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Bei Hund und Katze sowie beim Menschen zählen Epilepsien zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen. Im Hinblick auf eine vollständige Prävention der Epilepsieentstehung (Epileptogenese) haben sich bis heute alle therapeutischen Strategien als klinisch unwirksam erwiesen. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Epileptogenese zugrunde liegen, stellt die Grundvoraussetzung für die Identifizierung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern dar. Differentielle Proteomanalysen könnten wesentlich dazu beitragen die komplexen epileptogenese-assoziierten molekularen Veränderungen zu erforschen. Daher wurde in der vorliegenden Dissertationsstudie eine differentielle Proteomanalyse in einem Tiermodell der Epileptogenese durchgeführt. Die Induktion der Epileptogenese erfolgte in einem elektrischen Post-Status-Epilepticus-(SE)-Modell bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten. Hippocampales (HC) und parahippocampales (PHC) Gehirngewebe von SE- und Kontrolltieren wurde zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten (zwei Tage, zehn Tage und acht Wochen nach SE) entnommen und mittels markierungsfreier Liquid-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Zeitpunkte reflektieren die Post-Insult-Phase, die Latenzphase und die chronische Phase mit spontanen wiederkehrenden Anfällen. Unter Berücksichtigung der besonderen Rolle inflammatorischer Signalwege im Kontext der Epileptogenese, erfolgte neben der unspezifischen Datenanalyse eine fokussierte Auswertung immun- und inflammations-assoziierter Prozesse. Die anschließende immunhistochemische Untersuchung der Gewebe diente sowohl der Validierung der Methodik, als auch der Validierung des differentiellen Expressionsmusters ausgewählter Proteine. Durch die Studie konnte gezeigt werden, dass zu allen untersuchten Zeitpunkten im PHC mehr Proteine reguliert waren als im HC. Des Weiteren ließen sich in beiden Gehirnregionen die umfangreichsten molekularen Veränderungen in der Latenzphase nachweisen. Durch die Pathway-Enrichment-Analyse konnte im HC während der Post-Insult-Phase eine ausgeprägte Neurodegeneration dargestellt werden. Weiterhin zeigte sich in beiden Gehirnregionen eine Regulation Integrin-assoziierter Prozesse während der Latenzphase und der chronischen Phase. Ein signifikantes Enrichment neurodegenerativer und proliferativer Signalwege ließ sich im PHC acht Wochen nach SE darstellen. Im Hinblick auf immun- und inflammations-assoziierte Prozesse konnte eine Überrepräsentation entsprechender Pathways während der Post-Insult-Phase und der Latenzphase nachgewiesen werden. Die regulierten Pathways umfassten unter anderem Toll-like-Rezeptor-(TLR)-vermittelte Signalwege, Synthese und Regulation von Prostaglandinen, leukozytäre transendotheliale Migration und die Signaltransduktion durch transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF beta). Die inflammatorische Antwort während der chronischen Phase zeigte im PHC eine stärkere Regulation als im HC. Im Rahmen der immunhistochemischen Validierung konnte das differentielle Expressionsmuster der Proteine Heat shock 70 kDa protein (Hspa1a), P2Y Purinoceptor 12 (P2ry12) und P2X Purinoceptor 7 (P2rx7) bestätigt werden, die eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Mikroglia spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie liefern neue Erkenntnisse über die komplexen molekularen Veränderungen der Epileptogenese. Darüber hinaus deuten sie auf eine unterschiedliche Veränderung der molekularen Muster von HC und PHC während dem Zeitverlauf der Epileptogenese hin. Die Daten stellen zudem neue Informationen über das differentielle Expressionsmuster zahlreicher Proteine zur Verfügung, die bei wichtigen inflammatorischen Prozessen und Signalwegen eine Rolle spielen. Von besonderer Bedeutung ist hierbei die Regulation TLR-assoziierter Proteine und Purinozeptoren, die zu den essentiellen Modulatoren der inflammatorischen Antwort gezählt werden. Zusammenfassend trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zu unserem Verständnis über die molekularen und im Besonderen die inflammatorischen Mechanismen der Epileptogenese bei. Die Ergebnisse liefern eine umfassende Grundlage für die zukünftige Identifikation und Entwicklung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern für molekulare Bildgebungsverfahren. Die funktionellen Einflüsse einzelner Proteine sollten in zukünftigen Studien (zum Beispiel in Knock-out-Maus-Modellen) bestätigt und genauer untersucht werden.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Expression des astrozytenspezifischen Enzyms Glutaminsynthetase in Ergänzung zum gliaspezifischen Marker Repo, um Gliazellen, die mit der embryonalen Entwicklung des Zentralkomplexes in Schistocerca gregaria assoziiert sind, zellulär und molekular zu charakterisieren. Der Zentralkomplex ist ein modulares System neuropiler Strukturen im Mittelhirn aller Insekten, und ist in vielen Verhaltensvorgängen wie Laufen, Fliegen, Stridulation und Ernährung involviert. In der Heuschrecke entwickeln sich die Neuropile des Zentralkomplexes im Laufe der Embryogenese und sind zum Zeitpunkt des Schlüpfens funktionsfähig. Trotz großer Kenntnisse neuronaler Aspekte über die Entwicklung des Zentralkomplexes verbleibt die Funktion der Gliazellen unklar. In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster des astrozytenspezifischen Enzyms Glutaminsynthetase (GS) und des gliaspezifischen Homöobox Gens reversed polarity (repo) in Kombination mit der negativen Expression des neuron-spezifischen Markers Meerrettich Peroxidase (HRP) zur Identifizierung glialer Zellen benutzt. Doppelfärbungen zeigen, dass alle GS-positiven Zellen, die mit dem Zentralkomplex assoziiert sind, gleichzeitig Repo-positiv sind. Zum ersten Mal konnte ich durch diese Kombination nicht nur Zellkörper, sondern auch Projektionen (Gliapodien) der Gliazellen sichtbar machen. Während der Embryogenese, also noch vor der Entwicklung des Zentralkomplexes, formen Gliazellen eine zusammenhängende Population, die aus der Pars intercerebralis in die Region der Faserbündel einwandert. Anschließend verteilen sich die Gliazellen neu und umhüllen jedes der einzelnen Module des Zentralkomplexes. Innerhalb der einzelnen Neuropile des Zentralkomplexes sind keine glialen Zellkörper zu finden. Rekonstruktionen einzelner Zellen zeigen Populationen von Gliazellen, die ausgedehnte umhüllende Projektionen um die Neuropile des Zentralkomplexes, wie den Zentralkörper, senden, während eine andere Population von Gliazellen säulenartige Verzweigungen in den Zentralkörper hinein projiziert. Solche Verzweigungen in den Modulen des Zentralkomplexes sind erst nach Fertigstellung der Neuroarchitektur zu erkennen. Daher kann man annehmen, dass diese Verzweigungen auf ein zuvor entstandenes Gerüst von Neuronen oder Tracheen projizieren. Höchstwahrscheinlich sind diese Gliaprojektionen in die Transmitterregulation innerhalb des Neuropils involviert. Da Gliazellen weitreichende Projektionen (Gliapodien) in und um die Mittelhirnneuropile senden, wurden in gefrorenen Hirnschnitten intrazelluläre Injektionen durchgeführt um zu erforschen, ob diese Gliazellen ein zelluläres Netzwerk via Zellkopplung im Verlauf der Embryogenese bilden. Färbungen individueller Zellen, die an vier unterschiedlichen Injektionsstellen um den Zentralkörper lokalisiert sind, zeigen eine Population gekoppelter Zellen, deren Anzahl und räumliche Verteilung stereotypisch für jeden der Injektionspunkte ist. Darüber hinaus sind sie sowohl bei 70%igem wie auch bei einem embryonalen Entwicklungsstand von 100% miteinander vergleichbar. Anschließende immunhistochemische Experimente bestätigen, dass es sich bei den gekoppelten Zellen um astrozytenähnliche Gliazellen handelt. Durch Hinzufügen von n-Heptanol in das Puffermedium wurde die Zellkopplung verhindert. Da die Zellkopplung auch ohne direkten intersomalen Kontakt auftritt, könnten die erheblichen Verzweigungen der Gliapodien, die sich im Laufe der Embryogenese ausbreiten, involviert sein. Durch die Datenerhebung aller Injektionspunkte kann darauf geschlossen werden, dass die Gliazellen, welche den Zentralkörper umrunden, ein Netzwerk gekoppelter Gliazellen bilden, das als Positionierungssystem der sich entwickelnden Neuropile des Zentralkomplexes dient.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine sehr häufig auftretende autoimmune Augenerkrankung bei Pferden, welche meist mit dem Verlust der Sehfähigkeit der betroffenen Augen einhergeht. Da die ERU das einzig spontane Tiermodell für die humane autoimmune Uveitis darstellt, ist die Erforschung der zugrundeliegenden Pathomechanismen der ERU nicht nur veterinärmedizinisch, sondern auch für die Humanmedizin von großer Bedeutung. Charakteristisch für die ERU sind der Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke (BRS) und die Infiltration von autoaggressiven T-Lymphozyten in das innere Auge mit anschließender Zerstörung retinaler Strukturen. Beim Pferd wird die BRS, aufgrund der weitestgehend avaskulären Retina, hauptsächlich von der äußeren Komponente der BRS gebildet, dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Im physiologischen Zustand stellt das RPE durch feste Zell-Zellverbindungen sowohl eine stabile mechanische, als auch durch seine Fähigkeit, mit Mediatoren des Immunsystems kommunizieren und interagieren zu können, eine effektive immunologische Barriere dar. Die im Verlauf der ERU stattfindenden pathophysiologischen Mechanismen, welche für den Zusammenbruch dieser Barriere verantwortlich sind, konnten bislang nicht ausreichend geklärt werden. Vor allem Änderungen im Expressionsmuster des Zelloberflächenproteoms könnten hierbei aufgrund der ständigen Interaktion und Kommunikation der RPE-Zellen mit ihrer Umgebung eine entscheidende Rolle spielen. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit, differentiell regulierte Zelloberflächen-proteine zwischen gesunden und uveitischen RPE-Zellen zu detektieren, welche maßgeblich an der Pathogenese der ERU beteiligt sein könnten. Um so nah wie möglich die am RPE in vivo stattfindenden physiologischen und pathophysiologischen Prozesse widerspiegeln zu können, wurden RPE-Zelloberflächenproteine von gesunden und an ERU erkrankten Pferden in dieser Studie mittels einer neuartigen in situ Biotinylierungsmethode angereichert und anschließend massenspektrometrisch analysiert. Dabei konnten insgesamt 148 Proteine identifiziert werden, von denen 81,8 % Plasmamembranproteine waren, was deutlich für den Erfolg der neuartigen Anreicherungsmethode sprach. Unter den 148 insgesamt identifizierten Proteinen befanden sich 27 differentiell regulierte Proteine, wovon in uveitischem RPE drei hoch- und 24 herunterreguliert waren. Neben den für RPE-Zellen klassischen Proteinen wie RPE65, Rhodopsin und S-Arrestin konnten auch mehrere Proteine detektiert werden, die unseres Wissens zuvor noch nicht in RPE-Zellen beschrieben wurden, wie der Glukosetransporter 4, Synaptotagmin 1 und Peripherin 2. Funktionell besonders interessant fanden wir die vier Proteine Synaptotagmin 1, Basigin, Collectrin und Perpherin 2, welche alle mit einer verminderten Expression in uveitischem RPE zu finden waren. Interessanterweise ergab sich aus einer Pathway-Analyse für alle vier Proteine eine Beteiligung an „Visual Functions“ und „Immunological Diseases“. Mittels weiterführender Analysen wie der Durchflusszytometrie, der Immunhistologie und der Quantifizierung der Protein-Fluoreszenzintensitäten ist es gelungen die bereits massenspektrometrisch identifizierte verminderte Expression von Synaptotagmin 1, Basigin, Collectrin und Perpherin 2 zu verifizieren und die Proteine näher zu charakterisieren. Die in dieser Arbeit präsentierte neuartige in situ Biotinylierungsmethode zur Anreicherung von Oberflächenproteinen, welche anschließend mittels LC-MS/MS identifiziert wurden, erwies sich als sehr effektive und innovative Methode, um Oberflächenproteine so nah wie möglich in ihrem physiologischen und pathophysiologischen in vivo Vorkommen zu untersuchen. Daher liefert der in dieser Arbeit generierte Datensatz der differentiell regulierten Proteine zwischen gesunden und uveitischen RPE-Zellen eine solide Grundlage für weitere funktionelle Analysen zur Aufklärung der Pathogenese der ERU.

Um den Wirkmechanismus verschiedener Krebstherapeutika aufzuklären bzw. besser zu verstehen wurden in der vorliegenden Arbeit deren Wirkungen auf Zelllinien untersucht. Hierfür wurde die Wirkung verschiedener kommerziell erhältlicher und einiger Roche-eigener Kinaseinhibitoren auf Leukämiezelllinien untereinander und mit der Wirkung von FLT3-siRNAs verglichen. Die Auswirkungen von Behandlungen mit anti-CD20- und anti-BCR-Antikörper wurden an Lymphomzelllinien analysiert. Für die FLT3-Inhibition konnte gezeigt werden, dass die Vorhersagen zur Spezifität aus der Display-Technologie in vier von fünf Fällen tendenziell richtig waren. In einem mehrstufigen Verfahren wurden verschiedene Eigenschaften der Inhibitoren getestet: Hemmung der Phosphorylierung von rekombinanter FLT3-Kinase, Hemmung der zellulären Phosphorylierung der Wildtyp-FLT3-Kinase, Hemmung der Phosphorylierung von FLT3 mit der ITD-Mutation. So konnte für die Substanzen VX-680, CHIR-265 und RKI-1 eine FLT3-Hemmung als primärer Wirkmechanismus in einer Zelllinie mit FLT3-ITD ausgeschlossen werden. Für die kommerziell erhältlichen Inhibitoren Sorafenib, CFI-2 und CFI-3 sowie die neue Substanz RKI-3 konnte bestätigt bzw. gezeigt werden, dass sie FLT3 / FLT3-ITD in biochemischen und zellulären Testsystemen spezifisch hemmen können. Die Expressionsprofilierung erwies sich für die Klärung dieser Fragestellung nur als bedingt geeignet, da die Expressionsmuster der Behandlungen mit verschiedenen Inhibitoren untereinander trotz unterschiedlicher Wirkungsweisen funktionell stark übereinstimmten. In diesen Profilen zeichnete sich bereits nach vierstündiger Behandlung ein Zellzyklusarrest ab, und im weiteren Verlauf wurden sie von Expressionsänderungen aus dem Umfeld der Apoptose dominiert. Die Inhibitoren konnten jedoch hinsichtlich der FLT3-Hemmung relativ zu einander aufgrund der Übereinstimmung mit dem Muster der Behandlung mit FLT3-siRNAs eingeordnet werden. Aus den bei beiden Behandlungsarten übereinstimmend deregulierten Genen wurden zeitabhängige FLT3-Inhibitionssignaturen abgeleitet.Die Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Typ I anti-CD20-Antikörpern zeigten, dass der Signalweg downstream von CD20 in den getesteten Zelllinien zumindest teilweise mit dem der BCR-Aktivierung identisch ist. Obgleich die Übereinstimmung der BCR-Aktivierungsmuster der verschiedenen Zelllinien verhältnismäßig gering war, konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsmuster der Behandlungen mit anti-CD20- bzw. anti-BCR-Antikörpern untereinander in großen Teilen übereinstimmten. Zwei der besonders schnell und stark induzierten Gene waren CCL3 und CCL4. Die Kinase SYK ist als Signalüberträger downstream des BCR bekannt. Die Induktion der Cytokine CCL3 und CCL4 konnte durch SYK-Hemmung mittels spezifischer Inhibitoren und das siRNA-vermittelte Stilllegen von SYK deutlich vermindert werden. Somit deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass SYK auch im Signalweg von CD20 eine wichtige Rolle spielt. Durch die Behandlung von NHL-Zelllinien mit anti-CD20-Antikörpern wie Rituximab oder LT20 wird demzufolge eine zelluläre Antwort ausgelöst, die einer BCR-Aktivierung ähnelt.

Die sichere präoperative Abgrenzung maligner Befunde ist ein essentieller Schritt zur optimalen Therapie des Ovarialkarzinoms. Mit dem Ziel, die präoperative Diagnostik um einen zuverlässigen, wenig invasiven Test zu ergänzen, wurden in 92 Serumproben von Patientinnen mit Ovarialkarzinomen und benignen Raumforderungen im Adnexbereich die Spiegel des in der Diagnostik etablierten Markers CA 125 sowie der potentiellen neuen Biomarker HE4, CA 72-4, Galektin-1 und Galektin-3 bestimmt. Um mehr über die Rolle der Galektine in der Biologie maligner Ovarialtumore zu erfahren, wurden 111 histologische Präparate, ebenfalls von an malignen und benignen Adnextumoren erkrankten Patientinnen, auf die Expression von Galektin-1 und -3 hin untersucht. Bei den Untersuchungen des Serums war CA 125 der beste Einzelmarker und zeigte mit einer Fläche unter der Kurve (AUC) von 0,944 eine gute Diskriminationsfähigkeit zwischen Karzinomen und benignen Erkrankungen. Besonders gute Ergebnisse erzielten wir mit einer AUC von 0,897 auch mit dem neuen Marker HE4. Das Glykoprotein hat sich jedoch nicht nur bei unseren Untersuchungen, sondern auch in zahlreichen anderen Studien gegenüber dem etablierten Marker CA 125 als ebenbürtig erwiesen. CA 72-4 zeigte mit einer AUC von 0,726 eine mittlere Genauigkeit bei der Bestimmung der Tumordignität. Es zeichnete sich aber durch eine hervorragende Spezifität von maximal 98,2 % aus, so dass bei positivem CA 72-4 mit hoher Wahrscheinlichkeit von einem malignen Tumor ausgegangen werden muss. Galektin-1 (AUC 0,609) und Galektin-3 (AUC 0,71) sind dem etablierten Marker CA 125 in der Diagnostik des Ovarialkarzinoms weit unterlegen und daher allenfalls als ergänzende Marker geeignet. Um zusätzliches Differenzierungspotential zu erhalten haben wir unter Einbeziehung der in einer bereits veröffentlichten Arbeit unserer Forschungsgruppe untersuchten Marker jeweils zwei Biomarker miteinander kombiniert. Tatsächlich konnte die Vorhersagefähigkeit durch mehrere Kombinationen gegenüber der von CA 125 verbessert werden. Unsere beste Kombination war, mit einer AUC von 0,961, die aus CA 125 und HE4. Das entspricht einem Zuwachs von immerhin 1,7 % gegenüber dem besten Einzelmarker CA 125 (AUC 0,944). Bei auffälligem Sonographiebefund könnte die Bestimmung dieser beiden Marker in Zukunft helfen, Patientinnen mit hohem Risiko für ein Ovarialkarzinom präoperativ frühzeitig zu identifizieren. Hinsichtlich der Expression der Galektine 1 und 3 im Gewebe fiel eine besonders starke Akkumulation von Galektin-1 im karzinomassoziierten Stroma auf. Dieses Expressionsmuster wird auch von anderen Arbeitsgruppen im Zusammenhang mit verschiedenen Malignomen beschrieben und oftmals als Zeichen maligner Progression gewertet. Wir hoffen, dass die durch unsere Untersuchungen gewonnen Erkenntnisse über das Expressionsmuster der Galektine in Ovarialkarzinomen zur Durchführung weiterführender Studien anregen, da das Potential dieser Proteine gerade in einer möglichen Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze und der Gewinnung neuer Erkenntnisse über das Wechselspiel zwischen malignen Zellen und dem Immunsystem groß zu sein scheint.

Es wurden sechs turkey-Ig-like receptor (TILR) Sequenzen identifiziert, bestehend aus einer TILR-A, einer TILR-B und vier TILR-AB Sequenzen. Bei allen vier TILR-AB Sequenzen sind die fünf für die IgY-CHIR-AB-Bindung essentiellen Aminosäuren konserviert und für TILR-AB1 konnte die Bindung an IgY nachgewiesen werden. Interessanterweise bindet TILR-AB1 nicht nur IgY der Pute, sondern auch an IgY von Huhn, Wachtel und Fasan, die alle der Vogelfamilie der Phasanidae angehören. Bei drei ausgewählten Vertretern außerhalb dieser Familie (Graupapagei, Falke und Ente) konnte die IgY-Bindung an TILR-AB1 nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz zum Huhn, dessen CHIR-Familie auf einem Mikrochromosom lokalisiert ist, werden die in den Datenbanken vorhandenen TILR-Sequenzen und Fragmente dem Makrochromosom 3 zugeordnet. Auch im Expressionsmuster unterscheiden sich CHIR und TILR deutlich. Während die TILR-B-Expression nicht näher untersucht werden konnte, zeigte sich für TILR-A und TILR-AB, dass diese weder auf T- noch auf B-Zellen exprimiert werden. Auf Thrombozyten und Monozyten ist eine sehr hohe Expressionsrate sichtbar. Auffällig ist, dass der Großteil der TILR-A positiven Zellen auch TILR-AB coexprimiert. In den Datenbanken finden sich derzeit keine Hinweise auf das Vorhandensein von CHIR-Homologen bei Zebrafink, Fliegenschnäpper, Wellensittich und Ente. Auch die verfügbaren gegen CHIR gerichteten monoklonalen Antikörper zeigten auf Entenblut keine Kreuzreaktivität. Erst eine genaue Annotation der genomischen Daten wird Aufschluss darüber geben, inwiefern CHIR-homologe Rezeptorfamilien bei anderen Vogelspezies vorhanden und expandiert sind.

Im Zellkern einer jeden Zelle besteht eine gewisse Ordnung der darin vorhandenen DNA und Proteine. Diese Ordnung wird unter dem Begriff „Zellkernarchitektur“ zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit ging es um die nähere Betrachtung einiger Aspekte der Zellkernarchitektur. Diese Aspekte betrafen 1. die Anordnung von Genen, 2. die Anordnung von Chromatin mit Hilfe unterschiedlicher Histonmodifikationen und 3. die Anordnungen von Chromosomenabschnitten, die mit komplexen messenger RNA-Sonden hybridisiert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mittels 3D FISH die dreidimensionale Positionierung von drei auf dem Chromosom 1 lokalisierten Genen in Zellkernen der Burkitt- Lymphom Zelllinie DG75 bestimmt. Diese Zelllinie wurde von Stefan Bohlander zur Verfügung gestellt und enthielt einen induzierbaren episomalen Vektor für das CALM-AF 10 Gen. Messungen der Genexpression, die in der Bohlander Gruppe mit Hilfe eines Affymetrix- Chips durchgeführt wurden, zeigten das die Induktion des Transgens zu genomweiten Veränderungen der Expressionsmuster hunderter Gene in dieser Zelllinie führten. Die für die 3D FISH Experimente ausgewählten Markergene zeigten nach der Induktion eine signifikant veränderte Expression. Dennoch änderte sich die radiale Positionierung dieser Gene, darunter versteht man die mehr innere oder mehr periphere Position der Gene, nicht. Dieses Ergebnis schien zuerst darauf hinzuweisen, dass die Transkriptionsstärke keine bedeutsamer Faktor im Hinblick auf die radiale Positionierung ist. Die Befunde der Affymetrix-Chip Analyse für diese Gene konnten jedoch in einer anschließende Untersuchungen der Genexpression mit Real-Time-PCR nicht bestätigt werden, obwohl der Vergleich von Affymetrix-Chip und Real- Time-PCR Daten insgesamt eine klare Korrelation zwischen den Datensätzen zeigte. Bei Diskrepanzen gehen wir davon aus, dass Real-Time-PCR die zuverlässigeren Ergebnisse liefert. Bei der hier durchgeführten Real-Time-PCR Untersuchung wurden auch die Expressionsstärken aller in einer Nachbarschaft von etwa 1 Mbp um die Markergene annotierten Gene ermittelt. Dieses Fenster wurde gewählt, weil Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Thomas Cremer und anderen Gruppen gezeigt haben, dass ~1 Mbp Chromatindomänen die Basisstruktur der Chromatinorganisation darstellen. Als Maß für die gesamte Genexpression einer Chromatindomäne wurde eine „Total Expression Strength“ (TES) berechnet. Dieser Wert basiert auf den Real-Time-PCR Werten der annotierten Gene und berücksichtigt auch die Länge der ungespleissten RNA, die von einem Gen transkribiert wird. Dabei zeigte sich, dass das Markergen in der Domäne mit dem höchsten TES Wert am weitesten innen im Zellkern lokalisiert ist. Dieser Befund unterstützt Befunde aus der wissenschaftlichen Literatur, dass die radiale Positionierung von individuellen Genen von Eigenschaften der lokalen Umgebung abhängt. Da sich die Nachbarschaft der untersuchten Markergene nicht nur im Hinblick auf die TES Werte sondern auch im Hinblick auf die Dichte der dort annotierten Gene und den GC-Gehalt unterscheidet, bleibt offen, welcher dieser Parameter als Prädiktor für die zu erwartende radiale Position individueller Gene eine entscheidende Rolle spielt. Möglich ist auch, dass alle Parameter zusammenwirken oder dass je nach den speziellen Umständen einer Untersuchung verschiedene Parameter die radiale Positionierung eines Gens bevorzugt beeinflussen. Die Stabilität der radialen Positionierung der Markergene trotz einer genomweiten Veränderung des Genexpressionsmusters nach CALM-AF 10 Induktion stimmt mit Befunden verschiedener Arbeitsgruppe überein, die für einen hohen Grad an räumlicher Stabilität der Chromatinanordnung während der Interphase sprechen; ~1 Mbp Chromatindomänen zeigen dementsprechend meist nur sehr begrenzte lokale Bewergungen (

Trotz intensiver Forschung sind viele Details der Oogenese und Follikuologenese des Rindes erst wenig verstanden. So ist nicht klar, wie es zur gezielten Aktivierung einer bestimmten Zahl von Primordialfollikel pro Zyklus kommt. Sicher ist aber, dass die Aktivierung der Primordialfollikel auf parakrine und autokrine Weise über ein komplexes System von lokal exprimierten stimulierenden und hemmenden Faktoren erfolgt. Intermedärfilamente sind einer der drei Hauptbestandteile des Zytoskeletts und somit zunächst für die mechanischen Eigenschaften von Zellen verantwortlich. Wie in den letzten Jahren aber gezeigt wurde, spielen Intermedärfilament-Proteine bzw. Intermedärfilamente auch eine wichtige Rolle bei Signaltransduktionswegen und bei der Genregulation. Ein sehr interessantes Ergebnis meiner Arbeit ist die Coexpression von Vimentin und Cytokeratin 18 in Granulosazellen von Primär-, Sekundärund Tertiärfollikeln, wohingegen Cytokeratin 8 in diesen Zellen nicht nachgewiesen werden konnte. Vimentin zeigte in antralen Follikeln drei verschiedene Expressionsmuster, die wahrscheinlich mit der Atresie von Follikeln in Zusammenhang stehen. In der Eizelle des Rindes konnten keine Intermediärfilamente nachgewiesen werden, was möglicherweise auf die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper zurückzuführen ist. Das Keimdrüsenepithel zeigte für alle Cytokeratine eine positive Reaktion, wohingegen dies für Vimentin und Desmin nicht der Fall war. Im Rete ovarii konnten nur Cytokeratin 18 und 19 nachgewiesen werden.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) stellt weltweit die häufigste Ursache für eine erworbene Blindheit bei Pferden dar. Diese spontan auftretende, autoimmun-mediierte Augenentzündung tritt in der Pferdepopulation mit einer Prävalenz von 10% auf. Die ERU ist zudem das einzige spontane Tiermodell für die autoimmune Uveitis, dessen Erforschung einen wertvollen Beitrag für die humane Uveitisforschung leistet. Ablaufende Pathogenese-assoziierte Vorgänge in der Retina, dem Zielorgan der ERU, sind bisher noch weitgehend ungeklärt, tragen jedoch zu einer fortwährenden Schädigung der retinalen Gewebearchitektur, sowie der physiologischen Funktion der Retina bei. Die Müllerzellen, die retinalen Gliazellen, sind durch ihre besonderen strukturellen und funktionellen Glia-Neuron-Interaktionen von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der retinalen Struktur, sowie der Physiologie. Gliose bezeichnet eine bekannte Reaktion der Müllerzellen auf nahezu alle beschriebenen pathologischen Bedingungen und hat einen fundamentalen Einfluss auf den Verlauf einer Netzhauterkrankung. Die neuroprotektive Wirksamkeit steht dabei den für die Retina schädlichen Auswirkungen der Gliose gegenüber. Das Ziel dieser Studie war die Verifizierung und nähere Charakterisierung der bei der ERU auftretenden Gliose, um die Bedeutung der Müllerzelle bei der autoimmunen Uveitis zu bemessen und somit ein besseres Verständnis der Pathogenese-assoziierten Vorgänge im Zielorgan dieser Erkrankung zu ermöglichen. Dies wurde durch die Untersuchung der Expression von Müllerzell-spezifischen Membranproteinen, welche maßgeblich an der Regulation der retinalen Ionen- und Wasserhomöostase beteiligt sind, in gesunden im Vergleich zu uveitischen Retinae erzielt. Die Regulation der retinalen Kalium- und Wasserhomöostase ist eine der wichtigsten Müllerzellfunktionen und wird durch die einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle Kir2.1 und Kir4.1, sowie dem Wasserkanal Aquaporin 4 (AQP4) bewerkstelligt. Gesunde Pferderetinae zeigten im Gegensatz zu anderen Spezies ein gleichmäßiges Verteilungsmuster von Kir4.1 entlang der Müllerzelle, dessen Expression bei der ERU signifikant vermindert war. Hingegen war die Expression von Kir2.1 in uveitischen Retinae signifikant erhöht, welche auch ein verändertes Expressionsmuster für Kir2.1 von Müllerzellfortsätzen hin zu den Zellkörpern der inneren Körnerschicht aufwiesen. Diese Befunde deuten auf eine gestörte Kaliumpermeabilität der Müllerzellmembran hin, die eine Beeinträchtigung der retinalen Kaliumhomöostase, sowie weiterer Funktionen der Müllerzelle zur Folge haben könnte. AQP4 war signifikant erhöht exprimiert und zeigte eine massive Re-Lokalisation in uveitischen Retinae im Vergleich zu Kontrollen. Während gesunde Retinae eine AQP4 Expression vor allem in Stammfortsätzen der Müllerzelle aufwiesen, wurde ein kreisförmiges Expressionsmuster in der äußeren Körnerschicht von uveitischen Retinae detektiert. Dies könnte möglicherweise in Verbindung mit der Entstehung eines retinalen Ödems stehen, einer der Hauptursachen für den Verlust der Sehfähigkeit bei Uveitis. In der vorliegenden Studie wurde zudem das Verteilungsmuster eins weiteren Mitglieds der Aquaporin-Familie (AQP5) charakterisiert und erstmalig dessen Expression in der Müllerzelle beschrieben. Außerdem wurde eine signifikant verminderte Expression bei der autoimmun-mediierten Uveitis gefunden und damit erstmals eine Beteiligung dieses Membranproteins bei einer retinalen Erkrankung dokumentiert. Die in dieser Studie gewonnenen Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Müllerzelle von entscheidender Bedeutung für die Pathogenese der ERU ist, da die auftretende Gliose schädliche Auswirkungen auf die physiologische Funktion der Retina zu haben scheint. Weitere funktionelle Untersuchungen der Müllerzelle sind zukünftig notwendig, um ein besseres Verständnis der Physiologie der Müllerzelle und ihrer Beeinträchtigung bei der ERU zu erlangen. Durch die Etablierung der ersten equinen Müllerzelllinie eqMC-7 wurde mit dieser Studie die Grundvoraussetzung für dieses Vorhaben geschaffen.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, molekulare Vorgänge während der B-Zellentwicklung in der Bursa Fabricii des Haushuhns mittels proteomischer Analysen zu charakterisieren. Hierfür wurden zunächst repräsentative Zeitpunkte der bursalen B-Zellentwicklung für die Probengewinnung definiert. Daran schlossen sich qualitative Proteomanalysen der Bursa Fabricii zu den gewählten Entwicklungszeitpunkten Embryonaltag 10 (ET10), Embryonaltag 18 (ET18), Tag 2 und Tag 28 nach dem Schlupf an. Diese erfolgten durch Vorfraktionierung der Proben mittels 1D-SDS-PAGE und nano-HPLC gefolgt von Tandem-MS-Analysen. Hierbei konnten für die bursalen Proteome zu jedem Zeitpunkt zwischen 1152 und 1392 Proteine identifiziert werden (FDR < 1 %). Überschneidungen der einzelnen Zeitpunkte in 537 allgemeinen Struktur- und Stoffwechsel-Proteinen berücksichtigt, wurden insgesamt 2214 verschiedene Proteine identifiziert. Eine zusätzliche qualitative Analyse aufgereinigter bursaler B-Zellen führte zur Identifizierung von 758 Proteinen. Durch genontologische Analysen konnte festgestellt werden, dass für das Zellwachstum verantwortliche Proteine va. zu den frühen Zeitpunkten zu finden waren, während Proteine, welche eine Rolle für das Immunsystem spielen, eher zu späteren Entwicklungszeitpunkten in Erscheinung traten. Dies spiegelt die Entwicklung der Bursa von der unreifen, embryonalen Wachstums- und Differenzierungsprozessen unterliegenden Bursaanlage, zum fertig ausdifferenzierten, primär-lymphatischen Organ auf molekularer Ebene wider. Konform zu den hohen Proliferationsraten der B-Zellen während der Bursaentwicklung fanden sich in den genontologischen Analysen der B-Zellen besonders hohe Anteile an Proteinen, welche für Zellteilung verantwortlich sind. Proteine, welche in Zusammenhang mit Zellmigration stehen, wurden vor allem in der B-Zell-Probe sowie an ET10 gefunden, was als Hinweis auf eine Beteiligung dieser Proteine an der Einwanderung der B-Zellen in die Bursaanlage betrachtet werden kann. Die anschließende quantitative Proteomanalyse wurde zu denselben Entwicklungszeitpunkten an je sechs biologischen Replikaten mittels 2D-DIGE durchgeführt. In der statistischen Auswertung der quantitativen Veränderungen zeigten sich 402 hochsignifikante Unterschiede zwischen den bursalen Proteomen der verschiedenen Entwicklungszeitpunkte, wobei die sehr große Übereinstimmung der Analyseergebnisse innerhalb der biologischen Replikate die gute Reproduzierbarkeit der Experimente belegte. Die deutlichsten Veränderungen zeigten sich zwischen ET10 und allen weiteren Zeitpunkten, wohingegen innerhalb der übrigen Stadien eine geringere Anzahl signifikanter Unterschiede nachgewiesen wurde. Für die 402 differentiell exprimierten Proteine konnten verschiedene charakteristische Protein-expressionsverläufe nachgewiesen werden, welche Rückschlüsse auf die biologischen Hintergründe ermöglichten. Durch massenspektrometrische Analysen der Proteine mittels MALDI-TOF/TOF und LC-MS/MS gelang es, 203 der 242 zur Identifikation vorgesehenen Spots zu identifizieren. Im Rahmen einer bioinformatischen Auswertung des erhaltenen Datensatzes erbrachten sowohl die genontologische Analysen als auch Pathway-Analysen wesentliche Anhaltspunkte für die Auswahl besonders interessanter und vielversprechender Proteine für weiterführende funktionelle Analysen. Unter den identifizierten, differentiell exprimierten Proteinen fanden sich auffällig viele Vertreter des Aktin-Zytoskelett-Pathways, welcher für die mechanische Stabilisierung von Zellen und deren aktive Bewegungen verantwortlich ist. Dabei fielen in dieser Arbeit sowohl Vinculin als auch Gelsolin durch ihre charakteristischen Expressionsmuster auf. Vinculin zeigte zu Beginn der embryonalen Entwicklung erhöhte Abundanzwerte, welche nach ET18 steil abfielen. Als fokales Adhäsionsprotein stellt es ein Schlüsselprotein in der Regulation der Übertragung von kontraktilen Kräften dar, welche die Voraussetzung für die Migration von Zellen sind. Gelsolin, ein wichtiges Apoptose-Effektorprotein, welches auch in Verbindung mit Zellmotilität gebracht wird, zeigte erhöhte Expressionslevel an ET18, welche über die nachfolgenden Entwicklungszeitpunkte abfielen. Gelsolin konnte in drei verschiedenen Ladungs-Isoformen detektiert werden. Für die Fragestellung dieser Arbeit interessant erschien weiterhin eine Gruppe differentiell exprimierter Proteine des Retinolsäure-Metabolismus. Im Einzelnen wurden die Retinaldehydrogenase 2 (ALDH1A2), das „retinol-binding protein 5“ (RBP5), das „fatty acid-binding protein 7“ (FABP7), und Transthyretin (TTR) mit ähnlichen Proteinexpressions-profilen detektiert, welche ihr Expressionsmaximum jeweils an ET10 aufwiesen. Das könnte ein Hinweis sein, dass die embryonale Entwicklung der Bursa Fabricii von ähnlichen Faktoren gesteuert ist wie die embryonale Ausbildung der sekundär-lymphatischen Organe beim Säuger, bei der Retinolsäure-abhängige Proteine eine entscheidende Rolle spielen. Über die Thematik dieser Arbeit hinausgehend, stellt der umfangreiche proteomische Datensatz dieser Arbeit eine wertvolle Ressource dar, die sowohl für weitere Fragestellungen bezüglich der Bursa Fabricii des Huhns, als auch für die Vervollständigung der Annotation des Hühnergenoms genutzt werden können.

