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Die vermehrte Anwendung antimikrobieller Wirkstoffe in der Human- und Veterinärmedizin hat zu einer Zunahme und Selektion antibakteriell resistenter Zoonoseerreger, wie Yersinia enterocolitica geführt. Resistenzmechanismen dieser Bakterien beruhen auf der Bildung chromosomal-kodierter ß-Laktamasen (A und B). Aufgrund unterschiedlichen Vorkommens der ß-Laktamase-Gene und der Expression dieser Enzyme innerhalb der einzelnen Y. enterocolitica Biotypen weisen diese eine heterogene Antibiotikaempfindlichkeit auf. In Deutschland stehen besonders Infektionen mit Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 an erster Stelle. Obwohl dieser Bioserotyp beide chromosomalen ß-Laktamasen bildet, wurden bei Y. enterocolitica Stämmen aus Bayern eine Amoxicillin/Clavulansäure-Antibiotika-Empfindlichkeit belegt. Ziel dieser Studie war das Vorkommen der Gene und die Expression für ß-Laktamase A und B bei 200 aus Bayern isolierten Y. enterocolitica 4/O:3 Stämmen mittels PCR und Agardiffusionstest zu untersuchen. Von den untersuchten Stämmen waren 60 humanen und 140 porcinen Ursprungs. Für den Nachweis der ß-Laktamase-Expression wurden im Doppelplättchenagardiffusionstest pro Stamm je zwei Müller-Hinton-Agarplatten mit einer Bakteriendichte von 107 KbE/ml beimpft und zusammen mit den zwei Antibiotikatestplättchen Ticarcillin (75 μg) und Amoxicillin/Clavulansäure (2/1 μg) bebrütet. Anschließend wurde die Expression der ß-Laktamase A und B anhand der Hemmhofgrößen um Ticarcillin und Amoxicillin/Clavulansäure bestimmt. Zur Überprüfung einer temperaturabhängigen ß-Laktamase-Expression wurde der Doppelplättchenagardiffusionstest bei den Bebrütungstemperaturen 30°C und 25°C durchgeführt. Im Anschluss wurden dieselben Stämme mittels konventioneller PCRMethode auf das Vorliegen der ß-Laktamasegene blaA und blaB überprüft. Die Auswertung der PCR Ergebnisse zeigte, dass bei 199 (99,5 %) der 200 untersuchten Y. enterocolitica 4/O:3 Stämme das blaA-Gen vorlag. Von diesen 199 Stämmen zeigten 198 Stämme auch eine BlaA-Expression in der Agardiffusion. Nur ein aus Schweine-Tonsillen isolierter Stamm zeigte trotz blaA-Gen keine BlaA-Expression. Bei einem der 200 untersuchten Stämme konnte mit Hilfe der PCR kein blaA-Gen nachgewiesen werden. Trotzdem zeigte dieser aus Hackfleisch isolierte Stamm im Agardiffusionstest eine BlaA-Expression. Das blaB-Gen wurde bei allen untersuchten Y. enterocolitica 4/O:3 Stämmen nachgewiesen. Im Agardiffusionstest exprimierten 3 humane und 1 porciner Stamm keine BlaB. Der Vergleich der Bebrütungs-temperaturen 30°C und 25°C zeigte einen Unterschied in der HHR-Größe um Ticarcillin. Während bei 30°C die meisten Stämme einen HHR von 3 mm aufwiesen, hatten die meisten Stämme bei 25°C einen HHR von 2 mm. Die durchgeführte Studie zeigt, dass nahezu alle (199/200) der aus Bayern isolierten und untersuchten Y. enterocolitica 4/O:3 Stämme die chromosomalen Gene für blaA und blaB besitzen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass fast alle dieser Stämme beide ß-Laktamasen auch exprimieren. Die in einer vorangegangenen Studie ermittelte Empfindlichkeit dieser Stämme gegen Amoxicillin/Clavulansäure (20/10 μg) ist einerseits auf den 10fach höher konzentrierten Wirkstoff, andererseits auf eine geringere Expressionsmenge der ß-Laktamase B zurückzuführen. Die Bebrütungstemperatur zeigte keinen Einfluss auf die eigentliche ß-Laktamase-Expression, lässt aber einen Einfluss auf die Expressionsmenge vermuten.

