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Die Strahlenempfindlichkeit des Normalgewebes ist in der humanen Bevölkerung sehr heterogen und kann bislang nicht über prädiagnostische Biomarker charakterisiert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, um die Strahlenempfindlichkeit in lymphoblastoiden Zelllinien von jungen Lungenkrebspatienten in einem Hochdurchsatz Screening-Ansatz zu untersuchen. Fünf Zelllinien mit unterschiedlicher Strahlenempfindlichkeit wurden gewählt, um in einem ungerichteten Versuchsansatz (2D DIGE Methode = two-dimensional difference gel electrophoresis) strahlenspezifische Proteinregulation nach gamma-Bestrahlung (137Cs-Quelle) zu untersuchen. Dabei konnten sowohl neue Proteine, wie z.B. Mcm7und SerpinB9 identifiziert werden, als auch Proteine (Strukturproteine, Chaperone), die bereits in der Literatur in Verbindung mit der zellulären Stressantwort beschrieben wurden. Die 2D DIGE Ergebnisse konnten beispielhaft anhand von vier Kandidatenproteinen im Westernblot validiert werden. Die Untersuchungen zeigten, dass die intraindividuellen Expressionsunterschiede nach gamma-Bestrahlung auf Proteinebene sehr gering waren. Die geringen Expressionsunterschiede konnten jedoch validiert werden. Die Untersuchungen gaben Hinweise darauf, dass die interindividuelle Strahlenantwort sehr unterschiedlich ist. Dies konnte in weiterführenden Experimenten bestätigt werden. Da die Proteinexpression der Regulation durch mikroRNAs unterliegt, wurde in einem weiteren Ansatz eine miRNA Array Analyse durchgeführt. Hier bestätigte sich ebenfalls die Beobachtung aus der 2D Proteinanalyse, dass die Strahlenantwort interindividuell sehr heterogen ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Strahlenantwort auf verschiedenen zellulären Ebenen intraindividuell kaum variiert, die interindividuelle Varianz aber sehr groß ist. Diese beobachtete Heterogenität erklärt die Problematik einzelne Biomarker zur Prädiktion der Strahlenempfindlichkeit zu identifizieren.

Die Plasmamembran lebender Zellen stellt die Hauptbarriere für alle Arten von extrazellulären Signalen dar. Viele davon werden ins Innere der Zelle weitergeleitet, hier lösen sie im Kern transkiptionelle Veränderungen und damit die Anpassung der Zelle auf Proteinebene aus. Andere wiederum werden direkt erkannt und in unmittelbare molekulare Antworten umgewandelt, wie zum Beispiel die Sekretion von gespeicherten Stoffen oder Konformations-änderungen von Proteinen. Besonders in Pflanzen, welche durch ihre sesshafte Lebensweise auf die rechtzeitige und spezifische Erkennung von Umweltveränderungen angewiesen sind, hat sich ein höchst diverses Rezeptorsystem entwickelt. In der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana, der in dieser Arbeit verwendeten Modellpflanze, wurden 610 verschiedene Rezeptorproteine identifiziert, welche wiederum von zahlreichen interagierenden, und bis jetzt weitestgehend unerforschten Proteinen reguliert werden. Als entscheidendes Prinzip, dieses Aufgebot an membran-gebundenen Komponenten von Signalkaskaden zu organisieren, gilt inzwischen die zeitliche und lokale Kompartimentierung der Plasmamembran. Durch Akkumulation relevanter Bestandteile von biologischen Prozessen in sogenannten Membrandomänen werden kurze Reaktionszeiten und die unmittelbare Signalweiterleitung garantiert. Besonders wichtig bei solchen Prozessen sind sogenannte Gerüstproteine, welche als Adaptoren zwischen anderen Komponenten fungieren. In dieser Arbeit wurden Remorine, eine Familie pflanzenspezifische Proteinen ohne bisher definierte Funktion, aufgrund ihrer Eigenschaft Membrandomänen zu markieren und ihrer mutmaßlichen Beteiligung an Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, genauer untersucht. Eine systematische Expression von Remorinen als Fluorophor-Fusionen mit anschließender hochauflösender mikroskopischer und quantitativer Untersuchung offenbarte, dass die meisten Remorine sich in deutlich unterschiedlichen Mustern an der Membran verteilen. Untersucht wurden dabei Parameter wie die Größe der erkennbaren Domänen, die Form, die Helligkeit, aus welcher auf die Proteinkonzentration rückgeschlossen werden kann, sowie die Domänendichte an der Membran. Diese Ergebnisse wurden von Kolokalisationsanalysen unterstützt, welche die Lokalisation in unterschiedlichen, koexistierenden Membrankompartimenten erkennen ließen. Ferner wurden die Eigenschaften der von Remorinen markierten Membrandomänen, wie zum Beispiel der Austausch an Proteinen mit der umgebenden Membran, sowie lokale und zeitliche Dynamik und Stabilität untersucht. Dabei konnte eine hohe Fluktuation einzelner Proteine zwischen Domäne und umliegender Membran, jedoch eine klare laterale Immobilität der gesamten Domäne nachgewiesen werden. Zusätzlich zeichneten sich die untersuchten Domänen teilweise durch eine außerordentlich große zeitliche Stabilität aus, andere wiederum scheinen abhängig von bestimmten Stimuli zu entstehen. Weitergehende Arbeiten dienten der Identifizierung der Funktion einzelner Bereiche der Proteine. Hierbei konnte die entscheidende Rolle des äußersten C-terminalen Bereichs, des so- genannten RemCAs (Perraki et al., 2012; Konrad et al., 2014) als Membrananker bestätigt werden. Zusätzlich wurden mit Hilfe eines Hefe-2-Hybrid Ansatzes zahlreiche neue Interaktoren für eine Auswahl von Remorinen identifiziert. Dabei wurde ein essentieller Rezeptor der basalen Immunantwort, BAK1 als Interaktor für Remorin 6.4 gefunden. Zuletzt wurden einige wenige Remorine mit Hilfe von Mutantenlinien in einer genetischen Studie phänotypischen Analysen bezüglich ihrer Funktion bei Pflanzen-Pathogen Interaktionen unterzogen. Remorin 6.4 spielt hiernach eine Rolle bei der Immunantwort nach Befall mit virulenten Bakterien. Die grundlegende Erkenntnis, dass in lebenden Zellen zahlreiche klar unterscheidbare Arten an Membrandomänen koexistieren, ist ein Meilenstein auf dem Weg zur Anerkennung einer neuen Vorstellung vom Aufbau der Zytoplasmamembran. Diese wird häufig noch als undifferenzierte zweidimensionale Flüssigkeit beschrieben, in welcher stellenweise sogenannte Lipidflöße, festere Strukturen aus Cholesterin und Sphingolipiden, die auch bestimmte Proteine beherbergen können, auftreten. Anhand der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse, sowie ähnlicher Studien in Hefe lässt sich nun folgendes Bild zeichnen: Es ist davon auszugehen, dass unterschiedliche Proteine, welche im selben biologischen Prozess involviert sind, in unmittelbarer Nachbarschaft oder sogar im selben Proteinkomplex in der Membran organisiert sind. Die Lipidzusammensetzung in der unmittelbaren Umgebung wird von diesen Proteinen bestimmt, bietet jedoch auch die Grundlage für die Bildung der Domäne, indem sie die Lokalisation der Komponenten in diesem Bereich fördert. Die zahlreichen an der Zellmembran gleichzeitig ablaufenden, unterschiedlichen Prozesse erfordern eine hochkomplexe, zeitlich und räumlich stark regulierte Kompartimentierung der Membran. Es kann vermutet werden, dass Remorine eine Rolle als Gerüstproteine bei der Ausbildung einer Auswahl dieser Domänen bilden. Im Fall von Remorin 6.4 ist das Protein für den Prozess der Flagellin-Erkennung und die unmittelbaren Abwehrantworten, welche nachweislich eine Präformierung der beteiligten Proteinkomplexe voraussetzen, notwendig.

In der vorliegenden Arbeit wurde die potentielle Rolle der AMP-Kinase, eines der Schlüsselenzyme im Energiestoffwechsel, bei der Regulation des Vasotonus kleiner arterieller Blutgefäße untersucht und die Effekte einer AMPK-Stimulation mit der EDHF-vermittelten endothelialen Dilatation verglichen. Mittels Western-Blot Technik wurde auf Proteinebene nachgewiesen, dass in Arterien des Hamsters sowohl die α1-Untereinheit der AMPK - als prädominante katalytische Untereinheit - sowie die β1-Untereinheit der AMPK exprimiert werden. Die funktionellen Untersuchungen erfolgten an isoliert perfundierten Widerstandsarterien aus der Skelettmuskulatur des Hamsters. An diesen wurden gleichzeitige Registrierungen des Außendurchmessers als Maß für den Vasotonus sowie der intrazellulären Kalziumkonzentration in der glatten Gefäßmuskulatur (Kalziumindikator Fura 2) nach Zugabe verschiedener vasoaktiver Substanzen durchgeführt. An mit Noradrenalin vorkontrahierten isolierten Gefäßen führte der auf die β1-Untereinheit wirkende AMPK-Aktivator A769662 (A76) endothelunabhängig zu einer maximalen Dilatation der Gefäße, die mit einem erheblichen Abfall des glattmuskulären Kalziumspiegels einherging. Die beobachteten A76 Effekte auf Gefäßtonus und Kalziumspiegel waren dosisabhängig. Der Vasodilatator Acetylcholin löste ebenfalls einen ausgeprägten Kalziumabfall in der glatten Muskulatur aus. Dies war jedoch nur bei einem intakten Endothel zu beobachten. Eine Transfektion kultivierter Gefäße mit einer dominant negativ Variante der α1-Untereinheit der AMPK führte zu einer partiellen Herabsetzung der Dilatation und des Kalziumabfalls. Zwei weitere Aktivatoren der AMPK, AICAR und Metformin, bewirkten an den Widerstandsgefäßen ebenfalls eine statistisch signifikante Dilatation und einen Kalziumabfall. An Gefäßen, welche anstelle von Noradrenalin durch eine hohe extrazelluläre Kaliumkonzentration vorkontrahiert wurden, ließ sich nach Stimulation mit A76 weder eine Dilatation noch ein Kalziumabfall feststellen, welches als ein Hinweis auf eine Beteiligung von Kaliumkanälen an den A76 mediierten Effekten zu werten war. Zur genaueren Evaluation dieser Hypothese wurden die A76 Effekte nach pharmakologischer Blockade verschiedener Kaliumkanäle untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Iberiotoxin, ein selektiver Inhibitor von BKCa-Kanälen keinen Einfluss auf eine A76 vermittelte Dilatation hatte. Ebenso wenig wurde eine Acetylcholin vermittelte Vasodilatation blockiert. Demgegenüber führte Charybdotoxin, ein Hemmer von BKCa-Kanälen und IKCa-Kanälen, zwar zu einer Blockade der Acetylcholinantwort, ließ die A76 Effekte jedoch weitgehend unbeeinflusst. Die Blockade von ATP-abhängigen Kaliumkanälen KATP durch Glibenclamid in hohen Konzentrationen bewirkte hingegen eine deutliche Reduktion sowohl der Dilatation als auch des Kalziumabfalls nach Gabe von A76. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit damit gezeigt werden, dass eine Aktivierung der AMPK in isolierten Widerstandsgefäßen des Hamsters zu einer schnellen und ausgeprägten Vasodilatation führt, welche durch einen vorhergehenden Abfall der intrazellulären Kalziumkonzentration in der glatten Gefäßmuskulatur initiiert wird. Die Hemmwirkung von Glibenclamid weist darauf hin, dass dieser Dilatation ein Effekt der AMPK auf KATP-Kanäle in der glatten Muskulatur zu Grund liegen könnte.

Der humane Mas-related gene X1 (hMrgX1)-Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der selektiv in nozizeptiven Spinalganglienneuronen exprimiert wird. Eine spezifische Aktivierung des Rezeptors durch das Proenkephalin-Spaltprodukt BAM8-22 (bovine adrenal medulla 8-22) wird als schmerzhaft wahrgenommen. Damit stellt der hMrgX1-Rezeptor eine neue molekulare Zielstruktur für eine potentiell nebenwirkungsarme, analgetische Therapie dar. Trotz dieses Potentials sind die pro-algetischen Signalwege des hMrgX1-Rezeptors bislang nicht verstanden. Der MrgX1-Rezeptor entwickelte sich unter hohem positivem Selektionsdruck und kommt nur in Primaten vor. Trotzdem wurden die nicht-homologen MrgC-Rezeptoren der Nagetiere zur Analyse des hMrgX1-Rezeptors verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher zunächst vergleichende Ligandenprofile des hMrgX1- und der MrgC-Rezeptoren aus Maus und Ratte erstellt. Dabei wurden deutliche Unterschiede offensichtlich, da der hMrgX1-Rezeptor exklusiv von BAM8-22 aktiviert wurde, während die MrgC-Rezeptoren durch weitere Liganden, u. a. Spaltprodukte des Proopiomelanocortins, z. T. sogar effizienter aktiviert wurden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die MrgC-vermittelte Ca2+-Mobilisation auf Grund einer β-Arrestin-abhängigen Rezeptorendozytose deutlich desensitisierte, während der hMrgX1-Rezeptor resistent gegenüber dieser Liganden-induzierten Regulation war. Daher können die MrgC-Rezeptoren der Nagetiere nicht als Modellsytem für den hMrgX1-Rezeptor verwendet werden, so dass in dieser Arbeit weiterführend Signalwege des hMrgX1-Rezeptors in Spinalganglienneuronen-ähnlichen F11-Zellen und primären Spinalganglienneuronen untersucht wurden. Dabei zeigte sich eine duale funktionelle Regulation des etablierten pro-algetischen TRPV1 (transient receptor potential cation channel vanilloid 1)-Ionenkanals. Zum einen sensitisierte der hMrgX1-Rezeptor den TRPV1 über einen etablierten, Proteinkinase C-abhängigen Signalweg. Zum anderen zeigte sich eine direkte hMrgX1-mediierte Aktivierung des TRPV1. Dieser Regulationsmechanismus wurde durch eine Phospholipase C (PLC)-β-induzierte Produktion des endogenen TRPV1-Liganden Diacylglycerol und durch die Degradation des tonisch TRPV1-inhibierenden PLC-β-Substrates Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat vermittelt. Neben der TRPV1-Modulation induzierte der hMrgX1-Rezeptor die Expression verschiedener Gene, deren zentrale Bedeutung bei der inflammatorischen und neuropathischen Schmerzchronifizierung etabliert ist. Einerseits wurde eine hMrgX1-induzierte Phosphorylierung der extracellular signal-regulated kinases 1/2 beobachtet, die in einer Aktivierung von serum response factor-abhängigen Reportergenkonstrukten und in der Induktion von c-Fos auf mRNA- und von early growth response protein 1 auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Andererseits zeigte sich die transkriptionelle Ca2+/Calcineurin-abhängige Aktivierung des nuclear factor of activated t cells, die in der Induktion des CCR2 (chemokine receptor 2) auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Somit konnte erstmalig ein physiologischer Induktor des CCR2 in Spinalganglienneuronen beschrieben werden. Weiterhin wurde nach der Etablierung der endogenen Proteinexpression des hMrgX1-Rezeptors in LAD2-Mastzellen eine BAM8-22-induzierte Freisetzung des CCR2-Agonisten chemokine ligand 2 ermittelt, so dass der hMrgX1-Rezeptor die parakrine Stimulation von nozizeptiven Spinalganglienneuronen durch Mastzellen fördern könnte. Diese Dissertation trägt somit zum besseren molekularen Verständnis akuter und chronischer pro-algetischer Funktionen des hMrgX1-Rezeptors bei und könnte damit die Entwicklung neuer analgetischer Wirkstoffe ermöglichen.

