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Aspergillus fumigatus ist der häufigste zum Tode führende opportunistische Erreger invasiver Mykosen des Menschen. Durch den zunehmenden Einsatz von Immunsuppressiva und agressiverer Chemotherapieschemata, aber auch durch Zunahme von Organ- und Stammzelltransplantationen, steigt die Zahl abwehrgeschwächter Patienten stetig an und mit ihnen die Zahl der Invasiven Aspergillosen. Bei steigender Inzidenz blieb die Letalität trotz weiterentwickelten Therapiemöglichkeiten in den letzten Jahren nahezu konstant. Einer der Hauptgründe dafür ist die meist späte Diagnostik der Erkrankung, welche bei Entdeckung häufig so weit fortgeschritten ist, dass jeder Therapieversuch zu spät kommt. Diese Situation erfordert dringend die Einführung von neuen diagnostischen Methoden zur Früherkennung der Invasiven Aspergillose. Ein Ansatz in dieser Arbeit sollte sein, herauszufinden welche Makromoleküle von A. fumigatus sezerniert, und damit beim Patienten in den Blutkreislauf oder Urin gelangen. Anschließend sollte untersucht werden, ob diese Pilz-Makromoleküle auch unter Infektionsbedingungen im Menschen exprimiert werden und letztendlich im Serum detektierbar sind. Dazu wurde A. fumigatus in unterschiedlichen Medien kultiviert und sezernierte Proteine analysiert. Pilzproteine sind für die Diagnostik so wichtig, da sie als erregerspezifische Antigene mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen werden können. Umgekehrt können diese Antigene auch im Patienten eine Antikörperantwort induzieren, die mittels Antigen nachgewiesen werden kann. Von den elf sezernierten Proteinen, die in dieser Arbeit identifiziert wurden, wurden zwei Proteine näher charakterisiert: Die Protease Aspergillopepsin1 (PEP1) und das Toxin Hämolysin (Hly). Gegen diese beiden Proteine wurden monoklonale Antikörper (mAk) generiert, wofür Hly zuerst rekombinant hergestellt werden musste. Mithilfe monoklonaler Antikörper wurden sowohl die Sekretionsbedingungen von PEP1 und Hly genauer charakterisiert als auch versucht, in Patientenserum diese zwei Proteine nachzuweisen. Leider konnte weder PEP1 noch Hly im Serum detektiert werden. Grund dafür könnte ein vorzeitig stattgefundener Verdau durch serumeigene Proteasen sein, oder eine zu geringe Konzentration der beiden Proteine im Serum. Die Sensitivität dieses Test könnte verbessert werden, in dem diese monoklonalen Antikörper z.B. innerhalb eines Sandwich-ELISAS eingesetzt werden. Neben Proteinen haben sich in der Vergangenheit auch Polysaccharide von A. fumigatus als geeignete diagnostische Marker einer invasiven Aspergillose erwiesen. Zwar haben sie den Nachteil, als Zellwandbestandteil von Pilzen nicht Aspergillus spezifisch zu sein. Dagegen haben sie für den Nachweis im Serum andere Vorteile: Sie sind sehr stabile Moleküle (z.B. hitzebeständig) und werden in größeren Mengen von A. fumigatus produziert und freigesetzt, sodass sie bereits mit weniger sensitiven Methoden detektierbar sind. In dieser Arbeit wurden nach Immunisierung zweier Mäuse mit A. fumigatus-Kulturüberstand u.a. zwei Antikörper gegen Galaktofuranose (Galf) identifiziert. Galaktofuranose kommt nicht nur als Seitenkette des Galaktomannans, einem Hauptbaustein der Aspergillus-Zellwand, vor, sondern ist auch Bestandteil vieler sezernierter Pilz-Glykoproteine. Das Vorkommen sowohl als fester Bestandteil der Zellwand und gleichzeitig als in die Umgebung abgegebenes Molekül macht den Zuckerrest Galaktofuranose nicht nur zu einem brauchbaren Marker für histopathologische Untersuchungen sondern auch für die Serologie. Anhand einer Galf-Deletionsmutante von A. fumigatus konnte die Spezifität zweier monoklonaler Antikörper (L-10-1 und L-99-13) gezeigt werden. Diese Antikörper wurden im Folgenden genutzt, um die Expressionsbedingungen von Galaktofuranose-Resten in A. fumigatus näher zu untersuchen. Es fiel auf, dass die Freisetzung von Zellwandbestandteilen mit Galaktofuranose-Resten stark von der Zusammensetzung des Kulturmediums abhängig ist und erst mit Auskeimung der Sporen einsetzt. Des weiteren sollte mit Hilfe der beiden α-Galf-Antikörper versucht werden in Patientenserum Galaktofuranose-Reste zudetektieren. Hierzu wurde ein Sandwich-ELISA aufgebaut, der in zwei Varianten jeweils einen der beiden α-Galf-Antikörper als Fänger-Ak nutzte und den mAk L-10-1 (nach Konjugation mit Peroxidase) als Detektor-Ak. Es konnte gezeigt werden, dass dieser ELISA in Patientenseren sehr sensitiv Galaktofuranose-haltige Bestandteile nachweist und damit die Differentialdiagnostik einer invasiven Infektion durch A. fumigatus verbessern könnte. Nach den in dieser Arbeit erhobenen Daten kann die Sensitivität gegenüber dem kommerziell verfügbaren ELISA vermutlich noch erhöht werden. Bezüglich der Spezifität konnten die Probleme mit Galaktofuranose-Reste enthaltenen Antibiotika (wie Augmentan®) jedoch nicht beseitigt werden. Die guten Ergebnisse, die in dieser Arbeit mit dem L-10-1-ELISA erzielt wurden, führten dazu, dass dieser ELISA zur Zeit für den Einsatz in der Routinediagnostik am Max-von-Pettenkofer-Institut validiert wird.

Unterschiedliche Stressbedingungen wie Starklicht, Hitze oder Nährstoffmangel können zu einem Abbau photosynthetischer Komplexe wie dem Photosystem I, dem Photosystem II oder Antennenproteinen führen. Dieser Abbau wird durch spezifische Proteasen durchgeführt. Die Proteasen können dabei direkt am Abbau der Strukturproteine beteiligt sein oder aber die Translation oder Transkription von Strukturproteinen oder solchen, die am Schutz photosynthetischer Proteine unter Stressbedingungen beteiligt sind, beeinflussen. Eisenmangel kann z. B. in Pflanzen und in Cyanobakterien zu Chlorose führen. Eisen ist an der Bildung von Chlorophyll beteiligt und kann in Form eines Sauerstoffträgers als Katalysator bei der Atmung agieren. Zudem ist Eisen als Kofaktor von Cytochromen und einigen Enzymen, wie Peroxidase und Katalase, für deren Funktionalität essentiell. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Deg- und SppA-Proteasen aus Synechocystis und Arabidopsis bei der Anpassung an verschiedene Stressbedingungen analysiert. Die plastidären Deg-Peptidasen werden durch vier Mitglieder, drei lumenale Enzyme (DegP1, DegP5 und DegP8) und einem stromalen Enzym (DegP2), vertreten. In Synechocystis besteht die Deg-Familie aus drei Komponenten, HtrA (DegP), HhoA (DegQ) und HhoB (DegS). Die HhoB (DegS)-Protease, die im Synechocystis-Genom durch das sll1427-Gen kodiert wird, ist in die Anpassung an Eisenstress involviert. Die DhhoB-Mutante zeigte sich unter Eisenmangel weniger angepasst und blieb auch nach längerer Stresseinwirkung grün. Die Mutante bildete sehr wohl die zum Schutz vor Eisenmangel benötigten Proteine, jedoch war die Expression von photosynthetischen Genen unter Stressbedingungen nicht wie im Wildtyp herabreguliert. Es wird vermutet, dass HhoB, ähnlich zu der DegS-Protease aus E. coli, an der Regulation der Genexpression beteiligt ist. Jedoch anders als bei E. coli wird bei Abwesenheit des DegS-Proteins die Expression