ZUSAMMENFASSUNG Die Anwendung antimikrobieller Wirkstoffe in der Human- und Veterinärmedizin hat zu einer Selektion und Anreicherung antibakteriell resistenter Mikroorganismen geführt. Die Bedeutung tierischer Lebensmittel bei der Übertragung von Bakterien auf den Menschen wurde bereits des öfteren beschrieben. In Europa sind die meisten Y. enterocolitica-Stämme, die bei humanen Gastroenteritiden isoliert werden, vom Bioserotyp 4/O:3. Für menschliche Infektionen stellen symptomlos infizierte Schweine das wichtigste Erregerreservoir dar, dabei gilt Schweinefleisch als wichtigste Kontaminationsquelle. In der Literatur wurde bisher nur über eine Empfindlichkeitsbestimmung von Y. enterocolitica 4/O:3 in Deutschland berichtet. Aus diesem Grund befasste sich diese Studie mit dem Resistenzverhalten dieser Bakterien unter Anwendung zweier unterschiedlicher Methoden. Mittels Agardiffusionsverfahren wurden 200 Stämme (60 humane und 140 porcine) auf die antimikrobiellen Wirkstoffe Ampicillin, Amoxicillin/Clavulansäure, Cefotaxim, Aztreonam, Chloramphenicol, Colistin, Erythromycin, Gentamicin, Streptomycin, Nalidixinsäure, Ciprofloxacin, Tetracyclin, Sulphamethoxazol, Sulphamethoxazol/Trimethoprim und Trimethoprim getestet. Im Anschluss wurden 110 der gleichen Stämme (31 humane und 79 porcine) mittels Bouillon-Mikrodilutionsverfahren untersucht. Die im Handel erhältlichen Mikrotiterplatten wurden vom Nationalen Veterinärinstitut Schwedens bezogen und enthielten die antimikrobiellen Wirkstoffe Ampicillin, Cefotaxim, Ceftiofur, Chloramphenicol, Florfenicol, Gentamicin, Kanamycin, Streptomycin, Nalidixinsäure, Ciprofloxacin, Tetracyclin, Sulfamethoxazol und Trimethoprim. Mittels Agardiffusionstest wurden gegen fünf Wirkstoffe Resistenzen ermittelt. 98,0 % der untersuchten Yersinien waren gegen Ampicillin, 92,5 % gegen Erythromycin, 7,0 % gegen Streptomycin, 2,0 % gegen Sulphamethoxazol und nur 1 Stamm (0,5 %) war gegen den Kombinationswirkstoff Sulphamethoxazol/Trimethoprim resistent. Mittels Mikrodilutionsverfahren wurden bei drei von 13 getesteten Wirkstoffen Resistenzen ermittelt. So waren 97,2 % gegen Ampicillin, 15,5 % gegen Streptomycin sowie 1 Stamm (0,9 %), aus einer humanen Stuhlprobe, gegen Sulphamethoxazol resistent. Dieser Stamm war sowohl mittels Agardiffusions- als auch mittels Mikrodilutionsverfahren multiresistent. Es konnte kein wesentlicher Unterschied zwischen den Resistenzergebnissen humaner und porciner Stämme festgestellt werden. Von den 110 Yersinien waren die Ergebnisse von 82 Stämmen, mittels Agardiffusions- und Bouillon-Mikrodilutionsverfahren, übereinstimmend. Bei 28 Y. enterocolitica-Stämmen wurden unterschiedliche Resultate ermitelt. In 6 Fällen handelte es sich um größtmögliche Fehler, 4 mal sind große und 18 mal geringfügige Fehler aufgetreten. Dabei ist bei dem Vergleich der Ergebnisse der MHK-Wert als der verlässlichere anzusehen. Aus diesem zuletzt genannten Grund und da die Mikrodilution im Gegensatz zur Agardiffusion quantitative Ergebnisse liefert, was für eine effektive Therapie von Bedeutung ist, sollten Empfindlichkeitsbestimmungen mittels Mikrodilution durchgeführt werden. Insgesamt betrachtet, zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass Y. enterocolitica- Stämme 4/O:3 gegenüber den meisten antibakteriellen Wirkstoffen empfindlich sind und nur vereinzelt Resistenzen gegen antimikrobielle Wirkstoffe aufweisen. Des Weiteren ist zu sagen, dass bei Y. enterocolitica-Stämmen 4/O:3, die im süddeutschen Raum isoliert wurden, die Resistenzsituation zum derzeitigen Zeitpunkt nicht problematisch ist und mit den Ergebnissen anderer weltweit durchgeführten Untersuchungen übereinstimmt.

ZUSAMMENFASSUNG Yersinia enterocolitica 4/O:3 und Y. enterocolitica 2/O:9 sind die in unseren Breitengraden am meist verbreiteten humanpathogenen Bioserotypen, wobei Y. enterocolitica 4/O:3 am haeufigsten aus Lebensmitteln isoliert wird. Ein grosses Problem besteht in der relativ geringen Nachweisrate fuer pathogene Y. enterocolitica Staemme aus Lebensmittelproben mit den derzeit verfuegbaren Nachweismethoden. Verschiedene Selektivnaehrboeden wurden fuer die Isolierung von Y. enterocolitica entwickelt, sie werden aber haeufig von anderen Bakterien ueberwachsen. Y. enterocolitica Staemme koennen von den meisten anderen enteropathogenen gramnegativen Keimen anhand eines positiven Harnstoffabbaus unterschieden werden. Ziel dieser Studie sollte daher die Entwicklung eines selektiven Naehrbodens sein, der geeignet ist, Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 und 2/O:9 aus Fleischproben nachzuweisen. Es wurden verschiedene Peptone, Zucker, Harnstoff- und Agarkonzentrationen fuer die Grundlage des Urea-Agars getestet. Des Weiteren wurden verschiedene selektive Faktoren zugegeben, wie Gallensalze, Hefe, Natrium-Oxalat, Kaliumchlorat, Irgasan und Antibiotika (Cefsulodin, Novobiocin, Ticarcillin). Der neu entwickelte Naehrboden wurde anhand verschiedener gramnegativer und grampositiver Keime getestet (Y. enterocolitica 4/O:3, Y. enterocolitica 2/O:9, Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. kristensenii, S. aureus, S. typhimurium, E. coli, P. aeruginosa, P. fluorescens, M. morganii, A. hydrophila, S. liquefaciens, E. faecalis und E. faecium). Ausserdem fand eine Untersuchung des Naehrbodens mit kuenstlich kontaminiertem Hackfleisch sowie unbeimpften Nativproben (Tonsillen- und Kotproben von 34 Schlachtschweinen sowie 15 unbehandelten Hackfleischproben) statt. Die angewandeten Verfahren bestanden aus einem Direktausstrich, einer Uebernachtanreicherung, einer Voranreicherung in ITC-Bouillon sowie eine Kaeltevoranreicherung mit nachfolgender Anreicherung in ITC-Bouillon. Die Proben wurden jeweils zum Vergleich auf CIN-Agar nach Schiemann ausgestrichen. Zusammensetzung des Agars (g/l): Pepton aus Fleisch (1,0), Glucose (1,0), Natriumchlorid (5,0), Dinatriumhydrogenphosphat (1,2), Kaliumhydrogenphosphat (0,8), Gallensalze (5,0), Phenolrot (0,012), Agar (18,0), Urea (5,0), Irgasan (0,001), Ticarcillin (0,001), Kaliumchlorat (1,0); pH 6,76±0,2. Urea-positive Bakterien wuchsen auf diesem Urea-Selektivagar rosa, waehrend hingegen Urea-negative Bakterien gelb wuchsen. Y. enterocolitica 4/O:3 zeigte ein gutes Wachstum auf diesem Agar nach einer 24-stuendigen Inkubation bei +30°C. Y. enterocolitica 2/O:9 wuchs im Vergleich zu Y. enterocolitica 4/O:3 kleiner und geringer in ihrer Zahl, zeigte jedoch auch die typische Morphologie nach 48 h. Y. intermedia und Y. frederiksenii wuchsen kleiner. Durch die enthaltenen Selektivfaktoren konnte ein Wachstum von Y. kristensenii, grampositiven Spezies, S. typhimurium und E. coli unterbunden werden. Pseudomonaden und Aeromonaden wuchsen transparent und konnten leicht von den Yersinien abgegrenzt werden. Die groessten Probleme hinsichtlich der Differenzierung bereiteten M. morganii und S. liquefaciens, da diese eine aehnliche Morphologie aufwiesen wie Y. enterocolitica 4/O:3. Y. enterocolitica 4/O:3 konnte erfolgreich isoliert werden aus kuenstlich kontaminiertem Hackfleisch und nativen Tonsillen, wenn eine selektive Anreicherung in ITC Bouillon dem Ausstreichen vorausging. Der neu entwickelte Urea Selektivagar ist zusammen mit CIN-Agar ein geeigneter selektiver Naehrboden fuer die Isolierung von Bioserotyp 4/O:3 aus Fleisch. Eine Selektivanreicherung in ITC Bouillon sollte bei der Untersuchung von Fleischproben vor dem Ausstreichen auf dem festen Agar immer stattfinden.