Mit der intensiven Erforschung von Stammzellen soll zukünftig die Möglichkeit eröffnet werden durch Manipulation von Stammzellpopulationen das regenerative Potential des Organismus zu verstehen und zu nutzen. Darüber hinaus soll mittels genetisch modifizierter Stammzellpopulationen die Grundlagen dafür geschaffen werden schwere Gen- und Immundefekte zu therapieren. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) versprechen hierbei großes Potential, da sie bereits für systemische Therapieansätze eingesetzt werden. Allerdings sind die theoretischen Grundlagen der Stammzelleigenschaften der hMSC wie Proliferation, Invasion bzw. Migration und die Differenzierungskapazität nur rudimentär verstanden. Aufbauend auf den Ergebnissen von Dr. Marisa Karow und Dr. Thomas Kolben, die eine Beteiligung des Wnt/β-Catenin-Signalweges an der Steuerung dieser Stammzelleigenschaften in ihren Arbeiten nachweisen konnten (Karow 2008; Kolben et al. 2012), sollten in der vorliegenden Arbeit die Rezeption des spezifischen Wnt-Signals und die dabei beteiligten Frizzled (Fzd)-Rezeptoren näher untersucht werden. Da aus den vorigen Arbeiten schon hervorging, dass alle 10 Fzd-Rezeptoren in den hMSC exprimiert werden, sollte über eine qualitative PCR die Expression potentieller Wnt-Liganden sowie der beiden Inhibitoren des Wnt-Weges sFRP1 und WIF1 geprüft werden. Dabei zeigte sich, dass 8 der 19 Wnts sowie der Inhibitor sFRP1 exprimiert werden. Das Wnt-Expressionsmuster der Krebszelllinie HT1080 unterschied sich dagegen nur in der Expression zweier Wnts, was wahrscheinlich auf den mesodermalen Ursprung dieser Krebszelllinie zurückzuführen ist. Im Gegensatz hierzu zeigte sich eine umfangreichere Wnt-Expression in der immortalisierten Zelllinie HEK293, in der 13 der 19 Wnts sowie auch die beiden Inhibitoren sFRP1 und WIF1 nachgewiesen wurden. Für eine detailliertere Aufschlüsselung der Beteiligung einzelner Fzds an der Rezeption eines Wnt-Signals sowie an der basalen Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges in hMSC wurde ein TCF/LEF-Reporter-Vektorsystem in die hMSC eingebracht. Als Reportergen kam die sekretierte Form einer Luciferase aus dem Tiefsee-Cephalopoden Gaussia princeps zum Einsatz. Vorteil dieser Luciferase ist, dass die Sekretion in den Überstand eine Evaluierung der Wnt/β-Catenin-Aktivität über die Zeit hinweg erlaubt, ohne die Zellen zerstören zu müssen. Hierbei wurden transient und stabil-transfizierte TCF/LEF-(T-cell-specific transcription factor/lymphoid enhancer-binding factor)-Reporter-hMSC generiert und die Zellkulturbedingungen für nachfolgende Experimente optimiert. Die Evaluierung unterschiedlicher Aktivatoren des Wnt/β-Catenin-Signalweges ergab die stärkste Aktivierung nach Knockdown des Tumorsuppressorgens APC, während ein Knockdown des β-Catenins, dem zentralen Mediator des Wnt-Weges, zu einer signifikanten Reduktion der Gaussia-Luciferase-Aktivität führte. Bei Knockdown-Studien mit den verschiedenen Fzds mittels RNA-Interferenz (RNAi) in den TCF/LEF-Reporter-hMSC zeigte sich, dass Fzd5 und Fzd7 an der Weiterleitung eines Wnt-Signals sowohl unter unstimulierten Bedingungen als auch nach Applikation von Wnt3a beteiligt sind. Weiter zeigte nur noch der Knockdown von Fzd1, dass dieser Rezeptor an der Weiterleitung eines Wnt3a-Signals partizipiert. Um diese Ergebnisse über einen reversen Ansatz in Form einer Überexpression der Fzds zu untersuchen, wurde ein flexibles Klonierungssystem entwickelt, das einen einfachen Austausch von Protein-tags ermöglichen sollte. Nach Bestätigung der Überexpression der Fzds auf mRNA-Ebene und Proteinebene wurde die Wirkung der Überexpression in den TCF/LEF-Reporter-hMSC ohne und mit Wnt3a-Aplikation untersucht. Hier zeigte sich, dass neben der Überexpression von Fzd5 auch Fzd3 und Fzd6 eine Erhöhung der Gaussia-Luciferase-Aktivität und damit eine gesteigerte Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges sowohl unter unstimulierten als auch unter stimulierten Bedingungen nach sich zogen. Bei vergleichender Überexpression von Wnt3 oder Wnt3a konnte gezeigt werden, dass Wnt3 – welches hMSC auch endogen exprimieren – sehr viel stärker den Wnt-Weg aktivieren kann als Wnt3a. Um die Auswirkung des kanonischen Wnt-Rezeptors Fzd5 auf die Stammzelleigen-schaften der hMSC zu prüfen, wurde die Expression des Wnt-Zielgens Cyclin D1 und die Proliferation nach Knockdown sowie transienter Überexpression von Fzd5 quantitativ erfasst. Hierbei zeigte sich nach Knockdown von Fzd5 eine signifikante Abnahme der Proliferation, die auch auf Ebene der Wnt-Zielgene mit einer Abnahme der Cyclin D1-Expression einherging. Umgekehrt konnten stabil Fzd5-transfizierte hMSC-Populationen generiert werden, die eine signifikante Steigerung der Cyclin D1-Expression aufwiesen. Zusammenfassend konnte im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die verschiedenen Fzds in unterschiedlichem Maße an der Weiterleitung eines Wnt-Signals beteiligt sind. Besonders scheinen hier Fzd5 und Fzd7 eine wichtige Rolle in hMSC zu spielen, da sie auch an der Vermittlung eines endogenen Wnt-Signals innerhalb der Stammzellpopulation beteiligt sind. Weiter wurde im Fall von Fzd5 auch die maßgebliche Beteiligung dieses Rezeptors am Erhalt der Proliferationskapazität der hMSC-Population nachgewiesen.

Maligne Zellen wachsen in einem komplexen zellulären und extrazellulären Umfeld, welches die Initiierung und Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps bedeutend beeinflusst. Tumore bestehen zum einen aus den Tumorzellen, zum anderen aus dem unterstützenden Stroma, das Fibroblasten, Endothelien, Perizyten, Lymphgefäße, ein mononukleäres Infiltrat und die Extrazellulärmatrix einschließt. Dieses Tumor-Mikromilieu hat einen großen modulierenden Einfluss auf das Tumorwachstum, die Invasivität und das Metastasierungspotential. Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind pluripotente Vorläuferzellen, die an der Aufrechterhaltung und Wiederherstellung der Gewebeintegrität beteiligt sind. Geschädigtes Gewebe führt zur Mobilisation von MSC und deren Rekrutierung an den Ort der Schädigung. Tumore werden vom Organismus als nicht-heilende Wunden angesehen, so dass MSC in das tumorassoziierte Stroma rekrutiert werden. Dort tragen die Zellen zu verschiedenen Aspekten des Tumorwachstums bei, indem sie als Progenitorzellen für die Tumorgefäße und stromale fibroblastenartige Zellen dienen. Im Rahmen dieses Ausdifferenzierungsprozesses werden gewebespezifische Gensets wie das CC-Chemokin CCL5 in den mesenchymalen Stammzellen aktiviert und zur Expression gebracht. Das Pankreasadenokarzinom ist eines der aggressivsten soliden Malignome des Menschen und ist gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Proliferation des Stromas. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zum einen die Rolle mesenchymaler Stammzellen im Stroma des Pankreaskarzinoms zu evaluieren und zum anderen eine gewebespezifische stammzellbasierte und promoterkontrollierte Suizidgentherapie mit dem Stroma als Angriffspunkt zu etablieren. Mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Knochenmark von C57BL/6 p53-/- Mäusen isoliert und sowohl mit den Reportergenen des rot fluoreszierendem Proteins (RFP) und des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) als auch mit dem Suizidgen der Herpes Simplex I Thymidinkinase (HSV-TK) unter Kontrolle des CCL5-Promoters transfiziert. Die HSV-TK führt zu einer Phosphorylierung und Aktivierung der Prodrug Ganciclovir, welches zytotoxisch auf Thymidinkinase-positive (TK+) Zellen und über den sogenannten „Bystandereffect“ auf umgebende Thymidinkinase-negative (TK-) Zellen wirkt. Diese Stammzellen wurden C57BL/6 Mäusen intravenös injiziert, die orthotope und syngene panc02- Pankreastumore trugen. Die i.v. Applikation von nativen MSC führte zu einer Verdopplung der Tumormasse und einer gesteigerten lokalen Aggressivität im Sinne einer Peritonealkarzinose im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei zeigten sich erhöhte Ccl5-Expressionsniveaus im Tumorgewebe von Tieren, die MSC erhalten hatten. In-vitro konnte gezeigt werden, dass MSC bei adäquater Stimulation zur Ccl5 Expression angeregt werden und somit als Quelle des beobachteten Ccl5-Anstiegs in Frage kommen. Die stromale Aktivierung des CCL5-Promoters in den mesenchymalen Stammzellen konnte durch Verwendung von CCL5-Promoter/Reportergen Stammzellen direkt nachgewiesen werden. Dabei zeigten sich spezifisch im Tumorgewebe Fluoreszenzsignale, die sich in der Immunhistochemie morphologisch genauer darstellen ließen. Eine Reportergenexpression war spezifisch im stromalen Kompartiment der panc02- Tumore nachweisbar, andere untersuchte Organe mit Ausnahme der Milz zeigten keine Reportergenexpression. Der Einsatz der therapeutischen CCL5-Promoter/HSV-TK MSC in Kombination mit der intraperitonealen Gabe von Ganciclovir führte zu einer Tumormassenreduktion um 50%. Darüberhinaus konnte die Therapie die Metastasierungsrate in Milz, Leber und Peritoneum signifikant senken. Es wurden keine systemischen Nebenwirkungen beobachtet. Bei der Untersuchung von humanen Pankreaskarzinomen und korrespondierenden Pankreasnormalgeweben aus den gleichen Patienten zeigte sich bei der Mehrheit eine Hochregulation von CCL5-mRNA. Im immunhistochemischen Nachweis konnte die CCL5 Expression auf Proteinebene im Tumorstroma gezeigt werden, entsprechendes Normalgewebe zeigte bis auf vereinzelte Zellen keine CCL5 Produktion. Das Tumorstroma stellt aufgrund seiner vitalen Bedeutung für die Tumorprogression einen vielversprechenden Ansatzpunkt künftiger therapeutischer Interventionen dar. Mesenchymale Stammzellen eigenen sich hierbei im Rahmen einer Suizidgentherapie als zellbasierte Vehikel. Dank der gezielten Migration und des Einsatzes gewebespezifischer Promoter kann dabei eine hohe Selektivität der Genexpression im Tumorgewebe mit Minimierung der systemischen Nebenwirkungen erreicht werden. Der CCL5-Promoter wird im stromalen Kompartiment des murinen pankreatischen Adenokarzinoms aktiviert und eignet sich daher für die selektive und spezifische Expression von therapeutischen Genen wie der HSV-TK. Dieser Ansatz kann eine mögliche Therapieoption des ansonsten therapieresistenten humanenPankreaskarzinoms darstellen.

Vor Beginn dieser Arbeit war ein A. fumigatus-Protein (Chp: CipC homologes Protein) mit unbekannter Funktion und hoher Homologie zum CipC-Protein aus A. nidulans als prominentes hyphenspezifisches Protein identifiziert worden (Schwienbacher, 2005). Weiterhin gab es zu diesem Zeitpunkt Hinweise, dass ein zu CipC homologes Protein in C. neoformans eine wichtige Rolle während der Virulenz spielt (Steen et al., 2003). In dieser Arbeit sollte die biologische Funktion des pilzspezifischen Proteins genauer untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper gegen Chp, mehrere Reporterstämme sowie eine Deletionsmutante hergestellt. Die erhobenen Daten zeigen, dass Chp als Monomer im Cytosol der Hyphen vorliegt. Dabei zeigte sich eine gleichmäßige Verteilung eines GFP-Fusionsproteins innerhalb der Hyphen; nur die Vakuolen schienen ausgespart. Die Identifikation des Proteins auf der Sporenoberfläche von A. fumigatus (Asif et al., 2006) wurde wiederlegt und die differentielle Expression des Proteins bestätigt. Anders als in A. nidulans (Melin et al., 2002) wirkt das Antibiotikum Concanamycin A auf die Bildung von Chp in A. fumigatus nicht induzierend. Da diese Tatsache sowohl für die Na-mensgebung von CipC, als auch für die Namensgebung von Chp verantwortlich war, sollte das A. fumigatus-Protein umbenannt werden. Die Wahl des Namens fiel auf NrpA (Nitrogen regulated protein A), da die Bildung des Proteins von der N-Quelle abhängig ist. Die N-abhängige Regulation war für ein homologes F. fujikuroi Gen auf RNA-Ebene bereits bekannt (Teichert et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte sie in A. fumigatus und erstmals auf Proteinebene bestätigt werden. Desweiteren wurden auch neue N-Quellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass NrpA in Anwesenheit der N-Quellen Glutamat, Nitrat oder Harnstoff nicht gebildet wird, wohin-gegen Komplexmedien sowie die N-Quellen Ammonium, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Valin und Tryptophan zur Bildung des Proteins führen. In Kombination einer induzierenden und einer unterdrückenden N-Quelle dominiert stets die induzierende. In Reporterstämmen (gfp; lacZ) fand diese negative Regulation der Bildung von NrpA nicht statt. Das Protein wurde sowohl in Anwesenheit einer normalerweise unterdrückenden N-Quelle, als auch in den Sporen gebildet. Weiterhin nimmt die gebildete Menge von NrpA sowohl bei längeren Inkubationszeiten, als auch bei Verwendung höherer Animpfdichten zu. Wird der Pilz zunächst mit einer die NrpA-Bildung unterdrückenden N-Quelle angezogen und dann in Medium mit einer induzierenden N-Quelle umgesetzt, dauert es 6 h bis eine Bildung von NrpA verzeichnet werden kann. Diese Zeitspanne blieb auch in einem inversen Experiment gleich. Als nächstes wurde untersucht, ob NrpA in A. fumigatus unter Stressbedingungen von Bedeutung ist. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl osmotischer Stress, als auch oxidativer Stress, der durch Menadion verursacht wird, kei-ne Auswirkung auf die gebildete NrpA-Menge hat. Dagegen führt durch H2O2 verursachter Stress zu einem veränderten Laufverhalten von NrpA in SDS-Gelen. Das Protein scheint unter diesen Umständen ein höheres Molekulargewicht zu haben. Mithilfe eines A. fumigatus-Reporterstammes, der ein NrpA-GFP-Fusionsprotein bildet, konnte gezeigt werden, dass H2O2 auch zu einer veränderten Lokalisation von NrpA führt. Das sonst gleichmäßig in den Hyphen verteilte Protein formierte sich in punktförmigen Strukturen. Auch unter Mangelbedingungen spielt NrpA keine wichtige Rolle, denn weder ein C- noch ein N-Mangel verändert die gebildete Menge des Proteins. Dient die normalerweise die NrpA-Bildung induzierende N-Quelle Glutamin als C- und N-Quelle wird NrpA nicht gebildet. Ebenso wie in F. fujikuroi (Teichert et al., 2002) wird die Bildung des NrpA-Proteins durch MSX, einem Inhibitor der Glutaminsynthetase, fast vollständig inhibiert. Anders als in F. fujikuroi (Teichert et al., 2006) verursachte die Inhibierung der TOR-Kinase durch Rapamycin keinen Effekt auf die Bildung von NrpA. Auch durch eine her-gestellte Deletionsmutante konnte die biologische Funktion von NrpA nicht geklärt werden. In zahlreichen vergleichenden Untersuchungen verhielt sich die Mutante ebenso wie der Wildtyp. Der einzige dokumentierte Unterschied zwischen Mutante und Wildtyp ist eine verstärkte Bil-dung der Katalase 1 in der Deletionsmutante. Anders als angenommen spielt NrpA während der Virulenz von A. fumigatus keine Rolle. In einem Virulenzmodell in embryonierten Hühnereiern verhielten sich Deletionsmutante und Wildtyp gleich. Auch in murinen Makrophagen führten die Deletionsmutante und der Wildtyp etwa zu vergleichbaren Mengen an ausgeschüttetem IL-10 und TNFα. Ein potentieller Nutzen von NrpA bei der Diagnose der allergischen bronchoalveolaren Aspergillose (ABPA) konnte ebenso ausgeschlossen werden. Neben NrpA waren im Vergleich der Proteinmuster der verschiedenen A. fumigatus-Morphotypen auch weitere differentiell exprimierte Proteine aufgefallen. Eines davon war eine MnSOD (Aspf6), die bis dahin auch als mitochondriale MnSOD bezeichnet wurde (Rementeria et al., 2007). Da im Genom von A. fumigatus aber eine weitere MnSOD kodiert ist, die über eine putative Mitochondriensignalsequenz verfügt, sollte in einem zweiten Teil der Arbeit die tat-sächliche Lokalisation dieses Proteins gezeigt werden. Dafür wurden zunächst monoklonale Antikörper gegen das Protein hergestellt. Eine mitochondriale Lokalisation der MnSOD mit puta-tiver Signalsequenz konnte gezeigt werden. Dabei wurden sowohl Western-Blots als auch ein A. fumigatus-GFP-Reporterstamm verwendet. Weiterhin konnte das Protein genauer charakteri-siert werden. Im Gegensatz zu Aspf6, das nur in den Hyphen des Pilzes zu finden ist, wurde die mitochondriale MnSOD sowohl in den Sporen, als auch in den Hyphen nachgewiesen. Die gebil-dete Menge des Proteins verändert sich im Zeitverlauf nicht. Lediglich zu sehr späten Wachs-tumszeitpunkten in der späten stationären Phase war ein leichter Anstieg zu beobachten. Die gebildete Menge des Proteins hing auch nicht von der Animpfdichte der Kultur ab. Anders als Aspf6, das bekannterweise ein Homotetramer bildet (Flückiger et al., 2002), scheint die mitochondriale MnSOD als Dimer vorzuliegen. Auch in Antwort auf oxidativen Stress verhielten sich die beiden MnSODs unterschiedlich. Menadion, das innerhalb der Zelle die Bildung von Su-peroxidanionen bewirkt, führte zu einem leichten Anstieg der Proteinmenge der mitochondrialen MnSOD, während Aspf6 unverändert blieb. Als Folge von oxidativem Stress, der durch H2O2 verursacht wird, zeigte Aspf6 eine leichte Verringerung, während die mitochondriale MnSOD schnell abgebaut wird. In einem dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der Atmung während der Auskeimung von A. fumigatus genauer untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteinbiosynthese für den Auskeimungsprozess unbedingt notwendig ist. Desweiteren wurde mit Hilfe unterschiedli-cher Methoden eine sehr frühe Aktivierung der Atmungskette während des Auskeimungspro-zesses nachgewiesen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Sauerstoff für das Wachstum von A. fumigatus unbedingt erforderlich ist. Im anaeroben Milieu konnten die Konidien weder anschwellen noch auskeimen. Auch bereits vorhandene Hyphen konnten unter Abwesenheit von Sauerstoff nicht weiterwachsen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass A. fu-migatus anders als A. nidulans (Takasaki et al., 2004) nicht über die Fähigkeit verfügt, im Anae-roben durch eine Fermentation von Ammonium zu überleben. In dieser Arbeit wurde ebenso wie in anderen aktuellen Arbeiten (Williger et al., 2008) die Fähigkeit von A. fumigatus, in hypoxischen Umgebungen zu wachsen, nachgewiesen.

