Podcasts about lipidvesikel

In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Besonderheiten des klonierten equinen Histamin H1 Rezeptors (eH1) aufgeklärt. Insbesondere wurde die agonistvermittelte Regulation von Oberflächenrezeptoren sowie die intrazelluläre Signaltransduktion im Vergleich zum humanen Histamin H1 Rezeptor (hH1) dargestellt. Die Studie erfolgte an stabil die nativen eH1 bzw. hH1 oder die entsprechenden EGFP-Fusionsproteine exprimierenden HEK 293-Zellen. Die verwendeten Zellklone (HEK-hH1 und HEK-eH1) wiesen eine vergleichbare Rezeptorendichte auf. Im Vergleich zum hH1 induziert Histamin am eH1 nur eine geringe Internalisierung des Rezeptors, ein Effekt der sowohl mittels Radioligandenbindung an intakten Zellen als auch im konfokalen Mikroskop (LSM) nachgewiesen wurde. Die Internalisierung des eH1 erfolgt clathrinabhängig unter Beteiligung der GRK 2 und β-Arrestin 1. Dagegen scheint die Internalisierung des hH1 clathrinunabhängig mittels Lipidvesikel abzulaufen. Die klinische Wirksamkeit von Antihistaminika korreliert stark mit ihrer negativ intrinsischen Aktivität. Dabei zeigt der eH1 im Vergleich zum hH1 eine deutlich geringere spontane oder konstitutive Aktivität. Diese spiegelt sich in einer niedrigeren basalen GTPy35S Bindung (Rezeptor/G-Protein Kopplung) wieder, die in Anwesenheit von Diphenhydramin zunimmt. Das Antihistaminikum weist demnach am eH1 eine partielle agonistische Aktivität auf. Aufgrund seiner niedrigen konstitutiven Aktivität wird über den equinen Histamin H1 Rezeptor in HEK 293-Zellen keine basale ERK 1/2 Aktivierung induziert, so dass in diesem System keine dem Diphenhydramin am hH1 entsprechende inverse Aktivität bestimmt werden kann. Im Gegensatz zu hH1 führt die Aktivierung des eH1 mit Histamin zu einer sehr starken Stimulation der intrazellulären cAMP-Akkumulation. Diese ist im Vergleich zum hH1 nicht PTX- und PLC-abhängig, während beide Rezeptoren über PKA- und PKC-abhängige Mechanismen an die Adenylatcyclase (AC) gekoppelt sind. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse auf vielfältige funktionelle und regulatorische Besonderheiten des equinen Histamin H1 Rezeptors hin, die bei der klinischen Anwendung und Entwicklung neuer Antihistaminika beim Pferd berücksichtigt werden müssen.

Die Innenmembran von Mitochondrien besitzt zwei Translokasen für den Import von Proteinen. Der TIM23-Komplex vermittelt die Translokation über und in die Innenmembran, der TIM22-Komplex inseriert Proteine mit mehreren hydrophoben Segmenten in die Innenmembran. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Komponenten dieser Translokationsmaschinerien in N. crassa und S. cerevisiae identifiziert und charakterisiert werden. In N. crassa waren zu Beginn der Arbeit im Vergleich zu S. cerevisiae nur wenige Komponenten der TIM-Translokasen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Tim22, Tim54 und Tim44 in N. crassa identifiziert. Dies wurde entweder durch die Verwendung degenerierter Primer in PCR-Reaktionen mit cDNA aus N. crassa oder durch Durchmustern von Datenbanken erreicht. Die identifizierten Proteine des TIM22-Komplexes wurden bezüglich ihrer Lokalisation und Topologie untersucht. Es handelt sich bei Tim22 um ein Membranprotein der inneren mitochondrialen Membran mit vier Transmembranhelices, das sowohl den N- als auch den C-Terminus in den Intermembranraum exponiert. Tim54 ist ebenso in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt nur eine Transmembranhelix. Der größte Teil des Proteins liegt im Intermembranraum, nur wenige Aminosäurereste befinden sich in der mitochondrialen Matrix. Ferner wurde der TIM22-Komplex von N. crassa charakterisiert. Dazu zählten die Untersuchungen der beteiligten Komponenten, der Komplexgröße und der Stabilität des Komplexes. In N. crassa besteht der TIM22-Komplex aus den Komponenten Tim22, Tim54, Tim9 und Tim10, die einen etwa 350 kDa großen Komplex bilden. Für spätere funktionelle Untersuchungen wurde der TIM22-Komplex bzw. Tim22 alleine gereinigt. Beides wurde in Lipidvesikel rekonstituiert. Dieses Verfahren bietet die Grundlage für Untersuchungen in einem definierten experimentellen System, wie Proteine der Carrier-Familie in Lipidmembranen inseriert werden. In S. cerevisiae wurde mit Tim16 eine neue Komponente des mitochondrialen Importmotors des TIM23-Komplexes identifiziert. Dies konnte durch Koreinigung mit einer weiteren Komponente des Importmotors, Tim14, erreicht werden. Die strukturelle Vorhersage für Tim16 ähnelt stark der des J-Proteins Tim14. Tim16 fehlt allerdings das für die Funktion von J-Proteinen essentielle HPD-Motiv. Tim16 ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und peripher mit der inneren mitochondrialen Membran assoziiert. Durch Depletion von Tim16 wird der Import von Substraten in Mitochondrien beeinträchtigt, die vom mitochondrialen Importmotor abhängig sind. Durch Koimmunopräzipitationen und Quervernetzungsexperimente wurde Tim16 als neue Komponente des mitochondrialen Importmotors der TIM23-Translokase definiert. Funktionell spielt Tim16 eine große Rolle für die Integrität des Importmotors. Die genaue Struktur des Importmotors, seine Regulation und dessen Dynamik im Zuge der Translokation von Präproteinen muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden.