Haematopoiese, die Bildung der Blutzellen aus haematopoietischen Stammzellen, ist ein Prozess, der im Knochenmark von Vertebraten stattfindet. Zur Steuerung von Erhalt, Differenzierung und Selbst-Erneuerung haematopoietischer Stammzellen ist das Einwirken diverser Faktoren aus verschiedenen zellulären Milieus von essentieller Bedeutung. Die Proteinfamilie der EBF (early B-cell factor) Transkriptionsfaktoren besteht aus 4 Mitgliedern, welche sowohl untereinander als auch evolutionär stark konserviert sind. Eine essentielle Rolle von EBF1 in der Haematopoiese, genauer in der Entstehung früher B-Zellen konnte bereits nachgewiesen werden. Die Expression von EBF2, einem weiteren Mitglied dieser Familie, konnte in haematopoietischen Organen wie dem Knochenmark, genauer in Osteoblasten, gezeigt werden. Ebf2-exprimierende osteoblastäre Zellen sind dem Endosteum angelagert und stellen eine molekulare Nische dar, die zum Erhalt haematopoietischer Zellen beiträgt. Wie gezeigt werden konnte ist die Anzahl von Osteoblasten proportional zur Anzahl haematopoietischer Stammzellen. Die gezielte Zerstörung von Ebf2 in mutanten Mauslinien führt dazu, dass es zu einer verminderten Anzahl haematopoietischer Stammzellen im Knochenmark kommt. Dieser Phänotyp beruht auf einer direkten Störung der stammzellunterstützenden Funktion von unreifen Osteoblasten in EBF2-defizienten Mäusen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Analyse EBF2-defizienter Zellen einen Beitrag zur besseren Charakterisierung der Stammzellnische leisten kann. Durch den Vergleich der Expressionsmuster von Ebf2+/- und Ebf2-/- osteoblastären Zellen der Maus konnte Ang1, ein Mitglied der RNAse5-Familie in EBF2-defizienten Zellen als vermindert exprimiert gefunden werden. Dieses sezernierte Protein spielt eine Hauptrolle bei der Bildung von Blutgefäßen. Auch ist bekannt, dass Ang1 an Zellen bindet, in diese eingebracht wird und dort durch die Stimulation der rRNA-Transkription die Ribosomenbiogenese und somit die Zellproliferation beeinflussen kann. Das verringerte Ang1-Level in der haematopoietischen Stammzellnische könnte so einen Einfluss auf die Proliferation der Stammzellen haben. Analysen dieser Arbeit identifizieren Ang1 als direktes Zielgen von EBF2. In vitro konnte durch eine gleichzeitige Verminderung der Expression von Ebf1, 2 und 3 in osteoblastären Zellen mittels RNAi eine weitere Verringerung der stammzellunterstützenden Funktion der Osteoblasten gezeigt werden. Um diesen Effekt in vivo untersuchen zu können, wurde ein Mausmodell zur gleichzeitigen Expressionsverminderung von Ebf1, 2 und 3 generiert.

Das Glioblastoma multiforme (GBM, WHO-Grad IV) ist ein äußerst aggressiver und stark vaskularisierter Tumor. Trotz multimodaler Therapiekonzepte mit chirurgischer Resektion, Bestrahlung und Chemotherapie haben die betroffenen Patienten eine schlechte Prognose von lediglich 9 bis 15 Monaten Überlebenszeit nach Diagnosestellung. Innovative Therapiekonzepte sind daher dringend erforderlich. Im Fokus dieser Arbeit stand das abnorme Gefäßsystem maligner Hirntumoren. Aufbauend auf einem besseren Verständnis der Gefäßbiologie dieser Tumoren wurden potenzielle Strategien für Diagnostik und Therapie entwickelt und evaluiert. Progenitorzellen aus dem Knochenmark sind in vielfacher Weise an der Neoangiogenese von Tumorgefäßen beteiligt. Immundefizienten Ratten wurden in dieser Arbeit primäre humane MSC systemisch appliziert, nachdem den Tieren zuvor ein humanes Gliom implantiert worden war. Die Rekrutierung der MSC in den Tumor wurde immunhistochemisch nachgewiesen. Die endotheliale Differenzierung der MSC konnte mit gentechnisch modifizierten MSC-Linien bestätigt werden. Diese Zellen enthielten einen Vektor mit dem Reportergen RFP (red fluorescent protein), dessen Expression unter der Kontrolle des endothelspezifischen Tie2-Promotor/Enhancer-Konstruktes steht. Darauf aufbauend wurde eine MSC-Linie etabliert, bei der statt des Reportergens RFP das Selbstmordgen HSV-TK unter der Kontrolle des Tie2-Promoters steht. Die Hypothese hierzu ist, dass nach systemischer Verabreichung dieser MSC durch Zugabe von Ganciclovir eine selektive Toxizität auf den Tumor bewirkt wird. Zur genaueren Charakterisierung der Gefäßstrukturen in Hirntumoren wurde die Expression Lymphgefäß-assoziierter Moleküle in Gewebe unterschiedlicher Gliome untersucht. Die lymphangiogenen Wachstumsfaktoren VEGF-C,-D und ihr Rezeptor VEGFR-3 zeigten im GBM hohe Expressionswerte. Die Expression von VEGFR-3 unterschied sich signifikant von der in niedriggradigen Astrozytomen (WHO-Grad II). Podoplanin war in allen Gewebeproben des GBM sehr hoch exprimiert, in einigen Zellen zeigte sich eine Co-Lokalisation mit Prox-1. Die Expression war allerdings nicht gefäßassoziiert, sondern ausschließlich auf den Tumorzellen zu finden. Eine streng endotheliale Lokalisation zeigte sich dagegen im anaplastischen Oligodendrogliom (WHO-Grad III), in dem Podoplanin mit VEGFR-3 co-exprimiert ist. Durchgehend negativ für Podoplanin waren alle untersuchten Astrozytome (WHO-Grad II). Für weiterführende Untersuchungen zur Funktion von Podoplanin wurden zwei GBM-Zelllinien etabliert, die einen Podoplanin-Überexpressionsvektor stabil exprimieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die zentrale Bedeutung des Gefäßsystems für das GBM. Es wurde gezeigt, dass MSC effektiv aus der Peripherie in den Hirntumor rekrutiert werden und dort aktiv an der Angiogenese beteiligt sind. MSC eignen sich somit, nach genetischer Modifikation, als Vehikel für therapeutisch wirksame Gene, mit denen das neu entstehende Gefäßsystem des GBM gezielt angegriffen werden kann. Für die entsprechenden in vivo-Versuche wurde bereits eine gentechnisch modifizierte MSC-Linie entwickelt und ein Therapieschema entworfen. Obwohl das Gehirn unter normalen Bedingungen kein Lymphgefäßsystem besitzt, wurden im Gewebe der malignen Hirntumoren in dieser Arbeit auch Lymphgefäß-assoziierte Moleküle nachgewiesen. Die Expression des Rezeptor-Liganden-Systems VEGFR-3/ VEGF-C,-D korreliert dabei mit dem Malignitätsgrad der Hirntumoren. Das gegensätzliche Expressionsmuster von Podoplanin könnte ein diagnostisches Kriterium darstellen, um Hirntumore mit unterschiedlichem Malignitätsgrad histopathologisch voneinander zu unterscheiden oder es könnte eine potenzielle Zielstruktur für neue Therapieansätze darstellen. Mit den etablierten GBM-Zelllinien steht ein Zellmodell zur weiteren Analyse der noch ungeklärten Funktion des Podoplanins im GBM zur Verfügung.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine schubweise auftretende Augenentzündung, die 10% der Pferdepopulation betrifft. Die Entzündungsschübe führen im Verlauf der Erkrankung zur Erblindung des Pferdes. Die intraokuläre Entzündung ist durch autoreaktive T-Zellen gekennzeichnet. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind weder die Ätiologie noch die Pathogenese dieser häufigen Erkrankung bislang eindeutig geklärt. Das Blut zirkuliert ständig im Körper und spiegelt dessen Zustand sehr genau wider. Deshalb stellt das Serum-/Plasmaproteom eine sehr vielversprechende Probe zur Entdeckung von Biomarkern dar, obwohl die Komplexität und enorme dynamische Bandbreite der Probe hohe Ansprüche an die Aufbereitungsmethode stellt. Die Unterschiede der Proteine im Serum bezüglich ihrer Menge, Struktur und Funktion können Hinweise auf pathologische Prozesse liefern. Ziel dieser Arbeit war es, durch quantitative Serumproteomanalyse mittels 2D-DIGE, Seren von an ERU erkrankten Pferden mit gesunden Kontrollseren zu vergleichen und differenziell exprimierte Proteine massenspektrometrisch zu identifizieren. Die Serumproben wurden vor der zweidimensionalen Gelelektrophorese mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um einen direkten quantitativen Vergleich der Proteine zu ermöglichen. Es wurde ein Experiment mit Vollserum und ein Experiment mit depletiertem Serum mit jeweils fünf Seren von an ERU erkrankten Pferden und fünf Kontrollseren durchgeführt. Die Serumdepletion der abundanten Serumproteine erfolgte mittels polyklonaler, an Trägerkugeln gekoppelter Hühnerantikörper. Insgesamt wurden 117 differenziell exprimierte Protein-Spots gefunden, von denen 32 Spots eindeutig massenspektrometrisch (MALDI-TOF/TOF) identifiziert wurden. Die 32 identifizierten Spots repräsentieren 17 verschiedene Proteine. Sieben der Proteine, nämlich Immunglobulin G4 und 7 hc, IGLV3-25, Immunglobulin M, Komplementfaktor B, Serotransferrin und Alpha-2HS-Glykoprotein waren in den ERU Seren deutlich höher exprimiert als in den gesunden Kontrollseren. Die anderen zehn Proteine, Pigment epithelium-derived factor (PEDF), Komplementfaktor 1 und C4, Kininogen-1, Apolipoprotein H und A-IV, Immunglobulin G5 hc, Albumin, Vitamin D binding Protein und Antithrombin III waren in den Seren von an ERU erkrankten Pferden niedriger exprimiert. Einige der differenziell exprimierten Proteine stehen funktionell mit dem Immunsystem und Entzündungsprozessen in Verbindung. Alle hier identifizierten differenziell exprimierten Proteine wurden bislang noch nicht im Serum von ERU oder humaner Uveitis beschrieben und sind damit potenzielle Kandidaten, die zur Aufklärung der Pathogenese auf molekularer Ebene beitragen oder als Marker fungieren können. Darüber hinaus stimmt die verringerte Expression von PEDF im Serum mit dem Expressionsmuster des Proteins im Zielorgan der Erkrankung, dem Auge, bei an ERU erkrankten Pferden überein. Da PEDF nun in dieser Studie auch in der Peripherie der erkrankten Tiere signifikant erniedrigt gefunden wurde, ist PEDF ein vielversprechender Marker. Es bedarf weiterer Validierung, um zu prüfen, ob PEDF als diagnostischer Marker genutzt werden kann.

Thu, 20 Dec 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8234/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8234/1/Raziorrouh_Bijan.pdf Raziorrouh, Bijan

Unsere Untersuchungen zeigen erstmalig eine Vierfach-Immunfluoreszenz auf humanen mesenchymalen Stammzellen. Dieses Verfahren ermöglicht es, die Zellen auf Einzelzellebene zu analysieren und die Lokalisation der nachgewiesenen Antigene zu untersuchen. Die markierten Proteine Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV und CD 44 gehören dabei zum typischen Expressionsmuster von mesenchymalen Stammzellen. Durch die Kombination von Filtersets und dem Einsatz des spektralen Bildanalyseprogramms SpectraView (ASI, Israel) gelang es selbst Wellenlängen, die näher als 20nm beieinander lagen, voneinander zu unterscheiden. Bei der Auswertung bestätigte sich, dass hMSC aus einem heterogenen Zellpool bestehen. Dies zeigte sich unter anderem in der unterschiedlichen Expression des Markers Kollagen IV. Erweitert man nun das Färbeprofil um zusätzlichen Marker, so können diese Zellen auf Einzelzellebene eingehender untersucht und von anderen Zellarten und Vorläuferstufen abgegrenzt werden. Die in dieser Arbeit neu für diese Applikation etablierte Methode stellt einen erfolgsversprechenden Ansatz zur Identifikation und Charakterisierung von humanen mesenchymalen Stammzellen dar.

Bei dem Kaposi-Sarkom (KS) handelt es sich um eine eng mit dem Humanen-Herpes-Virus 8 (HHV 8) assoziierte vaskuläre Neoplasie. Die Etablierung eines kommerziell erhältlichen, stabilen Antikörpers gegen das virale „Latenz-assoziierte-nukleäre Antigen“ (LANA) von HHV 8 ermöglicht den Nachweis HHV-8-infizierter Zellen an Ex-vivo- Paraffinmaterial. In dieser Arbeit wird diese Methode an einem Kollektiv aus insgesamt 61 Patienten mit HIV-assoziiertem KS angewendet, um einen Beitrag zur Beantwortung von bislang ungeklärten Fragen nach der quantitativen Verteilung von HHV 8 im Organismus und zur formalen Pathogenese des KS zu leisten. Das Kollektiv besteht aus diagnostischen Exzisaten (20 Früh- und 20 Spätstadien des KS) sowie aus 21 Sektionsfällen mit KS wovon Lympknoten, Leber-, Milz- und Lungengewebe untersucht wurden. Durch die Etablierung und Auswertung technisch aufwendiger immunhistochemischer Doppelfärbeexperimente mit dem viralen Protein LANA und verschiedenen strukturellen und regulatorischen Humanproteinen (CD31, CD34, Ki67 und p21) sowie durch die Anpassung des LANA-Nachweises an Autolyse- bzw. Sektionsmaterial kommen wir in der vorliegenden Arbeit zu folgenden Ergebnissen: Die KS-Progression geht von der Proliferation nicht-infizierter Zellen aus. Dies spricht für ein parakrin-stimuliertes KS-Wachstum und stützt Hypothesen, die das KS als viral-getriggerte, reaktive Angioproliferation einstufen. Außerdem unterscheidet dieser Befund das KS von dem ebenfalls HHV-8-assoziiertem „Primären Effusions Lymphom“ (PEL), dessen Progression ein autonomer Zellzyklus zugrunde liegt. Weitere Ergebnisse dieser Arbeit stützen die mittels In-vitro-Experimenten von Wang et al. aufgestellte Hypothese, dass HHV 8 das Expressionsmuster der infizierten Zellen in Richtung der endothelialen Vorläuferzelle verändert. Durch Koexpressionsexperimente mit Endothelzellmarkern kann außerdem gezeigt werden, dass die HHV-8-infizierten Zellen an der Gefäßbildung im KS direkt beteiligt sind. Schließlich lassen sich im Sektionsmaterial HHV-8-infizierte mononukleäre Zellen in mehreren Organen als disseminierte Einzelzellen außerhalb der klinisch/makroskopisch sichtbaren KS-Läsionen nachweisen, und es finden sich mikroskopisch kleine KS-Frühstadien. Der bisher nur in vitro durch den Nachweis von HHV-8-infizierten Zellen im Blut vermutete formalpathogenetische Weg, wonach HHV-8-infizierte mononukleäre Zellen zur Infektion der endothelialen KS- „Zielzellen“ beitragen, wird somit ex vivo an dem Untersuchungskollektiv histomorphologisch belegt.

Thioredoxin Reduktase 1 (Txnrd1) ist ein ubiquitär exprimiertes, Selen-haltiges Redoxenzym, welches ein Teil des Thiol-Redox-Systems ist und in dieser Funktion verschiedene intrazelluläre Substrate im reduzierten Zustand bewahrt. Man nennt dieses erzielte Gleichgewicht Redoxhomöostase. Dies ist sowohl für die Regulation verschiedener Gene als auch für das Zellwachstum und für den Schutz von Zellen vor oxidativem Stress von Bedeutung. Die Funktion der vorwiegend zytoplasmatisch lokalisierten Thioredoxin Reduktase 1 in den neuronalen Vorläuferzellen eines Mausmodells sollte durch eine gezielte Inaktivierung studiert werden. Als Hauptbefund stellte sich heraus, dass das Fehlen von Txnrd1 in neuronalen Vorläuferzellen zu einem ausschließlich im Kleinhirn lokalisierten Phänotyp führt. Dieser Phänotyp wird kurz vor der Geburt (Embryonaltag 18,5) in Form einer Retardation der Fissuren-Bildung sichtbar und setzt sich in der postnatalen Kleinhirn- Entwicklung fort. Die Knockout-Tiere bleiben in der Gewichtsentwicklung hinter den Kontroll-Tieren zurück und weisen eine massive Kleinhirn-Hypoplasie mit klinischen Begleiterscheinungen wie Ataxie und intermittierendem Tremor auf. Das Kleinhirn der Txnrd1-Knockout Tiere zeigt eine im Lobulus VI begrenzte klare Trennung zwischen einem gut organisierten posterioren und einem dysmorphen anterioren Bereich. In diesem anterioren Bereich sind die Lobuli fusioniert. Die Purkinje-Zellen besitzen degenerierte Dendriten und sind ektopisch lokalisiert. Die geordnete Laminierung der Schichten Str. moleculare, Str. ganglionare und Str. granulare des posterioren Teils setzt sich aufgrund fehlender Differenzierung von Str. moleculare und Str. granulare nicht nach anterior fort. Weiterhin fehlt im anterioren Bereich ab dem postnatalen Tag 1 die radiale Ausrichtung der für die Neuronen-Migration essentiellen Bergmann Glia. Die Dicke deren Ausläufer bleibt hinter der der Kontroll- Tiere zurück. Mitotisch stark aktive EGL (External Germinal Layer), aus der später die Körnerzellen hervorgehen, zeigt in diesem Bereich keine Schichtenbildung, sondern eine nesterartige Anordnung. Die EGL der Txnrd1-Knockout Tiere zeigt ab P1 weit weniger proliferationstypische Expressionsmuster in der Immunhistochemie als die der Kontroll-Tiere. Weiterhin wird durch molekularbiologische Untersuchungen deutlich, dass die gezielte Ausschaltung von Txnrd1 in neuronalen Zusammenfassung 95 Vorläuferzellen zu einer Veränderung in der Expression der für Nestin, GFAP und Pax6 kodierenden Gene im Gewebe des Kleinhirns führt. Somit konnte eine wichtige Rolle der Txnrd1 in der Kleinhirnentwicklung und dort vor allem im Aufbau der Zytoarchitektur des anterioren Bereichs nachgewiesen werden. Die Ergebnisse aus dieser Arbeit legen in Verbindung mit den Erkenntnissen aus einem postnatalen Neuronen-spezifischen Txnrd1-Knockout den Schluss nahe, dass eine Störung in der Morphogenese der Bergmann Glia als primäre Ursache für die Entstehung des entstandenen Phänotyps im Txnrd1-Knockout angesehen werden kann.

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine vielversprechende Quelle für eine spezifische Zellersatztherapie ischämischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das große therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen für klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewünschten Zelltyp zu isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen Oberflächenmarkers könnte die zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung eines gewünschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps mit hoher Ausbeute ermöglichen und damit eine wichtige Basis für künftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen Zellsortierung (MACS), dem gegenwärtigen Goldstandard einer zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Für MACS wurden ES-Zellen markiert, die ein intrazellulär trunkiertes CD4-Oberflächenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu können, erfolgte in einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellulären EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalität dieses Fusionsproteins wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung für die MACS-Aufreinigung, mit welcher Reinheiten von über 97% erzielt wurden. Die Expression des ∆CD4-Moleküls ohne EGFP-Anteil führte nach MACS zu über 98% positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten Reinheiten unabhängig von dem Differenzierungszustand der Zellen und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die Vitalität der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei embryonaler Keimblätter exprimierten. Parallel zur Etablierung der MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb Nkx2.5-Promotor über die Expression des in vivo-Markers EGFP in murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitätsprofil des Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen früher kardialer Marker zeigten, dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster dem früher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden Ansatz, kardiale Vorläuferzellen innerhalb des heterogenen Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren. Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System könnte die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung kardialer Vorläuferzellen aus humanen ES-Zellen ermöglichen. Dieser Ansatz könnte die Therapie ischämischer Herzmuskelerkrankungen mit embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen entscheidenden Schritt näher bringen.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt weltweit zu den häufigsten Karzinomen, in Europa macht es zwar nur 3% der Karzinome aus – jedoch mit steigender Inzidenzrate. Diese ist möglicherweise auf eine Infektionswelle mit Hepatitis B und C von 1950 bis 1980 zurückzuführen (29, 125). Daneben zählen chronischer Alkoholabusus, Aflatoxin B1-Exposition und Leberzirrhose per se zu den Hauptrisikofaktoren für die Entstehung des hepatozellulären Karzinoms. Die Kenntnisse der molekularen Mechanismen der Karzinogenese in der Leber, insbesondere der Dysregulation von Proliferation und Apoptose sind indessen noch sehr lückenhaft. Die vorgelegte Arbeit wurde mit dem Ziel durchgeführt, einen Beitrag zur Klärung der formalen und molekularen Pathogenese der Hepatokarzinogenese zu leisten. Es wurde das Proliferations- und Apoptoseverhalten im hepatozellulären Karzinom (HCC, n=52) über immunhistochemische Verfahren und TUNEL-Hybridisierung untersucht. Dabei wurde die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67, der Zellzyklus- und Apoptosekontrollproteine Fas-Rezeptor (Fas), Fas-Ligand (FasL), bax, bcl-2, p53 und der Apoptosemarker M30 und TUNEL mit normalem Referenzgewebe (RG, n=61), dysplastischen Knoten (DN, n=9), einem hepatozellulären Adenom (HCA, n=1), makroregenerativen Knoten (MRN, n=5), fokaler nodulärer Hyperplasie (FNH, n=3), undifferenzierten Karzinomen (n=2), einem cholangiozellulären Areal eines Kollisionstumors (n=1) und Metastasen primärer Lebermalignome (n=3) verglichen. Fragen waren dabei, - ob bestimmte Expressionsmuster der untersuchten Zellzyklus- und Apoptose-regulatoren kennzeichnend für die Hepatokarzinogenese sein könnten, - ob sich Hinweise auf eine Adenom-Karzinom- oder Dysplasie-Karzinom-Sequenz ergeben, - ob interindividuelle Unterschiede zwischen HCC abhängig von Ätiologie, histologischem Differenzierungsgrad, Tumorgröße, pT-Stadium und Morphologie bestehen und sich daraus Rückschlüsse auf ein jeweils charakteristisches tumorbiologisches Verhalten ziehen lassen, - ob sich aus den Ergebnissen relevante Schlussfolgerungen für Diagnostik und Therapie des Hepatozellulären Karzinoms ableiten lassen. Damit wird mit dieser Arbeit erstmalig eine komplexe Beleuchtung des Proliferations- und Apoptoseverhaltens im hepatozellulären Karzinom und in anderen Veränderungen der menschlichen Leber vorgelegt, die so bisher nicht vorgenommen wurde. Folgende Ergebnisse waren in der Auswertung der immunhistochemischen Untersuchungen festzustellen: HCC zeigten eine signifikant gesteigerte Ki-67-Expression, TUNEL-Positivität, bax-Expression, sowie eine signifikant verminderte Fas- und FasL-Expression gegenüber normalem Referenzgewebe (RG) (p

Thu, 16 Nov 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6106/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6106/1/Gebhard_Sonja.pdf Gebhard, Sonja

In der vorliegenden Arbeit sollten monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des humanen Notch 1 Rezeptors als Werkzeug für weitergehende Untersuchungen hergestellt werden. Dazu konnte erfolgreich ein Reinigungsprotokoll zur Aufreinigung eines rekombinanten Proteins aus dem extrazellulären Teil von Notch 1 etabliert werden. Das Austesten der Antikörper ergab, dass diese aufgrund von geringer Sensitivität im Western Blot nicht zu verwenden waren. Auch im FACS konnten sie nicht eingesetzt werden, da keine Bindung an natives Notch erfolgte. Daher wurde auf die Verwendung von mittlerweile verfügbaren Antikörpern gegen die intrazelluläre Notch Domäne zurückgegriffen. Damit konnte gezeigt werden, dass Notch 1 Rezeptor auf allen untersuchten Proben von primären Zellen exprimiert wird, sowie auf allen untersuchten Zell-Linien. Unter Verwendung von Notch 3 Antikörpern wurde die parallele Expression von Notch 1 und Notch 3 auf Zell-Linien analysiert und festgestellt, dass auf T-Zell-Linien Notch 1 und Notch 3 gleichzeitig exprimiert werden. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass Notch 3 wie Notch 1 einer S1 Prozessierung im Golgi-Netzwerk zu unterliegen scheint. Mit den intrazellulär bindenden Notch 1 Antikörpern konnte eine immunhistochemische intrazelluläre Notch 1 Färbemethode etabliert werden, die eine Untersuchung von (Tumor-) Gewebe erlaubte. Das unterschiedliche Expressionsmuster von Notch lässt auf unterschiedliche Mechanismen bei der Regulation von Zellwachstum und Differenzierung schließen. So konnte in Tumoren der Haut keine Notch 1 Expression gesehen werden, jedoch im Str. basale. In Zellen des Kolonadenoms dagegen war eine Notch 1 Expression zu erkennen. Zusätzlich zu der bereits in der Literatur ausführlich beschriebenen Rolle von Notch als Onkogen tritt, abhängig vom untersuchten System, Notch auch in der Rolle eines Tumorsuppressorgens auf. Allerdings kann durch eine immunhistochemische Untersuchung der Notch 1 Expression allein keine Aussage getroffen werden, ob eine Änderung der Notch Expression Ursache für einen Transformationsprozess ist, oder als Folge eines solchen Prozesses auftritt. Dennoch liefert die parallele Untersuchung von gesundem und Tumor-Gewebe einen ersten Hinweis auf eine wie auch immer geartetete Beteiligung des Notch Signalweges. Prinzipiell ist bei der Interpretation auch zu beachten, dass hier die Notch 1 Färbung keine Aussage über den Aktivierungszustand von Notch liefern kann, da nicht gesichert ist, ob und in welcher Quantität Notch im Zellkern mit dieser Methode nachweisbar ist.

Die vorliegende Dissertation untersucht mit Hilfe der Microarray-Technologie die Auswirkungen gängiger Zytostatika auf die globale Genexpression humaner Tumor- und Normalzellen und evaluiert deren Gemeinsamkeiten und Unterschiede. Darüber hinaus werden niedermolekulare Inhibitoren, die spezifisch gegen onkologische Targets gerichtet sind, in ähnlicher Weise analysiert und mit einer RNAi-vermittelten Herabregulierung desselben Zielmoleküls verglichen. Der Vergleich der Expressionsmuster lässt darauf schließen, inwieweit die Effekte verschiedener Substanzen übereinstimmen, und ermöglicht aufgrund dessen eine Aussage über ihre Spezifität.

Die zyklischen Aktivitäten in Ovar und Hoden der Maus sind von einer Reihe von proliferativen und apoptotischen Ereignissen gekennzeichnet. Dadurch werden diese Organe zu interessanten Studienobjekten wenn es gilt, eine Proteinexpression mit Funktionen zu verknüpfen. Corpora lutea z. B., vorübergehende endokrine Drüsen, die aus den Resten ovulierter Follikel entstehen, zeigen hohe Zellproliferationsraten und während der Regression eine ausgedehnte Apoptose. Im Hoden zeigt der Zyklus der Spermatogenese und der Tubuli seminiferi contorti ein System von dynamischen Wachstumsprozessen aber auch von Apoptose, beeinflusst von den Sertoli- und Leydig-Zellen. Die Epithelzellen im Nebenhoden durchlaufen im Rahmen der postnatalen Entwicklung eine rasche Proliferation und Ausbreitung. Von Galektinen glaubt man, dass sie an diesen zellulären Prozessen beteiligt sind. Um die Anwesenheit von Galektinen in diesen Organen zu überprüfen, wurden RT-PCR Analysen mit verschiedenen Galektin-spezifischen Primerpaaren durchgeführt. Dabei erhielten wir Signale von Galektin-1 und -3, bemerkenswerterweise aber auch von Galektin-2, -4, -6, -7, -8, -9 und -12. Zur Entschlüsselung der in vivo Funktion(en) eines bestimmten Galektins verglichen wir normale (C57BL/6NCrl, Gal-3 +/+) und Galektin-3 Knock-out Mäuse (C57BL/6NCrl, Gal-3 -/-). Als nächstes überprüften wir mit polyklonalen Antikörpern gegen Galektin-1, -3 und -7 die Proteinexpression im Western Blotting. Es zeigten sich verschiedene Ergebnisse für Galektin-1 und -3, und im Falle des Ovars ein sehr schwaches Signal für Galektin-7. In der im Folgenden durchgeführten Immunhistochemie zur Darstellung der zellulären Lokalisation ergaben sich verschiedene Färbemuster für die Galektine. Wie erwartet führte Anti-Galektin-3 IgG zu keinerlei Färbung beim Knock-out Tier (C57BL/6NCrl, Gal-3 -/-). Im Einzelnen zeigte sich eine diffuse Verteilung von Galektin-1 im ovariellen Stroma, daneben war es noch zusammen mit Galektin-7 im „ovarian surface epithelium“ zu finden. Galektin-3 hingegen fand sich v. a. in den Corpora lutea. Vermutlich wurde die Galektin-3-positive Reaktion durch Gewebemakrophagen verursacht, die positiv für Galektin-3 sind. Diese Zellen sollen eine Rolle bei der lutealen Regression haben, indem sie apoptotische Zellen phagozytieren, um eine entzündliche Reaktion zu verhindern. Im Hoden wurde Galektin-1 v. a. in den Sertoli- und Leydig-Zellen gefunden, Galektin-3 fand sich nur bei den Makrophagen in der Nähe der Leydig-Zellen. Während Galektin-1 eine Rolle als immunsuppressives Lektin beim spermatogenen Zyklus haben könnte, könnte Galektin-3 für die Funktion der Makrophagen im Hoden nötig sein, die die Entwicklung der Leydig-Zellen beeinflussen. Das spatiotemporale Expressionsmuster von Galektin-3 im Nebenhoden, v. a. im Nebenhodenkörper, könnte für die resorptiven und sekretorischen Prozesse von Bedeutung sein, die für eine optimale Umgebung zur Reifung und Lagerung der Spermien sorgen.