Das PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) ist ein induzierbares zytoplasmatisches Protein, das einige Motive, die für die Vermittlung von Protein-Protein Interaktionen bekannt sind, enthält. Die PHLDA1 ist stark in gutartigen melanozytären Läsionen (Naevi) exprimiert und wird während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert. Das PHLDA1 Protein scheint als ein proapoptotisches Molekül zu fungieren. Das Mechanismus ist allerdings noch nicht bekannt. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die 293 PHLDA1 Transfektanten zusätzlich zu einer erhöhten Apoptose Empfindlichkeit auch eine höhere MHC Klasse I Oberflächenexpression im Vergleich zu Neo Kontrollzellen aufweisen. Das konnte mit mehreren monoklonalen Antikörpern, bestätigt werden. Auch mittels IEF, konnte auf der gesamten Proteinebene, bei zwei PHLDA1 Transfektanten eine höhere Expression der Allelprodukte HLA A2 und HLA B7 bestätigt werden. Nach einer 3-stündigen Inkubation mit radioaktivmarkierten Aminosäuren weisen die PHLDA1 Transfektanten 4,5- bis 8,5-fach mehr neu synthetisierte MHC Klasse I Moleküle, im Vergleich zu den Kontrollzellen, auf. Mit Hilfe der Pulse/Chase Methode konnte gezeigt werden, dass PHLDA1 Transfektanten, im Vergleich zu den Neo Kontrollzellen, einen schnelleren MHC Klasse I Transport vom ER zum Golgi Apparat aufweisen. Durch die Immunopräzipitation von MHC Klasse I Molekülen, konnte auch das PHLDA1 Protein mitpräzipitiert werden. Das PHLDA1 Protein war nicht mit ICAM-1 oder MCAM mitpräzipitiert, was eine spezifische Bindung des PHLDA1 Proteins an die MHC Klasse I bestätigt. Es ist denkbar, dass das PHLDA1 Protein als Chaperon fungiert und durch die Bindung an die MHC Klasse I Moleküle diesen eine höhere Stabilität verleiht. Dadurch können die MHC Klasse I Moleküle schneller an die Oberfläche transportiert werden. PHLDA1 Transfektanten wurden von HLA A2 allospezifischen T-Zellen besser als die Neo Kontrollzellen erkannt. So könnte der Verlust des PHLDA1 Proteins bei Melanomen und Mammakarzinomen auch zum Verlust der T-Zellerkennung beitragen.

Das Karzinom der Nebennierenrinde hat aufgrund seines schlechten Ansprechens auf konventionelle Chemo- oder Strahlentherapie eine infauste Prognose. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien von entscheidender Bedeutung. In diesem Zusammenhang wurde in der vorliegenden Studie die Möglichkeit einer Radioiodtherapie des Nebennierenrindenkarzinoms im Anschluss an einen gewebespezifischen Natrium/Iodid-Symporter-Gentransfer unter Steuerung des ACTH-Rezeptor Promoters untersucht. Adrenokortikale Karzinomzellen (Y-1) wurden stabil mit einem Expressionsvektor transfiziert, in welchem die Natrium/Iodid-Symporter-cDNA an ein ACTH-Rezeptor Promoter-Fragment gekoppelt worden war. Dieser Promoter ist für die gewebespezifische Expression des ACTH-Rezeptors in der Nebenniere verantwortlich. Stabil transfizierte Y-1 Zellen konzentrierten Iodid ca. 18fach in vitro, wobei ca. 7 % des akkumulierten Iods organifiziert wurden, was zu einer Hemmung des Iod-Effluxes führte. Die Tumorspezifität wurde durch die Transfektion von Kontroll-Tumorzelllinien (Mammakarzinom- und medullären Schilddrüsenkarzinomzellen) bestätigt, welche keine Iod-Akkumulation zeigten. Die Natrium/Iodid-Symporter-Expression wurde auf RNA-Ebene mittels Northern-Blot Analyse sowie auf Proteinebene mittels Western-Blot Analyse bestätigt. Darüberhinaus konnte immunzytologisch eine signifikante, vorzugsweise Membran-assoziierte, Natrium/Iodid-Symporter-spezifische Immunreaktion nachgewiesen werden. Die tumorspezifische, ACTH-Rezeptor Promoter-vermittelte Natrium/Iodid-Symporter-Expression in NNR-Karzinomzellen erlaubte schliesslich einen signifikanten therapeutischen Effekt von 131I mit einer selektiven Absterberate von 90 % der Natrium/Iodid-Symporter-exprimierenden Tumorzellen. Zusammenfassend konnte in Nebennierenrindenkarzinomzellen im Anschluss an einen gewebespezifischen Natrium/Iodid-Symporter-Gentransfer unter Steuerung des ACTH-Rezeptor Promoters ein therapeutischer Effekt von 131I in vitro nachgewiesen werden. Damit eröffnet diese Studie in Anlehnung an die seit über 60 Jahren mit grossem Erfolg eingesetzte Radioiodtherapie beim Schilddrüsenkarzinom vielversprechende Perspektiven hinsichtlich einer gezielten, Natrium/Iodid-Symporter-vermittelten Radionuklidtherapie beim Nebennierenrindenkarzinom.

In der hier durchgeführten Studie „Untersuchungen zur mikrobiellen Besiedlung der Nasenhöhle von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis unter besonderer Berücksichtigung von Staphylococcus aureus und Staphylococcus aureus Small Colony Varianten“ sollte das Keimspektrum der chronischen Rhinosinusitis (CRS) beim Menschen, mit Schwerpunkt auf Staphylococcus aureus (Sa) und seinem Small Colony Variant (SCV) -Phänotyp, untersucht werden. Die chronische Rhinosinusitis (CRS) ist eine häufig vorkommende Erkrankung die bei etwa 5-15 % der Bevölkerung westlicher Industrienationen auftritt. Ihre Ätiologie ist noch unbekannt, allerdings wird als mögliche Ursache eine Infektion mit Bakterien diskutiert. Unter den Bakterien wird dem grampositiven Keim Staphylococcus aureus eine große Bedeutung bei dieser Erkrankung zugeschrieben. In dieser Studie wurden Nasenschleimhautbiopsien und Nasenspülproben von 31 Patienten mit CRS und nasalen Polypen (CRSNP+), 13 Patienten mit CRS ohne nasale Polypen (CRSNP-) und 21 Kontrollpatienten mit verschiedenen mikrobiologischen Methoden untersucht. Die Ergebnisse der hier vorliegenden Studie stellen eine bakteriologische Ursache für die chronische Rhinosinusitis in Frage. Es wird deutlich, dass der normale Phänotyp von Sa keine wesentliche Rolle bei der CRS spielt, da dieser Keim sowohl bei erkrankten als auch bei gesunden Probanden etwa gleich häufig auftrat, bei CRSNP- Patienten sogar in noch geringerer Menge als bei den anderen beiden Gruppen. In keiner der untersuchten Proben konnten SASCV nachgewiesen werden, so dass deren Rolle bei der CRS untergeordnet erscheint. Auf Grund der kleinen Fallzahlen kann von dieser Studie zwar nicht auf die Gesamtbevölkerung geschlossen werden, aber die Ergebnisse geben dennoch Hinweise auf die tatsächliche Situation. Auch bei der Untersuchung der übrigen in den Proben vorkommenden gram-positiven und gram-negativen, aeroben und anaeroben Bakterien konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Beim Vergleich der hier angewandten mikrobiologischen Nachweismethoden, stellte sich heraus, dass die Bakterienkultur im Vergleich zur Real-time PCR und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung die sensitivste Methode war. Die PCR hat allerdings den Vorteil dass auch DNA toter Bakterien nachgewiesen werden kann, und dass sie erheblich schneller durchzuführen ist als die Bakterienkultur. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung an Paraffingewebsschnitten scheint nach den hier vorliegenden Ergebnissen nicht geeignet zu sein, Sa im Gewebe nachzuweisen. Auf diesem Gebiet besteht also noch Bedarf an weiterer Optimierung der Methode an Paraffinschnitten. Neben bakteriologischen Untersuchungen von Patientenproben sollten Auswirkungen des Sa und SASCV- Nachweises auf nasale immunologische Parameter erfasst werden. Hierzu sollte das nasale Zytokinmuster erhoben werden und mögliche Unterschiede der Genexpression bei CRSNP+ Patienten mit Sa- Nachweis untersucht werden. Wie eine Infektion mit Sa bzw. SASCV zelluläre Reaktionen auf Proteinebene beeinflusst und ob Unterschiede zwischen Sa und SASCV in der induzierten Zellantwort bestehen, wurde zusätzlich an humanen monozytären MonoMac-6 Zellen (MM6) und an humanen Atemwegsepithelzellen der Zelllinie BEAS-2B (B2B) untersucht. Eine in vitro Infektion dieser beiden Zelltypen mit verschiedenen Sa- Stämmen führte zu einer unspezifischen Stimulierung der Sekretion aller untersuchten Proteine. Eine Polarisation in Richtung TH1 bzw. TH2, also in Richtung CRSNP- bzw. CRSNP+ konnte nicht festgestellt werden. Auch die Microarrayanalysen von Sa-positiven und Sa-negativen Biopsien von CRSNP+ Patienten zeigen keine vermehrte Expression von Genen für Zytokine die für TH1 oder TH2 polarisieren. Ebenso wurde die Konzentration der in der nasalen Lavage gemessenen Zytokine durch eine Infektion mit Sa nicht beeinflusst und ein TH2 Shift war nicht erkennbar. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass bei der CRS vermutlich zunächst eine Entzündung vorliegt, die dann ggf. die bakterielle Besiedlung fördert, als dass diese Entzündung initial durch eine bakterielle Infektion induziert wird. Es sei aber nochmals darauf hingewiesen, dass hier nur kleine Fallzahlen untersucht wurden. Klarheit könnte eine groß angelegte Studie mit möglichst hohen Patientenzahlen und einer gut charakterisierten Patientenpopulation sowie ggf. die Verwendung molekularer Verfahren zum Nachweis bakterieller Erreger bringen. Diese Studie zeigt, dass eine bakterielle Ursache der CRS unwahrscheinlich ist.

Ein bedeutender Mechanismus zur Prävention und Regression von atherosklerotischen Läsionen ist die Abräumung von akkumulierten extrazellulären Lipiden in der Gefäßwand und deren Einschleusung in den reversen Cholesterintransport durch Makrophagen. Wichtigste molekulare Effektoren sind dabei Scavenger Rezeptoren wie CD36 und Cholesterin-Exporter wie ABCA1 und ABCG1. Deren Expression wird durch spezifische oxidierte Sterole, die die nukleären Transkriptionsfaktoren wie PPARgamma und LXRalpha aktivieren, induziert. Da hochdosierte lipidlösliche Antioxidantien diese regulatorischen Oxylipide beeinflussen könnten, war es Ziel dieser Arbeit am Makrophagen-Modell die Wirkung von hochdosiertem alpha-Tocopherol auf Signalwege und Schlüsselrezeptoren der Cholesterin-Homöostase zu untersuchen. Der Einfluss von alpha-Tocopherol und teilweise auch von gamma-Tocopherol wurde auf regulatorischer, transkriptioneller, translationeller und funktioneller Ebene mittels Realtime RT-PCR, Reportergen-Assays, FACS, Immunoblot und Lipidaufnahme- und Lipidefflux-Assays analysiert. Der LDL-R wurde durch hochdosiertes alpha-Tocopherol nicht beeinflusst, während die Expression des Scavenger Rezeptors CD36, konzentrationsabhängig sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Protein-Ebene durch alpha-Tocopherol beeinträchtigt wurde. Auf funktioneller Ebene verringerte alpha-Tocopherol die Aufnahme von [H³]-Cholesterin markiertem oxLDL durch Makrophagen. Der Effekt konnte ebenso mikroskopisch dargestellt werden. Die verminderte Expression von CD36 durch alpha-Tocopherol konnte zumindest teilweise durch eine dosisabhängige Verminderung der mRNA-Transkription von PPARγ und eine verminderte Aktivierung von PPARgamma im PPRE-Luziferase-Assay auch durch exogene Stimuli erklärt werden. gamma-Tocopherol hatte keinen vergleichbaren Effekt auf die CD36- und PPARgamma-spezifische mRNA, weswegen bereits auch ein direkter transkriptioneller Effekt von alpha-Tocopherol postuliert wurde. Die vermehrte zelluläre Aufnahme von oxidiertem LDL über Scavenger Rezeptoren wie CD36 induziert normalerweise auch eine vermehrte Einschleusung von Cholesterin in den reversen Cholesterintransport durch ABC-Exporter wie ABCA1 und ABCG1, wodurch die Schaumzellbildung zumindest verzögern werden kann. Diese Induktion der Cholesterin-Exporter wird durch oxidierte Sterole vermittelt, die LXRalpha aktivieren. Deshalb wurde ebenfalls eine mögliche Interferenz von hochdosiertem alpha-Tocopherol mit dem zellulären Cholesterin-Export untersucht. In der Tat wurde der Cholesterin-Efflux von Makrophagen auf delipidiertes HDL durch alpha-Tocopherol beeinträchtigt, wodurch der zelluläre Cholesterin-Bestand anstieg. Dieser Effekt zeigte auch mikroskopisch vermehrte Lipidgranula. Die Aktivierung des LXR-Response Elements im Luziferase-Assay durch exogene Stimuli wie 22-OHC oder oxidiertes LDL wurde durch alpha-Tocopherol ebenfalls negativ beeinflusst. Dadurch könnte die Reduktion der Expression von ABCA1 und ABCG1 auf mRNA-Ebene und von ABCA1 auf Proteinebene zumindest teilweise erklärt werden. Mit gamma-Tocopherol konnte nur eine geringe Reduktion auf mRNA Ebene, sowohl für ABCA1 als auch LXRalpha festgestellt werden. Bei der verminderten Expression von ABCA1 und ABCG1 durch hochdosiertes alpha-Tocopherol handelt es sich also wahrscheinlich um einen spezifischen, teilweise durch LXRalpha vermittelten Prozess. Es scheinen aber weitere Signalwege beteiligt zu sein: Unerwarteterweise wurde die Transkription und die Aktivierung von LXRalpha auch durch delipidiertes HDL stimuliert, was durch hochdosiertes alpha-Tocopherol ebenfalls dosisabhängig reduziert werden konnte. Nichtsdestotrotz war ABCA1 in Makrophagen nach Cholesterinverarmung durch delipidiertes HDL supprimiert. Die gefundenen Effekte von alpha-Tocopherol auf Schlüsselrezeptoren der Cholesterin-Homöostase in Makrophagen können zur Erklärung der enttäuschenden Resultate der Preventionsstudien mit hochdosiertem alpha-Tocopherol beitragen: Durch Hemmung des Scavenger Rezeptors CD36 reduziert alpha-Tocopherol zwar einerseits den ersten Schritt zur Schaumzellbildung um den Preis einer verzögerten Abräumung extrazellulärer Lipiddepots, alpha-Tocopherol verlangsamt aber auch durch Hemmung von ABCA1 und ABCG1, den endgültigen Abtransport von Cholesterin aus der Gefäßwand durch den reversen Cholesterin-Transport.