Ein essenzieller Schritt in der Biogenese der Mitochondrien ist der Import von Vorstufenproteinen aus dem Zytosol in die mitochondrialen Subkompartimente. Viele Proteine inserieren hierbei von der Matrixseite aus in die Innenmembran. Das Innenmembranprotein Oxa1 spielt dabei eine sehr wichtige Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde Mba1 als eine weitere mitochondriale Komponente identifiziert, welche für die effiziente Proteininsertion benötigt wird. Wie Oxa1 interagiert auch Mba1 spezifisch sowohl mit mitochondrialen Translationsprodukten, als auch mit konservativ sortierten kernkodierten Proteinen während ihrer Insertion in die Innenmembran. Obwohl Oxa1 und Mba1 in ihrer Funktion und Substratspezifität überlappen, können beide unabhängig von einander agieren. Somit ist Mba1 Teil der mitochondrialen Proteinexportmaschinerie und die erste identifizierte Komponente eines Oxa1-unabhängigen Insertionsweges in die mitochondriale Innenmembran. Des Weiteren wurde das Protein Oxa1 in Bezug auf Architektur und Funktionsweise näher untersucht. Hierzu wurde das Oxa1-Protein aus N. crassa Mitochondrien isoliert und charakterisiert. Das Protein bildet einen homooligomeren Komplex, welcher in Dodecylmaltosid eine Größe von 200-300 kDa zeigt. Der gereinigte Komplex lässt sich in künstliche Lipidvesikel rekonstituieren und ist in der Lage die Modellproteine ATPase8 und Oxa143-200 zu inserieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde somit zum ersten Male gezeigt, dass Oxa1 alleine in der Lage ist, Proteine in Membranen zu inserieren. Das gereinigte Oxa1-Protein zeigt in elektrophysiologischen Messungen kanalbildende Aktivitäten. Die Kanalcharakteristika von Oxa1 unterscheiden sich abhängig von der Stimulation. Wird die Leitfähigkeit durch eine hohe Spannung (U > 70 mV) angeregt, erhält man ein Strommuster, welches ein sehr schnelles „Flackern“ zeigt. Werden hingegen isolierte mitochondriale Ribosomen bei niedriger Spannung (U = 20 mV) zugesetzt, zeigen sich langsam schaltende Poren. Somit scheint Oxa1 in zwei unterschiedlichen Modi zu arbeiten, je nachdem ob es posttranslational kernkodierte Proteine oder kotranslational mitochondrial kodierte Proteine in die Membran inseriert.

Ziel der Arbeit war es, flexible kationische Lipidvesikel zu entwickeln, die für den transdermalen Transport von DNS geeignet ist. Um positiv geladene Lipidvesikel herzustellen, wurde in einem Ansatz SPC und CTAB verwendet, in einem anderen SPC, Polysorbat und DC-Chol. Nach der Herstellung dieser beiden Formulierungen fand eine in vitro und eine in vivo Untersuchung der beiden Trägersysteme sowie deren Wechselwirkung mit DNS statt. Dabei ergab sich, daß die DNS-Adsorption an die polysorbat-freien Vesikel grundlegend anders erfolgt als an die polysorbat-haltigen Vesikel. Die Flexibilität der beiden Formulierungen nahm durch die Beladung mit DNS deutlich ab, der Durchmesser der DNS-haltigen Vesikel im Vergleich zu den DNS-freien For-mulie-rungen zu. Beide Eigenschaften änderten sich bei den gewählten Formulierungen jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Grundsätzlich waren die polysorbathaltigen Formulierungen in der sich anschließenden in vitro Charakterisierung fähig, Zellen zu transfizieren, wenn auch nicht sehr effizient. Zur Überprüfung des in vivo Verhaltens der mit DNS beladenen Polysorbat-DC-Chol – Vesikel wurden die Vesikel schließlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, die DNS mit einem weiteren Farbstoff; die verwendete DNS codierte ebenfalls für einen Fluoreszenzfarbstoff. Die so markierten Formulierungen wurden NMRI – Mäusen intra- bzw. epicutan appliziert; einige Zeit später wurden Biopsien der behandelten Hautareale entnommen und mittels CLSM untersucht. Dabei waren DNS und kationische Vesikel bis in eine gewisse Hauttiefe nachweisbar, wobei sich unbeladene und mit DNS beladene Vesikel nicht signifikant in der Penetrationstiefe unterschieden. Eine Transfektion der Hautzellen wurde bislang jedoch nicht beobachtet. Zusammenfassend ist zu sagen, daß die Anwesenheit von Polysorbat in der Membran nicht nur für die Flexibilität der Vesikel zwingend notwendig ist, sondern v.a. für die Stabilität der Vesikel nach der Anlagerung von DNS. Da die Flexibilität des Trägersystems durch Anlagerung der DNS deutlich abnimmt, ist es für weitere Ansätze wohl notwendig, den unbeladenen Vesikel eine extrem hohe Flexibilität zu verleihen, um selbst nach der Bindung der DNS an diese Träger noch eine ausreichende Flexibilität für die Permeation durch die Haut zu erhalten.