Podcasts about probenvorbereitung

Heute gehen wir dem Geschmack mal richtig auf den Kern. Soviel sei vorweg gesagt. Dazu begrüßen wir Jan Garbe Immel (Linked In Profil Jan) einen absoluten Fachgast, der sich bei der Firma Gerstel (Homepage Gerstel) im Bereich der automatisierten Probenvorbereitung bewegt. Vorher bekommen wir von unserem #Foodtrendscout Jan ( Linked In Profil Jan ) eine an sich sehr heimisch bekannte Zutat, die aber eher selten in der Küche zum Verzehr landet, vorgesetzt. Sie wächst überall, sie beißt uns alle mal in die Wade und ist doch so gesund und vielfältig, entgegen ihrem eher schlechtem Ruf. Na schon eine Idee? Wir stellen heute wieder etwas nerdige Fragen, aber genau dafür hört ihr ja gerne bei uns rein. Wusstet ihr, dass Kaffee eine sehr große Anzahl von mehreren hundert verschiedenen Aromen hat? Wieso ist Cola/Rum eines der meist getrunkenen Getränke weltweit! Wieso ist das so? Was harmonisiert da besonders gut? Was sind Aromen? Wie entstehen diese? Wann kommen VOC (Volatil organic compounds = leicht flüssige Substanzen) an unsere Nase? Wie bekomme ich diese heraus und wann sehe ich diese? Um genau das rauszufinden, bzw. um diese Fragen zu beantworten, baut die Firma Gerstel die entsprechenden Geräte, entwickelt das Know How und verkauft das als Gesamtpaket an Labore usw, damit die Auswertung der einzelnen Rohstoffe vor Ort in der Firma stattfinden kann. Eine der Methoden hierfür ist z.B. ist Head Space Analytik - Gasraum Analyse Es gibt sogar bereits Ansätze, wo dieses Wissen für uns zugänglich gemacht wird - Besucht hierfür einfach mal die Seite der Firma Foodpairing (Webseite Foodpairing) Wir wünschen viel Spaß bei diesem Einblick in die Welt der Chemie unserer Aromen, die wir täglich erleben, riechen, schmecken usw. Geht mal wieder dem Geschmack auf den Grund ;-) Wir waren sehr überrascht, wie die komplexen Sachverhalte doch verständlich besprochen werden können. Für Fragen, Wünsche und Anregungen auf allen gewohnten Kanälen und unserer Facebookseite stehen wir gerne weiter Rede & Antwort (https://www.facebook.com/food.cast.hamburg). Beste Grüße euer Foodcast Team Jan und Sascha

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung, Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten. Der Stoffwechsel der proteinogenen, essentiellen Aminosäure Tryptophan umfasst nicht nur den Neurotransmitter Serotonin und das in der Epiphyse gebildete Hormon Melatonin, sondern er schließt auch den Kynurenin Pathway mit ein. Die neurobiochemische Bedeutung dieses Stoffwechselweges wird bereits durch die Tatsache offensichtlich, dass im zentralen Nervensystem mehr als 95% des Tryptophans über diesen Weg metabolisiert werden. Die Intermediate des Kynurenin Pathways spielen eine bedeutende Rolle als Mediatoren zwischen Immun- und Nervensystem. Dabei nehmen sie potenziell Einfluss auf höhere zentralnervöse Funktionen, wie Kognition, Verhalten und Affekt, weshalb sie von herausragender Bedeutung für das Forschungsgebiet der Psychoneuroimmunologie sind. Auf molekularer Ebene wird Tryptophan im ersten Schritt durch die beiden Schlüsselenzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase und Indoleamin-2,3-dioxygenase zu N-Formylkynurenin oxidiert. Durch Kynureninformidase erfolgt eine Metabolisierung von N-Formylkynurenin zu Kynurenin - der Ausgangssubstanz des gleichnamigen Stoffwechselweges. Während die Tryptophan-2,3-dioxygenase ausschließlich Tryptophan oxidiert, ist die Indolamin-2,3-dioxygenase nicht nur für