Aufgrund der Expression des Natrium-Iodid-Symporters (NIS) besitzt die Schilddrüse die Fähigkeit zur Iodidanreicherung. Dieser Mechanismus ermöglicht die Radioiodtherapie benigner und maligner Schilddrüsenerkrankungen. Da die Radioiodtherapie eine effektive und nebenwirkungsarme Therapiemodalität der differenzierten Schilddrüsenkarzinome ist, stellt sich die Frage, ob NIS auch in extrathyreoidalen Tumoren exprimiert ist und somit die Radioiodtherapie auch in diesen Fällen eine Option darstellen kann. In extrathyreoidalen Geweben findet sich eine physiologische Expression des NIS in erster Linie in der Brustdrüse, im Magen, in den Speicheldrüsen und im Plexus choroideus. Extrathyreoidale Tumore betreffend wurden bisher einige Studien über die Aktivität des NIS bei Mammakarzinomen veröffentlicht: NIS-Überexpression mit konsekutiver Iodidaufnahme wurde in Zelllinien humaner Mammakarzinome und auch bei Patienten nachgewiesen. Über die funktionelle Expression des NIS in weiteren extrathyreoidalen Tumorentitäten ist jedoch deutlich weniger bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine endogene Expression des NIS mit daraus resultierender Iodidaufnahme in murinen Zelllinien aus Mamma-, Rektum- und Lungenkarzinomen nachgewiesen. Die Expression des NIS wurde funktionell durch Iodid- bzw. Pertechnetataufnahme in vitro und in vivo in präklinischen Tumormodellen dokumentiert. Molekularbiologisch konnte NIS auf mRNA- und auf Proteinebene mittels real-time RT-PCR, Immunfluoreszenzfärbungen und Immunoblots nachgewiesen werden. Es konnte in vitro eine Modulation der funktionellen Iodidaufnahme in Abhängigkeit von der Tyrosinphosphorylierung und des cAMP-Spiegels demonstriert werden. In vivo konnte in subkutanen allotransplantierten Tumoren dieser Zelllinien eine Steigerung der NIS-Aktivität durch Inhibition von Tyrosinkinasen induziert werden. Des Weiteren wurden mehrere murine transgene Modelle kolorektaler Karzinome auf NIS-Überexpression untersucht: in 14 % der Tumorgewebsproben konnte eine erhöhte Expression der NIS-mRNA dokumentiert werden. Zusammenfassend wurde erstmals eine aktive endogene Iodidaufnahme in Tumoren kolorektalen und bronchialen Ursprungs dokumentiert und der Nachweis erbracht, dass diese Iodidaufnahme auf eine endogene Überexpression des NIS zurückzuführen ist. Des Weiteren wurde eine Steigerung der Iodidaufnahme in diesen Tumoren durch Tyrosinkinaseinhibition demonstriert. Weitere Versuche sind erforderlich um diese Ergebnisse auf humane Gewebe zu übertragen, mit dem langfristigen Ziel der Entwicklung neuer Anwendungsmöglichkeiten der Radionuklidtherapie in der Onkologie.

Im Escherichia coli Stamm ECOR31 konnte erstmals eine atypische Insertionsstelle der weit verbreiteten Pathogenitätsinsel Yersinia-HPI beschrieben werden. Statt dem asnT-tRNA-Gen findet sich am Integrase-Ende der HPI eine weitere, offenbar horizontal transferierte Region, die RegX genannt wurde. Diese besitzt eine Größe von 24196 Basenpaaren und unterscheidet sich mit einem G+C-Gehalt von 47,9% vom E. coli-Kerngenom. Weder auf DNA noch auf Protein-Ebene existieren höhere Homologien zu E. coli-DNA. Nach Anfertigung einer Cosmid-Bank wurde die gesamte Region sequenziert und annotiert. RegX weist eine mosaikartige Struktur auf, mit Punktmutationen, Deletionen und Insertionen. Sie besteht aus 22 offenen Leserastern und alle potentiellen Gene und deren Translationsprodukte wurden durch Vergleiche mit der NCBI-Datenbank charakterisiert. Die Transkription verschiedener Gen-Cluster und deren Operonstruktur wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Die DNA-Region enthält eine interessante Anhäufung von putativen Aufnahme-Systemen für divalente Metallionen, wie Eisen, Zink, Mangan. Zudem beheimatet die Region X Regulatorgene ähnlich zu Fur und Zur und Zink-abhängige Enzyme. Im Gesamtvergleich der Region X ergeben sich die höchsten Homologien zu Teilen des Plasmids pLVPK von Klebsiella pneumoniae CG43 30. Anhand der strukturellen Unterschiede der Sequenzen mit Punktmutationen und Rekombinations-Ereignissen kann der anhaltende Wandel bakterieller Genome nachvollzogen werden. Des Weiteren wurde die Verbreitung dieser Region unter klinisch relevanten Enterobacteriaceae und Pseudomonaceae untersucht. Von 530 gescreenten Bakterien konnte ein Klebsiella pneumoniae Stamm isoliert werden, der in der groben Struktur identisch zu der untersuchten Region von ECOR31 ist. In diesem Isolat, das aus der Blutkultur eines Patienten mit Sepsis stammt, konnte sowohl die gesamte Region X, als auch die benachbarte Yersinia-HPI und die atypische Insertionsstelle der HPI nachgewiesen werden. Es ist davon auszugehen, dass die untersuchte Region auf einem konjugativen Klebsiella-Plasmid lokalisiert ist und so zusammen mit der HPI horizontal zwischen verschiedenen Spezies übertragen werden kann.

Neben den klassischen kardiovaskulären Risikofaktoren wie arterielle Hypertonie oder Hypercholesterinämie kommen den psychosozialen Faktoren wie Stress oder Depression eine entscheidene Rolle als Risikofaktor für die Entwicklung der Atherosklerose zu. Obwohl das chronische Stresshormon Corticotropin-Releasing-Hormon im Rahmen der adaptiven Stressantwort als Hauptvertreter der Effektorhormone angesehen wird, sind die pathophysiologischen Mechanismen, die zu einer CRH/Stress-bedingten endothelialen Dysfunktion führen, weitgehend unbekannt. Diese Arbeit hatte zum Ziel, den Effekt von peripherem CRH auf die Monozyten/Endothel-Interaktion, beispielhaft die Adhäsion, herauszuarbeiten. Die Untersuchungen der Monozyten-Endothel-Adhäsion wurde in einem in-vitro-Modell unter Verwendung der Zelllinien HMEC-1 und THP-1 mit einer neuen, modifizierten fluorometrischen Methode untersucht, monozytäres MAC-1/CD11b, endotheliales ICAM-1/CD54 und VCAM-1/CD106 mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Der Nachweis der vermittelnden monozytären CRH-Rezeptoren R1/-R2 erfolgte mittels RT-PCR- und Immunfluoreszenztechnik. THP-1 konnte als Zielzelle für CRH mit Nachweis der CRH-Rezeptoren auf mRNA- und Proteinebene identifiziert werden. CRH induzierte eine signifikante zeit- und konzentrationsabhängige Adhäsionszunahme der THP-1 Zellen am HMEC-1 Monolayer. Der Effekt scheint Monozyten-vermittelt, da CRH, konzentrationsabhängig, zu einer monozytären MAC-1/CD11b-Freisetzung führte. Eine CRH-Stimulation nur von HMEC-1 führte hingegen zu keiner Adhäsionszunahme, erklärbar z. B. durch die hier dokumentierte fehlende Veränderung von endothelialem ICAM-1/CD54 und VCAM-1/CD106 unter Einfluß von CRH. Die Ergebnisse unterstreichen somit die Relevanz von peripherem CRH auf die Monozytenfunktion und Monozyten/Endothel-Interaktion. Sie können einen Beitrag zur Erklärung eines möglichen Zusammenhangs von chronischem Stress (mit konsekutiver Erhöhung des Stresshormons CRH) und der Initiation / Progression der endothelialen Dysfunktion leisten (Wilbert-Lampen, Straube et al., 2006).

Für die Assemblierung des bakteriellen Flagellums müssen die externen Untereinheiten an ihren Bestimmungsort transportiert werden. Dies geschieht wie bei allen Gram-negativen Bakterien auch in Escherichia coli mit Hilfe des flagellären Typ III-Sekretionssystems (fTTSS). Dabei ist der flagelläre Exportapparat mit seinen cytoplasmatischen Komponenten FliH, FliI und FliJ von Bedeutung. Der Exportapparat ist im Basalkörper des Flagellums lokalisiert und liefert die Energie für den Export der Substrate, wie z. B. das Hakenkappenprotein FlgD und das Hakenprotein FlgE. Die Substrate benötigen ihrerseits ein Signal für die Erkennung durch den Exportapparat. Im Rahmen dieser Arbeit konnten Interaktionen zwischen den löslichen Komponenten FliH, FliI und FliJ des flagellären Typ III-Sekretionssystems von E. coli K12 festgestellt werden. Zudem wurden begonnene Arbeiten zur Lokalisation und Beschaffenheit einer Erkennungssequenz für den Exportapparat beim Substrat FlgD weitergeführt und auch das Substrat FlgE näher untersucht. Mit Hilfe der Affinitätschromatographie konnte ein Komplex, bestehend aus FliH, FliI und FliJ, aus dem Cytosol von E. coli BL21 (DE3) präpariert werden. Dafür wurden zuvor die Gene fliH, fliI und fliJ zusammen in den Vektor pASK-IBA 45 kloniert und dann exprimiert. Parameter für Interaktionen und Affinitäten zwischen zuvor einzeln präpariertem FliH, FliI und FliJ konnten mit Hilfe von isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Surface Plasmon Resonance (SPR) ermittelt werden. Unter Verwendung eines bereits etablierten Testsystems für das fTTSS in E. coli CC181-Mutanten konnte der Export der Hybridproteine FlgDPhoA bzw. FlgEPhoA untersucht werden. Dabei wurden von FlgD auch N- oder C-terminale Verkürzungen sowie auf Nukleotid- oder Aminosäureebene veränderte Sequenzen eingesetzt. Die Untersuchungen ergaben ein Signal für den Export des Hakenkappenproteins FlgD auf Proteinebene und nicht auf der Ebene der mRNA. Zudem konnte das Exportsignal auf die N terminalen 71 Aminosäuren von FlgD eingegrenzt und eine Bedeutung des möglichen zweiten Startcodons an Position 52 in flgD für den Export ausgeschlossen werden. FlgE wurde in seiner gesamten Länge vom fTTSS transportiert. Im Gegensatz zu FlgD führten jedoch alle C-terminalen Verkürzungen von FlgE zum Transportverlust.

Epilepsien zählen zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen bei Hund, Katze und Mensch. Sie sind mit einer fortschreitenden Schädigung des zentralen Nervensystems und mit erheblichen Einschränkungen im täglichen Leben verbunden. Trotz Entwicklung zahlreicher neuer Antiepileptika über die letzten Jahrzehnte spricht etwa ein Drittel der Veterinär- und Humanpatienten nicht auf eine Pharmakotherapie an. Diese Pharmakoresistenz von Epilepsien stellt ein schwerwiegendes und bisher ungelöstes Problem für die betroffenen Patienten dar und macht neue Therapiestrategien dringend erforderlich. Eine Ursache der Pharmakoresistenz bei Epilepsien stellt die Überexpression von Multidrug-Transportern in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke dar. Die physiologische Funktion dieser Efflux-Transporter besteht darin, den Eintritt von Xenobiotika in das Gewebe bestimmter Körperregionen zu verhindern. Eine Überexpression bei pharmakoresistenten Patienten führt zu einem vermehrten Efflux-Transport von Antiepileptika in die Blutbahn, so dass trotz therapeutischer Plasma-Konzentrationen keine ausreichenden Wirkstoffspiegel im Bereich des epileptischen Fokus erreicht werden können. Auf der Basis der Multidrug-Transporter-Hypothese wurden im Rahmen dieser Dissertation zwei mögliche neue Behandlungsstrategien zur Überwindung der Pharmakoresistenz von Epilepsien im Tiermodell untersucht. In den letzten Jahrzehnten wurde ein direkter intra- oder extraneuronaler Transport von Substanzen nach intranasaler (i.n.) Applikation aus der Nasenhöhle in das Gehirn wiederholt beschrieben. Diese Möglichkeit zur Umgehung der Blut-Hirn-Schranke und der dort lokalisierten Efflux-Transporter wurde im Rahmen dieser Arbeit mittels Untersuchungen zur Gehirngängigkeit von Antiepileptika nach i.n.-Applikation im Rattenmodell näher überprüft. Mikrodialyse-Untersuchungen zur Bestimmung der Extrazellulär-Konzentration von Phenobarbital, Lamotrigin und Carbamazepin im Bereich des frontalen Cortex ergaben keine Hinweise auf einen effektiveren Substanztransport nach i.n.-Applikation im Vergleich zur intravenösen (i.v.) Applikationsform. Die Bestimmung der Phenobarbital-Konzentration im Gesamtgehirngewebe nach i.n.- und i.v.-Verabreichung resultierte ebenfalls in gleichwertigen Konzentrationen. Die Untersuchung einzelner Gehirnregionen 10 min nach i.n. Applikation ergab für den Bulbus olfactorius eine signifikant höhere Gehirn-Plasma-Ratio im Vergleich zur i.v.-Applikation. Im Amygdala-Kindling-Modell der Temporallappen-Epilepsie konnte eine dosisabhängige antikonvulsive Wirkung nach i.n.-Applikation von Phenobarbital beobachtet werden, die in vergleichbarem Maße auch nach i.v.-Applikation zu beobachten war. Insgesamt geben die Untersuchungsergebnisse keinen Hinweis darauf, dass ein direkter Transport von Antiepileptika aus der Nasenhöhle in das Gehirn in therapeutisch relevantem Ausmaß stattfindet und eine Umgehung der Blut-Hirn-Schranke auf diese Weise möglich ist. Eine besondere Eignung der i.n.-Applikation zur Therapie pharmakoresistenter Patienten erscheint daher unwahrscheinlich, kann jedoch endgültig erst durch Untersuchungen in einem Tiermodell für pharmakoresistente Epilepsie beurteilt werden. Die nach i.n.-Applikation von Phenobarbital erreichten Plasma-Konzentrationen in Kombination mit der gezeigten antikonvulsiven Wirksamkeit lassen diesen Applikationsweg jedoch zur nicht invasiven Behandlung eines Status epilepticus oder von Anfalls-Clustern Erfolg versprechend erscheinen. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (P-gp) wird in Zusammenhang mit transporter-basierter Pharmakoresistenz bei Epilepsie besondere Bedeutung beigemessen. Durch pharmakologische Inhibition der P-gp-Funktion gelang im Tiermodell bereits die Überwindung von Pharmakoresistenz. Die Anwendung von Hemmstoffen bringt jedoch den Nachteil einer P-gp-Inhibition in allen Körperregionen mit sich. Eine auf die Blut-Hirn-Schranke begrenzte Reduktion der P-gp-Expression wäre durch den Mechanismus der RNA-Interferenz zu erreichen. Für in vivo-Untersuchungen an Ratten wurde gegen P-gp-mRNA gerichtete „small interfering RNA“ (siRNA) zum Schutz vor endogenen Nukleasen in Liposomen eingeschlossen. Zudem wurde für ein Targeting das Peptid ApoE4 an die Oberfläche der Liposomen gebunden, welches eine Endozytose an Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke vermittelt. Das Ziel einer P-gp-Reduktion auf Protein-Ebene nach i.v.-Applikation derart geschützter und zielgesteuerter siRNA konnte jedoch nicht erreicht werden. Die Quantifizierung der P-gp-Expression in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke anhand immunhistochemisch gefärbter Gehirnschnitte ergab 24 h nach Applikation keine Verminderung der P-gp-Expression. Die Ursachen für die ausgebliebene P-gp-Reduktion sind in weiterführenden Untersuchungen zu klären.

