Podcasts about sumoylierung

Thu, 19 Jul 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14670/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14670/1/Zhang_Anja_Ziwen.pdf Zhang, Anja Ziwen ddc:610, ddc:600, Medizinische Fakultät

Die Biogenese eukaryotischer Ribosomen ist ein streng kontrollierter, dynamischer Prozess, der ein komplexes räumliches und zeitliches Zusammenspiel vieler verschiedener Proteine erfordert. Dabei wird zunächst ribosomale DNA mit Hilfe der RNA-Polymerase I im Nukleolus transkribiert. Das daraus resultierende rRNA-Vorläufer-Molekül wird anschließend umfassend prozessiert und modifiziert. Gleichzeitig assemblieren ribosomale Proteine mit der reifenden rRNA, um präribosomale Partikel zu bilden, die für weitere Reifungsschritte ins Nukleoplasma und Cytoplasma transportiert werden. Zum Verständnis des ribosomalen Reifungsprozesses haben bislang vor allem genetische und biochemische Studien in der Bäckerhefe beigetragen. In Säugerzellen sind dagegen die Komponenten der Ribosomenbiogenese wenig charakterisiert, und insbesondere unser Wissen über die Regulationsmechanismen ist lückenhaft. Die posttranslationale Modifikation mit dem ubiquitinähnlichen SUMO-Protein reguliert eine Vielzahl wichtiger zellulärer Prozesse. SUMO-spezifische Isopeptidasen der SENP-Familie katalysieren die Abspaltung von SUMO von Zielproteinen und kontrollieren damit das Gleichgewicht zwischen Modifikation und Demodifikation. Vorarbeiten zu dieser Arbeit haben eine entscheidende Rolle für die SUMO-Isopeptidase SENP3 während der nukleolären Schritte der Ribosomenbiogenese gezeigt. Allerdings waren die Substrate von SENP3 bei diesem Prozess weitgehend unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein SENP3-assoziierter Proteinkomplex bestehend aus den Komponenten PELP1, TEX10 und WDR18 aufgereinigt. Als weitere Bindungspartner von PELP1 wurden außerdem MDN1 und LAS1L identifiziert. Durch RNAi-vermittelte Depletionsexperimente in Zellkultur konnte gezeigt werden, dass PELP1, TEX10 und WDR18, sowie die assoziierten Proteine MDN1 und LAS1L, ebenso wie SENP3 für die Reifung der 28S rRNA und den nukleolären Export der großen ribosomalen Untereinheit erforderlich sind. PELP1 und LAS1L wurden als SENP3-sensitive SUMOSubstrate charakterisiert. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass das Gleichgewicht zwischen Sumoylierung und Desumoylierung die subnukleäre Lokalisierung des Komplexes kontrolliert. Sumoylierung führt zum Ausschluss aus dem Nukleolus, während Desumoylierung die nukleoläre Kompartimentierung fördert. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass der Komplex aus den Proteinen PELP1, TEX10 und WDR18 die Ribosomenbiogenese reguliert. Außerdem deuten sie darauf hin, dass dessen SUMO-abhängige subzelluläre Verteilung Ablauf und Koordination der Ribosomenreifung kontrolliert.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Frage, ob humanes CFTR-Protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) sumoyliert wird und welche funktionelle Bedeutung die Sumoylierung des CFTRs hat. In der kaukasischen Bevölkerung gilt die Cystischen Fibrose (CF) oder Mukoviszidose als eine der häufigsten Erbkrankheiten. Mutationen im CFTR-Gen, die zu einer drastischen Beeinträchtigung der Funktion des CFTR-Proteins führen, bilden die molekulare Basis der Entstehung der CF. So sind häufig die Reifung und der Transport von CFTR an die Plasmamembran betroffen. Diese Prozesse und verschiedene Aktivitätszustände im CFTR werden u.a. durch posttranslationale Modifikationen (z.B. Phosphorylierungen) spezifischer Konsensus-Motive reguliert. In diesem Zusammenhang führte eine genaue Betrachtung der Primärsequenz von CFTR zur Identifikation von zwei hoch konservierten Motiven, die dem publizierten SUMO-Konsensus-Motiv (ψKxE, nachfolgend SUMO-Motiv genannt) an Position 447 und 1486, bezogen auf das zentrale Lysin, an welchem die Sumoylierung stattfindet, entsprachen. Die Sumoylierung, als eine Form der posttranslationale Modifikationen, wird durch kleine Ubiquitin-ähnliche Proteine (small ubiquitin-like modifier, SUMO) vermittelt. Diese stellen eine Klasse von regulatorischen Proteinen dar, die die Aktivität des Zielproteins, dessen Lokalisation oder die Interaktion mit anderen Proteinen steuern. Damit ergab sich ein relevanter Anknüpfungspunkt, die Rolle der bislang für die CFTR-Regulation noch nicht beschriebenen Form der posttranslationalen Kontrolle durch Sumoylierung zu untersuchen. Als Resultat der hier beschriebenen Untersuchungen konnte die Sumoylierung als notwendiger Bestandteil der Regulation des intrazellulären Transportes von CFTR identifiziert werden. Konkret wurde mit dem Yeast-Two-Hybrid-Verfahren gezeigt, dass CFTR-Domänen an den identifizierten SUMO-Motiven in der Nukleotid-bindedomäne 1 (NBD-1) und am C-Terminus von CFTR sumoyliert werden. Im Säugerzellsystem wurde die spezifische Sumoylierung kompletten CFTRs durch transiente Transfektion von CFTR- und SUMO-Expressionskonstrukten sowie in Zellen, welche CFTR und SUMO endogen exprimieren, verifiziert. Verhindert man weiterhin auf transiente Weise in Säugerzellen die Sumoylierung, durch Mutation der beiden SUMO-Motive oder durch Überexpression der SUMO-spezifischen Protease (SENP1), erreicht CFTR nicht die apikale Plasmamembran. Im Gegensatz zu F508, welches im ER verbleibt, wird CFTR, welches Mutationen in den SUMO-Motiven trägt, im Golgi-Apparat zurückgehalten. Diese Beobachtung konnte mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation und anschließendem Nachweis der Proteine in den entsprechenden Fraktionen über die Western-Blot-Methode gezeigt werden. Abschließend wurden am Beispiel eines zum SUMO-Motiv benachbart gelegenen Di-Leucin-Motives erste experimentelle Hinweise erhalten, wonach beide CFTR-Motive in der Interaktion mit dem für den vesikulären Transport funktionell wichtigem Adaptor-Protein (AP) Komplex zusammenwirken. Mit den vorliegenden Resultaten konnte erstmals die Hypothese formuliert werden, dass die hier beschriebene Sumoylierung eine Form der Modifikation ist, welche am Transport von CFTR an die Plasmamembran maßgeblich beteiligt ist.