Die Generierung genetisch modifizierter Organspendertiere stellt eine Möglichkeit dar, die Überlebenszeit eines porcinen Xenotransplantats in einem humanen Empfänger zu verlängern. So könnte durch Transgenexpression von TGF-b1 oder TRAIL auf dem Xenotransplantat möglicherweise die zelluläre Abstoßungsreaktion inhibiert werden. Grundlagen zur Untersuchung dieser Strategien in-vivo wurden durch die hier analysierten Tiermodelle in Maus und Schwein geschaffen. In Mäusen wurde ein Modell eines Mifepristone-induzierbaren Genregulatorsystems etabliert, das die gewebespezifische und zeitlich kontrollierte Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 ermöglichen sollte. In diesem System sollte der chimäre Transaktivator GLVPc nur im Herzen exprimiert werden, und dieser sollte in doppelt-transgenen (dtg) Mäusen erst nach Verabreichung des Induktors Mifepristone eine auf das Herz beschränkte, zeitlich kontrollierbare Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 induzieren. Eine herzspezifische Expression sollte durch den murinen alpha myosin heavy chain (aMyHC)-Promotor erreicht werden. Schon die Analyse der einfach-transgenen Mauslinien ergab jedoch eine ubiquitäre Expression von mRNA des Transaktivators bzw. des konstitutiv aktiven TGF-b1 in allen untersuchten Organen. Außerdem wurde im Herzen von dtg Mäusen eine von der Mifepristone-Gabe unabhängige hohe Transgenexpression von TGF-b1 nachgewiesen und eine Expressionssteigerung von TGF-b1 nach Mifepristone-Gabe war nicht reproduzierbar. Auffällig war überdies die hohe Letalität dtg Mäuse innerhalb der ersten vier Lebenswochen. Somit wurde durch das verwendete Genregulationssystem keine auf das Herz beschränkte, zeitlich kontrollierbare Transgenexpression von TGF-b1 erreicht. Da jedoch konstitutiv aktives TGF-b1 im Myokard dtg Mäuse synthetisiert wurde, könnten diese Herzen dennoch für Transplantationsversuche verwendet werden. Dadurch wäre zumindest die Untersuchung der Wirkung von TGF-b1 auf das Transplantatüberleben möglich. Sollten transgene Schweine für die Expression von konstitutiv aktivem TGF-b1 erstellt werden, so wäre allerdings ein anderes bzw. modifiziertes Genregulationssystem zu verwenden, welches eine sichere zeitliche und gewebespezifische Kontrolle der TGF-b1-Expression gewährleistet. Des Weiteren dürfte der bei den Mäusen verwendete aMyHC-Promotor für eine hohe Transgenexpression im Schweineherzen nicht geeignet sein. Das untersuchte porcine Tiermodell umfasste verschiedene transgene Schweinelinien, die ein Expressionskonstrukt für humanen TRAIL unter der Kontrolle des murinen H-2Kb-Promotors integriert haben. Transgenexpression wurde in zahlreichen Organen mit höchsten Expressionsniveaus in Milz und Lunge detektiert, was auf eine gewebespezifische Expression des Transgens durch den murinen Promotor hinwies. Des Weiteren wurde humanes TRAIL-Protein nur in der Zellmembranfraktion von Gewebelysaten detektiert und sollte daher für eine Interaktion mit Rezeptoren zugänglich sein. Überdies war eine Regulation der humanen TRAIL-Expression durch den murinen Promotor in aktivierten transgenen Lymphozyten zu beobachten, welche erhöhte Expressionsniveaus gegenüber nicht stimulierten Lymphozyten aufwiesen. Daher kann vermutet werden, dass die humane TRAIL-Expression bei Auftreten von Entzündungsreaktionen erhöht sein dürfte. Die biologische Wirksamkeit des Transgens wurde durch einen TRAIL-spezifischen Apoptose-induzierenden Effekt von transgenen Lymphoblasten auf Jurkat-Zellen gezeigt. All dies sind Voraussetzungen für einen möglichen protektiven Effekt von humanem TRAIL zur Verhinderung einer Zell-vermittelten Xenotransplantatabstoßung. Die Selektion von bisher nicht oder wenig untersuchten Linien erfolgte durch Analyse der Transgenexpression auf peripheren Blutlymphozyten. Dies stellte einen Kompromiss dar, um kosten- und zeitsparend gut exprimierende transgene Schweine für die Zucht von homozygoten und/oder multitransgenen Tieren zu selektionieren. Nicht nur das Expressionsmuster von humanem TRAIL und die Regulation durch den H-2Kb-Promotor in transgenen Schweinen, sondern auch die Analyse der Sequenz und der Expression des endogenen porcinen TRAIL sind in Bezug auf ihren möglichen Einfluss auf des Überleben des Xenotransplantats von Interesse. Die Aminosäuresequenz von porcinem TRAIL hat 86 % Ähnlichkeit mit der von humanem TRAIL. Eine mögliche Interaktion von porcinem TRAIL mit humanen Rezeptoren ist anzunehmen. Außerdem wurde eine gewebespezifische und entwicklungsabhängige Expression von porcinem TRAIL in zahlreichen Organen nachgewiesen. Dies dürfte mit den verschiedenen Funktionen von porcinem TRAIL in Zusammenhang stehen.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen und molekularen Charakterisierung von humanen CD34- Zelllinien aus dem peripheren Blut (V54/1, V54/2) im Vergleich zu den aus dem Knochenmark etablierten Zelllinien (L87/4, L88/5). Die Klone V54/1 und V54/2 wurden aus dem peripheren Blut nach Stammzellmobilisierung und CD6 Depletion durch Zugabe eines Faktorengemisches aus IL-1b, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8 und IL-11 erzeugt. L87/4 und L88/5 hingegen sind adhärente und wachstumsarretierte Stromazellen, die die Erhaltung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen durch Mediatoren ermöglichen (Thalmeier et al. 2000). Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Stammzelleigenschaften bei den Zelllinien L87/4, L88/5, V54/1 und V54/2. Dazu soll die Färbung mit den Farbstoffen Rhodamin 123 (Rh123) und Hoechst 33342 zeigen, ob Subpopulationen innerhalb der Klone mit unterschiedlichen Färbeeigenschaften, bestehen. Die biologische Bedeutung der beiden Farbstoffe liegt darin, dass Sie dazu geeignet sind frühe Stammzellen zu identifizieren. Als Substrat der P-Glykoproteinpumpe, die u.a. auf frühen Vorläuferzellen mit stark erhöhter Repopulationskapazität gefunden wird, werden diese Farbstoffe aus der Zelle gepumpt. Der Farbstoff-Efflux kommt durch die mdr-Gen-kodierte (multi-drug-resistance) und Kalzium-abhängige P-Glykoproteinpumpe zustande. Das P-Glykoprotein hat neben der Bedeutung in der Stammzellbiologie in der angewandten Medizin eine wichtige Funktion in der Resistenzentwicklung von Tumoren. Des weiteren wurden bei den Zelllinien stammzellrelevante Oberflächenantigene (CD10, CD34, CD14, CD105, SH3 und CD117) untersucht, um Unterschiede zwischen L87/4, L88/5 und den Klonen V54/1, V54/2 zu erkennen. Versuche zur Induktion der Differenzierung sollten Hinweise auf die Plastizität der Zelllinien geben. Experimente an den durch den Rh123-Efflux unterscheidbaren Subpopulationen der Zelllinie V54/2 dienen der Aufklärung von Unterschieden in Morphe, zellulären Transportfunktionen und Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken. Methodisch wurde für die Analyse der Epitope und der Färbungen mit Rh123 und Hoechst 33342 ein Durchflußzytometer verwendet. Die Analyse der Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken wurde mittels Reverse Transkriptase Polymerase Ketten Reaktion durchgeführt. Die Ergebnisse der Färbeexperimente zeigten, dass bei allen untersuchten Zelllinien durch eine unterschiedliche Anfärbbarkeit der Zellen mit dem Farbstoff Rh123 zwei Subpopulationen unterschieden werden können. Die jeweils größere Subpopulation der Zelllinien färbt sich mit Rh123 an und bleibt auch nach einer definierten Inkubationszeit, die den Rh123-Efflux ermöglichen soll, gefärbt. Sie wird Rh123high genannt. Die übrigen Zellen, die bei allen Zelllinien unter 10% der Gesamtpopulation betragen, sind in der Lage den Farbstoff aus der Zelle zu pumpen. Diese Subpopulation wird Rh123low genannt und ist mit Stammzelleigenschaften wie tausendfach erhöhter Repopulationsfähigkeit in NOD/SCID-Mäusen assoziiert. Es konnte also innerhalb der untersuchten monoklonalen Linien eine Rh123low Subpopulation identifiziert werden, die sich durch zahlreiche biologische Eigenschaften von der Gesamtpopulation unterscheidet. Da der Rh123 Efflux durch eine Kalzium-abhängige Pumpe zustande kommt, lässt sie sich durch den Kalziumantagonisten Verapamil hemmen. Eine Hemmung der Pumpe bewirkt, dass die Rh123low Zellen nicht mehr in der Lage sind Rh123 aus der Zelle zu pumpen, so dass sie nach einer definierten Inkubationszeit mit Rh123 gefärbt bleiben. Neben diesem funktionellen Beweis für die P-Glykoproteinpumpe konnte durch den strukturellen Nachweis der Pumpe mittels eines Antikörpers gegen P-Glykoprotein ein definitiver Beweis für das Vorhandensein der aktiven P-Glykoproteinpumpe bei der Rh123low Population erbracht werden. Mit dem anderen Farbstoff Hoechst 33342 können die jeweiligen Anteile der Zelllinien in den einzelnen Stadien des Zellzyklus nachgewiesen und zudem ein kleiner Anteil an Zellen bestimmt werden, der als „Side Population“ (SP-Zellen) definiert wird. Diesen SP-Zellen werden Eigenschaften von aktiven Stammzellen zugeschrieben. Hierbei besteht ein Unterschied zwischen den aus dem Knochenmark und den aus dem peripheren Blut etablierten Linien, da die Zellen aus dem peripheren Blut nicht nur ein anderes Zellzyklusmuster aufweisen, sondern auch einen höheren Anteil an SP-Zellen besitzen. Es wurden vergleichende Untersuchungen zwischen den Zelllinien und zwischen den Rh123high und Rh123low Subpopulationen innerhalb einer Zelllinie mit Antikörpern gegen die Epitope CD14, CD45, HLA-DR, CD10, CD117, CD105 und SH3 durchgeführt. Dabei waren CD14 und CD45 auf allen Zelllinien negativ, wobei alle Zelllinien eine positive Expression für den mesenchymalen Marker Endoglin (CD105) und für SH3 (CD73) zeigten. CD117 konnte nur auf den aus dem Knochenmark etablierten Zelllinien L87/4 und L88/5 nachgewiesen werden. CD34, ein charakteristischer Marker für hämatopoetische Vorläuferzellen, aber auch für Endothelzellen, konnte nur auf den Zellen der Rh123low Subpopulation nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu exprimieren die Rh123high Zellen kein CD34. Da es sich bei den Zelllinien um Klone handelt, ist der Unterschied in der Expression von CD34 zwischen der Rh123low und der Rh123high Population ein deutlicher Hinweis auf die Plastizität der Zelllinien und das Fließgleichgewicht zwischen Rh123low und Rh123high. Durch eine Zellsortierung der Zelllinie V54/2 wurde die Rh123low von der Rh123high Subpopulation getrennt, um sie dann bezüglich ihrer Morphologie, dem Wachstum in Methylzellulose und der Expression ausgewählter Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken zu untersuchen. Dabei erhärtete sich die Hypothese, dass es sich bei der Rh123low Subpopulation um aktivere Zellen mit einer gesteigerten Expression von erythroid/myeloischen und mesodermalen Eingaben (z.B. VEGF, BMP-4), Rezeptoren (z.B. tie-1), vernetzter Transkriptionsfaktoren (z.B. GATA, ETS) und letztendlich Ausgaben (z.B. PECAM) handelt. Diese fungieren in Netzwerken mit dem Ziel, stammzellrelevante Funktionen zu ermöglichen. Die Morphologie zeigte in den Zytozentrifugationspräparaten deutliche Unterschiede zwischen Zellen der Rh123low und der Rh123high Subpopulation. Die Rh123low Subpopulation besteht aus lymphoid-ähnlichen Zellen, was für Zellen mit Stammzellfunktion charakteristisch ist. Die Rh123high Subpopulation dagegen hat ein insgesamt größeres Zellvolumen und einen gebuchteten Kern mit perinukleärer Aufhellung. Untersuchungen des klonalen Wachstums in der Methylzellulose ergaben bei keiner der Subpopulationen eine wesentliche Koloniebildung. Durch die Inkubation der Zelllinie V54/2 mit dem Neurotropen Wachstumsfaktor (NGF) konnte eine morphologische Änderung in Richtung einer neuronalen/glialen Differenzierung nach 8-12 Stunden induziert werden. Der immunhistochemische Nachweis von Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) bestätigte die mesenchymale Potenz zumindest in Richtung einer glialen Differenzierung. Das unterschiedliche Expressionsmuster ausgewählter, für die Differenzierung notwendiger Zusammenspieler innerhalb von Transkriptionsfaktor Netzwerken innerhalb der Rh123high und der Rh123low Population bei V54/2 war ein weiterer Hinweis, dass es sich bei der Rh123low Subpopulation um aktive Vorläuferzellen mit möglicher Stammzellpotenz handelt. In der Rh123low Subpopulation wurde im Gegensatz zur Rh123high Population eine Expression von BMP4, GATA1, GATA3 nachgewiesen, die essentiell für die Hämatopoese und für eine mesenchymale Differenzierung ist. Die Faktoren für GATA2, GATA3, beta globin, Elf-1 und PECAM1 wurden in einem stärkeren Maß in der Rh123low als in der Rh123high Population exprimiert. BMP-Rez., Myb, sowie die Endothel-assoziierten Faktoren Tie-1 und VEGF waren in beiden Subpopulationen gleich stark vorhanden. Bei den wenigen Funktionseinheiten der größeren und Rh123high Population handelt es sich vor allem um angiogenetische Faktoren, was auf eine limitierte Differenzierungseigenschaft der Rh123high Subpopulation und die enge Beziehung zwischen Blut- und Endothelzellen („Hämangioblast“) hinweist. Ein Nachweis für die Plastizität der Stammzellen innerhalb der von uns etablierten Zelllinien wurde dadurch erbracht, dass die zellsortierten Subpopulationen Rh123low und Rh123high nach dem Sortierexperiment getrennt rekultiviert wurden, wobei das Wachstum der Rh123low Subpopulation deutlich langsamer war als das der Rh123high Subpopulation. Nach zwei Wochen wurden die zellsortierten Subpopulationen erneut einer Rh123 Färbung unterzogen, wobei sich wiederum das ursprüngliche Verhältnis zwischen den Rh123low und Rh123high Subpopulationen einstellte. So kann man aus der Transdifferenzierung der Zelllinien von Rh123low in Rh123high und umgekehrt die Plastizität der hier untersuchten adulten Stammzelllinien ableiten. Die Ergebnisse sollen zum grundlegenden Verständnis der Biologie adulter (nicht embryonaler) Stammzellen beitragen und damit die Möglichkeit schaffen, adulte Stammzellen bzw. deren Subpopulationen gezielt für einen reparativen Gewebe- und Organersatz zu verwenden. Dabei liefern sie die Basis für weitergehende Untersuchungen zum besseren Verständnis der physiologischen und regenerativen Vorgänge, z.B. auch bei Alterung oder bei gesteigerter Funktion. Darüber hinaus kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse durch weitere Untersuchungen möglicherweise besser verstanden werden, ob es gelingen kann das Potential adulter Stammzellen zur therapeutischen Gewebereparation, z.B. zur Verhinderung oder Verringerung einer Narbenbildung, zu nutzen.