den Abbau von Tryptophan spezifisch, sondern für alle Indolamine, inklusive Serotonin und Melatonin. Die Aktivität der Tryptophan-2,3-dioxygenase wird dabei durch Glucocorticoide, die der Indolamine-2,3-dioxygenase durch bestimmte Zytokine reguliert. Die Indolamin-2,3-dioxygenase spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Modulation der T-Zell-Toleranz. Des Weiteren werden die Aktivitätszustände diverser Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems durch Metabolite des Kynurenins gesteuert. Einige Bestandteile des Kynurenin Pathways besitzen neuroprotektive oder neurotoxische Eigenschaften. So ist beispielsweise die neuroprotektive Kynureninsäure der bisher einzige bekannte endogene Antagonist des NMDA-Rezeptors und zusätzlich ein nichtkompetitiver Antagonist des α7-nikotinischen Acetylcholinrezeptors. Dieser Substanz steht der alternative Kynurenin-Metabolit, das exzitotoxische Neurotoxin Chinolinsäure gegenüber, welcher ein Agonist des NMDA-Rezeptors ist. Bei Untersuchungen zum Tryptophanstoffwechsel ist es daher von entscheidender Bedeutung nicht nur einzelne Substanzen sondern die Gesamtheit der Metabolite zu quantifizieren. Nur so kann die Balance zwischen neuroprotektiven und neurodegenerativen Substanzen, aber auch die Balance zwischen inhibierenden und aktivierenden Mediatoren des Immun- und Nervensystems dargestellt werden. In klinischen Studien können so Dysbalancen mit der Pathogenese einzelner Erkrankungen assoziiert werden, wodurch die Möglichkeit besteht, dass Biomarker zur frühzeitigen Diagnose identifiziert und neue Therapieansätze postuliert werden können. In dieser Arbeit wird eine neue HPLC-MS/MS-Methode vorgestellt, mit der eine bisher unerreichte Vielfalt an Tryptophan-Metaboliten quantifiziert werden kann. Die Probenvorbereitung ist eine einfache und kosteneffiziente Proteinfällung in zwei Stufen, wobei unterschiedliche Matrices, wie beispielsweise Serum oder Liquor cerebrospinalis, als Probenmaterial verwendet werden können. Um Analyte mit sehr niedrigen physiologischen Konzentrationen zu detektieren, wurde für diese eine Derivatisierung entwickelt. Die Methode benötigt ein sehr geringes Probenvolumen, ist durch die Verwendung der HPLC-MS/MS-Technologie äußerst sensitiv und spezifisch und umfasst alle bedeutenden Metabolite des Tryptophanstoffwechsels mit nur einer Probenvorbereitung. Die Robustheit wurde in einer ausführlichen Validierung bestätigt. Dabei wurden auch die analytischen Grenzwerte und Kennzahlen ermittelt, sowie die Stabilität der Proben untersucht. In Versuchen zu präanalytischen Einflüssen wurde festgestellt, dass unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahme, unterschiedliche Blutentnahmesysteme und die Nahrungsaufnahme zu gravierenden Änderungen der Konzentrationen der Analyte führen. So führt die Verwendung unterschiedlicher Blutentnahmesystem beispielsweise bei der Quantifizierung des Metaboliten Picolinsäure zu Ergebnissen, die sich um bis zu 60% unterscheiden. Es wurde nachgewiesen, dass es postprandial zu starken interindividuell unterschiedlichen Änderungen der Konzentrationen einzelner Intermediate kommt. Dabei verhalten sich die freien und proteingebundenen Metabolite ebenfalls unterschiedlich. Deshalb muss für Studien eine normierte Probengewinnung mit möglichst exakten Bedingungen eingeführt werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung des Tryptophans in vivo einer circadianen Rhythmik unterliegt. Aufbauend auf diesen Erkenntnisse