Der Erhalt der genomischen Integrität ist für das Überleben von Organismen notwendig, jedoch können verschiedene DNA-Läsionen das genetische Material gefährden. DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) stellen dabei eine besonders toxische DNA-Läsion dar, und schon ein einzelner DSB kann bei ausbleibender oder fehlerhafter Reparatur zum Absterben der Zelle führen. In höheren Eukaryonten gibt es zwei Mechanismen für die Reparatur eines DSB: nicht-homologe Endverknüpfung und homologe Rekombination. Bei der homologen Rekombination spielt der Rekombinationsfaktor Rad52 eine zentrale Rolle und wurde zu Beginn dieser Arbeit als ein Substrat für eine posttranslationale Modifikation mit SUMO identifiziert. Daraufhin wurde die Regulation von Rad52 durch die Modifikation mit SUMO untersucht. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die SUMOylierung von Rad52 in Saccharomyces cerevisiae hauptsächlich an zwei nicht konservierten Lysinresten außerhalb der hoch konservierten Rad52-Domäne erfolgt und eng an Rekombinations- und DNA-Reparaturereignisse gekoppelt ist. So wird die Rad52-SUMOylierung durch enzymatische DSB während der Meiose und durch chemisch induzierte DSB in mitotischen Zellen ausgelöst. Hierfür ist der MRX-Komplex (bestehend aus Mre11, Rad50 und Xrs2) notwendig, der vor Rad52 im Rekombinationsprozess aktiv ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass Zellen mit einer Rad52-Mutante, die nicht mehr mit SUMO modifiziert werden kann, keine auffälligen Wachstumsdefekte aufweisen, beispielsweise weder in Gegenwart DNA-schädigender Agenzien noch in der Meiose. Allerdings hat die SUMOylierung einen pro-rekombinatorischen Einfluss auf Rad52. Denn zum einen können Zellen, in denen zwei der Helikasen Rrm3, Sgs1 oder Srs2 deletiert sind, in Gegenwart von SUMOylierungsdefizientem Rad52 wachsen, da vermutlich keine toxischen Rekombinationsintermediate mehr entstehen wie in Gegenwart von Wildtyp Rad52. Zum anderen weisen Zellen mit SUMOylierungsdefizientem Rad52 Defekte bei speziellen Rekombinationsreaktionen auf. Die SUMOylierung schützt Rad52 zudem vor dem Abbau durch das Proteasom und ist besonders für die Rad52-Moleküle relevant, die am Rekombinationsgeschehen beteiligt sind. Diese Arbeit zeigt somit, dass die SUMOylierung von Rad52 die Aktivität des Rekombinationsfaktors dadurch reguliert, dass die im Rekombinationsprozess involvierten Rad52-Moleküle vor einem vorzeitigen Abbau geschützt werden.