nicht herabreguliert, sondern hochreguliert. Die DegP2- und DegP5-Proteasen aus Arabidopsis sind bei der Anpassung an Lichtstress involviert. Sie sind dabei aber nicht an der Reparatur des PSII oder am Abbau des D1-Proteins beteiligt. Die DdegP2-Mutante zeigte unter Lichtstress eine geringere nicht-photochemische Löschung (NPQ), die DdegP5-Mutante eine höhere NPQ. Die NPQ besteht aus drei Komponenten, der Photoinhibierung qI, der „state transition“ qT und dem „de-excitation quenching“ qE, wobei die ersten beiden nicht betroffen waren. Dass qE betroffen war, wurde anhand des Verhältnisses der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin bestimmt. Zeaxanthin wirkt sich positiv auf die NPQ aus. Die DdegP5-Mutante enthielt mehr Zeaxanthin relativ zu Violaxanthin als die DdegP2-Mutante. Beide Proteasen, DegP5 und DegP2, könnten Regulatoren der lumenalen Violaxanthin-de-epoxidase, welche Violaxanthin zu Zeaxanthin umwandelt, sein. Die DegP2- und die DegP5-Protease agieren als Gegenspieler bei der Löschung überschüssiger Anregungsenergie.

Ziel dieser Arbeit war es, Veränderungen innerhalb weniger Stunden nach UV-B-Exposition auf Protein- und Transkriptionsebene bei 10-wöchigen Buchensämlingen Fagus sylvatica L. zu analysieren. Dazu wurden Buchensamen unter standardisierten Bedingungen angezogen und von dem Zeitpunkt der Keimung an unter einem UV-B/PAR-Verhältnis exponiert, das den natürlichen Umweltbedingungen sehr ähnlich ist. Die UV-B-Exposition der 10-wöchigen Buchensämlinge erfolgte in einer UV-B-Pflanzenkammer, die das Lichtspektrum des Sonnenlichts simulierte. Die in einer Zeitkinetik geernteten Primärblätter dienten als Ausgangsmaterial für die Daten in der vorliegenden Arbeit. Die 2D-PAGE der löslichen Gesamtproteine und in vitro translatierten Proteine wurde stets zweifach durchgeführt und jeweils die Gele mit der besten Auflösung als Einzelbestimmung ausgewertet. Die Untersuchungen auf Ebene des löslichen Gesamtproteins der Buche Fagus sylvatica L. erfolgten mittels einer Zeitkinetik über 1 Woche, wobei täglich 1 mal geerntet wurde. Die 2DPAGE Analyse ergab über die gesamte Zeitkinetik betrachtet 1 UV-B-induziertes Protein gegenüber der Starklicht-Kontrolle: Protein 28 (17 kDa; pI 6,8). Die 2D-Analysen auf löslicher Gesamtproteinebene stimmten mit den Daten auf in vitro Translationsebene überein, wobei die Effekte auf Transkriptionsebene wesentlich stärker waren. Insbesondere nach 3 und 6 h UV-B-Exposition konnten auf Transkriptebene eine 60%-ige und 90%-ige Reprimierung gezeigt werden. Diese Reprimierung war transient und auf Proteinebene in geringerem Ausmaß zeitlich verzögert nachzuweisen. Diese Daten gaben Hinweise dafür, daß bei der Buche Fagus sylvatica L. infolge UV-B-Exposition eine Regulation auf Transkriptionsebene stattgefunden hat und die drastische Reprimierung der Transkripte verschiedener Gene nur transient war. Da diese Effekte auf Proteinebene wesentlich schwächer waren, deutete das darauf hin, daß sich die Buchensämlinge innerhalb weniger Stunden an die UV-B-Exposition adaptierten. Auf in vitro Translationsebene gab es bei der Buche Fagus sylvatica L. 18 mRNAs, die unter Berücksichtigung der UV-B- und Starklicht-Tagesgänge direkt dem UV-B-Effekt zugeordnet werden konnten. Es wurde belegt, daß infolge erhöhter UV-B-Exposition 10 Transkripte neu vorhanden waren und die Transkripte von 8 Proteinen nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Diesen charakteristischen Veränderungen unterlagen überwiegend saure und basische