wurden in einem in vitro Experiment tageszeitabhängige Schwankungen nachgewiesen und der Einfluss einer LPS-Stimulation auf den Kynurenin Pathway untersucht. Durch den Einsatz dieser neuen HPLC-MS/MS-Methode besteht die Möglichkeit, die funktionellen Zusammenhänge zwischen Intermediaten des Kynurenin Pathways und diversen immunologischen, neurochemischen und anderen pathophysiologischen Vorgängen zu untersuchen. In der Literatur gibt es eine Vielzahl an Hinweisen darauf, dass der Tryptophanstoffwechsel an der Pathogenese unterschiedlichster Erkrankungen beteiligt ist. Jedoch bedarf es der genauen Klärung der Zusammenhänge und der Möglichkeit, die Gesamtheit einer potentiellen Störung des Tryptophanstoffwechsels zu erfassen. So sind im Bereich psychiatrischer und neurologischer Erkrankungen beispielsweise Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Epilepsie zu nennen. Hier wurden in publizierten Studien häufig nur einzelne Metabolite quantifiziert und isoliert betrachtet. Darüber hinaus konnten unterschiedliche Arbeitsgruppen zeigen, dass eine Aktivierung des Kynurenin Pathways auch bei der Pathogenese von Tumoren beteiligt ist, weshalb auch hier die von uns entwickelte Methode für weitere Studien von großem Nutzen ist.

Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein bedeutender Lebensmittelkeim, der vorwiegend in Schweinefleisch vorkommt. Kulturell ist er sehr schwer nachzuweisen, da er auf Selektivagar sehr schnell von anderen Keimen überwuchert wird. Zudem sind die kulturellen Isolierungsmethoden sehr zeitaufwendig und eine Aussage über pathogene oder apathogene Stämme kann aufgrund der Ergebnisse ohne weitere Diagnostik nicht getroffen werden. Aus diesen Gründen wird in der Diagnostik von Y. enterocolitica aus Lebensmitteln vermehrt der PCR-Nachweis eingesetzt, welcher innerhalb von Stunden, bei vorheriger Anreicherung nach einem Tag, ein zuverlässiges Ergebnis liefert. Abhängig von der Wahl des Zielgenes werden nur pathogene Keime detektiert. Die Sensitivität einer PCR ist in großem Maße von der Aufreinigung abhängig, deshalb sollte ein PCR-Protokoll immer einschließlich Probenvorbereitung etabliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time PCR-basiertes Nachweisverfahren, zusammen mit der Probenvorbereitung, für Y. enterocolitica in Lebensmitteln entwickelt. Nachgewiesen wurde das chromosomale ail-Gen, sowie das auf dem Plasmid lokalisierte virF-Gen. In Vorversuchen erfolgte die Optimierung von verschiedenen Bedingungen für eine PCR, wie die Mastermix-Konzentration, Primer-Konzentration und Annealing-Temperatur. Anschließend erfolgte die Untersuchung von gezielt kontaminierten Rinderhackfleischproben. Diese Proben wurden nach Anreicherung mit sechs verschiedenen Extraktionsverfahren aufgereinigt und anschließend mit drei PCR-Methoden, davon eine Real-Time PCR mit SYBR Green und eine TaqMan Real-Time PCR sowie eine konventionelle Multiplex-PCR mit Gelelektrophorese, auf Y. enterocolitica untersucht. Parallel dazu wurde der klassische kulturelle Nachweis mit Anreicherung in TSB und ITC und Ausstrich auf CIN-Agar durchgeführt. Abschließend erfolgte die Untersuchung von 150 Schweinefleischproben aus dem Handel. Diese wurden ebenfalls mittels der drei PCR-Methoden und kulturell untersucht. Die Aufreinigung der Proben erfolgte nach Anreicherung mit drei Extraktionsmethoden, welche in den Versuchen mit den beimpften Proben die besten Ergebnisse lieferten. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden.