Abläufe in der Zelle eines multizellulären Organismus im Rahmen des Zellzyklus oder beim Vorgang der Differenzierung unterliegen strengen Kontrollmechanismen. Ein prominentes Regulationsprotein dieser Mechanismen ist der Retinoblastoma Tumorsuppressor (pRB). Im Zellzyklus liegt die Hauptfunktion pRBs in der Kontrolle des Übergangs von der G1- in die S-Phase. In der aktiven, nichtphosphorylierten Form reprimiert pRB die Expression von S-Phase Genen durch Inaktivierung des Transkriptionsfaktors E2F. Cyclin-abhängige Kinasen überführen pRB in eine mehrfach phosphorylierte, inaktive Form, wodurch die S-Phase eingeleitet wird. Im Gegensatz dazu übt pRB bei Differenzierungsvorgängen aber auch koaktivierende Funktionen aus und wird im Rahmen dieser Prozesse acetyliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass pRB nicht nur phosphoryliert und acetyliert wird, sondern darüber hinaus durch den small ubiquitin-like modifier (SUMO) modifiziert wird. Aktives pRB stellt das bevorzugte Substrat dieser Modifikation dar. Das Akzeptorlysin 720 ist konserviert und liegt in einer für die pRB-Funktion entscheidenden Domäne, der sogenannten pocket B Region. Zusammen mit der pocket A Region bildet sie die pocket Domäne, deren strukturelle Integrität sowohl für die Tumorsuppressorfunktion pRBs als auch für die Modifikation durch SUMO essenziell ist. An die pocket B Region binden neben zellulären Regulationsproteinen des Zellzyklus und der Differenzierung auch virale Onkoproteine, die pRB inaktivieren und dadurch für die Transformation einer Zelle verantwortlich sind. Diese viralen Onkoproteine und bestimmte zelluläre Proteine inhibieren die SUMO-Modifikation pRBs. Umgekehrt steigt die SUMOylierung von pRB an, wenn mutierte pRB-Versionen eingesetzt werden, die keine viralen oder zellulären Proteine mehr über die pocket B Region binden können. Eine Version von pRB, bei der das Lysin 720 zu Arginin ausgetauscht wurde und die somit nicht mehr SUMOyliert werden kann, besitzt ein stärkeres Repressionspotenzial auf die E2F-abhängige Genexpression, wie Reportergenversuche zeigten. Die SUMOylierung vermindert also pRBs Potenzial zur E2F-Reprimierung. Möglicherweise wird durch die SUMO-Modifikation von pRB die Zusammensetzung der Bindungspartner an der wichtigen pocket B Region moduliert.

Das Protein Ubiquitin kann posttranslational an Proteine geknüpft werden. Dieser Vorgang ist für den Abbau von Proteinen durch das Proteasom notwendig.Neben dieser Funktion hat die Modifikation mit Ubiquitin noch weitere Funktionen,die nicht zum Abbau des Proteins führen.Ubiquitin- ähnlichen Proteine,wie beispielsweise SUMO,sind ebenfalls nicht direkt am Proteinabbau beteiligt.Die Konsequenz der Modifikation,und das Zusammenspiel Ubiquitin-ähnlicher-Systeme mit dem Ubiquitin-System sind bisher allerdings wenig verstanden. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)ist eine zentrale Komponente der DNA-Replikation und DNA-Reparatur.Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden,daß PCNA über drei verschiedene posttranslationale Modifikationen reguliert wird.In der S-Phase des Zellzyklus wird PCNA durch SUMO modifiziert.Nach DNA-Schädigung wird PCNA dagegen durch Komponenten des RAD6 -DNA-Reparaturwegs mono-oder multiubiquitiniert. Alle drei Modifikationen finden am gleichen,zwischen eukaryontischen Spezies kon servierten Lysin statt.Der RAD6 -DNA-Reparaturweg reguliert postreplikative DNA-Reparatur.Eine Schlüsselstellung innerhalb dieses Reparaturwegs nehmen zwei Ubiquitin-konjugierende Enzyme,RAD6 sowie das Heterodimer UBC13/MMS2,die über die RING-Finger Prote ine RAD18 bzw.RAD5 an das Chromatin rekrutiert werden,ein.Interessanterweise interagiert neben PCNA auch das SUMO-konjugierende Enzym UBC9 mit den beiden RING-Finger Proteinen sowie mit PCNA selbst und ist so ebenfalls mit dem RAD6 -Reparaturweg assoziiert.Nach DNA-Schädigung wird PCNA von RAD6/RAD18 monoubiquitiniert.Alternativ kann PCNA durch das hierfür zusätzlich notwendige Heterodimer UBC13/MMS2 und das RING-Finger- Protein RAD5 mit speziellen,Lysin-63-verknüpften Ubiquitinketten, multiubiquitiniert werden.PCNA-Ubiquitinierung ist essentiell für DNA- Reparatur,da eine PCNA-Mutante,die nicht mehr modifiziert wird,starke Sensitivität gegenüber DNA-Schädigung besitzt. Es konnte gezeigt werden,daß die verschiedenen Modifikationen unterschiedlich auf die Funktionen von PCNA einwirken können. SUMOylierung von PCNA wirkt inhibierend auf RAD6 -abhängige DNA- Reparatur.PCNA-Multiubiquitinierung durch Lysin-63-verknüpfte Ubiquitinketten aktiviert PCNA in dem UBC13/MMS2/RAD5-abhängigen Zweig RAD6 -abhängiger DN A -Reparatur,der fehlerfrei arbeitet.PCNA- Monoubiquitinierung scheint dagegen den fehlerhaften Zweig RAD6 - abhängiger DNA-Reparatur zu aktivieren.ˇ