Bradykinin – ein früher Entzündungsmediator – ist ein aktiver Metabolit des Kallikrein-Kinin Systems, der seine Funktion in erster Linie über den konstitutiv exprimierten Kinin B2 Rezeptor vermittelt. Sämtliche Komponenten dieses Systems sind im Gehirn nachgewiesen worden. Pharmakologische Studien mit Kinin B2 Rezeptor Antagonisten lassen vermuten, dass Bradykinin an der Entwicklung des sekundären Hirnschadens nach zerebraler Ischämie beteiligt ist. Ferner gibt es sehr starke Hinweise darauf, dass Bradykinin durch Öffnung der Blut-Hirn Schranke maßgeblich an der Entstehung des Hirnödems nach Ischämie beteiligt ist. Dennoch ist der zeitliche Verlauf der Produktion von Bradykinin und der Expression der Kinin Rezeptoren sowie die Rolle des Kinin B2 Rezeptors für die Entwicklung des Hirnschadens nach experimentellem Schlaganfall bisher nicht weiter beleuchtet worden. Aufgrund der sehr starken Hinweise auf eine pathophysiologische Relevanz des Kallikrein-Kinin Systems bei der zerebralen Ischämie, wollten wir dessen Beteiligung an der Entstehung des sekundären Hirnschadens nach transienter fokaler zerebraler Ischämie genauer untersuchen. Hierfür unterzogen wir Mäuse des Stammes C57/Bl6 einer 45minütigen Okklusion der A. cerebri media (MCA) mittels eines intraluminalen Fadens, was zu einem standardisierten ischämischen Infarkt im MCA-Versorgungsgebiet führte. Zunächst bestimmten wir die Konzentration an Bradykinin mit einem Radioimmunoassay, sowie die Expression der Kinin Rezeptoren auf mRNA- und Protein-Ebene mit Real-Time PCR bzw. Immunhistochemie zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Ischämie. Nachdem wir die zeitlichen Verläufe der Produktion von Bradykinin und der Expression der Kinin Rezeptoren ermittelt hatten, interessierten wir uns besonders für die funktionelle Bedeutung des B2 Rezeptors, über den vermutlich die pathologischen Mechanismen in Gang gesetzt werden. Um dessen Bedeutung beurteilen zu können, ermittelten wir 24 Stunden nach Ischämie bei B2 Rezeptor knockout Mäusen (B2-/-) gravimetrisch durch Messung von Feucht- und Trockengewicht das Hirnödem, histomorphometrisch das Infarktvolumen, die motorische Funktion mit Hilfe eines Neuroscores und die Mortalität während der ersten Woche nach experimentellem Schlaganfall. Die B2-/- und C57/Bl6 Mäuse waren zuvor ausführlich hinsichtlich der für unsere Versuche relevanten Parameter charakterisiert und verglichen worden, wobei wir die C57/Bl6 Mäuse als geeignete Kontrollen evaluierten. Die Konzentration an Bradykinin im Hirngewebe war 12 Stunden nach Ischämie maximal angestiegen (3-fach), während die Hochregulation der mRNA der Kinin B1 und B2 Rezeptoren nach 24 Stunden ihr Maximum hatte (5-fach bzw. 17-fach). Die Immunhistochemie zeigte, dass die Kinin B1 und B2 Rezeptoren konstitutiv über das gesamte Mäusegehirn verteilt exprimiert wurden, bereits 2 Stunden nach Ischämie in Neuronen, die morphologische Zeichen ischämischer Schädigung zeigten, hochreguliert wurden und über 24 Stunden hochreguliert blieben. Bei der Untersuchung der funktionellen Bedeutung des Kinin B2 Rezeptors für die Entwicklung des sekundären Hirnschadens nach transienter fokaler zerebraler Ischämie zeigte sich, dass die B2 Rezeptor knockout Mäuse verglichen mit ihren wildtyp Kontrollen signifikant vor den Folgen der MCA-Okklusion geschützt waren. Sie hatten verglichen mit ihren Kontrollen eine bessere motorische Funktion (p

Der größte Teil der chloroplastidäre Protein werden an zytosolischen Ribosomen synthetisiert und posttranslational in den Chloroplasten importiert. Einige dieser Proteine können in ihrem N-terminalen Transitpeptid von einer bislang unbekannten Proteinkinase phosphoryliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten drei bislang nur bioinformatisch beschriebene Proteinkinasen identifiziert werden, welche spezifisch chloroplastidäre Vorstufenproteine in ihrem Transitpeptid phosphorylieren. Die Proteinkinase At2g17700 wurde aus Arabidopsis-thaliana-Rosettenblätter chromatographisch angereichert und massenspektroskopisch identifiziert. Die Proteinkinasen At4g35780 und At4g38470 wurden durch einen Abgleich mit dem Proteom von Arabidopsis thaliana identifiziert. Die Übereinstimmung auf Proteinebene zu At2g17700 beträgt zwischen 58-77%. Die cDNA der Enzyme wurde kloniert und die entsprechenden Proteine heterolog exprimiert. Alle drei rekombinanten Proteinkinasen phosphorylieren eine Reihe von chloroplastidären Vorstufenproteinen. Die Substratspezifität der drei Proteinkinasen zeigt deutliche Unterschiede bei den jeweiligen Vorstufenproteinen. Mitochondrielle Vorstufenproteine werden von den drei Proteinkinasen nicht phosphoryliert. Die Phosphorylierung von pSSU und pHcf136 durch die drei Proteinkinasen findet spezifisch in der N-terminalen Transitsequenz der Proteine statt. Die Proteinkinasen At2g17700 und At4g35780 weisen vergleichbare Transkriptmengen in allen Pflanzengeweben auf. Das Gen der Proteinkinase At4g38470 hat gegenüber den anderen beiden Enzymen ein durchschnittlich höheres mRNA Expressionsniveau und scheint vornehmlich in den Wurzel und den Wurzelanlagen exprimiert zu werden. Die Analyse von T-DNA-Insertionslinien für die Proteinkinasen At2g17700 und At4g35780 hat erste Hinweise erbracht, dass diese Enzyme auch für die Vorstufenprotein-Phosphorylierung in vivo verantwortlich sind. Die Phosphorylierung von pSSU durch Blattextrakt, gewonnen aus den jeweiligen Mutanten, ist um bis 60% reduziert. Aus Wildtyp-Pflanzen gewonnenes Blattextrakt lässt sich mit Antiserum gegen rekombinantes At2g17700 um 50% in seiner pSSU-Phosphorylierung depletieren. Bei den drei Proteinkinasen handelt es sich um eine Proteinfamilie, die vermutlich für die Vorstufenprotein-Phosphorylierung von Chloroplastenproteinen verantwortlich ist. Differenzen in der Substratspezifität und in den mRNA-Expressionslevel weisen auf unterschiedliche Aufgaben der drei Kinasen in der Zelle hin.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt weltweit zu den häufigsten Karzinomen, in Europa macht es zwar nur 3% der Karzinome aus – jedoch mit steigender Inzidenzrate. Diese ist möglicherweise auf eine Infektionswelle mit Hepatitis B und C von 1950 bis 1980 zurückzuführen (29, 125). Daneben zählen chronischer Alkoholabusus, Aflatoxin B1-Exposition und Leberzirrhose per se zu den Hauptrisikofaktoren für die Entstehung des hepatozellulären Karzinoms. Die Kenntnisse der molekularen Mechanismen der Karzinogenese in der Leber, insbesondere der Dysregulation von Proliferation und Apoptose sind indessen noch sehr lückenhaft. Die vorgelegte Arbeit wurde mit dem Ziel durchgeführt, einen Beitrag zur Klärung der formalen und molekularen Pathogenese der Hepatokarzinogenese zu leisten. Es wurde das Proliferations- und Apoptoseverhalten im hepatozellulären Karzinom (HCC, n=52) über immunhistochemische Verfahren und TUNEL-Hybridisierung untersucht. Dabei wurde die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67, der Zellzyklus- und Apoptosekontrollproteine Fas-Rezeptor (Fas), Fas-Ligand (FasL), bax, bcl-2, p53 und der Apoptosemarker M30 und TUNEL mit normalem Referenzgewebe (RG, n=61), dysplastischen Knoten (DN, n=9), einem hepatozellulären Adenom (HCA, n=1), makroregenerativen Knoten (MRN, n=5), fokaler nodulärer Hyperplasie (FNH, n=3), undifferenzierten Karzinomen (n=2), einem cholangiozellulären Areal eines Kollisionstumors (n=1) und Metastasen primärer Lebermalignome (n=3) verglichen. Fragen waren dabei, - ob bestimmte Expressionsmuster der untersuchten Zellzyklus- und Apoptose-regulatoren kennzeichnend für die Hepatokarzinogenese sein könnten, - ob sich Hinweise auf eine Adenom-Karzinom- oder Dysplasie-Karzinom-Sequenz ergeben, - ob interindividuelle Unterschiede zwischen HCC abhängig von Ätiologie, histologischem Differenzierungsgrad, Tumorgröße, pT-Stadium und Morphologie bestehen und sich daraus Rückschlüsse auf ein jeweils charakteristisches tumorbiologisches Verhalten ziehen lassen, - ob sich aus den Ergebnissen relevante Schlussfolgerungen für Diagnostik und Therapie des Hepatozellulären Karzinoms ableiten lassen. Damit wird mit dieser Arbeit erstmalig eine komplexe Beleuchtung des Proliferations- und Apoptoseverhaltens im hepatozellulären Karzinom und in anderen Veränderungen der menschlichen Leber vorgelegt, die so bisher nicht vorgenommen wurde. Folgende Ergebnisse waren in der Auswertung der immunhistochemischen Untersuchungen festzustellen: HCC zeigten eine signifikant gesteigerte Ki-67-Expression, TUNEL-Positivität, bax-Expression, sowie eine signifikant verminderte Fas- und FasL-Expression gegenüber normalem Referenzgewebe (RG) (p

Maligne Erkrankungen sind in den Industrieländern, nach Herz-Kreislauferkrankungen, die zweithäufigste Todesursache. Aufgrund der Erfolge bei der Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wird Schätzungen zufolge Krebs in den nächsten Jahren die häufigste Todesursache in den entwickelten Ländern sein. Trotz des klinischen und wissenschaftlichen Fortschritts ist die Prognose der meisten Tumorentitäten unverändert schlecht. Eine der Hauptursachen ist der Mangel an spezifischen Markern, um eine geeignete Frühdiagnostik, Vorsorge und Therapie zu ermöglichen. Biomarker, wie tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene, werden als potente Strukturen diskutiert, Karzinome bereits im Frühstadium zu diagnostizieren und im Rahmen von Therapien als Zielstrukturen eingesetzt zu werden. Seit einigen Jahren werden daher systematische Techniken zur Identifizierung neuer Tumorantigene entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine bestehende Technologie zur Identifizierung von Tumorantigenen weiterentwickelt und optimiert werden. Die in der Arbeitsgruppe etablierte Technik namens AMIDA (Autoantibody-mediated Identification of Antigens) basiert auf der spezifischen Autoantikörper-vermittelten Selektion und Aufreinigung potenzieller Tumorantigene und deren anschließender zweidimensionaler Auftrennung und Isolierung. AMIDA ermöglicht prinzipiell die Identifizierung von Tumorantigenen, die durch posttranslationale Modifikationen immunogen wurden, wobei für die Isolierung das komplette Proteom zur Verfügung steht. Es wurde eine allogene Variante etabliert, welche die Technik unabhängig von autologen Tumorbiopsien macht (allo-AMIDA). Neben der Einführung geeigneter Kontrollen kann allo-AMIDA nun im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Der Vorteil von allo-AMIDA gegenüber AMIDA und anderen Strategien ist, neben der schnellen und reproduzierbaren Durchführung, die nunmehr universelle Einsetzbarkeit der Methode. Zur Identifizierung von Tumorantigenen werden lediglich Seren von Tumorpatienten und eine geeignete Tumorzelllinie benötigt. Allo-AMIDA wurde am Beispiel von Karzinomen des Kopf-Hals-Bereiches eingesetzt und führte zur Identifizierung von insgesamt 12 potenziellen Tumorantigenen. Neun der 12 Tumorantigene wiesen zum Zeitpunkt der Identifizierung eine Assoziation mit Tumoren auf, fünf davon sind etablierte Tumorantigene, was die Eignung von allo-AMIDA zur Identifizierung von TAs beweist. Für die allo-AMIDA-Antigene Grb-2 und Hsp-27 konnte eine starke Expression in Tumorzellen der Kopf-Hals-Entität gezeigt werden. Drei der allo-AMIDA Antigene waren bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen assoziiert. Eines dieser Proteine – hnRNP H (heterogeneous ribonucleoprotein H) – stellte sich als geeigneter Marker für Tumorzellen des Kopf-Hals-Bereiches heraus. Es konnte auf Transkript- und Proteinebene gezeigt werden, dass hnRNP H bereits in hyperplastischem Epithelien vermehrt gebildet wird und mit zunehmender Karzinogenese in den meisten primären Tumoren bzw. Metastasen dieser Tumorentität stark überexprimiert ist. Interessanterweise war diese starke Expression auf Tumorzellen beschränkt. In anderen Tumorentitäten (Kolon-, Pankreas-, Mamma-Karzinom) war hnRNP H ebenfalls stark über-exprimiert, die Expression in humanen nicht-malignen Geweben war sehr heterogen. Da bis dato wenige Informationen über die Funktion dieses nukleären Proteins bekannt sind, wurde hnRNP H detaillierter analysiert. In der Literatur wird diskutiert, dass hnRNP H am alternativen Spleißen von prä-mRNAs bzw. an der Regulation dieses Prozesses beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Repression von hnRNP H durch RNAi zur Apoptose von Tumorzelllinien führt. Mittels Genexpressionanalyse konnten potenzielle Zielgene im Bereich Apoptose identifiziert werden, die von hnRNP H durch alternatives Spleißen reguliert werden. hnRNP H ist an der Regulation des Bcl-X-Gens beteiligt, was von Garneau und Kollegen (2005) kürzlich ebenfalls gezeigt werden konnte. Die Regulation von ARAF1 durch hnRNP H wurde erstmals gezeigt; ein potenzieller Weg, wie die Deregulation von ARAF1 Apoptose induzieren kann, wird vorgeschlagen. Die Validierung der Zielgene von hnRNP H im Kontext von Tumorzellen ist Gegenstand laufender Projekte und weiterer Analysen.

