Podcasts about karzinomzelllinien

Das Auftreten einer Metastasierung ist von großer prognotischer Relevanz für Patienten mit einer Tumorerkrankung und hat einen bedeutenden Einfluß auf die Heilungsrate. Bisher gibt es keine Therapie, die die Ausbreitung der Krebserkrankung verhindern oder stoppen kann, unter anderem, weil der Prozess der Metastasierung noch weitgehend unklar ist. Deswegen ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Tumorzelldisseminierung zu verstehen: Gibt es bestimmte Gene, die in disseminierten Zellen unter- oder überexprimiert sind? Hat ihre differentielle Expression einen Einfluss auf die Disseminierung? An welchen Signalwegen sind die dazu gehörigen Proteine beteiligt? Um Antworten auf diese Fragestellungen zu erhalten, ist es von großem Interesse, disseminierte Tumorzellen direkt zu studieren. Die Detektion solcher Zellen ist allerdings schwierig, da die Zellen extrem selten sind und es an spezifischen Markern mangelt. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Marker für die Detektion epithelialer Zellen in mesenchymalem Gewebe zu finden. Dafür wurde die differentielle Genexpression zwischen vier metastatischen Zellen von Brustkrebspatienten (Tester) und Knochenmarkzellen gesunder Patienten (Driver) mit der Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Methode analysiert. Da das Ausgangsmaterial aus global amplifizierter cDNA einzelner Zellen besondere Adaptersequenzen trägt, musste die SSH zuerst daran angepasst werden. Neun der gewonnenen Sequenzen zeigten eine differentielle Expression, die positiv im Tester und negativ im Driver war. Drei der identifizierten Sequenzen (BAF57, IGF1R und LPP) sind für ihre potentielle Beteiligung bei der Tumorentstehung bereits bekannt. Die Expression der neun Sequenzen wurde in elf Tumorzelllinien und Knochenmark geprüft. Drei Sequenzen sind nur in Zelllinien und nicht in Knochenmark nachzuweisen: IGF1R, BAF57 und eine Sequenz von uns #288 genannt, die keinem bereits bekannten Gen entspricht. Sie konnte als Fragment eines von ERV9 Long Terminal Repeat (LTR) gesteuerten Transkriptes identifiziert werden. LTRs von humanen endogenen Retroviren (HERV) enthalten Virale Promotoren, Enhancer und Polyadenylierungssignale und können die Genexpression regulieren. Es wurden bereits verschiedene zelluläre mRNA-Transkripte gefunden, die von ERV9 LTRs gesteuert werden. Die differentielle Expression der Sequenz #288 zwischen Karzinomzelllinien und Knochenmark deutet darauf hin, dass der ERV9 LTR für eine Gewebespezifizität verantwortlich zeichnen könnte. Da in Krebsgewebe auch eine höhere Transkriptionsaktivität für nicht kodierende Transkripte festgestellt wurde, stellt sich die Frage, ob die Sequenz #288 entweder einen neuen Tumormarker darstellen könnte oder an der Regulation anderer Gene beteiligt ist.

Das Epithelial Cell Adhesion Molecule, kurz EpCAM, ist ein transmembranes Zelladhäsionsmolekül, dessen Expression mit einer erhöhten Proliferation epithelialer Zellen einhergeht. Die veränderten proliferativen Eigenschaften werden durch eine EpCAM-vermittelte Signaltransduktion hervorgerufen, die u.a. die Transkription des Proto-Onkogens c-myc induziert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EpCAM die Transkription weiterer „down stream“-Zielmoleküle reguliert. Die mRNA-Synthese des Transkriptions-faktors Egr-1 wird durch EpCAM reprimiert. Dagegen induziert EpCAM die Transkription der Gene für RhoB und Calmodulin I. Außerdem korreliert in unterschiedlichen Karzinomzelllinien die native EpCAM-Expression mit der Transkriptionsrate von Calmodulin I. Zur Identifikation intrazellulärer Interaktionspartner wurde mit der kurzen zytoplasmatischen Domäne (26 Aminosäuren) von EpCAM ein Two-Hybrid Screening in Hefen durchgeführt. Es konnten 17 potentielle Interaktionspartner aus einer humanen cDNA-Bank identifiziert werden. Für die zwei Signaltransduktions-moleküle FHL2 und Cyclophilin A war es möglich, eine Interaktion mit EpCAM in humanen Zellen nachzuweisen. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass die C-terminale LIM-Domäne von FHL2 für eine Assoziation mit EpCAM notwendig ist. Somit konnte in dieser Arbeit die Grundlage für eine weitere Analyse der EpCAM-vermittelten Signaltransduktion geschaffen werden.