Proteine. Die Effekte waren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kinetik zu sehen (7 h, 10 h, 18 h, 28 h und 31 h nach Versuchsbeginn). Die DDRT-PCR wurde eingesetzt, um UV-B-vermittelte Antworten auf Genebene in Buchenblättern zu identifizieren. Bei den isolierten cDNAs wurden geringe Homologien verschiedener Buchenklone in der TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank gefunden: UV-Breprimierte Buchenklone zeigten Ähnlichkeiten zur Peroxidase, zur „DNA directed RNA-Polymerase alpha chain“ und zu einem „ara-3, ras-related GTP-binding protein“. Durch UV-B-Exposition induzierte Buchenklone wiesen Homologien zu dem „ABI-3“, zu dem „phytochrome regulated gene“ und zur Squalen-Synthase auf. Die Sequenzen dieser Buchenklone wurden zum ersten Mal beschrieben. Erstmals wurde ein ribosomaler Klon L37 bei der Buche beschrieben. Die L37 mRNA wurde aufgrund erhöhter UV-B-Exposition transient induziert. Bei erhöhter Ozon-Behandlung erreichte das Transkript dieses Klons zwei zeitlich voneinander getrennte Maxima; das zweite Maximum (am 3. Tag der Behandlung, 1,6-fache Induktion) ging mit sichtbaren Ozon- Schäden an den jungen Seitentrieben der Buche einher. Die Funktion dieses Proteins ist bisher noch unbekannt. Für eine direkte Zuordnung der isolierten Klone zu den Proteinspots auf der 2D-PAGE müßte eine Sequenzierung der Proteinspots erfolgen. Die Menge der Proteinspots für eine Proteinsequenzierung war jedoch nicht ausreichend. Über die TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank wurde erstmalig ein nach UV-BExposition induzierter Buchenklon isoliert, der hohe Homologien zum „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ aufwies. Dieses Transkript wurde bereits nach 3 h UV-BExposition transient induziert. Der durch Ozon-Exposition reprimierende Effekt wurde durch die kombinierte UV-B/Ozon-Exposition aufgehoben. Die UV-B-vermittelte Induktion dieser zwei Buchenklone unterstützten die auf der 2D-PAGE Analyse resultierende Hypothese, daß die Regulation nach UV-B-Exposition vor allem auf Transkriptionsebene stattzufinden scheint. Die Daten der vorliegenden Arbeit ergaben folgende Schlußfolgerungen: Das Differentielle Display wurde eingesetzt, um infolge UV-B-Exposition differentielle cDNAs in Buchenblättern zu klonieren. Mittels der durchgeführten Northern-Blots wurde gezeigt, daß die Veränderungen auf Transkriptebene durch erhöhte UV-B-Exposition bedingt waren. Die vorliegenden Daten belegten, daß 6 verschiedene Transkripte infolge UV-B-Exposition transient induziert wurden. Diese überwiegenden transienten Veränderungen wurden ebenso durch die Untersuchungen mittels 2D-PAGE auf löslicher Gesamtprotein- und Transkriptebene bestätigt. Das bedeutet, daß innerhalb kurzer Zeit eine Anpassung der Buche an die veränderten Umweltbedingungen erfolgte. Möglicherweise kann dies durch die Anzucht der Buchensämlinge unter UV-B und Schwachlicht begründet werden. Diese Bedingungen sind jedoch umweltrelevant, da die Pflanze in jungen Jahren unter schattigen Lichtbedingungen heranwächst. In der vorliegenden Arbeit wurden infolge abiotischer Streßbehandlung (erhöhtes UV-B) erstmals 2 eindeutig transient induzierte differentielle Buchenklone isoliert: der ribosomale Klon L37 und der „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ Klon. Die durchgeführten Northern-Blot Analysen zeigten, daß sich diese 2 Klone als Kandidaten für Molekulare Marker zum Nachweis frühzeitiger UV-B-vermittelter Änderungen auf Transkriptebene bei Fagus sylvatica L. eignen.