Nach der kompletten Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen des „Human Genome Project“ sind sich die Experten einig, dass die Forschung sich nun den Vorgängen der komplexen Regulationsnetzwerken auf der Proteinebene widmen muß. Die Proteomforschung bedient sich dabei der möglichst optimalen und quantitativen Auflösung von komplexen Proteingemischen. Um dies zu ereichen werden die Proteine mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (2D-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) aufgetrennt. Im Rahmen der vorliegenden Promotion sollten am Beispiel ausgewählter relevanter Blutplasmaproteine das Phänomen der „ladder of spots“ untersucht werden. Dies sind Leitern von Proteinspots, die einem einzigen Protein zugeordnet werden können, sich jedoch in der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung (IEF) aufgrund ihrer Nettoladung unterscheiden und aufgetrennt werden. Vor allem in 2D-Gelen von Blutplasma sind eine ganze Reihe solcher Leitern zu beobachten, und in der Regel werden sie durch posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen oder Phosphorylierungen verursacht. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch der Einfluss von Alterungsprozessen auf der Proteinebene nachgewiesen werden, der zu der Veränderung dieser Proteine in Form von Deamidierungen der Asparagin- und Glutaminaminosäuren beiträgt. Der Mechanismus der Alterung wurde ebenfalls genauer untersucht, da diese Art von Modifikationsreaktion in der Natur sowohl chemisch als auch enzymatisch ablaufen kann. Hier spielt natürlich auch die Art und Weise der Probenvorbereitung eine große Rolle bei möglichen posttranslationalen Modifikationen. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Klonierung eines der ausgewählten Proteine (ß2-Microglobulin) in E.coli mittels molekularbiologischer Techniken. Ziel der Klonierung war es festzustellen, zu welchem Zeitpunkt die zuvor entdeckten posttranslationale Modifikation im Rahmen der natürlichen Alterung von Proteinen auftritt.

Die Belastung des Menschen mit verschiedenen alkylierenden Agenzien ist auf unterschiedliche Quellen zurückzuführen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten durch ein Biomonitoring insbesondere die Beiträge von Nahrung, Rauchen und Passivrauchen möglichst umfassend geklärt werden. Als Biomarker wurden neben Hämoglobinaddukten methylierender, ethylierender, hydroxyethylierender und cyanoethylierender Precursoren mit dem N–terminalen Valin die korrespondierenden alkylierten Mercaptursäuren gewählt, erweitert um eine hydroxypropyl-alkylierte Mercaptursäure. Zur Erfassung der Gesamtbelastung sollte neben den Mercaptursäuren auch die Thioether-Gesamtausscheidung bestimmt werden. Um das Gesamtbild abzurunden, ist allerdings auch die Erfassung von Addukten auf dem Level der DNA nötig. Diese Marker sollten möglichst mit genetischen Prädispositionen in Verbindung gebracht werden, wobei ein Hauptaugenmerk auf den fremdstoffmetabolisierenden Phase-II-Enzymen der Glutathion-S-Transferasen GSTM1, GSTT1 und GSTP1 lag. Die Hauptaufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, geeignete Methoden zum Nachweis der genannten Verbindungen zu entwickeln oder in geeigneter Weise weiterzuentwickeln, so dass unter den Gesichtspunkten der Anwendbarkeit im Humanbiomonitoring im Rahmen einer Studie bei relativ geringem Aufwand, niedrigen Kosten pro Analyse, hoher Selektivität und Sensitivität bei paralleler Gruppenbestimmung ein möglichst effektives Biomonitoring möglich ist. Dazu wurde eine publizierte Methode der DFG zur Bestimmung der Hämoglobinaddukte so weiterentwickelt, dass sie die Simultanbestimmung des Ethylvalinadduktes mittels GC-MS-EI gestattet. Zum Nachweis der Mercaptursäuren alkylierender Verbindungen aus Humanurin wurde eine neue Methode