Hintergrund und Fragestellung: Die Konfrontation des Immunsystems mit einem definierten Antigen löst eine spezifische Immunantwort aus. Die daran beteiligten TH-Zellen können anhand der von ihnen sezernierten Zytokine in TH1- und TH2-Zellen sowie in weitere Subtypen differenziert werden. Dabei sind TH1-Zellen durch die Synthese von IFN-g charakterisiert, während TH2-Zellen vorwiegend Interleukin-4 produzieren. Die gezielte Auswanderung von TH-Zellen in inflammatorische Gewebe wird unter anderem durch Chemokinrezeptoren, welche chemotaktische Zytokine (sog. Chemokine) binden, gesteuert. TH1-Zellen exprimieren bevorzugt CXCR3 und CCR5, TH2-Zellen dagegen CCR3 und CCR4. TH-Zellen sind an der Pathogenese von Typ I Allergien entscheidend beteiligt. Für die Entwicklung der hinsichtlich der Ausbildung von Typ I Allergien protektiven TH1-Zellen scheint die Auseinandersetzung des Immunsystems mit mikrobiellen Antigenen in der allerfrühesten Kindheit notwendig zu sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in einem Pilotprojekt an einem Normalkollektiv zweijähriger Kinder das Expressionsmuster oben genannter Chemokinrezeptoren auf peripheren TH-Zellen zu analysieren. In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, ob ein positiver Zusammenhang zwischen TH2-assoziierten Chemokinrezeptoren und der Familienanamnese hinsichtlich atopischer Erkrankungen, der klinischen Diagnose einer atopischen Dermatitis und anderen in der Allergiediagnostik eingesetzten Parametern besteht, oder sich ein negativer Zusammenhang zwischen den TH1-assoziierten Chemokinrezeptoren und oben genannten Parametern zeigen lässt. Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob zwischen der Endotoxinexposition, als Proxy für die mikrobielle Exposition in den ersten Lebensmonaten, und dem Expressionsmuster der Chemokinrezeptoren ein Zusammenhang nachgewiesen werden kann. Ergebnisse:Die Chemokinrezeptoren CCR4, CCR5 sowie CXCR3 waren bei allen Probanden nachweisbar. CCR3 konnte bei acht von 37, IFN-g bei 33 von 42 untersuchten Probanden nachgewiesen werden. IL-4 war nicht nachweisbar. Es bestand ein positiver Trend in der Korrelation zwischen der mRNA-Expression von IFN-g und den Chemokinrezeptoren CCR5 (r=0,571) sowie CXCR3 (r=0,386). Ebenso zeigte sich ein positiver Trend in der Korrelation zwischen CCR5 und CXCR3 (r=0,273). Diese Zusammenhänge waren nicht statistisch signifikant. Dagegen korrelierte die CCR5 mRNA-Expression hochsignifikant (p=0,001) sowie die CCR4 mRNA-Expression grenzwertig signifikant (p=0,046) mit dem Endotoxingehalt in der Muttermatratze der Probanden. Schlussfolgerungen: ·In unstimulierten peripheren T-Helferzellen zweijähriger Kinder ist die Quantifizierung der Chemokinzeptoren CCR4, CCR5 sowie CXCR3 mit Hilfe der real-time RT-PCR möglich. IFN-g ist in der überwiegenden Anzahl der untersuchten Probanden nachweisbar, CCR3 nur bei wenigen, IL-4 bei keinem der Probanden. ·Die mRNA-Expression TH1-/TH2-assoziierter Chemokinrezeptoren in unstimulierten, peripheren T-Helferzellen ist für die Differenzierung von Kindern mit von Kindern ohne atopische Dermatitis nicht hilfreich. ·Dagegen scheint die mRNA-Expression von CCR5 als möglichem Marker einer TH1-Antwort mit dem Symptomenkomplex wheezing zu korrelieren. Dieser Befund muss in Studien mit großen Fallzahlen überprüft werden. Wheezing ist am häufigsten mit viralen Infektionen vergesellschaftet. Die weitere Nachuntersuchung der Kinder im Schulalter wird zeigen, bei welchen Kindern sich dennoch Asthma manifestiert. ·Die perinatale Endotoxin-Exposition ist mit einer erhöhten CCR5 mRNA-Expression peripherer TH-Zellen assoziiert. ·Damit deuten die Befunde auf eine Verwertbarkeit der CCR5 mRNA-Expression als TH1-Marker in unstimulierten peripheren TH-Zellen hin.

Seit der ersten Charakterisierung des Ih-Stroms wird dessen Funktion im Herzen, insbesondere während der langsamen spontanen Depolarisation im Sinusknoten kontrovers diskutiert. 1998 gelang es mehreren Arbeitsgruppen unabhängig voneinander, die entsprechenden Gene zu identifizieren, die für die Ih-Kanäle kodieren. Diese HCN-Genfamilie umfasst 4 Isoformen, wobei jede Isoform ein spezifisches Expressionsmuster besitzt. Im Säugetiersinusknoten konnte auf Transkriptebene gezeigt werden, dass HCN4 die dominante HCN Isoform darstellt. Um die physiologische Funktion von HCN4 aufzuklären wurden in der vorliegenden Arbeit Mäuse generiert und analysiert, die für diese HCN Isoform defizient sind. Es konnte gezeigt werden, dass HCN4 für die Funktion des sich entwickelnden kardialen Reizleitungssystems essentiell ist. Im Wildtyp Embryo wird HCN4 Transkript und Protein in der Region exprimiert, in der sich der Sinusknoten entwickelt. Mäuse die für den HCN4-Kanal ubiquitär oder herzspezifisch defizient sind, sterben zwischen ET 10,0 und 11,5. Histologische Untersuchungen an den HCN4-defizienten Tieren zeigten keine offensichtlichen morphologischen Defekte. Im Durchschnitt ist Ih in den Knock-out Kardiomyozyten um 85% reduziert. Die Herzen der HCN4-defizienten Mäuse schlagen signifikant langsamer als die von Wildtypen und können durch cAMP nicht stimuliert werden. Sowohl in Wildtypen als auch in HCN4-/--Mäusen konnten Kardiomyozyten mit einem "primitiven" Schrittmacherpotential detektiert werden. Hingegen sind Zellen mit einem ausgereiften Schrittmacherpotential, die im Wildtyp ab ET 9,0 auftreten, nicht im Knock-out zu finden. Deshalb ist der HCN4-Kanal für die Bildung von Schrittmacherpotentialen im sich entwickelndem Sinusknoten essentiell. Im adulten Tier wird HCN4 ausschließlich in Herzregionen exprimiert die spontane Aktivität aufweisen. Proteinexpression wurde sowohl im ganzen Sinusknoten als auch in isolierten Sinusknotenzellen, im AV Knoten und auf den Herzklappen nachgewiesen. Wegen der embryonalen Letalität des globalen HCN4 Knock-outs wurden mit Hilfe des Cre loxP Systems herzspezifische HCN4-defiziente Tiere hergestellt. Nach genauer Analyse von fünf verschiedenen Cre Transgenen konnte schließlich mit Hilfe der induzierbaren MerCreMer Maus die HCN4 Expression im Sinusknoten um etwa 90% reduziert werden. Mit diesen Tieren sollte es möglich sein, die Rolle von Ih im Herz zu untersuchen. Vorläufige in-vivo EKG Messungen ergaben aber Bemerkenswerterweise bisher noch keine Unterschiede zwischen Wildtyp und der herzspezifischen HCN4-MerCreMer-KO Maus.

Das Nierenzellkarzinom ist die häufigste neoplastische Erkrankung der Niere und stellt das siebthäufigste Malignom beim Mann dar, an der in Deutschland jedes Jahr mehr als 11 000 Menschen erkranken. Bei Erstdiagnose sind etwa 13 % der Karzinome bereits metastasiert. Die 1-Jahres-Überlebensrate dieser Patienten beträgt bei rein operativer Behandlung lediglich 15 %. Da das Nierenzellkarzinom keine Strahlensensitivität zeigt und gegenüber gängigen Chemotherapeutika refraktär ist, wird seit langem nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten gesucht. Hierbei wird berücksichtigt, dass das Karzinom zu der relativ kleinen Gruppe immunogener Tumoren gezählt wird, da es möglich ist in vitro eine Immunantwort gegen den Tumor zu induzieren. Zudem zeigen einige Patienten Remissionen von Primärtumoren oder Metastasen nach systemischer Gabe von IL-2, so dass scheinbar auch in vivo eine Immunantwort gegen den Tumor ausgelöst werden kann. Die Tumorgewebe weisen in den meisten Fällen außerdem eine sehr starke Infiltration von Lymphozyten auf, unter denen beispielsweise bereits Tumor-spezifische T-Zellen identifiziert werden konnten. Die Lymphozyten scheinen im Tumorgewebe allerdings inaktiv zu sein, da sie das Wachstum des Tumors in vivo nicht verhindern können. Die Erkennung und Bekämpfung der Ursachen für diese funktionelle Inaktivität der Lymphozyten könnte zu einer Entwicklung neuer immuntherapeutischer Ansätze führen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die NK-Zellen innerhalb der infiltrierenden Lymphozyten tatsächlich in einem funktionell inaktivierten Zustand vorliegen. Sie sind nicht in der Lage Zellen zu lysieren, selbst wenn diese keine MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren und deshalb von allen NK-Zellen erkannt werden sollten. Durch die direkte ex vivo-Isolierung der Lymphozyten konnte allerdings gezeigt werden, dass die infiltrierenden NK-Zellen durchaus eine maßgebliche Effektorpopulation bei der Eliminierung der Tumorzellen darstellen können. Ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen konnte bereits über eine Kurzzeitkultivierung der Zellen mit IL-2 induziert werden. Die infiltrierenden NK-Zellen waren in der Vergangenheit wenig untersucht worden, da viele Eigenschaften dieser Zellpopulation erst in den letzten Jahren charakterisiert wurden und sowohl Techniken als auch Reagenzien für ihre Beschreibung fehlten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine NK-Zell-Subpopulation, die durch die Expression des inhibitorischen Rezeptorkomplexes CD94/NKG2A charakterisiert ist, verglichen mit autologen peripheren Lymphozyten im Tumorgewebe überrepräsentiert ist. Die Charakterisierung weiterer phänotypischer und funktioneller Merkmale der infiltrierenden NK-Zellen ließ vermuten, dass sie sowohl durch das Expressionsmuster der inhibitorischen Rezeptoren, als auch durch die Expression bestimmter Zytokine wie IL-10 sowie durch ihre geringe zytotoxische Aktivität in situ eine Herabregulierung der Immunantwort im Tumorgewebe verursachen. Dass die NK-Zellen jedoch bereits über eine Kurzzeitstimulierung mit IL-2 aktivierbar waren, könnte erklären, warum die Immuntherapie an Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom über IL-2 auch in vivo Wirkung gegen die Tumoren zeigen kann. Die Aktivität der NK-Zellen nach dieser Stimulierung konnte allerdings nur dann festgestellt werden, wenn der Anteil der NK-Zellen innerhalb der TIL hoch lag. Somit konnte ein Zusammenhang zwischen der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen und ihrer Anzahl im Tumor festgestellt werden. Allerdings lag keine Korrelation mit der Größe und Ausbreitung des Primärtumors vor. Dies scheint nicht verwunderlich, da die NK-Zellen im Tumor funktionell inaktiv sind und den primären Tumor somit nicht bekämpfen können. Es wäre allerdings möglich, dass die Anzahl der NK-Zellen nicht nur mit ihrer Aktivierbarkeit im Tumor selbst in Zusammenhang steht, sondern bei diesen Patienten gleichzeitig eine generell bessere Aktivierbarkeit des Immunsystems gegen den Tumor wiederspiegelt. Bei verschiedenen anderen Tumortypen konnte bereits gezeigt werden, dass sowohl die Anzahl als auch die Aktivität der NK-Zellen für die klinische Prognose der Patienten entscheidend sein kann. Somit wäre möglich, dass ein hoher Anteil an NK-Zellen im Tumor einen prognostischen Faktor für das Ansprechen der Patienten auf die systemische Immuntherapie mit IL-2 darstellt und könnte helfen solche Patienten zu selektieren, die somit für diese Therapie mit den zum Teil schwerwiegenden Nebenwirkungen in Frage kommen. Eine Untersuchung dieses Zusammenhangs ist nun retrospektiv auf einfache Weise möglich, da in dieser Arbeit eine Methode dargestellt werden konnte, die es erlaubt die NK-Zellen erstmals über eine einfarbige immunhistochemische Färbung in asservierten Gewebeproben bereits vor längerer Zeit operierter Patienten spezifisch zu identifizieren und die Korrelation mit deren klinischem Krankheitsverlauf zu untersuchen. Bisher ist nicht geklärt, warum verschiedene Tumoren unterschiedliche Anteile infiltrierender NK-Zellen aufweisen. Neben einer verstärkten Einwanderung von NK-Zellen wäre es möglich, dass NK-Zellen in verschiedenen Tumoren unterschiedlich stark proliferieren können. Diese Tumoren weisen dann möglicherweise eine verminderte Fähigkeit auf, das Immunsystem zu unterdrücken und könnten auch aus diesem Grund eine bessere klinische Prognose für die Patienten darstellen. Die Ursachen für die unterschiedliche Aktivierbarkeit der NK-Zellpopulationen konnten bisher ebenso nicht geklärt werden. Hierfür würde sich anbieten, Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen NK-Zellpopulationen zu suchen, was beispielsweise mithilfe der Array-Technolgie bewerkstelligt werden könnte. Ein Zusammenhang zwischen der Anzahl der NK-Zellen im Tumor und der Prognose für die Tumorpatienten könnte bestätigen, dass die Population der NK-Zellen in vivo eine ausschlaggebende Effektorpopulation bei der Bekämpfung der Tumoren darstellen. Weiterhin wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen an infiltrierenden T-Zellen durchgeführt, die vermuten lassen, dass sowohl aktivierte T-Zell-Populationen als auch regulatorische T-Zellen im Tumorgewebe vorhanden sind. Dies konnte durch die Expression verschiedener Oberflächenmarker und Proteine wie beispielsweise Foxp3, das spezifisch von regulatorischen T-Zellen exprimiert wird, gezeigt werden. Die Anwesenheit verschiedener regulatorischer Zellen könnte einen entscheidenden Beitrag zu einer funktionellen Inaktivierung der Lymphozyten im Tumor und der damit verbundenen Toleranz gegenüber Tumorzellen leisten, da bereits gezeigt wurde, dass regulatorische Zellen beispielsweise die Immunantwort gegen Selbst-Antigene, die auch von Tumorzellen exprimiert werden, unterdrücken können. Erkenntnisse über die Eigenschaften infiltrierender Lymphozyten tragen entscheidend zu einem besseren Verständnis der immunologischen Vorgänge im Nierenzellkarzinom bei. Die in dieser Arbeit aufgezeigten Charakteristika der TIL und die Etablierung einer Methode für die spezifische Identifizierung der NK-Zellen im Gewebe könnten in Zukunft eine Grundlage für die Entwicklung neuer Immuntherapien darstellen, die eine gezielte Aktivierung des Immunsystems gegen den Tumor bewirken könnten.

