinbiosynthese erstmals mit Hilfe der Plastidentransformation modifiziert sowie ein universeller plastidärer Selektionsmarker entwickelt und etabliert. Mitochondrientransformation- In dieser Arbeit wurden zwei Strategien zur Transformation von Mitochondrien höherer Pflanzen entwickelt. Zum einen wurde ein mitochondrienspezifischer Ansatz gewählt, d.h. es wurden Selektionsmarker verwendet, die eine hemmende Wirkung auf die Atmungskette der Mitochondrien besitzen. Zum anderen wurden in Anlehnung an seit die seit 1990 erfolgreich durchführbare Plastidentransformation generelle Inhibitoren der Proteinbiosynthese verwendet, welche durch die Produkte der entsprechenden in die Mitochondrien eingebrachten Resistenzgene detoxifiziert werden sollten. Markergenstrategie- Geeignete Selektionsbedingungen zur Identifizierung von mitochondrialen Transformanten wurden bei Tabakblättern und Tabakprotoplasten mit den Antibiotika Blasticidin, Chloramphenicol und Hygromycin als Hemmstoffe ermittelt. Aus Transformationen mit den mitochondrialen Transformationskassetten pBMhph II, pBMhph III und pBMhph IV konnten über 200 Hygromycin-resistente Linien selektiert und charakterisiert werden. PCR- und Southern-Analysen lassen bei mindestens 7 Linien eine zielgerichtete mitochondriale Integration des Transgens vermuten. Möglicherweise sind aber nur wenige Kopien des Transgens in das Mitochondriengenom inseriert bzw. repliziert worden, was eine eindeutige Charakterisierung erschwert. Bei einer großen Anzahl resistenter Linien handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle zielortfremde Integrationen der Transformationskassetten in die Plastiden-, Kern- oder Mitochondriengenome. Mitochondrienspezifischer Transformationsansatz- Die in dieser Arbeit entwickelten mitochondrienspezifischen Transformationsvektoren pUMmyx II, pUMglu II, pUMarg II und pUManti II enthalten ein Fragment des mitochondrialen cob-Gens. In dieses cob-Fragment wurden Punktmutationen eingeführt, die zu einer Veränderung der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur des Apocytochroms b führen. Bei einer korrekten homologen Integration dieses modifizierten cob-Fragmentes in das Mitochondriengenom sind die Inhibitoren Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben nicht mehr in der Lage, an den Komplex III der mitochondrialen Atmungskette zu binden. Zur Bestimmung optimaler Selektionsbedingungen von mitochondrialen Transformanten mit den Hemmstoffen Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben wurden Testreihen mit Tabakblättern, Tabakprotoplasten sowie Tabak- und Arabidopsis-Suspensionskulturen durchgeführt. Bei „particle-gun“-Transformationen von Tabakblättern mit der Transformationskassette pUMarg II wurden 23 Moa-Stilben-resistente Linien selektiert. Bei 18 Linien konnte eine Integration des mutierten cob-Fragmentes eindeutig per PCR und Sequenzierung nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um eine mitochondriale Integration handelt, konnte nicht eindeutig belegt werden. In diesem Fall wäre jedoch zu klären, auf welchem Mechanismus der offensichtliche selektive Vorteil der mit dem Transformations-vektor transformierten Pflanzen beruht, da die Integration des cob-Gen-Fragmentes nur innerhalb des mitochondrialen Zielortes funktionell sein dürfte. Plastidentransformation- Bei dem plastidären Transformationsansatz dieser Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt. Zum einen wurde der „feedback“-Regulationsmechanismus der DHDPS innerhalb des Aspartat-Stoffwechsels durch die Integration eines insensitiven dhdps-Gens in die Plastiden von Tabak und Kartoffel beeinträchtigt. Der Gehalt der essentiellen Aminosäure Lysin wird somit gesteigert. Zum anderen wurde das insensitive dhdps-Gen als Markergen genutzt, um eine Selektion von plastidären Transformanten auf dem Lysinanalogon AEC zu ermöglichen. Erhöhung des Lysingehaltes- Es konnten 34 Spectinomycin-resistente Tabakklone selektiert werden, die mit der Transformationskassette pHoDh2b transformiert wurden. Die molekularbiologische Charakterisierung der Transformanten konnte bei 8 Linien eindeutig eine korrekte plastidäre Integration der Transgene belegen. Biochemische Analysen zeigen eine bis zu 32-fache Erhöhung an freiem Lysin im Blattgewebe von plastidären Transformanten. Es war damit erstmals mit der Plastidentransformation möglich, regulatorisch die Lysinbiosynthese zu verändern. AEC als plastidärer Selektionsmarker- AEC (S-Aminoethyl-L-Cystein) konkurriert als Lysinanalogon mit Lysin um den Einbau in Polypeptide. Wird die AEC-Konzentration im pflanzlichen Gewebe im Vergleich mit Lysin zu hoch, kommt es zum Erliegen des Stoffwechsels und damit zum Absterben der Zelle. Durch die Überproduktion von Lysin in den Transformanten verschiebt sich das Verhältnis von AEC → Lysin. Es wird somit kompetitiv mehr Lysin in die Polypeptide eingebaut. Dies lässt sich als Selektionsvorteil nutzen. Mit dem „Markergen“ dhdps-r1 und AEC als selektivem Hemmstoff wurden insgesamt 49 Tabaklinien selektiert. Bei 3 selektierten Linien konnte eindeutig die korrekte plastidäre Intergration der Transformationskassette nachgewiesen werden. Es ist damit erstmals gelungen, einen antibiotikumfreien universell einsetzbaren plastidären Selektionsmarker zu etablieren. In weiteren Transformationsexperimenten konnten mit dem gleichen „Markergen“ plastidäre Tomatentransformanten identifiziert und charakterisiert werden (Diplomarbeit L. Schaeffer). Damit ist es bereits bei 2 Spezies gelungen, AEC als selektiven Hemmstoff einzusetzen. Bei weiterer Optimierung der Selektionsbedingungen dürfte es möglich sein, auch bei weiteren Pflanzenspezies diesen universellen Selektionsmarker zu etablieren.

Mit speziell angefertigten cDNA-Makro-Arrays wurden Melanomzelllinien und kulti-vierte Melanozyten auf die transkriptionelle Aktivität von Genen untersucht, welche bekannterweise bei der zellulären Signaltransduktion von Bedeutung sind. Zur Analyse der daraus erhaltenen Daten wurde das Computer-Programm "GeneFish" geschrieben, welches auch für zukünftige, ähnliche Fragestellungen in anderen Systemen verwendbar ist. Mit Hilfe dieses Programmes wurde gefunden, dass bei ADAM-9, ADAM-10, HER3, FAK, SHC und dem IGF-1-Rezeptor die Unterschiede der Expression zwischen Melanomzelllinien und Melanozyten besonders ausgeprägt waren. Bei weiteren Genen wurden schwächer ausgeprägte, jedoch ebenfalls interessante Expressionsmuster beobachtet. Die Rolle von HER3 wurde durch Einführung einer dominant negativ wirkenden Mutante von HER3 in Melanomzelllinien weitergehend untersucht. Bei Verwendung eines konstitutiv exprimierenden Expressionssystems starben die transgenen Zellen, was einem lethalen Effekt der Mutante zugeschrieben wurde. Mit einem induzierbaren Expressionssystem wurden Zellklone erhalten, die veränderte biologische Eigenschaften aufwiesen, welche jedoch unabhängig von der Expression des Transgens waren. Trotz dieser technischen Schwierigkeit bleibt HER3 eines der vielversprechendsten Gene für die künftige Forschung an Melanomen.