Nab2 ist in Melanomen und Melanomzelllinien im Vergleich zu Melanozyten und benignen Nävi stark überexprimiert. Durch Stimulation mit Wachstumsfaktoren oder Phorbolester kann Nab2 außerdem in allen Geweben und Zelllinien transient induziert werden. Die Expressionskinetik folgt dabei der eines delayed early response-Gens. Das Nab2-Protein ist ein transkriptioneller Korepressor der für die Wachstums- und Differenzierungsregulation wichtigen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren Egr1, Egr2 und Egr3. Das sind immediate early response-Gene, die durch die selben Stimuli induziert werden wie Nab2. Nach Stimulation wird die Expression von Egr deswegen grundsätzlich von einem Anstieg der Nab2-Expression gefolgt. Nab2 ist deswegen wahrscheinlich der wichtigste Repressor der Egr-Aktivität und verhindert eine übermäßige Stimulation von Egr-Zielgenen. Ziel dieser Arbeit war es, die regulatorischen DNS-Abschnitte des Nab2-Gens zu isolieren und genau zu charakterisieren. Am Nab2-Promotor sollten dann die Ursachen für die Überexpression im Melanom untersucht und der Mechanismus der Nab2-Induktion nach Stimulation identifiziert werden. Dazu wurde die genomische Nab2-DNS in einer humanen DNS-Bibliothek durch DNS-Hybridisierung identifiziert und daraus isoliert. So konnte ein 7.391 bp langes DNS-Fragment kloniert werden, das 1.845 bp der 5´-untranslatierten Region sowie die gesamte, aus 7 Exons aufgebaute proteinkodierende Nab2-Sequenz enthält. Durch in silico Analysen der 5´-untranslatierten Region konnten eine putative Promotorregion von Position -705 bis -82 (+1 = Adenin des Startkodons), eine CpG Insel von Position -876 bis +82 aber keine klassischen Kernpromotorelemente wie eine TATA-Box oder ein Inr-Element identifiziert werden. Der Nab2-Promotor gehört deshalb zur Klasse der TATA- und Inr-losen CpG-Insel-Promotoren. Durch eine Kombination aus EST- und cDNS-Kartierungen sowie Primerextensionsversuchen konnte ein sehr großes Transkriptionsstartareal identifiziert werden, das sich von Position -366 bis -96 erstreckt. Um funktionelle Studien mit der 5´-untranslatierten Nab2-Region durchzuführen wurden 17 verschiedene 5´-verkürzte Abschnitte daraus in Luziferase-Reportervektoren kloniert und deren transkriptionelle Aktivität in verschiedenen Zelllinien untersucht. Für das Erreichen der maximalen Promotoraktivität (ca. dem 400fachen der Aktivität des Leervektors) war der Sequenzabschnitt stromabwärts von Position -679 ausreichend. Ab Position -58 war dann keine Promotoraktivität mehr detektierbar. Der Nab2-Promotor erstreckt sich also von Position -679 bis -58. Der Kernpromotor konnte aufgrund der Lokalisation der Transkriptionsstartpunkte (-366 bis -96) und des 3´-Endes des Promotors (-58) zwischen Position -366 und -58 eingegrenzt werden. Die sehr hohe Aktivität des gesamten Nab2-Promotors wird durch die aktivierende Region von Position -679 bis -263 hervorgerufen. Durch diesen DNS-Abschnitt steigt die Aktivität vom 15- bis 30fachen auf das ca. 400fache der Aktivität des Leervektors. In dieser positiven regulatorischen Region konnten 10 putative Sp1-Bindestellen identifiziert werden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit zu dem Aktivitätszuwachs beitragen. Um die Ursache der Überexpression von Nab2 in Melanomzelllinien zu Untersuchen, wurde die Aktivität der Nab2-Reporterkonstrukte in Melanomzelllinien, die Nab2 überexprimieren, und in Karzinomzelllinien, die nur wenig Nab2 exprimieren, verglichen. Die Reporterkonstukte zeigten jedoch in Melanom- und Karzinomzelllinien ungefähr die gleiche Aktivität. Die Ursache für die Überexpression in Melanomzelllininen konnte durch diese Versuche nicht identifiziert werden. Schließlich wurde die Aktivität der Reporterkonstrukte in unstimulierten und PMA stimulierten Zellen verglichen. Durch die PMA-Stimulation stieg die Aktivität des Nab2-Promotors auf das ca. 3fache der Basalaktivität an. Die gesteigerte Nab2-Expression nach Stimulation wird demnach auf der Transkriptionsebene reguliert. Anhand der Verkürzungskonstrukte konnte ein 19 bp