Die Immunantwort auf ein Verbrennungstrauma beginnt im Moment der Verletzung und resultiert in einer Monozytenaktivierung, die mit einer vermehrten Synthese und Ausschüttung von inflammatorischen Mediatoren einhergeht. Unter physiologischen Bedingungen dient ein ausgewogenes Zusammenspiel von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen der Homöostase, wohingegen das Immunsystem nach massivem Trauma mit einer oft exzessiven Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren reagiert. Patienten mit schwerer Verbrennungsverletzung sind daher hochgradig gefährdet ein ausgedehntes „systemic inflammatory response syndrome, (SIRS)“, d. h. eine maligne Ganzkörperinflammation, eine Sepsis oder eine Multiorgandysfunktion, assoziiert mit einer hohen Letalität, zu entwickeln. Eine überwiegend antiinflammatorische Immunantwort dagegen manifestiert sich als systemische Immundefizienz und Anergie mit einer signifikant erhöhten Infektionsanfälligkeit. Es besteht eine eindeutige Ursache-Effekt-Beziehung zwischen Trauma und Zytokinsystem. Mechanischer Stress führt zu schweren Störungen der Interaktion von Monozyten und T-Zellen mit der Folge einer schwerwiegenden Immundysfunktion, wobei PGE2 als einer der Hauptmediatoren der traumainduzierten Immundepression angesehen wird. Erhöhte PGE2-Spiegel sind mit einer reduzierten T-Zellmitogenese, IL-2-Produktion und IL-2-Rezeptorexpression korreliert und für eine Verschiebung der T-Helfer-Aktivität in Richtung eines dominierenden TH2 Phänotyps mit erhöhter Synthese der immunsuppressiven Zytokine IL-4 und IL-10 verantwortlich. Zytokine sind für die Kommunikation im Immunsystem, vor allem bei der Koordination einer Immunantwort durch T-Lymphozyten, von entscheidender Bedeutung. Als sezernierte Proteine waren sie bis vor kurzem der durchflusszytometrischen Analyse nur begrenzt zugänglich. Wir konnten sie wie in vorliegender Arbeit beschrieben in fixierten Zellen intrazellulär nachweisen, d. h. vor der Sekretion. Dieses Verfahren erlaubte es uns, die Expression der Zytokingene quantitativ, kinetisch, korreliert mit Oberflächenproteinen und auf die Einzelzelle bezogen analytisch zu erfassen, zumindest bis zur posttranslationalen Ebene. In peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 10 Patienten mit schwerer Verbrennungsverletzung (KOF >30%) und 15 gesunden Kontrollpersonen wurde die Zytokinsynthese mit Ionomycin und PMA polyklonal induziert und die Zellen anschließend mit fluorochromkonjugierten monoklonalen Antikörpern gegen IL-2, IL 4 und IFN-g, sowie gegen CD4-, CD8-, CD45RA- und CD45RO-Zelloberflächenantigene in unterschiedlichen Kombinationen gefärbt. Massives Verbrennungstrauma führte nach polyklonaler Stimulation der T Lymphozyten zu teils signifikanten systemischen Veränderungen der Zytokinexpression in den Kulturüberständen. Verglichen mit einer exzessiven IL-4 Freisetzung und stark erhöhter IL-10 Sekretion zeigten die IFN-g- und die IL-2 Synthese eine nur mäßige Steigerung gegenüber den gesunden Kontrollen. Wir sahen somit eine traumatisch induzierte Veränderung des Zytokinprofils in Richtung eines überwiegend TH2-artigen, immunsuppressiven Phänotyps. Diese Verschiebung von einer eher zytotoxischen (TH1) zu einer weitgehend humoralen und daher abgeschwächten Immunantwort ist mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit verbunden. Mit der durchflusszytometrischen Einzelzellanalyse gelang uns dann erstmalig die Identifikation der CD8+ Zelle, die ursächlich für die gesteigerten Syntheseantworten im posttraumatischen Verlauf verantwortlich ist. Die Synthesekapazität der CD4+ T-Helferzellen blieb nahezu unverändert. Eine Ausnahme bildete die prozentuale Abnahme IFN-g positiver Gedächtniszellen (CD45RO+) zugunsten einer zunehmenden Zahl IFN-g produzierender naiver T Helferzellen (CD45RA+). In der CD8+ Subpopulation kam es in der ersten Woche nach Verbrennungsverletzung zu einer signifikanten Steigerung der IL-2, IL-4 und IFN-g de novo Synthese, die interessanterweise bei weiterer, differenzierter Analyse eine positive Korrelation mit dem klinischen Verlauf ergab. Patienten, die verstarben, zeigten im Vergleich zu den Überlebenden signifikant erhöhte IL-4 und IL-2 Syntheseraten der CD8+ Zellen. Betrachtet man die IL-2 Synthese dieser CD8+ Zellen genauer, nahm nur die Zahl IL-2-produzierender CD8+CD45RA+ Zellen signifikant zu, verglichen mit dem Kontrollkollektiv, wobei beide Patientenkollektive an dieser Entwicklung partizipierten. Auch die IFN-g Synthese der CD8+CD45RA+ Subpopulation zeigte an allen Tagen post Trauma eine signifikante Zunahme gegenüber den Kontrollen ohne aber mit der Überlebensrate zu korrelieren. Dagegen war der prozentuale Anteil IFN-g produzierender CD8+ CD45RO+ Zellen von Verstorbenen signifikant gegenüber den Überlebenden reduziert und blieb auch an allen Untersuchungstagen deutlich hinter dem Kontrollniveau zurück, das von den überlebenden Patienten z. T. signifikant übertroffen wurde. Neben der funktionellen Charakterisierung über die Zytokinexpression (intrazellulär) kann der Aktivierungsstatus des Immunsystems durchflusszytometrisch auch über eine Oberflächenphänotypisierung ermittelt werden, ohne aber damit funktionell unterschiedliche Subpopulationen von T Zellen definieren zu können. Einen ersten Hinweis auf die Aktivierung des Immunsystems von Verbrennungspatienten erhielten wir über die signifikante Zunahme von IL-2Ra (CD25) tragenden T-Zellen in der ersten Woche nach Trauma. Aktivierte T-Zellen exprimieren darüberhinaus MHC-Klasse II-Moleküle und verschiedene Adhäsionsmoleküle, denen bei der Wechselwirkung der Zellen entscheidende Bedeutung zukommt. Akzessorische Moleküle erhöhen beispielsweise die Avidität der T-Zell-APC Interaktion und wirken kostimulatorisch. Wir konnten nach schwerer Verbrennungsverletzung eine verstärkte Expression des vorherrschenden T-Zellrezeptors (TCR) a/b und der akzessorischen T Zellmoleküle CD2, CD7, CD28, CD29 und CD80 nachweisen. Die Zunahme von CD28-Molekülen auf der Oberfläche von CD4+ und CD8+ T-Zellen ist besonders bemerkenswert, da mit zunehmender Signalstärke des über CD28 vermittelten Signals die Differenzierung einer T-Zelle auf die TH2-Entwicklung ausgerichtet wird. Die Aktivierung von T-Lymphozyten ist außerdem mit markanten Veränderungen im Expressionsmuster einzelner CD45 Isoformen verknüpft. Die Induktion der CD45RO Isoform und der Verlust von CD45RA waren beim Schwerstverbrannten besonders auffällig. Die durchflusszytometrische Bestimmung des Aktivierungsstatus des Immunsystems hat unseres Erachtens das Potenzial einer Standardmethode zur Ermittlung von Hochrisikopatienten mit deren Hilfe immunsupprimierte Patienten und solche mit SIRS und Sepsis unterschieden werden können. Die zentrale Vorbedingung für eine effektivere Sepsistherapie stellt eine verbesserte Diagnostik im Sinne kontinuierlicher zellbiologischer Informationen („Online-Monitoring“) am Krankenbett dar, um die meist sehr schnell wechselnden immuninflammatorischen Zustandsbilder direkt zu erkennen und einer zeitgerechten, individuell adaptierten Behandlungsintervention zuzuführen.

Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands. Vorraussetzung für eine erfolgreiche Infektion sind Fusion zweier kompatibler, haploider Zellen und die folgende Ausbildung eines dikaryotischen Filaments. Diese Prozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der a-Locus kodiert für ein biallelisches Pheromon/Pheromonrezeptor-System, das die Zell/Zell-Erkennung und die Zellfusion reguliert. Die folgende pathogene Entwicklung wird durch den multiallelischen b-Locus kontrolliert, der für zwei Homeodomänenproteine kodiert, bW und bE. Nach der Fusion der haploiden Sporidien können sich bE/bW-Heterodimere ausschließlich aus bW und bE-Proteinen unterschiedlicher Allele bilden. Diese regulieren das filamentöse Wachstum, die Penetration der Pflanzenoberfläche, das Wachstum in der Pflanze und die Tumorinduktion. Das Ziel dieser Arbeit war es, regulatorische Gene aus U.maydis zu identifizieren, die an der Kontrolle der b-abhängigen, pathogenen Entwicklung beteiligt sind. Es wurde versucht, in einem direkten Selektionsprozess haploide, pathogene Stämme zu isolieren, die aus einer REMI-Mutagenese hervorgingen. Um eine möglichst breite Mutagenese zu erreichen, wurde eine neuartige Mutagenesestrategie angewandt, die neben Geninaktivierung ("loss of function") auch eine mögliche Aktivierung der Genexpression der betroffenen Loci ("gain of function") berücksichtigte. In einer weiteren UV-Mutagenese wurden durch Nutzung von egl1 als Reportergen Stämme isoliert, die EG-Aktivität zeigten. Die Expression des b-abhängigen, aber vermutlich nicht direkt durch das bE/bW-Heterodimer regulierten Gens egl1 sollte dabei eine Mutation in einem regulatorischen Gen anzeigen, das wiederum unter der Kontrolle von b stehen könnte. Es wurde angenommen, dass die interessantesten Stämme neben egl1 weitere b-abhängige Gene exprimieren. Eine komplexe Deregulation der Genexpression b-abhängiger Gene in haploiden Zellen sollte die Zentralität des betroffenen Regulators innerhalb der b-Regulationskaskade anzeigen. Die Komplementation des Stammes MR9-1 führte zur Isolierung eines regulatorischen Gens. hda1 kodiert für ein Protein mit signifikanter Homologie zu Histondeacetylasen und ist an der Kontrolle der differentiellen Genexpression in haploiden und dikaryotischen Zellen, und später an der Sporenentwicklung im Tumor entscheidend beteiligt. Hda1 wirkt in haploiden Zellen nicht als genereller Regulator der Genexpression, sondern bestimmt ein spezifisches Set von hda1-abhängigen Genen, das sich vornehmlich aus b-abhängigen Genen und den b-Genen selbst zusammensetzt. Haploide ∆hda1-Stämme vollziehen nicht die pathogene Entwicklung; nur dikaryotische ∆hda1-Zellen führen zur Tumorentwicklung, leiten jedoch nicht die Bildung von Sporen im Tumorgewebe ein. Funktionelle und biochemische Analysen zeigen in haploiden Zellen einen hochmolekularen Hda1-Komplex, der vermutlich den Aufbau einer höher geordneten Chromatinstruktur an regulatorischen Sequenzen bestimmt. Vermutlich kann Hda1 über einen Deacetylierungsmechanismus regulatorischer Sequenzen zur Repression b-abhängiger Gene führen.

Die Eph-Familie von Rezeptortyrosinkinasen und ihre Liganden, die Ephrine, sind die größte Gruppe von axonalen Zielführungsmolekülen. Die membrangebundenen Ephrine und ihre Rezeptoren sind jedoch nicht ausschließlich für die Etablierung neuronaler Konnektivität, sondern auch für Entwicklungsvorgänge außerhalb des Nervensystems wie die Ausbildung des Blutgefäßsystems und die Steuerung von Zellmigration von Bedeutung. Als charakteristisches Merkmal dieser Molekülfamilie kann jeder einzelne Rezeptor durch eine Vielzahl verschiedener Ephrine aktiviert werden, was eine starke funktionelle Redundanz zur Folge hat. Konventionelle knock-out Experimente liefern daher nur ein unvollständiges Bild von der Funktion dieser Proteine, da eine genetische Deletion von Einzelmolekülen zumindest partiell von anderen Vertretern der Eph-Familie kompensiert werden kann. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine transgene Mauslinie etabliert, welche im gesamten Nervensystem ein sezerniertes, Antikörper-ähnliches Fusionsprotein, einen sog. Rezeptorkörper, exprimiert. In dieser Mauslinie sollte der Rezeptorkörper alle Ephrine der sog. A-Subfamilie zugleich binden und neutralisieren, und damit die funktionelle Redundanz der A-Ephrine überwinden. Hierzu wurde in einem ersten Schritt der Rezeptorkörper kloniert, in Zellinien exprimiert und hinsichtlich seiner Funktionalität charakterisiert. In einem zweiten Schritt wurde nun das Mikrotubuli bindende Protein Tau gegen die cDNA des Rezeptorkörpers ersetzt (sog. knock-in), und nach Keimbahntransmission des rekombinanten Allels wurde durch Rückkreuzung gegen den Inzuchtstamm C57BL/6 eine congenische Mauslinie erzeugt. In dieser Mauslinie wurde der Rezeptorkörper mit dem räumlich-zeitlichen Expressionsmuster von tau exprimiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden einige Eigenschaften der knock-in Mauslinie charakterisiert. Die vollständige Deletion des Tau-Proteins sowie die pan-neuronale Expression des Rezeptorkörpers wurden mit Hilfe von Northern-Transfer, mRNA in-situ Hybridisierung, RT-PCR sowie mit Western-Transfer und immunhistochemischen Experimenten belegt. Tiere mit dem rekombinanten Allel waren fertil, zeigten keine Hinweise für eine erhöhte prä- oder postnatale Letalität, und das äußere Erscheinungsbild der Mäuse war weitgehend unauffällig. Eine erste Analyse der Hirnanatomie mit Hilfe klassischer histologischer Färbemethoden lieferte keine Hinweise auf starke, offensichtliche morphologische Veränderungen. Mit einem Immunassay wurde die Gewebekonzentration des Rezeptorkörpers zu verschiedenen embryonalen und postnatalen Entwicklungsstufen quantifiziert. Auf subzellulärer Ebene wurde mittels immuncytochemischer Färbungen dissoziierter Neuronen demonstriert, daß der Rezeptorkörper nicht auf das Soma der Zellen beschränkt, sondern auch in Nervenfortsätzen lokalisiert war. Die Analyse der Mauslinie auf spezifische Veränderungen im dritten Teil der Arbeit konzentrierte sich auf sensorische Projektionen in Peripherie und Rückenmark, sowie auf physiologische Aspekte des visuellen Systems und Blutgefäße. In neugeborenen Tieren wurden keine offensichtlichen Veränderungen der topographischen Projektionen von Spinalganglien in das Rückenmark detektiert. In der Peripherie wurde in dem knock-in hingegen eine signifikante Zunahme von Nervenverzweigungen in verschiedenen Strukturen beobachtet, die bei der Innervierung von Extremitäten sowie bei Interkostalnerven zwischen dem 12. und dem 14. Tag der Embryonalentwicklung (E12-14) besonders ausgeprägt war. Die Untersuchung der Blutgefäße im zentralen Nervensystem adulter Mäuse mit Hilfe von Korrosionsausgüssen ließ in der Mutante keine offensichtlichen Veränderungen erkennen. Mit Hilfe der in Anwendung auf Mäuse neuartigen Technik „Intrinsic Signal Optical Imaging“ wurde die Repräsentation der Retina im Primären Visuellen Cortex juveniler und adulter Mäuse untersucht. Zentraler Befund dieser Experimente war eine Verzerrung der retinotopen Karte in dem knock-in, die in jungen Mäusen erheblich stärker war als in adulten Tieren.

Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) stellen die unkontrollierte Proliferation und Reifungsblockade myeloider Vorläuferzellen, Expansion dieser Zellen in das periphere Blut, extramedulläre Manifestationen und verminderte Elimination der Leukämiezellen durch das Immunsystem grundlegende Pathomechanismen dar. Diese Vorgänge werden über ein komplexes Zusammenspiel von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen reguliert. In dieser Arbeit wurde daher mittels Durchflußzytometrie die Expression von Zytokinrezeptoren, Adhäsions- und kostimulatorischen Molekülen in Knochenmarks(KM-) Proben von 103 AML-Patienten bei Diagnosestellung und acht gesunden Probanden untersucht. Zytokinrezeptoren weisen bei der normalen Hämopoese ein reifegradabhängiges und linienspezifisches Expressionsmuster auf. Es wurden daher zum einen Zytokinrezeptoren ausgewählt, die schon in der frühen Hämopoese exprimiert werden, wie der SCF-R (CD117), FL-R (CD135), IL-3-R (CD123) und zum andern Zytokinrezeptoren, die erst in späteren Differenzierungsstadien der monozytären Zelllinie (v.a. GM-CSF-R; CD116) und der granulozytären Zelllinie (v.a. G-CSF-R, CD114) exprimiert werden. Die gp130-Subunit (CD130) stellt die signaltransduzierende Untereinheit von IL-6, IL-11, LIF etc. dar und wirkt synergistisch auf allen Stufen der Hämopoese mit. Die untersuchten Adhäsionsmoleküle wurden in drei Gruppen unterteilt: a) Adhäsionsmoleküle, die den Kontakt zur KM-Matrix oder zu sich selbst beeinflussen: VLA-2 (CD49b), VLA-3 (CD49c) und die erst kürzlich auf hämopoetischen Zellen gefundenen Adhäsionsmoleküle PRR-1 und PRR-2. b) Adhäsionsmoleküle, die den Kontakt zum Endothel fördern: LFA-1 (CD11a), Mac-1 (CD11b), L-Selektin (CD62L) und UPA-R (CD87) c) kostimulatorische Moleküle, die eine Rolle bei der Interaktion der Leukämiezellen mit immunkompetenten Zellen spielen: ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), B7-1 (CD80), B7-2 (CD87) und NCAM (CD58). Eine KM-Probe wurde als positiv gewertet, wenn mehr als 20% der Blasten im Auswertefenster den entsprechenden Marker exprimierten. Ergebnisse: Der durchschnittliche Anteil Zytokinrezeptoren exprimierender Zellen war in KM-Proben von AML-Patienten deutlich höher als in KM-Proben von gesunden Probanden. Einzige Ausnahme bildete die gp130-Subunit, die nur auf durchschnittlich 4% der AML-Blasten exprimiert wurde, während durchschnittlich 23% der Zellen in gesunden KM-Proben die gp130-Subunit exprimierten. Bei den Adhäsionsmolekülen zeigte sich im Vergleich zu den gesunden KM-Proben bei der AML ein höherer Anteil von Zellen, die kostimulatorische und Endothel-Kontakt-fördernde Moleküle exprimierten, während der Anteil von Zellen, die das Stroma-Kontakt-fördernde ß1-Integrin VLA-2 exprimierten, vermindert war. VLA-3 konnte dagegen in keinem der untersuchten AML-Fälle und der gesunden KM-Proben als positiv gewertet werden. Innerhalb der AML-Subtypen konnte ein reifegrad– und linienabhängiges (monozytäres, granulozytäres) Verteilungsmuster der Zytokinrezeptoren festgestellt werden: Blasten unreifer Leukämien (M0; M1) exprimierten bevorzugt SCF-R und FL-R. Blasten von AML-Subtypen, die der granulozytären Differenzierungslinie zugeordnet werden (M2, M3), exprimierten v.a. G-CSF-R. Blasten monozytärer Leukämien (M4, M5) exprimierten v.a. GM-CSF-R und FL-R. Der IL-3-R wurde in fast allen AML-KM-Proben auf einem Großteil der Blasten exprimiert. Den größten Anteil positiver Zellen für Adhäsions- und kostimulatorische Moleküle (Integrine, B7-2, NCAM, UPA-R) wiesen die monozytären Leukämien auf. B7-1 wurde v.a. auf Blasten des FAB-Typs M3 exprimiert. L-Selektin, ICAM-1 und PRR-1/PRR-2 zeigten eine variable Expression innerhalb aller FAB-Typen. In der Gruppe der sekundären Leukämien waren signifikant mehr Fälle Mac-1-positiv als in der Gruppe der primären Leukämien (p = 0.074, Qui2-Test). Ansonsten zeigten sich zwischen primären und sekundären Leukämien keine signifikanten Unterschiede. Wichtig für die Entscheidung über Art und Intensität der Therapie bei der AML ist das Abschätzen der Prognose eines Patienten bei Diagnosestellung. Bislang werden Patienten v.a. anhand zytogenetischer Untersuchungen von Karyotypanomalien in Prognosegruppen eingeteilt. Da aber nur ca. 50-60% der AML-Patienten chromosomale Veränderungen aufweisen, besteht ein Bedarf an Karyotyp-unabhängigen Prognosekriterien. Zytogenetische Analysen wurden bei allen AML-KM-Proben durchgeführt und die Expression der Marker sowohl mit den zytogenetischen Risikogruppen als auch mit dem tatsächlichen klinischen Verlauf der Patienten korreliert. In die klinische Auswertung wurden nur Patienten (n = 55) eingeschlossen, die nach dem Therapieprotokoll der German AML-Cooperative-Group behandelt worden waren. In der zytogenetisch günstigen Prognosegruppe zeigten sich im Vergleich zur zytogenetisch ungünstigen Prognosegruppe signifikant mehr G-CSF-R-positive Zellen (p = 0.027, T-Test), signifikant weniger L-Selektin-positive Fälle (p = 0.037, Qui2-Test) und signifikant mehr Mac-1- und PRR-1-positive Fälle (p = 0.005; p = 0.009; Qui2-Test). Diese Marker zeigten aber keine signifikanten Unterschiede bezüglich Remissionrate und progressfreier Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten. Dies läßt sich auf die zum Teil geringe Fallzahl und die kurze Beobachtungsdauer von im Mittel 11 Monaten nach Remission erklären. Andere Marker zeigten dagegen keine Korrelation mit den zytogenetischen Risikogruppen, dagegen aber mit dem tatsächlichen klinischen Verlauf der Patienten: VLA-2-, NCAM-, UPA-R-positive Leukämien zeigten eine signifikant niedrigere Remissionsrate (p = 0.049, p = 0.03, p = 0.03, Qui2-Test). Patienten, in deren KM-Proben >85% der Blasten den FL-R oder >45,5% den SCF-R exprimierten, wiesen eine signifikant niedrigere Wahrscheinlichkeit für progressfreies Überleben auf, ebenso wie Patienten, in deren KM-Proben >60,5% der Blasten ICAM-1-, >15% B7-1-, >65% B7-2- und >8% NCAM-positiv waren. NCAM korrelierte als einziger Marker negativ sowohl mit der Remissionsrate, als auch mit der progressfreien Überlebenswahrscheinlichkeit, allerdings nicht mit der Einteilung in zytogenetische Risikogruppen. Auch für die übrigen Marker konnten Cut-off-Werte für den Anteil Marker-positiver Blasten ermittelt werden, bei denen aus dem Vergleich der entstandenen Gruppen ein deutlicher Unterschied in der Dauer der progressfreien Überlebenszeit hervorging. Diese Unterschiede waren allerdings aufgrund der geringen Fallzahl nicht signifikant, so dass sich eine eindeutige prognostische Aussagen nicht treffen ließ. Dabei wiesen Patienten mit einem höheren Anteil von G-CSF-R-, GM-CSF-R- und einem niedrigeren Anteil von IL-3-R-exprimierenden Blasten eine längere progressfreie Überlebenszeit auf. Patienten mit sehr hohem Anteil PRR-2- oder mit geringem Anteil PRR-1-positiver Blasten tendierten zu einer eher kürzeren progressfreien Überlebenszeit. Umgekehrt wies eine niedrige Expression von Endothel-Kontakt fördernden Oberflächenmolekülen, wie z.B. L-Selektin, Mac-1 und UPA-R auf eine schlechte Prognose hinsichtlich der Dauer des progressfreien Überlebens hin. Therapeutische Konsequenzen: Die in dieser Arbeit aufgezeigten Zusammenhänge zwischen der Expression bestimmter Oberflächenmarker und dem klinischen Verlauf der Patienten helfen, die Prognoseeinschätzung von Patienten - über die Zytogenetik hinaus - weiter zu spezifizieren: So stellt die NCAM-positive Leukämie eine eigene Entität mit prognostisch schlechtem Verlauf unabhängig vom Karyotyp dar. Bei UPA-R- und/oder VLA-2-positiven AML-Fällen sollten aufgrund der verminderten Remissionswahrscheinlichkeit intensivere therapeutische Induktionstherapien eingeleitet werden. Für die Remissionsdauer ist sowohl die hohe Expression kostimulatorischer Moleküle, als auch die hohe Expression von Zytokinrezeptoren, die v.a. auf Stammzellebene wirksam sind und die die Expression von diesen kostimulatorischen Molekülen fördern, prognostisch ungünstig. Diese Patienten sollten bei intensiver Konsolidierungstherapie engmaschig kontrolliert werden und die Indikation zur Knochenmarkstransplantation sollte frühzeitig gestellt weren. In der Zytokintherapie werden G-CSF und GM-CSF regelmäßig in der Klinik zur Verkürzung der Neutropeniephase nach Chemotherapie eingesetzt. Dagegen konnte mit dem Einsatz von G-CSF und GM-CSF als Priming-Medikamente bisher noch kein eindeutiger klinischer Benefit für die Patienten erzielt werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse einer linienspezifischen und reifegradabhängigen Expression der Zytokinrezeptoren legen nahe, dass G-CSF als Primingmedikament v.a. bei granulozytär-differenzierten AML-Subtypen und GM-CSF eher bei monozytär-differenzierten AML-Subtypen eingesetzt werden sollte. In der Supportivtherapie, bei der die Stimulation von AML-Blasten nicht mehr gewünscht ist, sollten G- und GM-CSF genau umgekehrt eingesetzt werden. Da eine hohe Expression von FL-R und SCF-R mit einer schlechten Prognose für die Dauer des progressfreien Überlebens korrelierte, kann sich eine Stimulation dieser Rezeptoren durch die Gabe von SCF und FL in der Supportivtherapie eher ungünstig auswirken, ebenso wie beim Priming, da auch gesunde Stammzellen stimuliert und damit sensibler gegen Zytostatika werden. Darüber hinaus geben diese Ergebnisse auch Hinweise auf mögliche pathobiologische Bedeutungen und damit verbundener neuer therapeutischer Strategien bei der AML: So kann die erhöhte FL-R-Expression - wie bei der Tandemduplikation des FL-R auch - zu einer erhöhten, prognostisch ungünstigen Phophorylierung von Tyrosinkinasen führen. Auch der SCF-R aktiviert intrazellulär Tyrosinkinasen. Neue Medikamente, wie z.B. Tyrosinkinase-Inhibitoren, oder Dexamethason, das die FL-R-Expression auf den AML-Blasten herunterreguliert, könnten bei diesen AML-Patienten neue benefit-bringende therapeutische Möglichkeiten darstellen. Ebenso scheint die Immunantwort bei AML-Patienten trotz, oder vielleicht sogar gerade bei Expression von kostimulatorischen Molekülen vermindert zu sein, was die Gabe von immunstimulierenden Medikamenten, wie rIL-2 oder CTLA-4-Inhibitoren im Bereich der Immuntherapie sinnvoll erscheinen lässt. So leistet diese Arbeit nicht nur einen Beitrag zur Diagnostik, Prognose und Biologie der AML, sondern entwickelt in Zusammenschau mit bereits publizierten Daten neue, therapeutische Möglichkeiten für die Behandlung der AML.

Im Unterschied zu den HLA-Klasse-Ia-Molekülen ist das nicht-polymorphe Klasse-Ib-Molekül HLA-G v.a. in der Plazenta exprimiert. Es wird postuliert, daß HLA-G die Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegen den „semiallogenen“ Fetus mitreguliert. In allen anderen Zellen und Geweben, in denen es gefunden wurde, ist die Menge im Vergleich zu klassischen Klasse-I-Molekülen um Größenordnungen geringer. Auch in der Genexpression unterscheidet sich HLA-G drastisch von allen übrigen Klasse-I-Molekülen. Am auffallendsten ist dabei das Auftreten verschiedener alternativer Spleißformen. Neben dem Volle-Länge-Transkript G1m gibt es eine Reihe verkürzter Isoformen: G2 (G2m, Da2-Domäne), G3 (Da2/Da3-Domäne), G4 (Da3-Domäne) sowie zwei Formen, die für lösliche Proteine kodieren, da die nicht-entfernte Intron-4-Sequenz zu einem vorzeitigen Translationsstop führt, G5 (G1s), G6 (G2s, Da2-Domäne, + In4). Die schwache Expression von HLA-G bestätigte sich auch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Haut- und Muskelbiopsien sowie Gehirnproben. Transkripte für HLA-G und die verkürzten Isoformen waren in fast allen Proben nachweisbar, wobei das Volle-Länge-Transkript die dominante Form war. Bei den nach Krankheitsgruppen eingeteilten Hautbiopsien und den Muskelbiopsien mit definierten Diagnosen konnte keine Korrelation eines bestimmten Expressionsmusters mit einer bestimmten Krankheitsgruppe bzw. Diagnose festgestellt werden. Diese Heterogenität des Expressionsmusters sowie die selektive Hochregulation der Volle-Länge-Isoform G1m auf Transkriptions- und Proteinebene in Glioblastomzellinien und Myoblasten, die nur eine äußerst schwache konstitutive Expression von HLA-G aufweisen, nach Behandlung mit IFNg deutet auf eine differentielle Regulation hin. Um die einzelnen Isoformen getrennt voneinander untersuchen zu können, wurden Transfektanten für jede Form in der Klasse-I-negativen B-Zellinie 721.221 etabliert. Nur die Volle-Länge-Isoform G1m sowie deren lösliche Variante G1s konnten auf der Zelloberfläche bzw. im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Von den übrigen Isoformen konnten nur EndoH-sensitive Polypeptide gefunden werden, und auch Immunofluoreszenzfärbung mit einer Reihe von Klasse-I-Ak zeigte keine Zelloberflächenexpression. Es muß daraus geschlossen werden, daß die verkürzten Isoformen in der Zelle zurückgehalten werden. HLA-G kann auf zwei Wegen die Aktivität von Immuneffektorzellen regulieren: direkt über ILT2 und indirekt über HLA-E. Das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-E wird durch Bindung eines Nonamers (P3-11) aus dem Signalpeptid verschiedener Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen stabilisiert. Aus der Interaktion dieses funktionellen HLA-E/Peptid-Komplexes mit dem inhibitorischen Rezeptorkomplex CD94/NKG2A auf NK-Zellen resultiert ein Schutz dieser Zellen vor der NK-Lyse. Auch das entsprechende Peptid aus der Signalsequenz von HLA-G ist ein Ligand für HLA-E. Allerdings wurde gezeigt, daß die Stabilisierung von HLA-E auf der Zelloberfläche durch das Peptid G3﷓11 schwächer als mit anderen Klasse-I-Peptiden und auch weniger stabil ist. Effektive Inhibition der Lyse der NK-Zellinie NKL über diese Interaktion von HLA-E mit CD94/NKG2A findet man nur bei HLA-G1m-Transfektanten. Diese werden auch durch die direkte Interaktion von HLA-G1m mit einem weiteren inhibitorischen Rezeptor auf NKL - ILT2 - geschützt. In den 721.221-Transfektanten der verkürzten HLA-G-Isoformen war eine unphysiologisch hohe Konzentrationen an HLA-G-Polypetid notwendig, um die kritische Menge an HLA-E-Ligand für den Schutz dieser Zellen vor der Lyse durch NK-Zellen liefern zu können. Das war nur für eine äußerst stark exprimierende G3-Transfektante der Fall. Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in einer ineffizienteren Prozessierung des Signalpeptids von HLA-G und einer im Vergleich mit anderen HLA-E-Liganden geringeren Bindungsaffinität des Peptids G3-11 für HLA-E. Eine Funktion der verkürzten HLA-G-Isoformen durch die direkte Interaktion mit Rezeptoren auf NK-Zellen konnte nicht nachgewiesen werden und ist wegen ihrer intrazellulären Expression auch unwahrscheinlich. Vielmehr deuten erste Daten, die zeigen, daß die Isoformen, direkt oder indirekt, mit dem TAP-Komplex assoziiert sind, auf eine mögliche Funktion im Rahmen der Antigenpräsentation hin. Worin diese besteht, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Daher ist anzunehmen, daß HLA-G in vivo hauptsächlich über HLA-G-bindende KIR immunregulatorische Funktionen wahrnimmt und durch indirekte Wirkung über HLA-E-CD94/NKG2A modulierend eingreift.

Das Gen des Selenoproteins PHGPx war in der Arbeitsgruppe im Verlaufe einer Expressionsklonierung als antiapoptotisches Gen für Burkitt-Lymphom-Zellen kloniert worden. Die Komplexität der kotranslationalen Inkorporation von Selenocystein, welches bei Selenoenzymen Teil des reaktiven Zentrums ist, limitiert die Überexpression und erschwert die funktionelle Analyse der Selenoproteine sowohl in vitro als auch in vivo. Die PHGPx und das ebenfalls Selenocystein-abhängige mitochondriale Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System sind bei der Detoxifikation von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt, die in der mitochondrialen Atmungskette erzeugt werden. Im Gegensatz zur PHGPx vermittelt die Thioredoxin- Reduktase ihre Schutzfunktion vor oxidativem Stress über Thioredoxin-abhängige Peroxidasen, die sogenannten Peroxiredoxine. Aufgrund einer möglichen Redundanz beider Systeme sollten beide Gene in Mäusen gezielt zerstört und bei Bedarf doppel-knock-out-Tiere erzeugt werden. Da das Fehlen der funktionellen, mitochondrialen Thioredoxin-Reduktase möglicherweise nicht mit dem Leben vereinbar ist, wurden Mäuse unter Verwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems etabliert, bei welchen das Gen zunächst aktiv ist. Die Inaktivierung der Thioredoxin-Reduktase 3 erfolgte durch Einkreuzen von transgenen Mäusen, die die Cre-Rekombinase in allen Geweben exprimieren. Die aus dieser Verpaarung abstammenden, heterozygoten knock-out-Mäuse zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp. Erste Ergebnisse zeigen, dass homozygote TR3 knock-out-Mäuse wahrscheinlich embryonal oder perinatal letal sind. Bei der Inaktivierung des PHGPx-Gens in Mäusen wurden zwei Strategien verfolgt. Die lacZ knock-in-Strategie sollte ermöglichen, die Gewebeexpression der PHGPx zu studieren. Die konditionale knock-out-Strategie wurde parallel verfolgt, weil zu Beginn der Arbeit nicht abzusehen war, ob homozygote PHGPx knock-out-Mäuse lebensfähig sind oder ob Probleme mit der männlichen Fertilität zu erwarten sind. Schon lange war bekannt, dass die PHGPx im Hoden hoch exprimiert ist. Wie sich dann im Laufe dieser Arbeit herausstellte, handelte es sich bei dem konditionalen PHGPx knock-out ebenfalls um einen direkten knock-out. Durch die beabsichtigte konditionale knock-out-Strategie wurde ein Spermienkern-spezifisches, alternatives Exon des PHGPx-Gens zerstört. Diese neue Form der PHGPx wurde kloniert, das Hoden-spezifische Expressionsmuster und die Kernlokalisation des alternativenExons durch GFP-Fusionsproteine gezeigt. Geleitet von den in dieser Arbeit und von Ursini et al. (1999) beschriebenen neuen Funktionen der PHGPx in der Spermatogenese und den vergeblichen Versuchen, das veränderte PHGPx-Allel in Mäusen in die Keimbahn zu bekommen, wurden die Hoden und Spermien von den PHGPx- Chimären analysiert. Die Analyse der Chimären zeigte einen Phänotyp der partiellen Hodenatrophie und schweren Missbildungen der Spermien, der dem von Selendefizienten Nagetieren sehr ähnlich ist. Die bei diesen Chimären beobachtete Haploinsuffizienz führte zu der Entscheidung, die konditionale knock-out-Strategie für PHGPx zu ändern. Letztendlich gelang es, mit der neuen konditionalen knock-out- Strategie Keimbahntransmission zu erhalten. Dadurch wurde nicht nur das gesteckte Ziel, ein Maus knock-out-Modell für die PHGPx zu etablieren, erreicht, sondern es wurden viele zusätzlich wichtige neue Erkenntnisse über die Struktur und Funktion der PHGPx in der Spermienreifung gewonnen. Die Cre-vermittelte Inaktivierung des konditionalen PHGPx-Allels wird in Kürze erwartet.

Mit speziell angefertigten cDNA-Makro-Arrays wurden Melanomzelllinien und kulti-vierte Melanozyten auf die transkriptionelle Aktivität von Genen untersucht, welche bekannterweise bei der zellulären Signaltransduktion von Bedeutung sind. Zur Analyse der daraus erhaltenen Daten wurde das Computer-Programm "GeneFish" geschrieben, welches auch für zukünftige, ähnliche Fragestellungen in anderen Systemen verwendbar ist. Mit Hilfe dieses Programmes wurde gefunden, dass bei ADAM-9, ADAM-10, HER3, FAK, SHC und dem IGF-1-Rezeptor die Unterschiede der Expression zwischen Melanomzelllinien und Melanozyten besonders ausgeprägt waren. Bei weiteren Genen wurden schwächer ausgeprägte, jedoch ebenfalls interessante Expressionsmuster beobachtet. Die Rolle von HER3 wurde durch Einführung einer dominant negativ wirkenden Mutante von HER3 in Melanomzelllinien weitergehend untersucht. Bei Verwendung eines konstitutiv exprimierenden Expressionssystems starben die transgenen Zellen, was einem lethalen Effekt der Mutante zugeschrieben wurde. Mit einem induzierbaren Expressionssystem wurden Zellklone erhalten, die veränderte biologische Eigenschaften aufwiesen, welche jedoch unabhängig von der Expression des Transgens waren. Trotz dieser technischen Schwierigkeit bleibt HER3 eines der vielversprechendsten Gene für die künftige Forschung an Melanomen.