Die Funktion der Niere basiert auf einer intakten glomerulären Filtrationseinheit, für deren Aufrechterhaltung den Podozyten eine tragende Rolle zugeschrieben wird. Podozyten formen die Schlitzmembran und sind durch ihre anionische Glykokalix für die größen- und ladungsselektive Filtration des Blutes im Glomerulus zur Bildung eines proteinfreien Ultrafiltrats verantwortlich. Podozyten-Schädigung führt zu einem Verlust der Filtrationsschlitze, zu einem Ablösen der Podozyten von der GBM und zur Ausscheidung von hochmolekularen Proteinen im Urin (Proteinurie). Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifikation von molekularen Regulationsmechanismen. Vorarbeiten zeigten eine Induktion der ILK bei Podozyten- Schädigung in humanen Nierenerkrankungen, zwei Tiermodellen und in Podozyten- Zellkultur. Anhand eines ILK-Inhibitors konnte in vitro gezeigt werden, dass die ILKInduktion zu einer gesteigerten Proliferation und zu einer verminderten Zell-Matrix- Adhäsion führt. Durch den Einfluß der ILK auf GSK-3β wurden Elemente des Wnt- Signaltransduktionsweges rekrutiert. Die nucleäre Translokation von β-Catenin beeinflusste auf transkriptioneller Ebene das Schlitzmembranmolekül P-Cadherin in Podozyten. P-Cadherin wurde auf mRNA- und Protein-Ebene reprimiert (siehe Abbildung 8.1). Die Applikation des ILK-Inhibitors in einem Proteinuriemodell verminderte die strukturellen Schädigungen innerhalb der Glomeruli. Immunfluoreszenzen und Co-Immunpräzipitationen ermöglichten die Identifikation eines neuen, cytoskeletalen Interaktionspartners von ILK, bei dem es sich um das kürzlich beschriebene PDZ-LIM Domänen Protein CLP-36 (siehe Abbildung 8.1) handelt. In Podozyten wird CLP-36 an Serin- und Threonin-Resten phosphoryliert. Eine direkte Phosphorylierung von CLP-36 durch die ILK konnte mit den verwendeten in vitro Experimenten zunächst nicht nachgewiesen werden. CLP-36 assoziiert neben FActin mit den Alpha-Actinin-Isoformen 1 und 4. Die Expression und molekulare Interaktion von CLP-36 und Alpha-Actinin-4 in Podozyten konnte bestätigt werden. Mutierte Formen von Alpha-Actinin-4 führen bei Menschen zu einem Podozyten- Schaden, einhergehend mit starker Proteinurie.Über die Regulation von nativem Alpha-Actinin-4 und seinem Interaktionspartner CLP-36 war bei erworbenen Nierenerkrankungen noch nichts bekannt. Diese sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Bei humanen Nierenerkrankungen, insbesondere bei FSGS-Patienten, fand sich eine deutliche Reduktion von Alpha- Actinin-4 und CLP-36 Protein bei gleich bleibender mRNA-Expression. Die Analyse der Primärsequenz beider Moleküle ergab, dass diese durch Proteasomen degradiert werden könnten. Die Ubiquitinierung von Alpha-Actinin-4 konnte experimentell bestätigt werden, für CLP-36 fanden sich Hinweise auf eine Poly-Ubiquitinierung. Untersuchungen mit dem Translationsblocker Cycloheximid ergaben eine Halbwertszeit von mehr als 20 Stunden für beide Moleküle. Bei zusätzlicher Inhibition mit einem Proteasom-Inhibitor wurde deren proteasomale Degradation verhindert. Der Verlust beider Proteine bei oxidativem Stress konnte ebenfalls durch Inhibition der Proteasomen unterbunden werden. In dem murinen Proteinuriemodell entsprach die Regulation von CLP-36 und Alpha-Actinin-4 auf Protein- und mRNA-Ebene den Befunden an Patientenmaterial. Die Inhibition der Proteasome blockierte den Verlust von Alpha-Actinin-4 Protein in vivo. Die vorgestellten Daten identifizieren neue molekulare Regulationsmechanismen bei Podozyten-Schädigung und leisten einen Beitrag zum besseren Verständnis der zellulären Prozesse bei Nierenerkrankungen.

Der Eileiter spielt eine bedeutende Rolle im Reproduktionsgeschehen und ist dabei in viele wichtige Prozesse involviert. Er unterstützt durch das Milieu, das er bereit stellt, die Kapazitation der Spermien, die Reifung und die Befruchtung der Eizelle, und er fördert durch sezernierte Faktoren die frühe Embryonalentwicklung. Während des Zyklus durchläuft er deutliche morphologische und histologische Veränderungen, um seinen verschiedenen Aufgaben gerecht zu werden. Da viele Veränderungen in einem Gewebe mit einer Veränderung des Transkriptoms einhergehen, haben wir bovines Eileiterepithel als Ausgangsmaterial für Untersuchungen auf der Ebene der mRNA ausgewählt. Um ein homogenes und definiertes Probenmaterial erhalten zu können, musste die Schlachtung der Tiere zur Probengewinnung zu einem möglichst genau definierten Zykluszeitpunkt stattfinden. Hierfür wurde ein Protokoll zur Tiervorbereitung erarbeitet, mit dessen Hilfe alle Tiere für die Versuche einheitlich ausgewählt und zyklussynchronisiert wurden. Weiterhin wurde ein Entnahmeprotokoll für die Eileiterepithelproben entwickelt, das Schwankungen in der Probenqualität unabhängig von der durchführenden Person minimiert. Zur Untersuchung von Veränderungen des Transkriptoms wurde in einem ersten Ansatz eine Kombination aus subtraktiven cDNA-Banken und radioaktiver cDNA-Array-Hybridisierung verwendet. Zuerst wurde Eileiterepithel (Ampulle und Isthmus gemeinsam) von drei Tieren im Östrus und drei Tieren im Diöstrus untersucht. Insgesamt wurde die Expression von 3072 cDNA-Klonen (1536 cDNAs pro subraktiver Bank, eine Bank pro Zykluszeitpunkt) im Östrus versus Diöstrus verglichen. Dabei konnten 77 verschiedene cDNAs mit signifikanten Konzentrationsunterschieden zwischen den beiden Zykluszeitpunkten identifiziert werden. Davon waren 37 im Östrus und 40 im Diöstrus stärker exprimiert. Die identifizierten Gene wurden in Funktionsklassen eingeordnet. Dadurch konnten vereinfachte „Gene Ontologies“ gebildet werden, die einen Überblick geben, welche biologischen Prozesse und molekularen Funktionen zwischen Östrus und Diöstrus reguliert werden. So sind Gene, die für die Synthese und Sekretion von Proteinen wichtig sind, im Östrus hochreguliert, wohingegen Gene, die Aufgaben in der Regulation der körpereigenen Immunantwort und der Transkription haben, im Diöstrus hochreguliert sind. In einem zweiten Ansatz wurden die gewonnenen Einblicke in die Genexpressions-veränderungen während des Zyklus weiter vertieft. Dazu wurde ein Ovidukt-Array hergestellt, das auf vorangegangene Arbeiten zur Genexpression im Eileiterepithel aufbaute und durch alle cDNAs, die im Vergleich von Eileiterepithel im Östrus zu Diöstrus als differenziell exprimiert auffielen sowie durch einige Kandidatengene, erweitert wurde. Zusätzlich enthielt es, als interne Kontrolle, 94 cDNAs, von denen keine Veränderung der Genexpression im Zyklusverlauf zu erwarten waren. Auf dem Ovidukt-Array befanden sich insgesamt 549 cDNAs von 432 Genen. Mit diesem Array wurden Hybridisierungs-experimente mit bovinen Eileiterproben aus vier verschiedenen Zyklusstadien durchgeführt, jeweils drei Tiere an Tag 0, Tag 3,5, Tag 12 und Tag 18 des Sexualzyklus. Dabei wurden Proben aus Ampulle und Isthmus getrennt voneinander untersucht. Die Auswertung der Hybridisierungsergebnisse ergab 196 differenziell exprimierte Gene. Die mit den Ovidukt-Array erhaltenen Daten konnten die beim Östrus-Diöstrus-Vergleich erhaltenen Ergebnisse sehr gut bestätigen, weiter vertiefen und spezifizieren. Zusätzlich wurden Veränderungen der mRNA-Spiegel ausgewählter Gene durch quantitative Real-time RT-PCR genauer quantifiziert und Lokalisationsstudien im Eileiterepithel mittels in situ Hybridisierung durchgeführt. Weiterhin wurde damit begonnen, Veränderungen auf Proteinebene in den Eileiterepithelzellen im Zyklusverlauf für einzelne Kandidatengene zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit ergab grundlegende Erkenntnisse zur Veränderung der mRNA-Zusammensetzung während des Sexualzyklus im bovinen Eileiterepithel aus der Ampulle und dem Isthmus. Damit wurden histologische Veränderungen des Epithels während des Zyklus auf molekularer Ebene charakterisiert. Auf dieser Grundlage können auch spezifische Reaktionen, die von anwesenden Spermien, befruchteten Eizellen oder Embryonen ausgelöst werden, untersucht werden.

In der Pathogenese, Progression und den akuten Ereignissen der Atherosklerose haben die Wachstumsfaktoren VEGF und PDGF und das Chemokin MCP-1 große Bedeutung. Durch Veränderung der Ausbildung dieser Proteine könnte der Lauf der durch Atherosklerose bedingten Erkrankungen positiv beeinflusst werden. Untersuchungen von Medikamenten oder Nahrungsbestandteilen die einen Einfluss auf die Genexpression dieser Proteine haben sind somit von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von diätetisch zugeführten, niedrig dosierten w-3 Fettsäuren auf die Serumspiegel von VEGF, PDGF-AB und MCP-1 und die Expression und Proteinbildung von MCP-1 und PDGF unter dem Einfluss von alleiniger Adhärenzstimulation oder Zugabe von verschiedenen gängigen Stimulanzien in mononukleären Zellen untersucht. In der Atherogenese spielen mononukleäre Zellen eine zentrale Rolle. Da w-3 Fettsäuren einen positiven Effekt in den durch Atherosklerose bedingten Krankheiten haben und vorausgegangene Studien sehr hohe, in der Praxis nicht mögliche Dosierungen gewählt wurden, ist eine Studie zu deren Einfluss, in niedriger, jedoch wirksamer Dosierung, auf die Expression von VEGF, PDGF-AB und MCP-1 von großer Bedeutung. Dafür wurde ein randomisierte, doppelblinde, Placebo kontrollierte Interventionsstudie an 14 männlichen gesunden Freiwilligen durchgeführt. Die Probanden der Verumgruppe erhielten zusätzlich zu ihrer normalen Ernährung für sechs Wochen täglich 3g und dann für weitere sechs Wochen 1,5g w-3 Fettsäuren. Die anfängliche hohe Dosierung wurde gewählt um eine Aufsättigung mit w-3 Fettsäuren zu erreichen. Die Probanden der Placebogruppe erhielten entsprechend Placebokapseln die in ihrem Fettsäurenprofil der westlichen Ernährung angepasst waren. Die Expressionsänderungen der genannten Proteine wurden in den Zellstimulationen auf der Genomebene mittels der etablierten 3n-rT-PCR als auch auf der Proteinebene mittels ELISA gemessen. Aufgrund von o.g. methodischen Problemen waren diese Ergebnisse jedoch angesichts der großen Mühen leider nicht verwertbar. Die Konzentrationen von VEGF, PDGF-AB und MCP-1 im Serum der Probanden wurden mittels ELISA gemessen. Hier zeigten sich deutliche interindividuelle Schwankungen. Die Konzentration von VEGF im Serum der Probanden der Verumgruppe senkte sich nach 3 Monaten durchschnittlich um 54±18% gegenüber den Ausgangswerten. Die Konzentration von VEGF im Serum der Placebogruppe änderte sich im Durchschnitt nicht, jedoch schwankten die Werte. Die Konzentration von PDGF-AB senkte sich im Serum der Verumgruppe nach 3 Monaten durchschnittlich um 57±20%. Die Konzentration von PDGF-AB veränderte sich in der Placebogruppe über den Untersuchungszeitraum nicht relevant. In der Verumgruppe senkte sich die Konzentration von MCP-1 im Serum der Probanden nach 3 Monaten im Durchschnitt um 43±17%. In der Placebogruppe war keine nennenswerte Veränderung vorhanden. Diese Ergebnisse waren statistisch relevant. Bei gesunden Probanden beeinflussen niedrig dosierte w-3 Fettsäuren die Regulation von VEGF, PDGF-AB und MCP-1. Somit wird die antiatherosklerotische Wirkung von w-3 Fettsäuren über die Beeinflussung der Genexpression und Proteinbildung proatherogener Faktoren auch in niedrigen Dosierungen bestätigt. Ein Einfluss von w-3 Fettsäuren auf VEGF wurde hier erstmals beim Menschen beschrieben.

In der vorliegenden Arbeit wurden Effekte von IL-10 auf monocytäre Lipidrezeptoren und -Transporter untersucht, die zusätzlich zu den anti-inflammatorischen Wirkungen von IL-10 für dessen anti-atherosklerotische Wirkung von Bedeutung sein könnten. Es konnte gezeigt werden, dass IL-10 die Expression des quantitativ wichtigsten Scavenger Rezeptors, CD36, in Monocyten/Makrophagen sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene hemmt. Diese Hemmung ging einher mit einer verringerten zellulären Aufnahme von oxidiertem LDL. Durch PPARgamma-FACS und -Western Blot in Cytosol-Kern-Fraktionen sowie Koinkubationen mit IL-10 und den PPARgamma-Agonisten 15d-PGJ2 (15-deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2) und Indomethacin konnte gezeigt werden, dass die IL-10 Hemmung von CD36 über die Hemmung des Transkriptionsfaktors PPARgamma vermittelt wird. Im Gegensatz dazu stimulierte IL-10 den Cholesterinexporter ABCA1 und dessen wichtigsten Transkriptionsfaktor LXRalpha auf RNA- und Proteinebene. Die Induktion von ABCA1 hatte funktionell einen verstärkten zellulären Cholesterinefflux zur Folge, welcher die Monocyten und Makrophagen vor Lipidakkumulationen schützte und das vermehrte Einschleusen von Cholesterin in den reversen Cholesterintransport ermöglicht. IL-10 stimulierte ABCA1 dabei trotz der Hemmung des Transkriptionsfaktor PPARgamma. Die IL-10 Stimulation von ABCA1 war durch Piceatannol, einem Inhibitor der proximalen, STAT3-vermittelten Signalübertragung des IL-10 Rezeptors, hemmbar. Mittels LXRalpha "knock down" Zellen konnte weiter gezeigt werden, dass für die IL-10-stimulierte ABCA1 Expression ein intakter LXRalpha-Signaltransduktionsweg nötig ist. Koinkubationen mit Fenofibrat, 9-cis RA (9-cis retinoic acid) und 22-OHC (22-Hydroxycholesterol) ergaben, dass IL-10 auch die Induktion von ABCA1 durch die beiden Transkriptionsfaktoren, PPARalpha und LXRalpha, verstärkte. Durch Hemmung der Proteinkinase A (PKA) und Messung der zellulären cAMP-Spiegel konnte des Weiteren ein distaler cross-talk des IL-10-Signalweges mit dem cAMP/PKA-Weg für die ABCA1 Stimulation nachgewiesen werden. Dagegen hatte IL-10 keinen anhaltenden Einfluss auf die Transkription von SR-BI. Der Scavenger Rezeptor BI (SR-BI) kann je nach Konzentrationsgradient sowohl die zelluläre Cholesterinaufnahme wie die Cholesterinabgabe vermitteln. Des Weiteren reduzierte IL-10 die LPS-induzierte ICAM-1 Expression, was auf die Attenuierung der NFkappaB- und PPARgamma-vermittelten ICAM-1 Expression zurückgeführt werden konnte. Insgesamt befördert IL-10 somit den ABCA1-initiierten peripheren Cholesterinabtransport aus Monocyten/Makrophagen durch HDL. Die gezeigten Effekte von IL-10 erklären tierexperimentelle Befunde eines deutlich reduzierten Lipidgehalts in atherosklerotischen Plaques unter IL-10 Behandlung. Sie erklären auch die niedrigen HDL-Spiegel bei IL-10 knock out (IL-10-/-) Mäusen, die durch exogene IL-10 Substitution korrigiert werden können. Demnach sollte IL-10 nicht nur durch seine anti-inflammatorischen Mechanismen, sondern auch durch seine Effekte auf das Cholesterinhandling von Monocyten/Makrophagen in der Gefäßwand die Entstehung und Progression atherosklerotischer Plaques reduzieren.

