Podcasts about induzierbarkeit

Für die Entwicklung einer extern regulierbaren Expression plastidärer Fremdgene wurde das bakterielle Induktionssystem des quorum sensing in Nicotiana tabacum (Tabak) getestet. Die Komponenten zur Kontrolle der Expression eines Reporterproteins, β-Glucuronidase (GUS), wurden von Vibrio fischeri entnommen und an die Expressionsmaschinerie der Plastiden adaptiert. Um die Induzierbarkeit der GUS-Expression zu testen, wurden Blattstücke der generierten stabilen Plastomtransformanten mit N-3-(Oxohexanoyl)-L-Homoserin-Lacton (VfHSL) bzw. Ethanol als Kontrolle inkubiert. Die Expression von GUS fand bereits im nicht induzierten Zustand statt, konnte jedoch durch die Auswahl geeigneter Promotorelemente auf eine Konzentration von 0,0003 % vom gesamtlöslichen Protein erheblich gesenkt werden. Mit dem Induktor VfHSL konnte hingegen keine signifikante Steigerung der GUS-Expression erzielt werden. Mögliche Ursachen dafür werden anhand der Literatur diskutiert. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein transientes Expressionssystem aufgebaut, um Vektoren auf ihre Funktionalität zu überprüfen. Mittels Polyethylenglykol (PEG) wurden dafür Tabak-Protoplasten mit einem konstitutiven GUS-Expressionsvektor transient transformiert und reproduzierbar eine signifikante GUS-Aktivität im Zellextrakt gemessen. Die plastidäre GUS-Konzentration ließ sich indessen nicht ermitteln - Ursachen und Probleme werden diskutiert. Insgesamt lassen die Ergebnisse jedoch darauf schließen, dass der Großteil der GUS-Expression im Kern/ Cytosol stattfand, während die Expressionsrate in Plastiden für einen Nachweis zu gering war.

Nab2 ist in Melanomen und Melanomzelllinien im Vergleich zu Melanozyten und benignen Nävi stark überexprimiert. Durch Stimulation mit Wachstumsfaktoren oder Phorbolester kann Nab2 außerdem in allen Geweben und Zelllinien transient induziert werden. Die Expressionskinetik folgt dabei der eines delayed early response-Gens. Das Nab2-Protein ist ein transkriptioneller Korepressor der für die Wachstums- und Differenzierungsregulation wichtigen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren Egr1, Egr2 und Egr3. Das sind immediate early response-Gene, die durch die selben Stimuli induziert werden wie Nab2. Nach Stimulation wird die Expression von Egr deswegen grundsätzlich von einem Anstieg der Nab2-Expression gefolgt. Nab2 ist deswegen wahrscheinlich der wichtigste Repressor der Egr-Aktivität und verhindert eine übermäßige Stimulation von Egr-Zielgenen. Ziel dieser Arbeit war es, die regulatorischen DNS-Abschnitte des Nab2-Gens zu isolieren und genau zu charakterisieren. Am Nab2-Promotor sollten dann die Ursachen für die Überexpression im Melanom untersucht und der Mechanismus der Nab2-Induktion nach Stimulation identifiziert werden. Dazu wurde die genomische Nab2-DNS in einer humanen DNS-Bibliothek durch DNS-Hybridisierung identifiziert und daraus isoliert. So konnte ein 7.391 bp langes DNS-Fragment kloniert werden, das 1.845 bp der 5´-untranslatierten Region sowie die gesamte, aus 7 Exons aufgebaute proteinkodierende Nab2-Sequenz enthält. Durch in silico Analysen der 5´-untranslatierten Region konnten eine putative Promotorregion von Position -705 bis -82 (+1 = Adenin des Startkodons), eine CpG Insel von Position -876 bis +82 aber keine klassischen Kernpromotorelemente wie eine TATA-Box oder ein Inr-Element identifiziert werden. Der Nab2-Promotor gehört deshalb zur Klasse der TATA- und Inr-losen CpG-Insel-Promotoren. Durch eine Kombination aus EST- und cDNS-Kartierungen sowie Primerextensionsversuchen konnte ein sehr großes Transkriptionsstartareal identifiziert werden, das sich von Position -366 bis -96 erstreckt. Um funktionelle Studien mit der 5´-untranslatierten Nab2-Region durchzuführen wurden 17 verschiedene 5´-verkürzte Abschnitte daraus in Luziferase-Reportervektoren kloniert und deren transkriptionelle Aktivität in verschiedenen Zelllinien untersucht. Für das Erreichen der maximalen Promotoraktivität (ca. dem 400fachen der Aktivität des Leervektors) war der Sequenzabschnitt stromabwärts von Position -679 ausreichend. Ab Position -58 war dann keine Promotoraktivität mehr detektierbar. Der Nab2-Promotor erstreckt sich also von Position -679 bis -58. Der Kernpromotor konnte aufgrund der Lokalisation der Transkriptionsstartpunkte (-366 bis -96) und des 3´-Endes des Promotors (-58) zwischen Position -366 und -58 eingegrenzt werden. Die sehr hohe Aktivität des gesamten Nab2-Promotors wird durch die aktivierende Region von Position -679 bis -263 hervorgerufen. Durch diesen DNS-Abschnitt steigt die Aktivität vom 15- bis 30fachen auf das ca. 400fache der Aktivität des Leervektors. In dieser positiven regulatorischen Region konnten 10 putative Sp1-Bindestellen identifiziert werden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit zu dem Aktivitätszuwachs beitragen. Um die Ursache der Überexpression von Nab2 in Melanomzelllinien zu Untersuchen, wurde die Aktivität der Nab2-Reporterkonstrukte in Melanomzelllinien, die Nab2 überexprimieren, und in Karzinomzelllinien, die nur wenig Nab2 exprimieren, verglichen. Die Reporterkonstukte zeigten jedoch in Melanom- und Karzinomzelllinien ungefähr die gleiche Aktivität. Die Ursache für die Überexpression in Melanomzelllininen konnte durch diese Versuche nicht identifiziert werden. Schließlich wurde die Aktivität der Reporterkonstrukte in unstimulierten und PMA stimulierten Zellen verglichen. Durch die PMA-Stimulation stieg die Aktivität des Nab2-Promotors auf das ca. 3fache der Basalaktivität an. Die gesteigerte Nab2-Expression nach Stimulation wird demnach auf der Transkriptionsebene reguliert. Anhand der Verkürzungskonstrukte konnte ein 19 bp langer DNS-Abschnitt zwischen Position -232 und -213 identifiziert werden, der diesen Anstieg der Promotoraktivität nach Stimulation hervorruft. In diesem Abschnitt liegen je eine Egr1- und Sp1-Bindestelle, die sich teilweise überlappen. Bei Kotransfektion eines Egr1-Expressionsvektors mit den Nab2-Reporterkonstrukten konnte ein Aktivitätsanstieg vergleichbarer Größenordnung wie durch PMA-Stimulation beobachtet werden. Wurde die Egr1-Bindestelle an Position -222 durch Mutation inaktiviert, so nahm die Induzierbarkeit des Nab2-Promotors durch PMA um 35-50% und durch Egr1-Kotransfektion um 64-73% ab. Diese Daten zeigen, dass Egr1 alleine in der Lage ist, den Nab2-Promotor maximal zu aktivieren und dass dieser Effekt vorwiegend über die Egr1-Bindestelle an Position -222 vermittelt wird. Weil der Promotor aber nach der Inaktivierung der Egr1-Bindestelle an Position -222 noch durch PMA und durch Egr1-Kotransfektion aktivierbar ist, sind weitere Egr1-Bindestellen und womöglich noch andere Transkriptionsfaktoren an der Aktivierung beteiligt. Diese Daten zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Egr1 seinen eigenen Korepressor Nab2 induziert. Funktionell liegt also ein negativer Rückkoppelungs-Mechanismus vor, der eine überschießende Egr1-Aktivität verhindert.

Ventrikuläre Tachykardien und Kammerflimmern gelten als Hauptursache des plötzlichen Herztodes, der ca. 50 % aller kardial bedingten Todesfälle ausmacht und somit eine häufige Todesursache darstellt. Bei Patienten, die diese ventrikulären Rhythmusstörungen überlebt haben, besteht innerhalb des folgenden Jahres ein 10 – 30 %iges Risiko des Wiederauftretens. Somit stellt nach der Akutbehandlung bei diesen Patienten vor allem die Prophylaxe bzw. die Therapie weiterer Ereignisse dieser potentiell lebensbedrohlichen ventrikulären Herzrhythmusstörungen ein wichtiges medizinisches Problem dar. Als Behandlungsmöglichkeit von Patienten mit ventrikulären Tachyarrhythmien hat in den letzten Jahren vor allem der implantierbare Kardioverter-Defibrillator an Bedeutung gewonnen. Dennoch ist auch die medikamentöse antiarrhythmische Therapie auf der Basis der seriellen Testung eine weiterhin bestehende Therapieoption. Studien, die den Verlauf von Patienten mit medikamentös supprimierbarer Rhythmusstörung mit dem Verlauf von Patienten vergleichen, bei denen eine Suppression der Induzierbarkeit in der elektrophysiologischen Untersuchung nicht gelingt, zeigen für die erstgenannte Patientengruppe eine Verbesserung der Prognose hinsichtlich des Arrhythmierezidivrisikos. Es gibt bisher jedoch keine Studie, die den Wert der als effektiv getesteten antiarrhythmischen Therapie gegenüber einer Kontrollgruppe überprüft hat. Daher sind zwei verschiedene Interpretationen dieser Ergebnisse möglich. 1. Der gezielte Einsatz des Antiarrhythmikums verhindert ein Rezidiv der Rhythmusstörung und verbessert damit die Prognose. 2. Die Methode der seriellen programmierten Ventrikelstimulation selektiert die Patienten in solche mit guter und schlechter Prognose, unabhängig davon, ob sie das als effektiv getestete Antiarrhythmikum erhalten oder nicht. In dieser Arbeit sollte im Rahmen der prospektiven kontrollierten multizentrischen Studie "ADIOS" (Antiarrhythmic Drugs Improve Outcome Study) geprüft werden, welche dieser beiden Interpretationsmöglichkeiten zutreffend ist.