langer DNS-Abschnitt zwischen Position -232 und -213 identifiziert werden, der diesen Anstieg der Promotoraktivität nach Stimulation hervorruft. In diesem Abschnitt liegen je eine Egr1- und Sp1-Bindestelle, die sich teilweise überlappen. Bei Kotransfektion eines Egr1-Expressionsvektors mit den Nab2-Reporterkonstrukten konnte ein Aktivitätsanstieg vergleichbarer Größenordnung wie durch PMA-Stimulation beobachtet werden. Wurde die Egr1-Bindestelle an Position -222 durch Mutation inaktiviert, so nahm die Induzierbarkeit des Nab2-Promotors durch PMA um 35-50% und durch Egr1-Kotransfektion um 64-73% ab. Diese Daten zeigen, dass Egr1 alleine in der Lage ist, den Nab2-Promotor maximal zu aktivieren und dass dieser Effekt vorwiegend über die Egr1-Bindestelle an Position -222 vermittelt wird. Weil der Promotor aber nach der Inaktivierung der Egr1-Bindestelle an Position -222 noch durch PMA und durch Egr1-Kotransfektion aktivierbar ist, sind weitere Egr1-Bindestellen und womöglich noch andere Transkriptionsfaktoren an der Aktivierung beteiligt. Diese Daten zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Egr1 seinen eigenen Korepressor Nab2 induziert. Funktionell liegt also ein negativer Rückkoppelungs-Mechanismus vor, der eine überschießende Egr1-Aktivität verhindert.

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluss des potentiellen Tumorsuppressors Pdcd4 auf das invasionsassoziierte Urokinase-Rezeptorgen(uPAR), sowie auf den Invasionsvorgang selbst, untersucht. In verschiedenen gastrointestinalen Karzinomzelllinien wurde eine gegenläufige Expression von uPAR und Pdcd4-mRNA und -Protein nachgewiesen. In Reportergen-Assays unter Verwendung von Wildtyp- und mutiertem uPAR-Promotor zeigte sich nach gleichzeitiger Transfektion von Pdcd4 eine dosisabhängige Suppression der uPARPromotoraktivität. Ferner wurden verschiedene cis-Elemente innerhalb des Promotors als potentielle Mediatoren dieser Regulation identifiziert. Bei diesen handelt es sich potentiell um die Region -402/-350bp mit mutmaßlichen Bindestellen für Sp-1, GATA-1, NF-1 und einem PEA3/ets Element an Position -245 bp. Zusätzlich konnte durch eine Mutation der kombinierten Bindungstelle für Sp-1 und Sp-3 an Position -152/-135bp, die über Pdcd4 ermittelte Suppression der Promotoraktivität aufgehoben werden. In Gelshiftanalysen zeigte sich neben einer verminderten Bindung von Transkriptionsfaktoren der GATA- und Sp-Familie innerhalb der Region -402/-350bp insbesondere eine Erhöhung der Bindung von Sp-3 an Promotorregion - 152/-135bp. Dies impliziert neben den oben genannten Mediatoren, dass Pdcd4 durch Induktion der Bindung von Sp-3 an dieses Element den uPAR-Promotor supprimiert. Darüber hinaus konnte durch die Expression von Pdcd4 die Invasionsfähigkeit der Kolonkarzinomzellinie HCT-116 in vivo reduziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pdcd4 die Promotoraktivität von uPAR über verschiedene cis-aktive Elemente des Promotors supprimiert und belegen erstmals die Regulation eines invasionsassoziierten Gens durch den potentiellen Tumorsuppressor Pdcd4. Ferner wird erstmals Sp-3 als Mediator der Pdcd4 vermittelten Genexpression vorgeschlagen. Daneben postulieren die Invasionsdaten auch eine Funktion von Pdcd4 als potentiellen Suppressor von Teilschritten der Metastasierungskaskade. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit ein neues quantitatives CAM-Modell etabliert werden, das die Invasion und Intravasation von Tumorzellen in vivo spezifisch im Hühnerei-Modell untersucht. Das Protokoll unterscheidet sich von den bisher publizierten Arbeiten durch die Verwendung einer spezifischen TaqMan®-Probe in Zusammenfassung 116 Kombination mit Primern, die spezifisch humane Alu-Sequenzen der YB8-Unterfamilie nachweisen. Durch diese Modifikationen wurde eine höhere Sensitivität der quantitativen Alu-PCR erreicht. Zusätzlich eröffnet die Spezifität der hier entwickelten Primer über den CAM-Assay hinaus die Möglichkeit, humane Zellen und Mikrometastasen auch in murinen in vivo Modellen wie SCID- oder Nacktmäusen nachzuweisen.

Das epitheliale Adhäsionsmolekül EpCAM wird insbesondere in gesunden Adenoepithelien exprimiert, nicht aber in den mukösen Plattenepithelien der oberen Atem- und Verdauungswege. Aus diesen Geweben hervorgehende Plattenepithelkarzinome dagegen zeigen eine Überexpression von EpCAM. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen zudem, dass die Plattenepithelkarzinome der Kopf-Hals-Region EpCAM außerdem in einer hyperglykosilierten Proteinvariante exprimieren, die das Ergebnis posttranskriptioneller Modifikation ist. So konnte gezeigt werden, dass in gesundem und in malignem Gewebe tatsächlich unterschiedliche Glykosilierungsformen von EpCAM vorliegen: In gesundem Gewebe wird EpCAM als unglykosiliertes Protein von 37 kDa exprimiert. Das aus Tumorgewebe stammende EpCAM hingegen war in den untersuchten Karzinomzelllinien aus SCCHN, Mamma- und Kolon und in den Gewebsproben aus Patienten mit SCCHN und mit Kolonkarzinomen hyperglykosiliert. Dabei zeigten die Karzinome ein heterogenes Bild mit unterschiedlichen Variationen und Kombinationen der verschiedenen Glykosilierungsformen. Gesundes EpCAM-positives Schilddrüsenepithel und auch gesunde Kolon- und Magenschleimhaut dagegen exprimierten vorwiegend unglykosilierte Formen von EpCAM. Innerhalb von Probenpaaren aus SCCHN und autologem Schilddrüsengewebe war EpCAM in den meisten Fällen (81,5 %) in der Karzinomprobe stärker glykosiliert als im gesunden Epithel, eine analoge Verteilung der Glykosilierungsmuster zeigten die Probenpaaren aus gesunder und neoplastisch veränderter Kolon- und Magenschleimhaut. In epithelialen Neoplasien wird EpCAM eine essentielle Bedeutung für die Karzinogenese zugeschrieben. Gleichzeitig dominieren in SCCHN und in anderen Karzinomen hyperglykosilierte Proteinvarianten von EpCAM, die in gesunden Epithelien nicht oder kaum anzutreffen sind. Man könnte daher vermuten, dass zwischen der posttranslationalen Hyperglykosilierung von EpCAM und den funktionellen Eigenschaften des tumorassoziierten Antigens in Karzinomzellen ein enger Zusammenhang besteht. Weitere Untersuchungen wären notwendig, um die molekulare Struktur und funktionelle Bedeutung der hyperglykosilierten Proteinvarianten von EpCAM in Karzinomen zu klären. Die Identifizierung karzinomspezifischer Epitope auf dem Glykoprotein EpCAM wäre Voraussetzung für die Entwicklung spezifischer Antikörpern, die hyperglykosiliertes EpCAM auf Karzinomzellen erkennen. Ziel wäre eine Immuntherapie mit EpCAM von hoher Karzinomspezifität und somit ein hoher therapeutischer Wirkungsgrad bei geringerer Toxizität. Für Patienten mit SCCHN könnte dies insbesondere bei minimal residual disease zu einer Verbesserung der bisher ungünstigen Prognose führen.