Das natürliche Vitamin Nikotinsäure wird seit 1955 in pharmakologischer Dosierung als Medikament zur Behandlung von Dyslipidämien und bei arteriosklerotischen Gefäßveränderungen verwendet. Von Nikotinsäure konnte als erstem Medikament bereits 1975 im Coronary Drug Project nachgewiesen werden, dass es die Mortalität nach Myokardinfarkt signifikant und anhaltend reduziert. Nikotinsäure senkt den LDL-Plasmaspiegel und erhöht den HDL-Spiegel. Während der Nikotinsäureeffekt auf LDL vielfach untersucht wurde, ist über den Mechanismus der HDL-Erhöhung bisher wenig bekannt. Nikotinsäure stimuliert massiv die PGD2-Synthese in vivo. Der Hauptmetabolit von PGD2, das 15-deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2, wurde kürzlich als wichtigster endogener Aktivator des nukleären Transkriptionsfaktors PPAR erkannt. PPAR ist entscheidend an der Regulation des Scavenger Rezeptors CD36 und des zellulären Cholesterinexporters ABCA-1 beteiligt. Diese Rezeptoren dominieren die zelluläre Aufnahme modifizierter LDL-Partikel und die Ausschleusung zellulären Cholesterins auf HDL-Partikel und damit die Cholesterinhomöostase in Monozyten/Makrophagen in der Gefäßwand. Deshalb war es Ziel der Arbeit an einem Makrophagenmodell zu untersuchen, ob Nikotinsäure Scavenger-Rezeptoren und zelluläre Cholesterin-Transporter tatsächlich beeinflusst und so über einen gesteigerten reversen Cholesterintransport aus der Peripherie zur Leber seinen klinischen Nutzen vermitteln könnte. Als Modelle wurden die differenzierte humane Monozytenlinie MM6, die humane hepatische Linie HepG2 und frisch präparierte humane Monozyten verwendet. Die Expression der Scavenger Rezeptoren CD36, SR-BI, LOX-1, des LDL-R, des Cholesterinexporters ABCA-1, des Transkriptionsfaktors PPAR und von -Aktin wurden durch reverse Transkription der spezifischen mRNAs, nachfolgende PCR und Quantifizierung der Amplifikate über HPLC bestimmt. Die Proteinexpression von CD36 und PPAR wurden mittels spezifischer Antikörper nach Fluoreszenzmarkierung im FACS gemessen. Die Änderung des zellulären Cholesteringehalts durch Inkubationen mit Nikotinsäure, oxLDL und delipidiertem HDL wurde nach zellulärer Lipidextraktion in einem adaptierten enzymatischen Assay gemessen. Im Makrophagenmodell stimulierte die Inkubation der Zellen mit Nikotinsäure schon nach 3 h und mindestens bis 48 h anhaltend die Transkription von PPAR, des PPAR abhängigen Scavenger-Rezeptors CD36 und des zellulären Cholesterinexporters ABCA-1. Dagegen blieb die Transkription des ApoB-spezifischen LDL-R und des Scavenger-Rezeptors LOX-1 unverändert. Vergleichbare Effekte waren auch am Hepatozytenmodell nachweisbar. Die Effekte auf die PPAR und CD36 Expression waren tendenziell auch auf Proteinebene nachweisbar. Die Stimulation von CD36 und ABCA-1 durch Nikotinsäure konnte auf RNA-Ebene auch an frisch präparierten peripheren Monozyten von Normalpersonen nachgewiesen werden. Die funktionelle Bedeutung der Nikotinsäureeffekte wurde in einem Cholesterin-Aufnahme und Efflux-Assay überprüft. Dabei reduzierte die Inkubation mit Nikotinsäure den zellulären Cholesteringehalt basal und unter oxLDL-Exposition und steigerte den zellulären Cholesterin-Efflux auf delipidiertes HDL. Diese neuen Effekte der Nikotinsäure auf mehrere Lipid-Rezeptoren und -Transporter können Lipidablagerungen in der Gefäßintima reduzieren, der Schaumzellbildung entgegenwirken und durch vermehrte Einschleusung von zellulärem Cholesterin in den reversen Cholesterintransport zurück zur Leber die HDL-Spiegel erhöhen. Diese peripheren Effekte der Nikotinsäure ergänzen die Effekte von Statinen und liefern ein Rational für einen potentiell überadditiven klinischen Nutzen durch die Kombinationstherapie, die gegenwärtig klinisch geprüft wird.

Die Infiltration mit leukozytären Zellen spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese glomerulärer Erkrankungen der Niere und wird durch sequentielle und sich überschneidende Interaktionen verschiedener Signalmoleküle gesteuert. In dieser Arbeit wurde die Adhäsionsmolekül- und Chemokinexpression von Mesangialzellen (MC) und glomerulären Endothelzellen (GEC untersucht) und deren Regulation durch verschiedene NF-kappaB Inhibitoren bestimmt. Die Zytokinstimulation der MC mit TNF-alpha induzierte die Transkription und Proteinexpression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 sowie der Chemokine GRO-alpha, IL-8, MCP-1, aber nicht Fractalkine. GRO-alpha und IL-8 wurden auf der MC Oberfläche über Heparanproteoglykane immobilisiert, MCP-1 und auch IL-8 als lösliche Moleküle sezerniert. Fractalkine hingegen war nur geringfügig induzierbar konstitutiv auf der MC Oberfläche exprimiert. Diese Induktion der Adhäsionsmoleküle und Chemokine durch Zytokinstimulation der MC war assoziiert mit einer vermehrten Monozytenadhäsion und Transmigration. Dabei vermittelte ICAM-1 und VCAM-1, der GRO-alpha Rezeptor CXCR2 und in geringerem Maße auch Fractalkine den festen monozytären Arrest, während der MCP-1 Rezeptor CCR2 die transendotheliale Chemotaxis von Monozyten auf aktivierte MC zu steuerte. Die transkriptionelle Hochregulation der untersuchten Moleküle wurde über eine Inhibition der IkappaB-alpha Degradation durch den Proteaseninhibitor TLCK, den Proteosomeninhibitor MG132 und durch die adenovirale IkappaB-alpha Überexpression gehemmt. Dies war assoziiert mit der Inhibition der monozytären Adhäsion auf aktivierten MC sowie der transendothelialen Migration auf stimulierte MC zu. Im Gegensatz zu MC wurde Fractalkine auf mRNA wie Proteinebene in transformierten GEC deutlich induziert, und sowohl CXCR2 also auch CX3CR vermittelten den Monozytenarrest auf aktivierten GEC unter Flussbedingungen. Die Relevanz dieser Ergebnisse konnte in einem akzelerierten Glomerulonephritis-Modell an der Ratte bestätigt werden, in dem die Blockade von CCR2 deutlich, und die Blockade von CXCR2 fast komplett die akute glomeruläre Makrophagenrekrutierung inhibierte. Dies unterstreicht die Bedeutung von CXCR2 für die Makrophageninfiltration in den frühen Phasen der NTN. Zusammenfassend erschließt sich ein mehrstufiges Modell, das die inflammatorische Monozytenrekrutierung durch funktionell spezialisierte Adhäsionsmoleküle und Chemokine zeigt.

HIV-1-infizierte Patienten leiden häufig unter krankhaften Veränderungen des Endothels, die zu funktionellen Störungen des Gefäßsystems, koronaren Herzerkrankungen und zu Tumoren führen können. Bemerkenswert ist, dass auch Kinder HIV-1-infizierter Frauen eine signifikant schlechtere Herzfunktion und somit ein erhöhtes Risiko für koronare Herzerkrankungen aufweisen, selbst wenn diese Kinder nicht mit dem Virus infiziert sind. Ziel diese Arbeit war zu untersuchen, ob die Ursache für diese Auffälligkeit eine Störung der Endothelzellen ist. Dazu wurden differenzierte Endothelzellen und zirkulierende endotheliale Vorläufer-Zellen aus der Stammzellfraktion des Nabelschnurblutes von nicht-infizierten Kindern HIV-1-infizierter und nicht-infizierter Mütter untersucht. Dabei konnten keine Unterschiede hinsichtlich der Proliferation, der Fähigkeit zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen in Matrigel und der Expression charakteristischer Endothelzellmarker beobachtet werden. Allerdings zeigte der molekularbiologische Vergleich der Genexpression, dass in Endothelzellen von Kindern HIV-1-infizierter Mütter die Expression von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) unter der Nachweisgrenze liegt oder signifikant reduziert ist. Dies konnte auf RNA- und Proteinebene sowie mittels Gelatine-Zymografie bestätigt werden.

Bei Patienten, die mit dem humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) infiziert sind, kommt es häufig zu krankhaften Veränderungen des Endothels, die zu einer Fehlfunktion des Gefäßsystems führen. Klinischer Ausdruck dieser als acquired immune deficiency syndrome (AIDS)-assoziierten Vaskulopathie bezeichneten Veränderungen sind Schädigungen des Aortenendothels, die mit einer erhöhten Adhäsion mononukleärer Zellen an das Endothel einhergehen, Defekte der Blut-Hirn-Schranke, die zur Entstehung von Demenz beitragen, sowie das Kaposi-Sarkom (KS), das durch eine sehr starke Extravasation von T-Zellen und Monozyten gekennzeichnet ist. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass das regulatorische HIV-1-Tat-Protein und das inflammatorische Zytokin TNF-a synergistisch die Adhäsion der promonozytären Zelllinie U937 und von PBMZ an humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVEZ) erhöht. Die adhäsionsfördernde Wirkung wurde selektiv bei HIV-1-Tat beobachtet, andere virale Proteine des HIV-1, wie Negativfaktor (Nef) und das Glykoprotein gp41, hatten keinen Einfluss auf die Adhäsion. Anhand zellspezifischer Marker wurde gezeigt, dass HIV-1-Tat in periphere mononukleäre Blutzellen (PBMZ) spezifisch die Adhäsion von Monozyten und T-Zellen erhöhte, jedoch nicht von B-Zellen. Intravital-mikroskopische Untersuchungen an der Maus bestätigten in vivo, dass HIV-1-Tat und TNF-a synergistisch die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel erhöhten. HIV-1-Tat reguliert die Expression einer großen Anzahl zellulärer Gene. Diese Fehlregulation durch HIV-1-Tat könnte an der Enstehung der AIDS-assoziierten Vaskulopathie beteiligt sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die parakrine Wirkung von HIV-1-Tat auf die Genexpression in Monozyten mittels der suppressed subtractive hybridization (SSH)-Methode untersucht. Hierbei wurde O-linked N-Acetylglucosamine-transferase (OGT) als Gen identifiziert, dessen Expression durch HIV-1-Tat unterdrückt wird. Bisher ist bekannt, dass OGT ein Repressor der basalen Transkription und der SP-1-regulierten Transkription ist. Die Expression von OGT wurde sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Protein-Ebene durch HIV-1-Tat und VEGF121 gehemmt, wobei die Regulierung über den VEGF-Rezeptor Flt-1 vermittelt wurde. Weitere Faktoren wie inflammatorische Zytokine (TNF-a, IL-1b, IFN-g und IL-2), angiogene Wachstumsfaktoren (bFGF und VEGF165) und Chemokine (IL-8, MIP-1a, IP-10, MCP-1 und SDF-1a) hatten keine hemmende Wirkung auf die OGT-Expression. Die schnelle Abnahme von intrazellulärem OGT-Protein wurde weder durch lysosomale Proteasen noch durch Proteasen des Proteasoms verursacht. Expressionsstudien an PBMZ von fünf verschiedenen Probanden zeigten, dass bei zwei Probanden die OGT-Konzentration durch HIV-1-Tat zunahm, bei zweien nahm sie ab und bei einer Person gab es keine Veränderung. Diese Ergebnisse belegen, dass HIV-1-Tat entscheidend an der Entstehung der AIDS-assoziierten Vaskulopathie, insbesondere von KS, beteiligt sein könnte. Die Repression von OGT durch HIV-1-Tat könnte die weitreichende Wirkung des HIV-1-Tat-Proteins auf zelluläre und virale Gene erklären.

Nach der kompletten Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen des „Human Genome Project“ sind sich die Experten einig, dass die Forschung sich nun den Vorgängen der komplexen Regulationsnetzwerken auf der Proteinebene widmen muß. Die Proteomforschung bedient sich dabei der möglichst optimalen und quantitativen Auflösung von komplexen Proteingemischen. Um dies zu ereichen werden die Proteine mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (2D-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) aufgetrennt. Im Rahmen der vorliegenden Promotion sollten am Beispiel ausgewählter relevanter Blutplasmaproteine das Phänomen der „ladder of spots“ untersucht werden. Dies sind Leitern von Proteinspots, die einem einzigen Protein zugeordnet werden können, sich jedoch in der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung (IEF) aufgrund ihrer Nettoladung unterscheiden und aufgetrennt werden. Vor allem in 2D-Gelen von Blutplasma sind eine ganze Reihe solcher Leitern zu beobachten, und in der Regel werden sie durch posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen oder Phosphorylierungen verursacht. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch der Einfluss von Alterungsprozessen auf der Proteinebene nachgewiesen werden, der zu der Veränderung dieser Proteine in Form von Deamidierungen der Asparagin- und Glutaminaminosäuren beiträgt. Der Mechanismus der Alterung wurde ebenfalls genauer untersucht, da diese Art von Modifikationsreaktion in der Natur sowohl chemisch als auch enzymatisch ablaufen kann. Hier spielt natürlich auch die Art und Weise der Probenvorbereitung eine große Rolle bei möglichen posttranslationalen Modifikationen. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Klonierung eines der ausgewählten Proteine (ß2-Microglobulin) in E.coli mittels molekularbiologischer Techniken. Ziel der Klonierung war es festzustellen, zu welchem Zeitpunkt die zuvor entdeckten posttranslationale Modifikation im Rahmen der natürlichen Alterung von Proteinen auftritt.

Die Superfamilie der ABC-Proteine ist eine der größten bisher bekannten Proteinfamilien. Ihre Mitglieder enthalten ein oder zwei nukleotidbindende Domänen mit je einem Walker A- und B-Motiv, sowie das charakteristische ABC-Motiv. Ein Großteil darunter sind Membranproteine, die zusätzlich ein oder zwei Transmembrandomänen besitzen. Diese ABC-Transporter sind vor allem in Mensch und Hefe charakterisiert, wo sie in zahlreichen Transportprozessen über die Membranen involviert sind. Über die Funktion der ABC-Transporter in pflanzlichen Organismen ist wenig bekannt, jedoch gibt es Hinweise dass diese Proteinfamilie in Pflanzen auch an der Kompartimentierung von Fremdstoffmetaboliten beteiligt ist. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurden 103 ABC-Transportergene annotiert, die sich in 9 Subfamilien aufteilen. Experimentell nachgewiesen wurden bisher lediglich 6 Mitglieder aus 2 Subfamilien. In dieser Arbeit wurden 28 ABC-Transporter aus 6 Subfamilien, davon 4 bisher nicht untersuchte, hinsichtlich organspezifischer Expression und Induktionsverhalten nach Herbizid- bzw. Safenerbehandlung untersucht. Dazu wurde ein DNA-Array ("Detox-Array") mit genspezifischen Sonden zur parallelen Transkriptanalyse etabliert. Zusätzlich wurden in Zusammenarbeit mit anderen Projekten weitere Genfamilien mit einbezogen, die potenziell an der Detoxifizierung von Xenobiotika beteiligt sind (Cytochrom P450 Monooxygenasen, Glutathion-S-Transferasen und UDP-Glycosyltransferasen), um Koregulationen einzelner Mitglieder der unterschiedlichen Genfamilien untersuchen zu können. Um die Unterscheidung auch hoch homologer Mitglieder dieser Familien zu ermöglichen, wurden Sonden aus dem 3‘-untranslatierten Bereich dieser Gene entwickelt und auf ihre Eignung zur Transkriptmessung untersucht. Die Expressionsanalyse der ABC-Transporter in Wurzeln, Stängeln, Blättern, Blütenständen und Schoten zeigte neben den sechs bereits bekannten ABC-Transportern Transkripte von 21 weiteren Vertretern. Die meisten waren in der Wurzel (26 von 28) nachzuweisen, die wenigsten (7 von 28) im Blatt. Am höchsten exprimiert waren AtMRP12 und AtPDR8 in der Wurzel und AtMRP5 in der Schote. Die Induktion der ABC-Transporter durch Xenobiotika wurde an Pflanzen 24h oder 36h nach Behandlung mit unterschiedlichen Chemikalien (Primisulfuron, Bromoxynil, Benoxacor) in sublethalen Dosen untersucht. Für die beiden Herbizide typische Schäden konnten erst 3 Tage nach der Behandlung beobachtet werden. Neben der in der Literatur beschriebenen Primisulfuron-Induktion von AtMRP3 (Tommasini et al., 1997) waren AtPDR8, AtMRP5, AtMRP4 und AtAOH1 transient nach 24h induziert. Mit einem Antiserum, das gegen die Subfamilie der PDR-Transporter erzeugt worden war, konnte deren Induktion durch Primisulfuron und Benoxacor auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Eine spezifische 6-fache Induktion nach Bromoxynil-Behandlung zeigte der ABC-Transporter AtTAP1. Die sechs genannten ABC-Transporter stellen somit Kandidaten dar, die an der Kompartimentierung von Metaboliten beteiligt sein können. Dabei kann es sich entweder um Primisulfuron- bzw. Bromoxynilmetabolite oder durch die Behandlung mit den Xenobiotika entstandene endogene Metabolite handeln. Eine Hauptkomponentenanalyse der Expressionsprofile zeigte, dass auf der Basis der auf dem Detox-Array vertretenen, aus dem Entgiftungs- und Sekundärmetabolismus ausgewählten Genfamilien eine eindeutige Unterscheidung der Antwort auf die verschiedenen Herbizide abgeleitet werden kann. Weitere Daten aus Kollaborationen mit anderen Projekten wurden in einer zweiten Hauptkomponentenanalyse mit einbezogen und zeigen, dass die Unterschiede vor allem auf die sekundären Auswirkungen der Herbizide zurückzuführen sind. Die dabei gefundene Koregulation der Primisulfuron-Behandlung mit der Reaktion auf das Signalmolekül Salicylsäure und ein bakterielles Pathogen ließ weiter schließen, dass Primisulfuron einen Elicitor-ähnlichen Effekt auf die Pflanze hat. Zur weiterführenden Funktionsanalyse von ABC-Transportern wurden parallel zu diesen Arbeiten knock-out Mutanten gesucht. In einer Kollektion des MPI für Züchtungsforschung in Köln konnten zwei Mutanten identifiziert werden, die jeweils ein En-Transposon innerhalb der offenen Leserahmen von AtPDR4 bzw. AtMDR4 besitzen.