entwickelt, die sich auf eine einfache Probenvorbereitung durch Festphasenextraktion und anschließende Detektion mittels HPLC-APCI-MS/MS stützt. Die Ionisierung der Analyten durch die APCI-Quelle hat gegenüber einer Ionisierung durch Elektrospray-Verfahren wesentliche Vorteile vor allem im Routinebetrieb. Durch den Einsatz des Tandem-Massenspektrometers und Messung selektiver Ionenübergänge ist eine zuverlässige Identifizierung der gesuchten Komponenten gewährleistet. Obwohl Bestimmungen der Gesamt-Thioetherausscheidung schon lange bekannt sind, war die Anwendbarkeit der Methodik insofern begrenzt, als die Probenvorbereitung und die Messungen einen für größere Studien nicht vertretbaren Zeitaufwand bedeuteten. Durch die im Rahmen dieser Arbeit eingeführten Modifikationen ist es möglich, den Arbeitsablauf in den meisten Schritten zu beschleunigen und den Probendurchsatz damit zu erhöhen. Die Kenndaten der Methode werden durch die erhöhte Anzahl an Messungen pro Probe verbessert. Durch den Einsatz eines Multikanalreaders kann die Messung und Auswertung gleichzeitig rechnergestützt erfolgen. Die Bestimmung von 3-Methyl- und 3-Ethyladenin in Urin als Marker für die Alkylierung der DNA setzte bislang im Bereich einer Hintergrundbelastung den Einsatz immunochemischer Methoden voraus. Durch die neuentwickelte Methode reduzieren sich die Probenvorbereitung und –Anreicherung auf eine Festphasenextraktion. Vorteil davon ist ein erhöhter Probendurchsatz bei reproduzierbaren Bedingungen. Die Messung mit HPLC-APCI-MS/MS gestattet die sichere Quantifizierung selbst unbelasteter Nichtraucherproben mit hoher Genauigkeit. Auch in diesem Falle zeigt die Ionisierung mit APCI bedeutende Vorteile gegenüber der Elektrospray-Ionisation, vor allem bei den bedingt durch die hohe Konzentrierung stark matrixbelasteten Proben. Im Rahmen einer longitudinalen Feldstudie mit 69 Probanden wurden die Thioether, Mercaptursäuren, sowie die Hämoglobin- und DNA-Addukte alkylierender Verbindungen untersucht. Die Ergebnisse bestätigen andere Studien, wonach Aktivraucher bezüglich der MeVal-, HyEtVal- und CyEtVal-Addukte erhöhte Level aufweisen. Gleiche Resultate sind für die Mercaptursäuren MMA und HPMA, die Thioether-Gesamtausscheidung sowie für die untersuchten DNA-Addukte gefunden worden. Die vom Probanden selbst berichtete Passivrauchbelastung hatte keinen messbaren Einfluss auf die Biomarker der Exposition gegenüber alkylierenden Agenzien. Es wurde auch kein Zusammenhang zwischen der durch Biomonitoring ermittelten Belastung und der durch Cotinin im Urin und Plasma bzw. der objektiv gemessenen Passivrauchbelastung (Nikotin auf Passiv-Diffusionssammlern) gefunden. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Exposition gegenüber alkylierenden Verbindungen aus weiteren exogenen und endogenen Quellen einen wesentlichen Beitrag zur Gesamtexposition leistet. Im Falle der Nahrung sind die Precursoren allerdings in der Regel zu unspezifisch, als dass sie bestimmten biochemischen Effektmarkern zugeordnet werden könnten, so dass keine Effekte beobachtet werden können und eine eventuelle zusätzliche Belastung beispielsweise durch Passivrauchen im Hintergrundrauschen untergeht. Allerdings lässt sich ein Einfluss der genetisch bedingten Enzymausstattung auf die Level bestimmter Marker feststellen. Vor allem die Träger des GSTT1*0-Gens zeigen eine verringerte Mercaptursäurebildung und ähnlich wie bei doppelten Nullgenotypen GSTM1 T1 vermehrte Bildung von Hämoglobinaddukten, zumindest für methylierende Spezies. Bei hydroxy- und cyanoethylierenden Verbindungen lässt sich allenfalls ein Trend erkennen, der jedoch nicht signifikant ist. Dies ist vermutlich auf die zu geringe Anzahl an Probanden und den Einfluss weiterer im Rahmen einer Feldstudie nicht kontrollierbarer Parameter zurückzuführen.