Im Zeitraum von Juni bis August 2001 wurde in acht verschiedenen Metzgereien im Raum München eine Gesamtzahl von 298 Proben gesammelt. 115 Tupferproben stammten von rohem Schweinefleisch und Innereien, 183 von Gerätschaften und Oberflächen, die mit Lebensmitteln, insbesondere rohem Fleisch, in Berührung kommen. Die Proben wurden auf Yersina enterocolitica untersucht. Die Nachweismethode erfolgte in Anlehnung an die ISO DIN 10273: „Microbiology – General guidance for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica“ und an den Vorschlag des NCFA (Nordic Committee On Food Analysis: „Yersinia enterocolitica – Detection in foods“). Unmittelbar nach der Probennahme wurde ein Direktausstrich auf Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin (CIN)-Agar durchgeführt und die Proben anschließend für ca. drei Monate tiefgefroren. Nach diesem Zeitraum wurde ein CIN-Agar-Ausstrich nach Inkubation der tiefgefrorenen Probe in Tryptose-Soja-Bouillon (TSB) durchgeführt. Ein Ausstrich wurde nach Vorbehandlung der Über-Nacht-Anreicherung dieser Probe mit 0,25%iger KOH angefertigt. Außerdem erfolgten selektive Anreicherungen in Irgasan-Ticarcillin-Kaliumchlorat-Nährbouillon (ITC-Nährbouillon) bzw. modifizierter Rappaport-Bouillon (MRB-Bouillon) mit anschließendem Ausstrich auf CIN-Agar. Typische Kolonien auf CIN-Agar (sog. „Kuhaugen“), die sich als Urea-positiv erwiesen, wurden mit dem API 20E weiterdifferenziert. Die gefundenen Y. enterocolitica-Isolate wurden bio- und serotypisiert und die Pathogenität mit Hilfe des Kongorot-Magnesium-Oxalat (CRMOX)-Agars bestätigt. Die meisten der pathogenen Isolate (68,8%) wurden bereits nach Direktausstrich auf selektive CIN-Agar-Platten gefunden, weitere pathogene Yersinien konnten erst nach selektiver Anreicherung in ITC und MRB identifiziert werden. Pathogene Y. enterocolitica 4/O:3 wurden in sechs der acht Metzgereien aus rohen Produkten vom Schwein nachgewiesen. Insgesamt stammten 9,5% der positiven Ergebnisse aus rohem Schweinefleisch (von 95 Proben erwiesen sich neun als positiv) und 25,0% aus Schlachtnebenprodukten (Zunge, Niere und Leber; von 20 Proben erbrachten fünf ein positives Ergebnis). In einem Betrieb konnten pathogene Y. enterocolitica auch in zwei Umgebungsproben gefunden werden. Alle pathogenen Isolate gehörten zum Bioserotyp 4/O:3. Neben den pathogenen Y. enterocolitica konnten an apathogenen Yersinien drei Mal Y. kristensenii und je ein Mal Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. rohdei und ein apathogener Y. enterocolitica-Stamm nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass pathogene Y. enterocolitica in Metzgereien vorhanden sind, wobei der Großteil der Nachweise in unbehandeltem Schweinefleisch und in Nebenprodukten der Schlachtung gelang. Der geringe Nachweis pathogener Y. enterocolitica in den Umgebungsproben ist insofern nicht erstaunlich, als die vorhergehende Reinigung und Desinfektion eine entscheidende Verminderung der Keimflora bewirkt hatte. Die meisten Y. enterocolitica-Isolate wurden ohne Anreicherung gefunden. Dies weist auf eine große Menge an pathogenen Isolaten in den untersuchten Proben hin. Damit wird deutlich, dass das Vorkommen und die Ausbreitung von pathogenen Y. enterocolitica 4/O:3 in nicht selbstschlachtenden Metzgereien ein nicht zu vernachlässigendes Problem darstellt.