Im Unterschied zu den HLA-Klasse-Ia-Molekülen ist das nicht-polymorphe Klasse-Ib-Molekül HLA-G v.a. in der Plazenta exprimiert. Es wird postuliert, daß HLA-G die Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegen den „semiallogenen“ Fetus mitreguliert. In allen anderen Zellen und Geweben, in denen es gefunden wurde, ist die Menge im Vergleich zu klassischen Klasse-I-Molekülen um Größenordnungen geringer. Auch in der Genexpression unterscheidet sich HLA-G drastisch von allen übrigen Klasse-I-Molekülen. Am auffallendsten ist dabei das Auftreten verschiedener alternativer Spleißformen. Neben dem Volle-Länge-Transkript G1m gibt es eine Reihe verkürzter Isoformen: G2 (G2m, Da2-Domäne), G3 (Da2/Da3-Domäne), G4 (Da3-Domäne) sowie zwei Formen, die für lösliche Proteine kodieren, da die nicht-entfernte Intron-4-Sequenz zu einem vorzeitigen Translationsstop führt, G5 (G1s), G6 (G2s, Da2-Domäne, + In4). Die schwache Expression von HLA-G bestätigte sich auch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Haut- und Muskelbiopsien sowie Gehirnproben. Transkripte für HLA-G und die verkürzten Isoformen waren in fast allen Proben nachweisbar, wobei das Volle-Länge-Transkript die dominante Form war. Bei den nach Krankheitsgruppen eingeteilten Hautbiopsien und den Muskelbiopsien mit definierten Diagnosen konnte keine Korrelation eines bestimmten Expressionsmusters mit einer bestimmten Krankheitsgruppe bzw. Diagnose festgestellt werden. Diese Heterogenität des Expressionsmusters sowie die selektive Hochregulation der Volle-Länge-Isoform G1m auf Transkriptions- und Proteinebene in Glioblastomzellinien und Myoblasten, die nur eine äußerst schwache konstitutive Expression von HLA-G aufweisen, nach Behandlung mit IFNg deutet auf eine differentielle Regulation hin. Um die einzelnen Isoformen getrennt voneinander untersuchen zu können, wurden Transfektanten für jede Form in der Klasse-I-negativen B-Zellinie 721.221 etabliert. Nur die Volle-Länge-Isoform G1m sowie deren lösliche Variante G1s konnten auf der Zelloberfläche bzw. im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Von den übrigen Isoformen konnten nur EndoH-sensitive Polypeptide gefunden werden, und auch Immunofluoreszenzfärbung mit einer Reihe von Klasse-I-Ak zeigte keine Zelloberflächenexpression. Es muß daraus geschlossen werden, daß die verkürzten Isoformen in der Zelle zurückgehalten werden. HLA-G kann auf zwei Wegen die Aktivität von Immuneffektorzellen regulieren: direkt über ILT2 und indirekt über HLA-E. Das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-E wird durch Bindung eines Nonamers (P3-11) aus dem Signalpeptid verschiedener Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen stabilisiert. Aus der Interaktion dieses funktionellen HLA-E/Peptid-Komplexes mit dem inhibitorischen Rezeptorkomplex CD94/NKG2A auf NK-Zellen resultiert ein Schutz dieser Zellen vor der NK-Lyse. Auch das entsprechende Peptid aus der Signalsequenz von HLA-G ist ein Ligand für HLA-E. Allerdings wurde gezeigt, daß die Stabilisierung von HLA-E auf der Zelloberfläche durch das Peptid G3﷓11 schwächer als mit anderen Klasse-I-Peptiden und auch weniger stabil ist. Effektive Inhibition der Lyse der NK-Zellinie NKL über diese Interaktion von HLA-E mit CD94/NKG2A findet man nur bei HLA-G1m-Transfektanten. Diese werden auch durch die direkte Interaktion von HLA-G1m mit einem weiteren inhibitorischen Rezeptor auf NKL - ILT2 - geschützt. In den 721.221-Transfektanten der verkürzten HLA-G-Isoformen war eine unphysiologisch hohe Konzentrationen an HLA-G-Polypetid notwendig, um die kritische Menge an HLA-E-Ligand für den Schutz dieser Zellen vor der Lyse durch NK-Zellen liefern zu können. Das war nur für eine äußerst stark exprimierende G3-Transfektante der Fall. Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in einer ineffizienteren Prozessierung des Signalpeptids von HLA-G und einer im Vergleich mit anderen HLA-E-Liganden geringeren Bindungsaffinität des Peptids G3-11 für HLA-E. Eine Funktion der verkürzten HLA-G-Isoformen durch die direkte Interaktion mit Rezeptoren auf NK-Zellen konnte nicht nachgewiesen werden und ist wegen ihrer intrazellulären Expression auch unwahrscheinlich. Vielmehr deuten erste Daten, die zeigen, daß die Isoformen, direkt oder indirekt, mit dem TAP-Komplex assoziiert sind, auf eine mögliche Funktion im Rahmen der Antigenpräsentation hin. Worin diese besteht, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Daher ist anzunehmen, daß HLA-G in vivo hauptsächlich über HLA-G-bindende KIR immunregulatorische Funktionen wahrnimmt und durch indirekte Wirkung über HLA-E-CD94/NKG2A modulierend eingreift.

Die Expression des HIV-1 Env Glykoproteins wird von verschiedenen Faktoren beeinflußt, die sowohl auf die Env mRNA als auch auf das Glykoprotein wirken. Diese Faktoren verursachen eine sehr effiziente Suppression des Glykoproteins, weshalb nur ein geringer Anteil von Env auf der Zelloberfläche exprimiert wird, während der größte Teil im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten und nachfolgend degradiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurden die auf der Proteinebene wirksamen Faktoren untersucht, die die Expression von Env auf der Zelloberfläche beeinflussen. Wahrscheinlich aufgrund seiner komplexen Faltung und Modifikation wird ein ungewöhnlich großer Teil des Env Glykoproteins nicht von den während der Proteinsynthese bindenden Chaperonen, die Bestandteile des Qualitätskontrollsystems des ER sind, freigesetzt und in das Golgi Kompartment transportiert, sondern bleibt im ER und wird nachfolgend degradiert. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß ER-assoziiertes Env ubiquitiniert und nachfolgend von Proteasomen abgebaut wird. Die extrazelluläre Domäne der gp41 Untereinheit wird monoubiquitiniert, und der ubiquitinierte Anteil des Glykoproteins befindet sich im Lumen des ER. Da ubiquitiniertes Env das Molekulargewicht des reifen Proteins aufweist und dessen extrazelluläre Domäne vollständig das Lumen des ER erreicht, wird es entweder kotranslational ohne Importstop oder innerhalb des ER Lumens ubiquitiniert. Die ubiquitinierte Form bleibt mit der ER-Membran assoziiert und ist auch nach Inhibition der proteasomalen Degradation nicht im Zytosol nachweisbar, was für einen gekoppelten Prozeß des retrograden Transports und des proteasomalen Abbaus spricht. Während des Proteinexports ist außerdem eine Assoziation mit dem Sec61p Translokon-Protein nachweisbar, welches beim retrograden Transport mißgefalteter Proteine eine Rolle spielt. Die proteasomale Degradation von Env konnte sowohl in vivo als auch mit Hilfe eines in vitro Systems mit isolierten Mikrosomen und aufgereinigten Proteasomen nachgewiesen werden. Korrekt synthetisiertes und prozessiertes Env Glykoprotein, das die ER Qulitätskontrolle erfolgreich passiert hat, wird über das Golgi Kompartment zur Zelloberfläche transportiert. Dieser Weitertransport und die Oberflächenexpression des Glykoproteins wird entscheidend von der zytoplasmatischen Domäne beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit konnten zwei Proteinmotive is1 (aa750 - 763) und is2 (aa764 - 785) identifiziert werden, die sowohl in einem heterologen, chimären Protein, als auch im gp160 Glykoprotein zu einer Inhibition der Oberflächenexpression und zur Golgi Lokalisation führen. Der Mechanismus konntezumindest teilweise auf eine Internalisierung des auf der Zelloberfläche exprimierten Proteins zurück-geführt werden.

Ziel dieser Arbeit war es, Veränderungen innerhalb weniger Stunden nach UV-B-Exposition auf Protein- und Transkriptionsebene bei 10-wöchigen Buchensämlingen Fagus sylvatica L. zu analysieren. Dazu wurden Buchensamen unter standardisierten Bedingungen angezogen und von dem Zeitpunkt der Keimung an unter einem UV-B/PAR-Verhältnis exponiert, das den natürlichen Umweltbedingungen sehr ähnlich ist. Die UV-B-Exposition der 10-wöchigen Buchensämlinge erfolgte in einer UV-B-Pflanzenkammer, die das Lichtspektrum des Sonnenlichts simulierte. Die in einer Zeitkinetik geernteten Primärblätter dienten als Ausgangsmaterial für die Daten in der vorliegenden Arbeit. Die 2D-PAGE der löslichen Gesamtproteine und in vitro translatierten Proteine wurde stets zweifach durchgeführt und jeweils die Gele mit der besten Auflösung als Einzelbestimmung ausgewertet. Die Untersuchungen auf Ebene des löslichen Gesamtproteins der Buche Fagus sylvatica L. erfolgten mittels einer Zeitkinetik über 1 Woche, wobei täglich 1 mal geerntet wurde. Die 2DPAGE Analyse ergab über die gesamte Zeitkinetik betrachtet 1 UV-B-induziertes Protein gegenüber der Starklicht-Kontrolle: Protein 28 (17 kDa; pI 6,8). Die 2D-Analysen auf löslicher Gesamtproteinebene stimmten mit den Daten auf in vitro Translationsebene überein, wobei die Effekte auf Transkriptionsebene wesentlich stärker waren. Insbesondere nach 3 und 6 h UV-B-Exposition konnten auf Transkriptebene eine 60%-ige und 90%-ige Reprimierung gezeigt werden. Diese Reprimierung war transient und auf Proteinebene in geringerem Ausmaß zeitlich verzögert nachzuweisen. Diese Daten gaben Hinweise dafür, daß bei der Buche Fagus sylvatica L. infolge UV-B-Exposition eine Regulation auf Transkriptionsebene stattgefunden hat und die drastische Reprimierung der Transkripte verschiedener Gene nur transient war. Da diese Effekte auf Proteinebene wesentlich schwächer waren, deutete das darauf hin, daß sich die Buchensämlinge innerhalb weniger Stunden an die UV-B-Exposition adaptierten. Auf in vitro Translationsebene gab es bei der Buche Fagus sylvatica L. 18 mRNAs, die unter Berücksichtigung der UV-B- und Starklicht-Tagesgänge direkt dem UV-B-Effekt zugeordnet werden konnten. Es wurde belegt, daß infolge erhöhter UV-B-Exposition 10 Transkripte neu vorhanden waren und die Transkripte von 8 Proteinen nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Diesen charakteristischen Veränderungen unterlagen überwiegend saure und basische Proteine. Die Effekte waren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kinetik zu sehen (7 h, 10 h, 18 h, 28 h und 31 h nach Versuchsbeginn). Die DDRT-PCR wurde eingesetzt, um UV-B-vermittelte Antworten auf Genebene in Buchenblättern zu identifizieren. Bei den isolierten cDNAs wurden geringe Homologien verschiedener Buchenklone in der TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank gefunden: UV-Breprimierte Buchenklone zeigten Ähnlichkeiten zur Peroxidase, zur „DNA directed RNA-Polymerase alpha chain“ und zu einem „ara-3, ras-related GTP-binding protein“. Durch UV-B-Exposition induzierte Buchenklone wiesen Homologien zu dem „ABI-3“, zu dem „phytochrome regulated gene“ und zur Squalen-Synthase auf. Die Sequenzen dieser Buchenklone wurden zum ersten Mal beschrieben. Erstmals wurde ein ribosomaler Klon L37 bei der Buche beschrieben. Die L37 mRNA wurde aufgrund erhöhter UV-B-Exposition transient induziert. Bei erhöhter Ozon-Behandlung erreichte das Transkript dieses Klons zwei zeitlich voneinander getrennte Maxima; das zweite Maximum (am 3. Tag der Behandlung, 1,6-fache Induktion) ging mit sichtbaren Ozon- Schäden an den jungen Seitentrieben der Buche einher. Die Funktion dieses Proteins ist bisher noch unbekannt. Für eine direkte Zuordnung der isolierten Klone zu den Proteinspots auf der 2D-PAGE müßte eine Sequenzierung der Proteinspots erfolgen. Die Menge der Proteinspots für eine Proteinsequenzierung war jedoch nicht ausreichend. Über die TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank wurde erstmalig ein nach UV-BExposition induzierter Buchenklon isoliert, der hohe Homologien zum „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ aufwies. Dieses Transkript wurde bereits nach 3 h UV-BExposition transient induziert. Der durch Ozon-Exposition reprimierende Effekt wurde durch die kombinierte UV-B/Ozon-Exposition aufgehoben. Die UV-B-vermittelte Induktion dieser zwei Buchenklone unterstützten die auf der 2D-PAGE Analyse resultierende Hypothese, daß die Regulation nach UV-B-Exposition vor allem auf Transkriptionsebene stattzufinden scheint. Die Daten der vorliegenden Arbeit ergaben folgende Schlußfolgerungen: Das Differentielle Display wurde eingesetzt, um infolge UV-B-Exposition differentielle cDNAs in Buchenblättern zu klonieren. Mittels der durchgeführten Northern-Blots wurde gezeigt, daß die Veränderungen auf Transkriptebene durch erhöhte UV-B-Exposition bedingt waren. Die vorliegenden Daten belegten, daß 6 verschiedene Transkripte infolge UV-B-Exposition transient induziert wurden. Diese überwiegenden transienten Veränderungen wurden ebenso durch die Untersuchungen mittels 2D-PAGE auf löslicher Gesamtprotein- und Transkriptebene bestätigt. Das bedeutet, daß innerhalb kurzer Zeit eine Anpassung der Buche an die veränderten Umweltbedingungen erfolgte. Möglicherweise kann dies durch die Anzucht der Buchensämlinge unter UV-B und Schwachlicht begründet werden. Diese Bedingungen sind jedoch umweltrelevant, da die Pflanze in jungen Jahren unter schattigen Lichtbedingungen heranwächst. In der vorliegenden Arbeit wurden infolge abiotischer Streßbehandlung (erhöhtes UV-B) erstmals 2 eindeutig transient induzierte differentielle Buchenklone isoliert: der ribosomale Klon L37 und der „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ Klon. Die durchgeführten Northern-Blot Analysen zeigten, daß sich diese 2 Klone als Kandidaten für Molekulare Marker zum Nachweis frühzeitiger UV-B-vermittelter Änderungen auf Transkriptebene bei Fagus sylvatica L. eignen.