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion ausgesuchter Aminosäuren in der archaealen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) bei der Entstehung der zweidimensional kristallinen Purpurmembran (PM) in Halobacterium salinarum untersucht. Mittels gerichteter Mutagenese wurden aromatische Gruppen (W12, Y64, W80) gegen andere Reste ausgetauscht und die mutierten Gene homolog exprimiert. Die Tryptophanmutationen hatten dabei eine drastische Störung der PM-Bildung zur Folge, was auf wichtige Wechselwirkungen mit Lipidmolekülen schließen ließ. Insbesondere der Tryptophanrest W80, der mit dem Phythanylrest eines Glykolipids im Zentrum des Trimers wechselwirkt, zeigte seine essentielle Bedeutung für die PM-Bildung. Eine Abhängigkeit der PM-Bildung von der vorhandenen BR-Menge und Wachstumsphase konnte beim Wildtyp (WT) ausgeschlossen werden. Gefrierbruchelektronenmikroskopische Aufnahmen von ganzen Zellen zeigten bei der Mutante BR-W12I zahlreiche kleinere kristalline Bereiche auf der Oberfläche, während die Zellen mit BR-W80I nahezu keine geordneten Flächen aufwiesen. Mit Hilfe von Rotationsdiffusionsmessungen in Vesikeln und Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie von spinmarkierten Cysteinmutanten wurde eine Zunahme der Mobilität der markierten Seitenketten und des mittleren Abstands der BR-Moleküle nachgewiesen. Lichtinduzierte Proteinvernetzung zeigte eine deutliche Auflockerung der kristallinen Struktur der mutierten BR-Moleküle in der Zellmembran, vor allem bei BR-W80I. Die Funktion von BR als Protonenpumpe wurde durch die Mutationen nicht beeinträchtigt, ebenso wurde keine durch die PM bewirkte höhere Photophosphorylierungsrate in den Zellen nachgewiesen, weshalb eine Begünstigung dieser Prozesse als Erklärung für die in vivo- Kristallisation ausgeschlossen wurde. Der Einfluß der Mutationen auf die spektroskopischen Eigenschaften war vergleichsweise gering. Jedoch bot die Abnahme der Lichtadaptationsfähigkeit und Zunahme des Anteils an inaktiven 9- und 11-cis-Retinalisomeren in lichtadaptierten Proben eine plausible Erklärung für die Bildung der kristallinen PM. Die Bildung des 9-cis-Isomeren führt zur Spaltung der Bindung zwischen Retinal und dem Protein. Dies wurde durch Belichtung von Zellen mit BR-W80I nachgewiesen, die innerhalb weniger Stunden ihren aktiven Chromophor in BR verloren. Demnach wird durch die kristalline Anordnung von BR die thermoreversible Isomerisierung von all-trans- zu 13-cis-Retinal so stark bevorzugt, dass die funktionelle Stabilität des Proteins gewährleistet ist. Dies erklärt den evolutionären Vorteil des kristallinen Form des BR als Purpurmembran. Das Vorkommen von zweidimensionalen Kristallen von Halorhodopsin (HR) mit hexagonaler Ordnung im Überexpressionsstamm D2 wurde mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Anordnung wurde in 3D-Kristallen gefunden, die im Rahmen dieser Arbeit durch Aufreinigung des Proteins und Kristallisation in kubischen Lipidphasen erhalten wurden (Kolbe et al., 2000). Damit wurde gezeigt, dass in den 3D-Kristallen von HR die gleiche Anordnung wie in der Zellmembran auftreten kann. Dies ließ auch auf eine physiologische Relevanz des Palmitatmoleküls schließen, das im Innern des HR-Trimers in der Kristallstruktur gefunden wurde. Die Affinität dieser Fettsäure zu HR wurde durch Markierung der Zellen mit 3H-Palmitat untersucht. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass die Affinität der Palmitinsäure zu HR im Vergleich zu BR nicht höher ist. Eine BR-Mutante, die in einer nichtkristallinen Anordnung vorlag, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Klonierung und homologe Expression von Genen für lösliche Proteine als Fusionsprotein am C-terminus von BR ermöglicht. Dies wurde mit dem Gen für das Ferredoxin von H. salinarum erfolgreich durchgeführt. Die rasche Aufreinigung der entstandenen PM mittels Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten führte zu einer einfachen Abtrennung von einem Großteil anderer Proteine. Durch Einführung spezifischer Proteaseschnittstellen wurde auch eine Spaltung des Fusionsproteins ermöglicht. Die Koexpression löslicher Proteine mit BR in der PM bietet enorme Vorteile aufgrund der hohen Expressionsrate des Bacterioopsingens (bop), der Induzierbarkeit des bop-Promoters, die einfache Aufreinigung und der Möglichkeit zur Expression von Mutanten von essentiellen Genen ohne deren vorherige Deletion. Die Eignung dieses Systems für die einfache Isolierung von löslichen Proteinen als Fusionsprotein mit BR wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt.